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Abstract
El género Staphylococcus, está formado por un importante grupo de bacterias patógenas oportunistas y ubicuitarias, capaces de colonizar piel y mucosas, tanto de personas como de animales. Las especies con una mayor relevancia a nivel clínico, son particularmente Staphylococcus aureus y Staphylococcus intermedius/ pseudointermedius. Estos microorganismos se caracterizan, por su capacidad de transmisión de resistencia a antibióticos, fundamentalmente al grupo de los β- lactámicos, entre los que se incluye la meticilina. Las infecciones causadas por los Staphylococcus resistentes a meticilina (MRSA), son una de las causas más importantes de morbilidad y mortalidad de los animales de compañía. Uno de los principales problemas con el que nos encontramos, es, la repercusión que esas resistencias detectadas en el entorno veterinario, van a tener en medicina humana, ya que estos microorganismos, son potencialmente zoonóticos. Por ello, el objetivo del estudio, fue conocer la distribución de las cepas de S. aureus y de S intermedius/ pseudointermedius en animales de compañía, así como la caracterización fenotípica y genotípica de sus resistencias a antibióticos. El trabajo se completó con la valoración de la fiabilidad y grado de acuerdo existente entre las pruebas diagnósticas disponibles y utilizadas de forma habitual para detectar dichas resistencias. La metodología de trabajo se centró en el muestreo de animales de compañía con el fin de aislar e identificar la presencia de S. aureus y S. intermedius/ pseudointermedius. Estos aislamientos se completaron con la determinación de los patrones fenotípicos de resistencia a los antibióticos de mayor interés en medicina humana y veterinaria, mediante los test de Difusión en disco de Kirby Bauer (KB) y la determinación de las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMIs). También se caracterizaron los patrones de resistencia a –lactámicos, mediante el test de aglutinación para la proteína PBP2a (específica de cepas resistentes a aquellos antibióticos). Finalmente, aquellas cepas con patrones de resistencia fenotípica que suponían un riesgo para la Salud Pública, se tipificaron genéticamente por PCR a través de la detección directa del gen mec- A. El estudio se concluyó con la determinación de la fiabilidad de las pruebas utilizadas mediante los parámetros de sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivo y negativo, de los test. El grado de acuerdo entre las pruebas se definió mediante el valor Kappa. Se muestrearon un total de 135 animales, de los cuales, las especies más representadas fueron perros (71,85%), y caballos (14,81%). De las cepas identificadas, un 23,93% fueron S. aureus y un 76,06% S. intermedius/ pseudointermedius. La prevalencia de cepas de S. intermedius/ pseudointermedius fue muy elevada, mientras que en caballos, fue S. aureus el que presenta la prevalencia más alta. Los test de KB, pusieron de manifiesto, que un alto porcentaje de cepas de estafilococos presentaron resistencias a la estreptomicina (90- 100%), y un bajo porcentaje a las quinolonas (10- 25%). Se mostraron altos porcentajes de cepas resistentes a β- lactámicos en S. aureus. S. intermedius/ pseudointermedius, evidenciaron bajos porcentajes de resistencias a β- lactámicos tales como meticilina (16,36%), oxacilina (14,55%), y cefoxitina (1,82%). Mediante la determinación de las CMIs se observó que un 50% de los S. aureus, eran resistentes a penicilina, en contraste con el 0% de resistencia a vancomicina, distribución prácticamente similar a lo observado en S. intermedius/ pseudointermedius. Las proporciones de resistencia para oxacilina y amoxicilina fueron más bajas; resultados estos, que no coincidían con los obtenidos mediante el Test de KB. Un alto porcentaje de cepas fueron positivas a la presencia de la proteína PBP2a, siendo ese porcentaje similar en S. aureus (43,75%) y en S. intermedius/pseudointermedius (38,18%). Las cepas consideradas de riesgo para la Salud Pública y analizadas por PCR fueron principalmente S. intermedius/ pseudointermedius (20), estas en su mayoría fueron negativas a la presencia del gen mec- A (13) y procedentes de aislamientos de perros; de las cepas de S. aureus aisladas (8), prácticamente todas fueron positivas a la presencia de dicho gen (7). Considerando que estos son microorganismos potencialmente zoonóticos, es posible el intercambio de cepas, incluidas las resistentes a antibióticos, entre animales y personas, siendo las personas en contacto con estos animales (veterinarios, cuidadores y propietarios) el primer eslabón en la cadena de difusión del patógeno en la comunidad, pero no el único, ya que el carácter ubicuitario de Staphylococcus, le permite su persistencia en el medio. La difusión de resistencias puede comprometer las opciones terapéuticas frente a este patógeno, y favorecer la adaptación de estas bacterias en otros hospedadores, dando lugar a la aparición de nuevas enfermedades. Finalmente, los resultados del estudio ponen en evidencia, la escasa fiabilidad y grado de concordancia, de la que gozan los diferentes métodos de detección de resistencia a antibióticos utilizados habitualmente, sobre todo en el caso de S. intermedius/ pseudointermedius, hecho que complica la eficacia del tratamiento de este patógeno, así como el control de sus prevalencias por los Sistemas de Vigilancia. Alcalá García, Leticia; Ortega Rodríguez, Carmelo
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MásterOficialUniversitarioenSaludPública2011‐2012. FacultaddeMedicinadeZaragoza. TrabajodefindeMáster. R RE ES SI IS ST TE EN NC CI IA A A A A AN NT TI IB BI IÓ ÓT TI IC CO OS S E EN N S St ta ap ph hy yl lo oc co oc cc cu us s a au ur re eu us s Y Y O OT TR RO OS S S St ta ap ph hy yl lo oc co oc cc cu us s s sp pp p. . D DE E O OR RI IG GE EN N A AN NI IM MA AL L; ; I IM MP PL LI IC CA AC CI IO ON NE ES S P PA AR RA A L LA A S SA AL LU UD D P PÚ ÚB BL LI IC CA A Alumno:LeticiaAlcaláGarcía.LicenciadaenVeterinaria Director:CarmeloOrtegaRodríguez.Profesortitulardel DepartamentodePatologíaAnimaldelaFacultaddeVeterinariade Zaragoza. Fechadeentrega:30/08al04/09de2012.
2 ÍNDICE RESUMEN:..................................................................................................................................4 INTRODUCCIÓN:.......................................................................................................................7 1.El concepto de Salud Global “One world, one health” y las enfermedades emergentes:.............................................................................................................................7 2.Relación entre las enfermedades emergentes y la resistencia a antibióticos:.....8 3.El problema de la resistencia a los antibióticos:......................................................10 a)Fundamentos de la resistencia a antibióticos:.....................................................10 b)Resistencia a los antibióticos en Salud Pública y Sanidad Animal:.................11 c)Funcionamiento de los antibióticos y su utilización:...........................................12 d)Condiciones para el buen funcionamiento de los antibióticos:..........................14 e)Consecuencias del mal uso de los antibióticos:..................................................15 f)Mecanismos de resistencia a antibióticos:...........................................................16 4.Staphylococus aureus y otros Staphylococcus spp:...............................................18 a)Características microbiológicas, patogenididad y factores de virulencia:.......18 b)El problema de la resistencia a los antibióticos en estos microorganismos:..21 c)S. aureus resistente a meticilina (MRSA):...........................................................23 d)Opciones terapéuticas para el tratamiento de las cepas MRSA:......................26 e)Clasificación epidemiológica de las cepas MRSA:.............................................27 f)Factores de riesgo asociados:................................................................................28 g)Bases genéticas de la resistencia de MRSA:.....................................................30 5.Falta de concordancia en la valoración de la resistencia a antibióticos:.............32 6.Bases de la lucha frente a la resistencia a antibióticos:.........................................33 a)Uso racional de los antibióticos:.............................................................................34 b)Prevención de las enfermedades microbianas y su propagación:...................38 c)Diseño de nuevos antibióticos eficaces o de tratamientos alternativos:..........38 d)Aunar esfuerzos con socios internacionales para reducir los riesgos de propagación de la resistencia, relacionados con el comercio y los viajes internacionales y por el medio ambiente:.....................................................................40 JUSTIFICACIÓN:.....................................................................................................................41 OBJETIVOS:.............................................................................................................................42 MATERIALES Y MÉTODOS:.................................................................................................44 1.Selección de animales y recogida de las muestras:...............................................44 2.Aislamiento e identificación bacteriana:....................................................................45 3.Determinación de los patrones fenotípicos de resistencia y sensibilidad a antibióticos:............................................................................................................................46
3 4.Caracterización de las cepas, mediante biología molecular:................................48 5.Análisis estadístico de los resultados:......................................................................48 RESULTADOS Y DISCUSIÓN:..............................................................................................49 1.Distribución y caracterización de las cepas de estafilococos aisladas:...............49 Resultados:........................................................................................................................49 Discusión:..........................................................................................................................52 2.Patrones de resistencia y sensibilidad a los antibióticos:......................................53 Resultados:........................................................................................................................53 Discusión:..........................................................................................................................55 3.Estudio genético de las cepas de S. aureus y S. pseudointermedius que presentaron patrones de resistencia específicos de interés para Salud Pública:......58 Resultados:........................................................................................................................58 Discusión:..........................................................................................................................60 4.Estudio de la fiabilidad y la concordancia entre los métodos de selección de resistencia utilizados en el laboratorio:.............................................................................62 Resultados:........................................................................................................................62 Discusión:..........................................................................................................................66 CONCLUSIONES:....................................................................................................................69 BIBLIOGRAFÍA:........................................................................................................................71
4 RESUMEN: El género Staphylococcus, está formado por un importante grupo de bacterias patógenas oportunistas y ubicuitarias, capaces de colonizar piel y mucosas, tanto de personas como de animales. Las especies con una mayor relevancia a nivel clínico, son particularmente Staphylococcus aureus y Staphylococcus intermedius/ pseudointermedius. Estos microorganismos se caracterizan, por su capacidad de transmisión de resistencia a antibióticos, fundamentalmente al grupo de los βlactámicos, entre los que se incluye la meticilina. Las infecciones causadas por los Staphylococcus resistentes a meticilina (MRSA), son una de las causas más importantes de morbilidad y mortalidad de los animales de compañía. Uno de los principales problemas con el que nos encontramos, es, la repercusión que esas resistencias detectadas en el entorno veterinario, van a tener en medicina humana, ya que estos microorganismos, son potencialmente zoonóticos. Por ello, el objetivo del estudio, fue conocer la distribución de las cepas de S. aureus y de S intermedius/ pseudointermedius en animales de compañía, así como la caracterización fenotípica y genotípica de sus resistencias a antibióticos. El trabajo se completó con la valoración de la fiabilidad y grado de acuerdo existente entre las pruebas diagnósticas disponibles y utilizadas de forma habitual para detectar dichas resistencias. La metodología de trabajo se centró en el muestreo de animales de compañía con el fin de aislar e identificar la presencia de S. aureus y S. intermedius/ pseudointermedius. Estos aislamientos se completaron con la determinación de los patrones fenotípicos de resistencia a los antibióticos de mayor interés en medicina humana y veterinaria, mediante los test de Difusión en disco de Kirby Bauer (KB) y la determinación de las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMIs). También se caracterizaron los patrones de resistencia a –lactámicos, mediante el test de aglutinación para la proteína PBP2a (específica de cepas resistentes a aquellos antibióticos). Finalmente, aquellas cepas con patrones de resistencia fenotípica que suponían un riesgo para la Salud Pública, se tipificaron genéticamente por PCR a través de la detección directa del gen mec- A. El estudio se concluyó con la determinación de la fiabilidad de las pruebas utilizadas mediante los parámetros de sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivo y negativo, de los test. El grado de acuerdo entre las pruebas se definió mediante el valor Kappa.
5 Se muestrearon un total de 135 animales, de los cuales, las especies más representadas fueron perros (71,85%), y caballos (14,81%). De las cepas identificadas, un 23,93% fueron S. aureus y un 76,06% S. intermedius/ pseudointermedius. La prevalencia de cepas de S. intermedius/ pseudointermedius fue muy elevada, mientras que en caballos, fue S. aureus el que presenta la prevalencia más alta. Los test de KB, pusieron de manifiesto, que un alto porcentaje de cepas de estafilococos presentaron resistencias a la estreptomicina (90- 100%), y un bajo porcentaje a las quinolonas (10- 25%). Se mostraron altos porcentajes de cepas resistentes a βlactámicos en S. aureus. S. intermedius/ pseudointermedius, evidenciaron bajos porcentajes de resistencias a βlactámicos tales como meticilina (16,36%), oxacilina (14,55%), y cefoxitina (1,82%). Mediante la determinación de las CMIs se observó que un 50% de los S. aureus, eran resistentes a penicilina, en contraste con el 0% de resistencia a vancomicina, distribución prácticamente similar a lo observado en S. intermedius/ pseudointermedius. Las proporciones de resistencia para oxacilina y amoxicilina fueron más bajas; resultados estos, que no coincidían con los obtenidos mediante el Test de KB. Un alto porcentaje de cepas fueron positivas a la presencia de la proteína PBP2a, siendo ese porcentaje similar en S. aureus (43,75%) y en S. intermedius/pseudointermedius (38,18%). Las cepas consideradas de riesgo para la Salud Pública y analizadas por PCR fueron principalmente S. intermedius/ pseudointermedius (20), estas en su mayoría fueron negativas a la presencia del gen mec- A (13) y procedentes de aislamientos de perros; de las cepas de S. aureus aisladas (8), prácticamente todas fueron positivas a la presencia de dicho gen (7). Considerando que estos son microorganismos potencialmente zoonóticos, es posible el intercambio de cepas, incluidas las resistentes a antibióticos, entre animales y personas, siendo las personas en contacto con estos animales (veterinarios, cuidadores y propietarios) el primer eslabón en la cadena de difusión del patógeno en la comunidad, pero no el único, ya que el carácter ubicuitario de Staphylococcus, le permite su persistencia en el medio. La difusión de resistencias puede comprometer las opciones terapéuticas frente a este patógeno, y favorecer la adaptación de estas bacterias en otros hospedadores, dando lugar a la aparición de nuevas enfermedades.
6 Finalmente, los resultados del estudio ponen en evidencia, la escasa fiabilidad y grado de concordancia, de la que gozan los diferentes métodos de detección de resistencia a antibióticos utilizados habitualmente, sobre todo en el caso de S. intermedius/ pseudointermedius, hecho que complica la eficacia del tratamiento de este patógeno, así como el control de sus prevalencias por los Sistemas de Vigilancia. Palabras clave: Salud Pública, Sanidad Animal, Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, resistencia, antibiótico, diagnóstico, fiabilidad.
7 INTRODUCCIÓN: 1. El concepto de Salud Global “One world, one health” y las enfermedades emergentes: A lo largo de las últimas décadas, se ha observado un incremento en la emergencia de enfermedades de naturaleza infecciosa y parasitaria a nivel mundial. La Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), las denomina enfermedades emergentes y las define, como nuevas infecciones, resultado de la evolución o modificación de un agente patógeno o parásito existente, que cambia de espectro de hospedadores, vector, patogenicidad o cepa; también incluyen las infecciones o enfermedades desconocidas hasta el momento de su aparición (enfermedad reemergente). A su vez, la enfermedad reemergente es definida, como una infección conocida que, o bien cambia de ubicación geográfica, amplía su espectro de hospedadores o su prevalencia aumenta considerablemente. Si tenemos en cuenta, que las enfermedades infecciosas son la tercera causa de mortalidad en el mundo, es evidente que estas enfermedades, constituyen un gran problema para la humanidad y un desafío para los sanitarios. (EASAC, 2008). Fenómenos como la migración de poblaciones, tanto humanas como animales, favorecen el desarrollo de dichas enfermedades; pero esta, no sería la única causa de aparición de enfermedades emergentes. Los expertos, coinciden en la existencia de una correlación entre factores, que predisponen su aparición, como son en el caso de las enfermedades animales: los nuevos sistemas de producción animal, la influencia humana sobre el medio ambiente y el cambio climático (OIE, 2010). Desde la perspectiva de la Salud Pública, también es importante, el papel que juegan la globalización y las desigualdades existentes en recursos sanitarios entre los países, puesto que la aparición de una nueva enfermedad, no se va a abordar de la misma forma, en países desarrollados que en subdesarrollados. Los factores anteriormente citados, van a crear nuevas condiciones para la difusión de los microorganismos (no hay que olvidar, que las bacterias, presentan una capacidad de adaptación, mucho mayor que la humana o animal). Algunos de estos microorganismos causantes de enfermedades emergentes, pueden ser patógenos, tanto para el hombre como para los animales; aunque también saprófitos o comensales del medio o de los animales, que si bien no producen de forma habitual enfermedad en estos últimos, si pueden ser patógenos para el hombre.
8 Una parte muy importante de las enfermedades emergentes detectadas en los últimos diez años, son zoonosis con un origen animal (en torno al 75% según la OIE). La Organización Mundial de la Salud (OMS), define a las zoonosis, como aquellas enfermedades que se transmiten de forma natural de los animales vertebrados al hombre y viceversa. La globalización, está aumentando el riesgo de aparición de zoonosis nuevas, y la lucha frente a ellas es fundamental, debido al gran impacto que estas tienen en Salud Pública. Estos aspectos, nos hacen reflexionar, sobre la necesidad de trabajar en sanidad con una perspectiva global (humana, animal, ambiental), tal y como sugiere la filosofía sanitaria “One World, one Health” (FAO, 2008). Esta corriente, aboga por un marco estratégico para reducir los riesgos derivados de las enfermedades infecciosas en la interfaz entre humanos, animales y ambiente, y que promueve, la actuación conjunta de profesionales de medicina humana, Salud Pública, salud Animal y ambiental. 2. Relación entre las enfermedades emergentes y la resistencia a antibióticos: Entre las enfermedades infecciosas de carácter emergente, han adquirido gran importancia en los últimos años, las causadas por cepas de microorganismos resistentes a antibióticos, tanto en medicina humana, como en sanidad animal. Por esta razón, la resistencia a los antibióticos, está considerada como uno de los problemas emergentes de mayor impacto en el siglo XXI por la OMS (OMS, 2012). La resistencia a los antibióticos, es definida como el fenómeno por el cual un microorganismo, deja de verse afectado por un antibiótico, al que anteriormente era sensible. En general, hay que considerar que los microorganismos resistentes (entre ellos las bacterias, los virus y algunos parásitos), han perdido su sensibilidad a los efectos de los antimicrobianos, como los antibióticos, los antivíricos o los antipalúdicos, de modo que los tratamientos habituales se vuelven ineficaces y las infecciones persisten y pueden transmitirse a otras poblaciones contiguas, entre ellas las personas (OMS, 2012). Entre las causas de aparición de la resistencia a antibióticos, está el uso inadecuado y abusivo de los antibióticos, que favorece la aparición y diseminación de los microorganismos resistentes (mala adherencia del paciente al tratamiento, mala prescripción o mala calidad del medicamento prescrito), tanto en medicina humana
9 como en medicina veterinaria. Estos hechos, predisponen a que surjan mutaciones de los microorganismos o adquisiciones de genes de resistencia, que son finalmente los responsables de este problema (OMS, 2012). La relevancia de este fenómeno, radica en las consecuencias que acarrea, y que se resumen en seis puntos, según la OMS: La resistencia a los antibióticos mata: Las infecciones por microorganismos resistentes no responden a los tratamientos habituales, lo cual prolonga la duración de la enfermedad y aumenta el riesgo de muerte. Pone en peligro el control de las enfermedades infecciosas: se reduce la eficacia del tratamiento, con lo que los enfermos persisten infectados por más tiempo, hecho que a su vez propicia la propagación de los microorganismos resistentes a otras personas o animales. Amenaza con hacer retroceder a la humanidad a la época anterior al descubrimiento de los antibióticos: Existe el riesgo de que muchas enfermedades infecciosas se vuelvan intratables, lo cual podría echar por tierra lo que se ha conseguido para cumplir los Objetivos de Desarrollo del Milenio relacionados con la salud para el año 2015. Encarece la asistencia médica: Cuando las infecciones dejan de responder a los medicamentos de primera línea, hay que recurrir a productos más caros. La prolongación de la enfermedad y del tratamiento, a menudo en hospitales, también aumenta los costos asistenciales y la carga económica sobre las familias y la sociedad. Pone en riesgo los logros de la sociedad en materia de asistencia sanitaria: hace peligrar los adelantos de la medicina moderna. En ausencia de antimicrobianos eficaces para el tratamiento y la prevención se pondría en peligro el éxito de tratamientos como el trasplante de órganos, la quimioterapia antineoplásica o las grandes intervenciones quirúrgicas. Afecta a la seguridad sanitaria y perjudica el comercio y las economías. El aumento del comercio y los viajes internacionales permite que los microorganismos resistentes se propaguen rápidamente a países y continentes lejanos. Hoy en día, la resistencia a los antibióticos, está teniendo un impacto importante en la sanidad mundial, por sus repercusiones sanitarias. Cuando hablamos de datos, este problema afecta cada vez a más enfermedades: tuberculosis
16 Por tanto, los fenómenos de resistencia a los antibióticos, pueden deberse a (Gimeno y Ortega, 2005): Falta de especificidad por el antibiótico (al antibiótico no alcanza su objetivo, es inactivado…) Mutaciones esporádicas del agente en un determinado momento. Adquisición de DNA que codifica la resistencia a los antibióticos. Las características de resistencia y sensibilidad a los antibióticos de las cepas bacterianas, es lo que se conoce como “fenotipo de resistencias” o “patrón de resistencias”. Como se ha comentado anteriormente, la aparición de resistencia a antibióticos, y la posibilidad de su transmisión, es un hecho que no sólo afecta a los grupos de población localizados más o menos próximos, sino que es un problema universal, desde el momento en que la globalización ha afectado a las poblaciones animales; la posibilidad de realizar grandes desplazamientos de animales, en breves periodos de tiempo, también hacen posible la difusión de esos microorganismos resistentes a antibióticos a grandes distancias. Por ello, conocer profundamente cómo funcionan los mecanismos de adquisición y transmisión de resistencias, es fundamental para decidir cómo actuar correctamente. f) Mecanismos de resistencia a antibióticos: A priori, el fenómeno de la resistencia a los antibióticos, es un fenómeno natural, que puede ser amplificado o acelerado por varios factores, dentro de los que se incluye la acción humana. El uso de los antibióticos, constituye de una manera u otra, una intervención genética en los seres vivos más abundantes del planeta: las bacterias. La aplicación a gran escala de los antibióticos, conlleva una presión selectiva, que favorece la desaparición de las cepas sensibles y la proliferación de cepas bacterianas con mecanismos de resistencia. Se ha demostrado, que los antibióticos, son capaces de seleccionar los mutantes resistentes espontáneos, que surgen en la población bacteriana. El fármaco, inhibe o mata las bacterias sensibles, pero no afecta a los individuos que por mutación espontánea, o por transmisión genética desde otras bacterias donantes, han adquirido un alelo resistente, en consecuencia, estas bacterias se multiplican, de modo que al final son los más prevalentes.
17 Para que se produzca la resistencia, hacen falta dos condiciones (Gimeno y Ortega, 2005): Un contacto persistente y estrecho del microorganismo con el antibiótico. Dicho contacto tiene que realizarse a una concentración de antibiótico que permita la supervivencia del microorganismo. Los mecanismos de resistencia bacterianos más frecuentes, son los relacionados con los fenómenos que afectan a la pared celular, que además presentarán base genética. Además, cuando una bacteria presenta un alto grado de resistencia, se debe probablemente a la coexistencia en la misma, de varios mecanismos de resistencia. Desde el punto de vista genético, hay dos mecanismos principales encargados de proporcionar dicha resistencia (Gimeno y Ortega, 2005): Mutación de un gen existente: mediante el cual se produce una transmisión de la resistencia en las sucesivas divisiones celulares (Transmisión vertical). Adquisición de un nuevo gen, que va a conferir resistencia a partir de otras bacterias: la transmisión se produce entre una bacteria donante a una receptora a través de un plásmido (moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico), que lo transporta (transmisión horizontal). En el primer caso, la mutación se produce en la población en contacto con el antibiótico, mientras que en el segundo caso, será necesaria una primera bacteria con un gen de resistencia a un antibiótico, que realizará el papel de “donante” del gen de la resistencia, y una segunda bacteria “receptora” de ese gen. En este último caso, es dónde tienen una mayor importancia los microorganismos saprófitos o comensales. La adquisición de los nuevos genes de resistencia a antibióticos, puede producirse de tres formas (Gimeno y Ortega, 2005): Transducción: cuando un virus bacteriano o bacteriófago, actúa como vector del ADN de una bacteria donante a otra receptora. Conjugación: cuando las células bacterianas se ponen en contacto, y hay transmisión directa de ADN de una bacteria donante a una receptora.
18 Transformación: cuando la bacteria receptora incorpora ADN extracelular procedente de una bacteria donante. El origen de esos genes de resistencia a antibióticos, no está claro hoy en día; pero se piensa que pudiera estar, en las bacterias productoras de los propios antibióticos que utilizarían estos mecanismos de resistencia, para sobrevivir a su propia producción de antibióticos. Este hecho sugiere, que para que se transmitan genes de resistencia, debe darse un nicho ecológico adecuado, es decir, que exista un punto en concreto y simultáneamente una población de bacterias, de diferentes especies, y que tengan un contacto con el antibiótico a dosis no letales para las bacterias. Como ejemplo más claro, está el de las bacterias del aparato digestivo, lugar que constituye en sí mismo en un nicho ecológico de bacterias que además son necesarias de forma permanente allí, y por dónde pasan la gran mayoría de los antibióticos utilizados, tanto en el hombre, como en los animales (la vía oral es la vía de administración más utilizada). Los estudios de patrones de resistencia realizados hasta el momento, parecen indicar, que el mecanismo de adquisición de resistencia a antibióticos por mutaciones genéticas es poco frecuente, siendo la adquisición de nuevos genes de resistencia a través del contacto entre bacterias resistentes donantes y bacterias susceptibles receptoras el principal mecanismo, lo que en definitiva, vuelve a incidir en la importancia de los agentes saprófitos y comensales como vehículos de transmisión de resistencias. 4. Staphylococus aureus y otros Staphylococcus spp: a) Características microbiológicas, patogenididad y factores de virulencia: Desde un punto de vista microbiológico, el género Staphylococcus se clasifica, junto con los géneros Micrococcus, Stomatococcus y Planococcus, dentro de la familia Micrococcaceae. Se caracterizan por ser cocos Grampositivos, catalasa positivos, oxidasas negativos y no esporulados. Tienen un tamaño que va de 0,5-1,5µm de diámetro; en los crecimientos, se presentan aislados, por parejas o tétradas, formando racimos irregulares. Son aerobios o anaerobios facultativos (crecen con oxígeno en el aire, pero también con concentraciones bajas del mismo), que se encuentran
19 colonizando de forma habitual, la superficie de los seres vivos, sin que necesariamente sean patógenos para estos (Modric, 2011; Prescott, 1999) Otras características, son su crecimiento en condiciones de termofilia (puede llegar a crecer a 50ºC, siendo su óptimo 37ºC), su halofilia o capacidad para crecer con altas concentraciones de sal, y su crecimiento en ambientes secos (Modric, 2011). Cuando hablamos de Staphylococcus aureus, podemos decir que presenta un alto grado de patogenicidad, conferido por diferentes factores de virulencia; estos, son los encargados de producir una gran variedad de proteínas, que contribuyen a su capacidad para colonizar y causar enfermedades, tanto en el hombre como en los animales (Bustos-Martínez et al., 2006). En el CUADRO- 1 se muestra una clasificación de los factores de virulencia de S. aureus, teniendo en cuenta si forman parte estructural de la bacteria o si son enzimas o toxinas: CUADRO- 1: Principales factores de virulencia de S. aureus Fuente: Bustos- Martínez et al., 2005. Los factores de virulencia, participan en la adhesión y adquisición de nutrientes para el microorganismo y sirven también para evadir la respuesta inmune del huésped. En base a esto los factores se han clasificado en tres categorías (Bustos-Martínez et al., 2006): o Los involucrados en la adherencia a la célula huésped o matriz extracelular, como las proteínas de unión a fibrinógeno, fibronectina, colágeno y coagulasa.
20 o Aquellos que están involucrados en la evasión de las defensas del huésped, como las enterotoxinas estafilocócicas; la TSST-1, la leucocidina de Panton-Valentine (PVL), proteína A, lipasas, y polisacáridos capsulares. o Los involucrados en la invasión de la célula huésped y penetración de los tejidos, como la toxina α, hemolisinas β, γ y δ. Casi todas las cepas de S. aureus, producen un grupo de enzimas y citotoxinas. La función principal de estas proteínas puede ser la de ayudar a degradar los tejidos locales del huésped para convertirlos en nutrientes para las bacterias. Una de ellas, la coagulasa, nos va a permitir diferenciar a S. aureus (coagulasa positivo) de otras especies estafilocócicas (coagulasa negativas). La importancia de la coagulasa en la patogenia de la enfermedad, radica en que esta enzima causa la formación de una capa de fibrina alrededor del absceso estafilocócico, localizando la infección y protegiendo a la bacteria de la fagocitosis (Bustos- Martínez et al., 2006). Algunas cepas, producen proteínas adicionales como la toxina 1 del síndrome del shock tóxico (TSST-1), las enterotoxinas estafilocócicas (SE), las toxinas exfoliativas (ETA y ETB) y la leucocidina. Vamos a desarrollar alguno de ellos (Bustos- Martínez et al., 2006): o Las enterotoxinas estafilocócicas, forman parte del grupo de toxinas conocidas como superantígenos toxina pirogénicos (PTSAgs), ya que tienen la habilidad de estimular la proliferación de linfocitos T sin tener en cuenta la especificidad antigénica de estas células Son las toxinas causantes de toxiinfecciones alimentarias por S. aureus. o Otra de las toxinas interesantes, son las Toxinas 1, responsables de producir el shock tóxico, a través de la supresión de la quimiotaxis de los neutrófilos, de la acción de los linfocitos T, y del bloqueo del sistema reticuloendotelial. o La leucocidina de Panton-Valentine (PVL) es una citotoxina detectada en cepas humanas principalmente (Morgan, 2008), que produce la destrucción de los leucocitos y necrosis tisular. La lisis de esos leucocitos, produce la liberación de mediadores de la inflamación, con una consecuente respuesta inflamatoria grave.
21 Ocurre en menos del 5% de las cepas de S. aureus, y suele estar asociada a las cepas de MRSA adquiridas en la comunidad (CAMRSA) (Hanselman et al., 2006; Rankin et al., 2005), ausentándose en cepas MRSA hospitalarias (Pantosti, 2012). b) El problema de la resistencia a los antibióticos en estos microorganismos: Entre los diferentes estafilococos con resistencia a los antibióticos, destaca S. aureus, por ser una de las principales bacterias, que hoy en día se incluyen en las listas de microorganismos clave en la resistencia a antibióticos, especialmente en medicina humana, ya que el hombre es su principal reservorio y hospedador. Este hecho, se sustenta en la necesidad de S. aureus de nutrirse a base del hierro localizado en la hemoglobina, el cual adquiere a través de uno de sus factores de virulencia, la hemolisina, y los receptores bacterianos para la hemoglobina, tienen más afinidad por la humana que por la de otras especies (Pantosti, 2012). Dentro de las resistencias de este microorganismo, destaca su resistencia a los β-lactámicos del grupo de las penicilinas; especialmente a penicilinas semisintéticas como la meticilina (MRSA) y la oxacilina, a las cefalosporinas, a los carbapenems (Rubin y Chirino, 2011), y a glicopéptidos como la Vancomicina (S. aureus resistente a vancomicina o VRSA), antibiótico utilizado actualmente frente a las cepas MRSA (Kobayashi et al., 2012; Wertheim et al., 2005; Van Vuuren, 2001). A priori, hay que indicar que las cepas MRSA y VRSA, no son más peligrosas o virulentas, que otras variedades de S. aureus no resistentes a esos antibióticos; el problema principal, radica en que estos implican una mayor dificultad de tratamiento. Las primeras situaciones de emergencia a meticilina en S. aureus, se detectaron en personas de Inglaterra entre 1960-1961, justo dos años después de la introducción de la meticilina como tratamiento (Kobayashi et al, 2012; Tokateloff et al., 2009; Wertheim, 2005); una década después se reportó MRSA como agente infeccioso en animales, en Asia, Norte América y Europa, caracterizándose como un importante patógeno nosocomial (Walther et al., 2008) (Tabla- 1). Desde su aparición, la prevalencia ha ido aumentando progresivamente, así como su distribución a nivel mundial.
22 TABLA- 1: Listado de principales eventos históricos en el estudio de S. aureus Fuente: Wertheim et al., 2005 Actualmente, en Europa, se ha observado que la prevalencia de MRSA es más elevada en los países del Sur (Italia, Portugal, Malta, España), que en los del Norte (sobre todo los nórdicos). (ECDC, 2010; Pantosti, 2012). Algunos países industrializados de Europa, han visto incrementado de forma dramática, el número de cepas resistentes a meticilina; por ejemplo, el Reino Unido, ha pasado de un 5% de cepas resistentes en 1992, a un 50% en 2002 (Catry et al., 2012). (Figura- 1): FIGURA- 1: S. aureus: proporción de MRSA en el año 2009. Fuente: ECDC, 2010.
23 En España, algunos trabajos realizados en entornos hospitalarios, indican un aumento progresivo de la prevalencia de cepas MRSA, habiendo pasado del 1,5% de los aislamientos de S. aureus en el año 1986 a un 17,9% en 1996, lo que ponía desde el principio a nuestro país en valores que se consideran de los más altos de Europa, junto con los de Italia y Francia (Voss et al ,1994); país este último, donde ya en 1998 se consideraba que un 40% de las cepas aisladas eran resistentes a meticilina, pero además, la mayoría de ellas, también poseían a la vez resistencia a tobramicina, amikacina, neomicina y kanamicina, siendo variable para la gentamicina (Lemaître et al., 1998). c) S. aureus resistente a meticilina (MRSA): Los MRSA, están considerados como el principal problema emergente de tipo nosocomial en medicina humana, y ya se destaca con la misma importancia en las poblaciones animales, especialmente en perros y caballos, donde la prevalencia de estos microorganismos con resistencia es cada vez mayor. La aparición de MRSA y a otros antibióticos, no sólo tiene efectos sanitarios, sino que también son considerables las pérdidas económicas que producen sus brotes de enfermedad; se ha estimado en 350 millones de euros anuales el coste de los brotes de MRSA en Alemania (Wertheim et al., 2005; Wernitz, 2005 en EASAC 2007). En un principio, la presencia de este microorganismo, es rara en animales de compañía, no aislándose en gatos sanos, tomando valores de entre 0-2,1% en perros (llegando al 9% en perreras), y del 0-11% en caballos. Es interesante destacar, que las cepas aisladas en caballos, a diferencia de las aisladas en mascotas, son cepas MRSA bastante distintas a las cepas humanas aisladas predominantemente en la zona (Pantosti, 2012). El origen de esas infecciones con cepas MRSA, no está claro, pero los aislamientos obtenidos de gatos y perros parecen MRSA nosocomiales, y es normal asumir que los animales de compañía adquieren MRSA de los humanos (humanosis), aunque también, se han aislado en personas cepas atípicas, que muy probablemente tengan su origen en animales. Esta situación, se ha presentado con cierta frecuencia en caballos, dónde además parece que el contacto habitual con poblaciones grandes de animales (mayor de 20 caballos), es un factor de riesgo para el hombre (Catry et al., 2010).
24 Pero no sólo los animales de compañía, actúan como reservorios de cepas de MRSA; también los animales de abasto (fundamentalmente cerdos y vacas), suponen un reservorio importante del mismo, pero a diferencia de las cepas de MRSA aisladas en animales de compañía, las cepas detectadas en estos, parecen ser clones adaptados a los animales (Pantosti, 2012). Dentro de los animales de abasto, hay que hacer mención especial al caso del cerdo, ya que se han puesto de manifiesto niveles de infección elevadas con la cepa MRSA ST398 (en Holanda se considera que el 40% de los cerdos están colonizados con cepas MRSA y también se han descrito casos en Bélgica, Dinamarca, Alemania, España y Canadá) (Pantosti, 2012). Las bacterias del género Staphylococcus, son patógenas oportunistas y ubicuitarias, por lo que podemos encontrarlas también en el medio ambiente. En el caso concreto de MRSA, el papel del ambiente en su difusión no está claro. Si bien el microorganismo se localiza naturalmente en los seres vivos, parece claro que en determinados momentos, puede encontrarse en el medio, especialmente en material que ha estado en contacto con seres vivos infectados, y a partir de allí, puede pasar a otros seres vivos no infectados, actuando el ambiente como vehículo del microorganismo. En algunas superficies contaminadas, esta bacteria puede persistir infectante durante días, e incluso excepcionalmente meses dependiendo de factores como temperatura, humedad o presencia de materia orgánica. La mayoría de los estafilococos, suelen localizarse en piel, mucosas y vías respiratorias altas, sin producir ninguna patología, tanto en animales como en personas. En función del grado de interacción entre S. aureus y su hospedador, pueden producirse distintas situaciones o estados: infección (por contacto directo con la piel de un individuo sano, que ha sufrido una solución de continuidad o con material contaminado que alcanza mucosas como la digestiva o la nasal), contaminación (presencia transitoria de S. aureus en el individuo) o colonización (presencia permanente de S. aureus en el individuo), estado este último, que con mayor frecuencia se da, tanto en animales como en personas (Pantosti, 2012). Su transmisión, se va a producir a través del contacto directo de piel con piel, por el contacto de heridas abiertas, en cirugías, por hacinamiento, contacto con artículos o superficies contaminadas y por la falta de higiene. En las personas, suele localizarse de forma habitual en la piel y en las vías respiratorias altas, sin producir ningún tipo de patología, dando lugar al estado de portador. Se considera que entre el 25 y el 50% de las personas son portadoras asintomáticas de S. aureus, bien de forma transitoria o permanente (Wertheim et al,
25 2005). En algunos casos, puede ocasionar cuadros cutáneos de moderados a severos y excepcionalmente infecciones sistémicas más graves (infecciones óseas, neumonías o septicemias que pueden evolucionar a endocarditis o meningitis). En los animales de compañía (perros, gatos y caballos), son habituales tanto S. aureus (se considera que es comensal y patógeno oportunista) (Burton et al, 2008), como S. intermedius/ pseudointermedius (Hanselman et al., 2008). Este último microorganismo, es el Staphylococcus coagulasa positivo predominante en la piel sana de perros y gatos. Se piensa, que es el agente causal más común de pioderma y otitis externa en la especie canina (Bannoehr et al., 2008; Onuma et al., 2011), aunque en ocasiones, también puede originar procesos patológicos más graves, que abarcan desde bacteriemia a neumonía. Como el resto de los estafilococos, también tiene la capacidad de desarrollar resistencia a antibióticos, tales como penicilinas, fluoroquinolonas, tetraciclinas y macrólidos (Jong- Hyung et al., 2009; Onuma et al, 2011). Los MRSA en estos animales de compañía, producen también lesiones en piel y en tejidos blandos (especialmente tras una cirugía). Cuando hablamos de la especie equina, podemos encontrarlos produciendo bacteriemia, artritis séptica, osteomielitis, infecciones debidas a implantes, metritis, onfalitis, infecciones debidas a cateterización y neumonía (Morgan, 2008). Además, S. aureus, y consecuentemente MRSA, es un patógeno importante en animales de abasto, principalmente en el ganado porcino y bovino, con las implicaciones económicas que eso supone. Las patologías que pueden encontrarse en las granjas, debidas a este patógeno son entre otras: mamitis (en el ganado vacuno es el agente causal más importante de mamitis) (Pantosti, 2012), lesiones en aparato locomotor, pododermatitis, así como infecciones tanto de piel como de tejidos blandos. La presencia de este microorganismo en granjas, da una idea de su presencia en los animales; en un estudio realizado en granjas de cerdos de 17 países Europeos, se han encontrado cepas de MRSA, con una prevalencia que varía entre países que va del 1 al 50%, en función de la densidad de la granja (Morgan, 2008; Pantosti, 2012). Por último, hay que hablar de los MRSA transmitidos por alimentos. La contaminación de productos alimentarios, con MRSA procedente de animales, se considera como un gran desafío, debido a su potencial papel como diseminador de esté patógeno en toda la población. Se han realizado diferentes estudios a nivel europeo, donde se encontró una prevalencia del 11-12% de MRSA, en muestras de carne cruda procedentes de cerdo, ternera, cordero y pollo (Pantosti, 2012; Scott Weese et al., 2010). En América, se han encontrado aislamientos de MRSA en el 5,6%
32 Estos genes localizados en los MGEs, son menos comunes en aislamientos de S. aureus de animales que de personas, no existiendo mucha variación de MGEs dentro de cada clon. Además, se evidenció el intercambio de genes a través de bacteriófagos o transposones entre clones humanos y animales, pero hay una menor evidencia de que los genes que transmiten resistencia a antibióticos, se transfieran en el SCCmec o en los plásmidos, si bien hay estudios más antiguos, donde se habían identificado plásmidos de S aureus humano en S. intermedius de perros (Schwarz et al, 1998), incluso a nivel laboratorial se ha demostrado la transferencia horizontal de plásmidos con resistencia a vancomicina de VRSA a MRSA (Kobayashi et al., 2012). Sorprendentemente, las líneas animales están cercanas a las humanas y sólo un puñado de genes o combinaciones de genes pueden ser responsables de la especificidad de hospedador (Sung et al., 2008). Algunos estudios epidemiológicos, que incluyen la secuenciación genética de cepas MRSA aislados en animales, indican que las cepas de perros y gatos son indiferenciables de las cepas humanas, lo que sugiere que ambas especies compartirían esas cepas, y que tienen el mismo origen, posiblemente humano, algo que no ocurre entre las cepas de animales (Leonard y Markey, 2007). Lo mismo ocurre con la especie equina, dónde se han encontrado coincidencias importantes con cepas humanas, que sugiere un mismo origen (De Martino et al., 2012; Sung et al., 2008). 5. Falta de concordancia en la valoración de la resistencia a antibióticos: Otro problema añadido a la existencia de microorganismos resistentes a antibióticos, es la falta de acuerdo a la hora de estandarizar los protocolos de diagnóstico de resistencias, y sobre todo, la interpretación de los mismos. Al no existir un criterio común (para lo que unos es resistencia, para otros es sensibilidad, en función del método o criterio de interpretación utilizado), se genera en muchas ocasiones, un conflicto en la toma de decisiones sobre los tratamientos, se inducen fallos de los mismos y/ o se alteran las valoraciones de riesgos existentes para el hombre desde la perspectiva de la Salud Pública (Franklin et al, 2003; Rahbar, 2005). Por ello, la correcta valoración de la existencia de bacterias con resistencia a antibióticos, especialmente a aquellos de uso específico para su tratamiento, resulta ser una de las piezas angulares, en la resolución de los problemas en Medicina Preventiva.
33 Una vez conocida la trascendencia que tienen en la actualidad las cepas MRSA en medicina humana, así como el papel de otros Staphylococcus coagulasa positivo (S. intermedius/ pseudointermedius), de origen animal, se hace necesario conocer mucho más a fondo, la importancia de estas cepas en el entorno animal, su relación con las infecciones por estas bacterias en personas, así como también es necesario verificar la capacidad de detección de las mismas, tanto a nivel laboratorial como en condiciones de campo. Pero para ello, es necesario que los protocolos de detección de resistencia sean suficientemente fiables, máxime cuando tienen repercusiones en Salud Pública. De este hecho depende, en gran medida, la calidad de las medidas de lucha y las evaluaciones de riesgo que supone, para la salud pública, la presencia de estos microorganismos en animales de compañía. Por ello, para poder abordar correctamente el problema de las resistencias, uno de los aspectos prioritarios a resolver en la actualidad, es la “estandarización” de los protocolos de diagnóstico y valoración de las resistencias, tanto fenotípica como genotípicamente, con el fin de disponer de datos fiables y comparables en los diferentes contextos, en donde se puedan ir desarrollando brotes de enfermedades, asociadas a microorganismos con resistencia a antibióticos. 6. Bases de la lucha frente a la resistencia a antibióticos: La resistencia bacteriana es en Europa y en el mundo, es un grave problema de la sociedad, que atañe a muy diversos sectores, como los de la medicina, la veterinaria, la cría de animales, la agricultura, el medio ambiente y el comercio. Para hacer frente a este problema, es necesaria la colaboración conjunta de todos ellos. Tanto los alimentos, como el contacto directo con los animales o indirectamente a través del medio, pueden desempeñar un papel clave en la transmisión zoonótica de la resistencia, lo que subraya el nexo entre la medicina y la veterinaria, como resalta la iniciativa “One world, one health”. Prueba de que estamos ante un problema serio para la Sanidad Global (humana y veterinaria), son los resultados de una encuesta realizada recientemente por la OIE, que ha evidenciado que el 64% de los países encuestados, reconocen tener resistencia a los antibióticos en bacterias, que pueden compartir los hombres y los animales, especialmente en microorganismos como Salmonella spp., Campylobacter spp., Staphylococcus spp. o E. coli (todos ellos pueden causar graves
34 enfermedades en el hombre, debido en gran medida a su carácter zoonótico) (OIE, 2003). Al hecho del riesgo que supone para la Salud Pública, la existencia de bacterias de origen animal resistentes, se suma el que, una vez aparecida la resistencia, pasa a ser un fenómeno persistente a largo plazo, es decir, se prolonga en el tiempo, incluso una vez que ha cesado el contacto con el antibiótico. La clave del éxito en la lucha contra la resistencia a los antibióticos, según la Comisión Europea, consiste en establecer un planteamiento integrado, que además pueda explotar las nuevas oportunidades que ofrece la investigación genómica. Este organismo, ha creado un “Plan de acción contra la amenaza creciente de las resistencias bacterianas”, en Noviembre de 2011, basado en la colaboración conjunta, de todas las personas que trabajan en Salud Pública. Son 4 los puntos abordados en este Plan de acción: a) Uso racional de los antibióticos: La iniciativa denominada uso racional o uso apropiado y responsable de los antibióticos está considerada actualmente, como un punto esencial para reducir y prevenir la resistencia bacteriana, y la base para luchar contra ella, tanto en medicina veterinaria como en medicina humana. Sólo hay que emplear antibióticos cuando sea necesario, y de una forma correcta, puesto que una vez que han aparecido las resistencias, la reversión al estado de sensibilidad a los mismos, es un proceso muy lento. La EASAC, además de este uso racional, sugiere otra estrategia, la del establecimiento de programas de vigilancia de dichas resistencias (EASAC, 2007). Una vez considerada la importancia de esas dos estrategias, es necesario comprender los mecanismos de adquisición y transmisión de resistencia a los microorganismos en cada situación, así como la ecología y la dinámica de esos microorganismos en sus hospedadores y en el medio, es decir, conocer la influencia de la relación agente, hospedador y medio en el desarrollo de las resistencias (EASAC, 2007). Pero además, la efectividad de esos planes de vigilancia de resistencias, dependerá de que se contemplen, no sólo los microorganismos patógenos con resistencia adquirida, sino también aquellos microorganismos saprófitos y comensales que pueden desempeñar algún papel importante en el mantenimiento y la transmisión de la resistencia a otras bacterias, que sí pueden ser altamente patógenas.
35 A este nivel, otro de los puntos en los que se hace hincapié, es el de desarrollar un método de análisis de riesgos para poder evaluar y gestionar las medidas encaminadas a reducir el impacto de la resistencia a antibióticos de origen animal en Salud Pública (Van Vuuren, 2001). La vigilancia y el análisis de riesgos de resistencias deben prestar especial atención a las cepas MRSA y VRSA de poblaciones animales que están en contacto permanente con personas, y al uso de antibióticos en estas poblaciones, ya que de ello depende, en gran medida evitar su paso posterior al hombre. Por supuesto, conseguir estos objetivos ligados al uso prudente de los antibióticos, implica desarrollar programas de formación y educación, tanto a nivel profesional (médicos, veterinarios, farmacéuticos), como a nivel social. Cuando se habla del uso responsable de los antibióticos para reducir las resistencias, en medicina humana, es muy importante la colaboración estrecha entre médicos y farmacéuticos, que serán los responsables de fomentar ese comportamiento entre los pacientes; mientras que en medicina veterinaria, también se han establecido mecanismos de cooperación entre las partes interesadas (la industria de Sanidad Animal, veterinarios, propietarios de animales de compañía y ganaderos). Un último aspecto, no menos importante, considerado en la lucha frente a las resistencias a antibióticos, es la creación de protocolos estandarizados de diagnóstico, así como el diseño de nuevas herramientas de diagnóstico, que sean precisas, eficaces a la vez que factibles y de rápida realización. Aunque, también es cierto, que siempre que tenemos un resultado laboratorial, habría que realizarse una pregunta: ¿el hecho de que la bacteria responsable de la enfermedad resulte sensible a un determinado antibiótico “in vitro”, implica que el ser vivo tratado se vaya a curar? Siempre deberemos estar preparados para que la respuesta a la misma sea NO NECESARIAMENTE, ya que la respuesta “in vivo” puede no coincidir con el resultado de laboratorio. La estrategia “uso racional de los antibióticos” en veterinaria, plantea los siguientes objetivos (Gimeno y Ortega, 2005) 1. Mantener la eficacia de los agentes antimicrobianos y asegurar el uso racional de estos, con el propósito de asegurar su eficacia y seguridad en los animales. 2. Mantener a los animales en buen estado sanitario de acuerdo a las necesidades económicas y las obligaciones éticas.
36 3. Prevenir o reducir, tanto como sea posible, las transmisiones bacterianas entre poblaciones animales, 4. Prevenir o reducir la transmisión de bacterias de animales a humanos. 5. Prevenir la contaminación de alimentos de origen animal con residuos de antimicrobianos. 6. Proteger la salud de los consumidores, garantizando la seguridad de los alimentos de origen animal destinados al consumo humano. Ante la elección de un antibiótico, hay que plantearse primero si está realmente indicado el uso del antibiótico. Si la respuesta es afirmativa, los pasos a seguir son los siguientes (Gimeno y Ortega, 2005): 1. Localización de lugar dónde se ha producido la infección (localización del microorganismo). 2. Determinación de sensibilidades a antibióticos mediante antibiograma. 3. Selección inicial en función de los dos puntos anteriores. 4. Si es necesario el uso de un antibiótico de amplio espectro hasta obtener los resultados de laboratorio, seleccionarlo atendiendo al historial de uso de antibióticos y sus resultados. 5. Considerar la vía, la dosis y la frecuencia de administración adecuadas. 6. Salvo antibióticos específicos, el tratamiento, no debería durar menos de 7 días, salvo en profilaxis quirúrgica, donde el tratamiento no excederá las 24h. 7. Evitar el cambio de antibiótico, antes de 48 horas de haber iniciado un tratamiento. 8. Considerar la potencial toxicidad para el hospedador. 9. En el caso de que sea necesario, asociar más de un antibiótico, prestando atención a sus posibles antagonismos (guías de asociación de antibióticos). 10. Rotación de antibióticos en tratamientos muy prolongados en el tiempo. 11. Valorar su posible efecto ante situaciones de debilidad inmunológica del hospedador a tratar. 12. Conveniencia de disponer de una base de datos específica de susceptibilidad a antibióticos basada en la realización de cultivos y antibiogramas dentro de programas de vigilancia.
37 13. En el caso de su uso veterinario en animales cuyos productos se destinan a consumo humano, considerar los periodos de supresión. En el ámbito veterinario, existen determinadas prácticas habituales, que predisponen al desarrollo y al mantenimiento de las cepas resistentes, y que requieren diseñar una estrategia correcta de uso de antibióticos. En animales de abasto, la administración de antibióticos en el pienso o en el agua de bebida a grandes lotes de animales, conlleva generalmente una inadecuada relación dosis peso, por lo que debería restringirse esta práctica o realizarla en lotes de animales relativamente homogéneos. Cuando hablamos de animales de compañía, tenemos el ejemplo de la interrupción de la administración de los tratamientos por parte de los propietarios cuando el animal muestra cierta mejoría. Existen dos ejemplos claros, citados por Van Vuuren en 2001: el primero es el uso de fluoroquinolonas en aves, que predisponen a la resistencia de Campylobacter spp en humanos frente a este antibiótico considerado de elección para este microorganismo y el segundo es el uso veterinario de avoparcina, la cual parece estar detrás de parte de la resistencia a la vancomicina en cepas humanas de Enterococcus faecium (Román, 2008). También la prohibición de uso de determinados antibióticos en el entorno veterinario, puede ser una medida óptima de cara a la Salud Pública, puesto que evitaría el paso de la resistencia de animales a hombre. Es razonable considerar, por tanto, que el uso prudente de antibióticos como estrategia para reducir los problemas de resistencia, y sus posibles implicaciones en Salud Pública, requiere, en muchos casos, de la elaboración de legislaciones, que restrinjan el uso de algunos antibióticos en veterinaria, por su importancia en medicina humana. No es desdeñable destacar, que un diagnóstico de las resistencias, complementadas con el cese en el uso de esos antibióticos, ha permitido en algunos casos y a largo plazo, recuperar la sensibilidad de las nuevas cepas a aquellos antibióticos a los que eran resistentes. Es el caso de las cepas de S. aureus resistentes a la gentamicina, detectadas en Francia, entre los años 1991 y 1998, que han ido perdiendo la resistencia a dicho antibiótico conforme ha pasado el tiempo sin utilizarlo (Lemaître et al, 1998). Esto quiere decir que, el hecho de preservar ciertas moléculas de antibióticos para situaciones de emergencia en medicina humana, podría garantizar que su uso sea efectivo en esas situaciones de verdadera necesidad. Pero además del uso racional de los antibióticos, hay que valorar las posibles resistencias cruzadas, debido al uso de otros antibióticos de las mismas familias, o
38 incluso de familias diferentes afines en el entorno animal, ya que los problemas de resistencia a vancomicina por el uso de avoparcina, son una clara referencia a ello. b) Prevención de las enfermedades microbianas y su propagación: Está demostrado científicamente, que la aplicación de medidas preventivas e higiénicas (protocolos de limpieza y desinfección, lavado de manos entre pacientes), tanto en hospitales o en ámbitos sanitarios, así como la instauración de medidas de bioseguridad y buenas prácticas ganaderas, serían un buen punto de inicio en la lucha frente a las resistencias microbianas. Permiten reducir el uso de los antibióticos y con ello, la posible aparición de resistencias en los patógenos de los animales y en los agentes zoonóticos. c) Diseño de nuevos antibióticos eficaces o de tratamientos alternativos: En 2009, el informe “The bacterial challenge: time to react”, realizado por el ECDC y el EMEA, ya pone de manifiesto la necesidad de diseñar nuevos antibióticos capaces de cubrir necesidades médicas frente al creciente problema que suponen las bacterias polifarmacorresistentes en la UE. A lo largo de los años, la industria farmacéutica, proporcionaba un flujo constante de nuevos antibióticos, con distintos mecanismos de acción que solucionaban rápidamente los problemas de resistencias bacterianas que iban sucediéndose. Desde los años 70, hasta la actualidad, sólo se han sacado al mercado, tres antibióticos de tipo sistémico (quinupristinadalfopristin, linezolida y daptomicina), y dos grupos nuevos (Oxazolidinonas y lopopéptidos), para utilizarse como tratamiento de infecciones de microorganismos multirresistentes Gram positivos (dentro de los que se incluyen los S. aureus) (ECDC y EMEA, 2009). FIGURA- 2. Descubrimiento a lo largo del tiempo de nuevos antibióticos. Fuente: ECDC, EMEA, 2009.
39 * Las penicilinas fueron los primeros βlactámicos. Otros agentes frecuentemente utilizados del grupo de los βlactámicos, además de las cefalosporinas y los carbapenems, fueron desarrollados en los años 60 y 80 respectivamente. Existen diversas razones de esa falta de inversión industrial en nuevos antibióticos (Comisión Europea, 2011): 1. Diseñar antibióticos nuevos, eficaces y seguros presenta cada vez más dificultad tanto a nivel científico como económico. 2. Cada vez está más restringido su uso. 3. La estructura de los precios no prima la utilidad. 4. La mayor parte de los antibióticos se administran durante breves periodos de tiempo. 5. Los antibióticos genéricos, van incrementando su parte de mercado. 6. En el ámbito de los antibióticos hay una necesidad imperiosa de más investigación y desarrollo, y de un nuevo modelo comercial. En medicina veterinaria, además existe otro problema añadido: el desarrollo de nuevos antibióticos, se ve frenado por la incertidumbre sobre si a los nuevos antibióticos, o incluso a nuevas indicaciones de sus principios activos, se les concedería la autorización de comercialización para el sector veterinario (Comisión Europea, 2011). Además de organismos como la OMS, en Europa son fundamentalmente dos los entes que trabajan conjuntamente, para el desarrollo de nuevos tratamientos frente a los nuevos desafíos en Salud Pública. Por un lado tenemos el EMEA, que creó un grupo en 2006, encargado de promover la investigación e innovación en la industria farmacéutica, y por tanto desarrollar nuevos antibióticos, y por el otro lado el ECDC, que desde 2005, trata de identificar, comunicar y apoyar los desafíos actuales y emergentes producidos por enfermedades de carácter infeccioso en Salud Humana; dentro de sus objetivos, se encuentra la identificación de antibióticorresistencias. La utilización de los antibióticos, debe ser un complemento al apoyo al sistema inmune del ser vivo, que es el último responsable de la eliminación de la infección, así como de las consecuencias derivadas de esta (enfermedad). Es por ello, que en la lucha frente a los agentes bacterianos capaces de desarrollar resistencias a antibióticos, que al final son todos, debe considerarse la mejora de esa respuesta
40 inmune, es decir, potenciar de alguna manera la capacidad de respuesta del ser vivo a la infección. Por ello, no sólo los antibióticos son la única respuesta: las vacunas y otras medidas preventivas, también son capaces de reducir la propagación de las infecciones, y por tanto, de la necesidad de un tratamiento. Podemos concluir, que la otra gran alternativa de lucha frente a la resistencia a los antibióticos, junto con un uso responsable de los mismos, es la búsqueda de la inmunización de las poblaciones frente a aquellos agentes, capaces de desarrollar dicha resistencia. d) Aunar esfuerzos con socios internacionales para reducir los riesgos de propagación de la resistencia, relacionados con el comercio y los viajes internacionales y por el medio ambiente: El problema de las resistencias bacterianas, es un problema global, por lo que la UE está colaborando con distintos organismos internacionales, para desarrollar estrategias conjuntas y para promover medidas comunes y aumentar la concienciación social sobre este asunto. Dentro de este grupo de organismos se encuentran: la Oficina Regional para Europa de la OMS, la OIE a través de la elaboración de sus Códigos Sanitarios y fomentando la aplicación de los protocolos internacionales del Codex Alimentarius sobre las resistencias bacterianas y por último, el grupo operativo transatlántico EE.UU.-UE, sobre la resistencia a los antimicrobianos (grupo TAFTAR).
41 JUSTIFICACIÓN: Dada la significación que tienen en la actualidad las cepas de S. aureus resistentes a meticilina y a vancomicina en medicina humana, resulta fundamental estudiar la importancia de estas cepas en el entorno animal, y especialmente la interacción entre las personas, los animales y el medio en la proliferación, mantenimiento y transmisión de estos microorganismos, así como de otros Staphylococcus coagulasa positivo y que puedan presentar resistencia a Meticilina, al resto de βlactámicos y glucopéptidos, como la vancomicina, antibióticos de referencia en medicina humana. Con esta inquietud por conocer la situación de la resistencia a antibióticos en esos microorganismos en poblaciones animales, y ante el riesgo potencial que suponen los animales colonizados o infectados, para la salud Pública, surge la iniciativa de desarrollar un trabajo que analice la situación actual y el riesgo que para la Salud Pública suponen, las cepas de S. aureus y de S. intermedius/ pseudointermedius con resistencia a antibióticos, en la interacción animales, hombre y entorno. El estudio parte de una primera línea de trabajo desarrollada en conjunto por varios grupos de investigación; por un lado, por el grupo de Microbiología del Hospital Miguel Servet de Zaragoza en el estudio de cepas de S. aureus resistentes de meticilina en el entorno hospitalario, a partir del cual se ha elaborado un importante cepario, y por otro lado, por el grupo de Medicina Preventiva de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza que, a través del Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud, ha desarrollado un estudio sobre la importancia de la resistencia a antibióticos, y especialmente a βlactámicos en cepas de Staphylococcus spp. de origen animal, y el riesgo que la relación hombre-animal, implica en la transmisión de la resistencia a personas en contacto con ellos, y por tanto, el riesgo de que estos animales actúen como portadores de la resistencia para el hombre.
48 4. Caracterización de las cepas, mediante biología molecular: A partir de los resultados obtenidos en los aislamientos, y la caracterización de los patrones fenotípicos de resistencia y sensibilidad a los antibióticos, se seleccionaron 28 cepas, que por sus patrones fenotípicos de resistencia, considerábamos que podían constituir un riesgo especial para la Salud Pública. Estas 28 cepas, fueron tipificadas genéticamente mediante la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR); esta actividad fue desarrollada por un laboratorio externo, con el que el grupo de investigación colabora. Esta prueba, en concreto, determinaba los patrones genéticos de resistencia a los antibióticos βlactámicos, especialmente detectaba la presencia del gen mec- A. 5. Análisis estadístico de los resultados: La información obtenida de los aislamientos y los patrones de resistencia y sensibilidad a los antibióticos, se introdujeron en una base de datos EXCEL y la información almacenada en esta, se analizó utilizando el mismo programa informático. En el análisis de los resultados, se determinó la distribución de frecuencias, proporciones, de los aislamientos y de la resistencia o sensibilidad a los diferentes antibióticos. Por otro lado, la evaluación de la fiabilidad de algunas de las pruebas de detección utilizadas en el estudio y del grado de concordancia entre esos métodos utilizados, se realizó con el programa informático WINEPISCOPE 2.0. (Thrusfield et al, 2001). En el caso de determinar la fiabilidad de las pruebas se utilizó como gold standard, la aglutinación en látex de la proteína PBP2a. El acuerdo (concordancia) entre pruebas se ha valorando mediante el parámetro Kappa. En este caso, cuanto más se aproxima a 1 el valor, mayor es el grado de acuerdo entre las pruebas. La fiabilidad de los test KB y las CMIs se ha valorado mediante el cálculo de los parámetros: sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo y J de Youden, parámetro este último que, proporciona una valoración global para la prueba, de manera que, cuanto más se aproxime su valor a 1, mayor fiabilidad global se atribuye a esa prueba.
49 RESULTADOS Y DISCUSIÓN: 1. Distribución y caracterización de las cepas de estafilococos aisladas: Resultados: a) Distribución por especies: A lo largo del periodo de estudio, se muestrearon un total de 135 animales, de los cuales un 71,85% fueron perros, 14,81% caballos, 10,37% gatos, 0,74% cabra, 0,74% cerdo, 0,74% conejo y 0,74% muestra de origen desconocido (GRÁFICO- I). 71,85% 10,37% 14,81% 0,74% 0,74% 0,74% 0,74% Perros Gatos Équidos Cabras Cerdos Conejos Desconocido GRÁFICO- I. Distribución de las proporciones (%) de las distintas especies animales incluidas y muestreadas en el estudio, y que resultaron positivas a la presencia de alguna bacteria del género Staphylococcus spp. b) Caracterización de las cepas aisladas para la prueba de la coagulasa: Tras realizar los análisis microbiológicos pertinentes, de esas muestras, un 53% fueron positivas a la prueba de la coagulasa, grupo dentro del cual se encuentran las dos especies de mayor interés en animales de compañía, S. aureus y S. intermedius/ pseudointermedius, frente a 47,41% que fueron coagulasa negativas.
50 c) Distribución de las especies de S. aureus, S. pseudointermedius y otros Staphylococcus. Del total de cepas de estafilococos que se aislaron, un 52,59% de cepas eran coagulasa positivo y un 47,41% fueron coagulasa negativo (GRÁFICO II): Entre las cepas que resultaron positivas a la prueba de la coagulasa, un 23,93% fueron identificadas como S. aureus y un 76,06% fueron S. intermedius o S pseudointermedius. La diferenciación entre estos dos últimos, solo puede llevarse a cabo mediante técnicas de biología molecular, que en nuestro caso, no fueron factibles de realizar para todas ellas, razón por la que a partir de este momento hablaremos de S. intermedius/ pseudointermedius sin diferenciar entre ambos salvo en el punto 3 de los resultados donde se realiza el estudio genético de algunas de las cepas, en cuyo caso, si se pudo diferenciar. 12,59% 40,00% 47,41% S.aureus S.intermedius/ pseudointermedius OtrosStaphylococcus GRAFICOII. Distribución de las proporciones (%) de las cepas de Staphylococcus spp. aislados en el estudio. Las especies animales más representadas en el muestreo, fueron la especie canina y la equina. De los perros estudiados, se aislaron un 48,45% de S. intermedius/ pseudointermedius, un 6,18% de S. aureus y un 45,36% de otros estafilococos (GRÁFICOIII).
51 6,18% 48,45% 45,36% S.aureus S.intermedius/ pseudointermedius OtrosStaphylococcus GRÁFICOIII. Distribución de las proporciones (%) de las diferentes especies de Staphylococcus spp. aisladas en perros. En cuanto a los équidos muestreados, se aislaron un 10% de S. intermedius/ pseudointermedius, un 35% de S. aureus y un 55% de otros estafilococos (GRÁFICOIV). 35,00% 10,00% 55,00% S.aureus S.intermedius/ pseudointermedius OtrosStaphylococcus GRÁFICOIV. Distribución de las proporciones (%) de las diferentes especies de Staphylococcus spp. aisladas en caballos.
52 Discusión: El estudio, se ha centrado en el aislamiento de cepas procedentes de muestras, tomadas en animales de compañía (perros, gatos y caballos). La razón principal es el aumento del número de cepas de S. aureus aisladas en ellos con origen humano en los últimos años, y al papel que desempeñan estos animales, en la transmisión y difusión de las mismas, y consecuentemente de la resistencia a los antibióticos; ya que los animales de compañía, pueden ser colonizados por cepas humanas, a consecuencia de su estrecho contacto con ellos, actuando como portadores (EMEA, 2009). Cuando hablamos de colonización por estas bacterias en personas, es mayor por S. aureus que por S. intermedius/ pseudointermedius, incluso en personas con un estrecho contacto con animales de compañía; si bien, la presencia de S. intermedius/ pseudointermedius en dueños de perros, es mayor que en la del resto de la población, siendo esta presencia, similar a la de sus animales (Scott Weese y Van Duijkeren, 2009). En cuanto a los resultados de los aislamientos obtenidos, se aislaron cepas coagulasas positivas en similar proporción que coagulasas negativas. Dentro de esas coagulasas positivas, existió un mayor porcentaje de cepas de S. intermedius/ pseudointermedius, hecho que puede ser debido, a una mayor representación de la especie canina en el estudio; ya que este microorganismo, es uno de los más comúnmente aislados, tanto en perros sanos como con algún tipo de patología a nivel tisular (Huerta et al., 2010; Scott Weese y Van Duijkeren, 2009; Rubin et al., 2011; Onuma et al., 2011). Además, existe evidencia, de que la colonización de S. aureus es transitoria en perros y gatos, quizás porque este, no es un comensal natural predominante en esas especies (Scott Weese y Van Duijkeren, 2009). Por otro lado, cuando hablamos de la especie equina, existen grandes variaciones de distribución de las cepas aisladas con respecto al perro. El porcentaje de cepas aisladas de S. aureus es muy superior (es un microorganismo comensal en caballos) (Burton et al., 2008), así como se observa un descenso de las cepas de S. intermedius/ pseudointermedius aisladas, puesto que este último microorganismo, o no está presente, o es muy raro en caballos (Scott Weese y Van Duijkeren, 2009).
53 2. Patrones de resistencia y sensibilidad a los antibióticos: Resultados: a) Proporción de cepas positivas a la presencia de la proteína PBP2a: Dentro de las cepas aisladas de las especies S. aureus y S. intermedius/ pseudointermedius, interesaba especialmente conocer que cepas son resistentes a la meticilina, lo que se identifica con la resistencia general a los –lactámicos, por ser estos los antibióticos de elección en los tratamientos de infecciones por estas bacterias en humanos. Esa resistencia al grupo de los –lactámicos, viene determinada por la presencia de la proteína PBP2a (gold standard en este estudio). Un 43,75% de los aislados de S. aureus y un 38,18% de S. intermedius/ pseudointermedius, resultaron positivos a esta prueba. Una vez determinada la presencia de la proteína PBP2a, se analizaron los patrones de resistencia a diferentes antibióticos por dos procedimientos: test de difusión en disco de Kirby Bauer y determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI). b) Características de resistencia y sensibilidad fenotípica a los antibióticos estudiados mediante el Test de Kirby Bauer (KB): Los resultados obtenidos con el Test de KB, ponen de manifiesto que un 100% de las cepas aisladas de S. aureus, eran resistentes a la estreptomicina, pero especialmente destacaba que un 93,75% presentaban resistencia a ampicilina y un 87,50% a penicilina, ambos antibióticos importantes -lactámicos. Las menores proporciones de cepas resistentes fueron observadas para las quinolonas: marbofloxacina y levofloxacina, ambas con un 12,5% de resistencia, y norfloxacina con un 18,75%. (TABLA-2) Entre las cepas aisladas de S. intermedius/ pseudointermedius, el 98,18% presentaban resistencia a la estreptomicina, un 89,09% a penicilina y un 87,27% a ampicilina, mientras que los menores porcentajes de resistencia fueron para meticilina (16,36%), oxacilina (14,55%), y cefoxitina (1,82%) (TABLA-2). Indicaremos también y de forma general, que para el resto de estafilococos aislados (coagulasa negativos), en su mayoría (91,23%) eran resistentes a estreptomicina; por el otro lado, sólo un 5,26% eran resistentes a amoxicilina, meticilina y oxacilina (TABLA-2).
54 TABLA-2. Distribución (valores absolutos y porcentajes) de las características de resistencia a los antibióticos de las distintas cepas aisladas mediante el test de Kirby-Bauer. Antibióticos Númerodeaislamientos(%) S.aureus S.intermedius Otrosestafilococos Meticilina 7 (43,75) 9 (16,36) 3 (5,26) Oxacilina 6(37,5) 8(14,55) 11(5,26) Vancomicina 6(37,5) 18(32,73) 11(19,3) Ampicilina 15(93,75) 48(87,27) 27(47,37) Amoxicilina- Ac. Clavulánico 6(37,5) 11(20) 6(10,53) Penicilina 14 (87,5) 49 (89,09) 34 (59,65) Eritromicina 8(50) 45(81,82) 35(61,4) Tetraciclina 8(50) 41(74,55) 27(47,37) Estreptomicina 16(100) 54(98,18) 52(91,23) Gentamicina 6(37,5) 17(30,91) 6(10,53) Sulfa- Trimetroprim 4(25) 32(58,18) 14(24,56) Ciprofloxacina 4(25) 13(23,64) 6(10,53) Clindamicina 4(25) 35(63,64) 24(42,11) Marbofloxacina 2(12,5) 10(18,18) 4(7,02) Levofloxacina 2(12,5) 11(20) 4(7,02) Norfloxacina 3 (18,75) 13 (23,64) 6 (10,53) Cefoxitina 4(25) 1(1,82) Tobramicina 5(31,25) 13(23,64) Lincomicina 5(31,25) 46(83,64) Teicoplanin 4(25) 26(47,27) TOTAL 16 55 57 c) Características de resistencia y sensibilidad fenotípicas a los antibióticos estudiados mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMIs): El estudio de los patrones de resistencia a los antibióticos de interés en Salud Pública (- lactámicos y vancomicina) mediante la determinación de las CMIs (Método MICE), ha puesto de manifiesto que un 50% de los S. aureus, eran resistentes a penicilina, en contraste con el 0% de resistencia a vancomicina, distribución prácticamente similar a lo observado en S. intermedius/ pseudointermedius. Si bien las proporciones de resistencia para oxacilina y amoxicilina son más bajas (TABLA- 3).
55 Por el contrario, hay que recalcar que en el caso de los Staphylococcus coagulasa negativos la resistencia a la vancomicina alcanzaba el 77,19%. (TABLA-3). TABLA- 3. Distribución (valores absolutos y porcentajes) de las características de resistencia, de las distintas cepas de Staphylococcus spp aisladas, a los antibióticos de interés en Salud Pública a través de las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMIs). Antibióticos Númerodeaislamientos(%) S. aureus S. intermedius Otros estafilococos Amoxicilina 4(25) 7 (12,73) 18(31,58) Oxacilina 4(25) 1(1,82) 3(5,26) Vancomicina 0(0) 0(0) 44(77,19) Penicilina 8(50) 28(50,9) 0(0) TOTAL 16 36 65 Discusión: Los resultados observados en el estudio, ponen de manifiesto la creciente importancia de cepas de S. aureus y S. intermedius/ pseudointermedius con resistencia muy significativa a antibióticos, que son referencia en el tratamiento de enfermedades causadas por los mismos, tanto en medicina humana como en veterinaria. Puesto que, aunque en el caso de algunos antibióticos, el porcentaje de cepas resistentes es bajo, siempre existen cepas resistentes, para las especies de Staphylococcus analizadas. Esta multirresistencia, nos hace reflexionar sobre la necesidad de frenar este problema, ya que, de seguir así, las opciones terapéuticas frente a estos microorganismos, podrían verse gravemente disminuidas. Es cierto que en este estudio los muestreos, se han llevado a cabo en su totalidad en animales; no obstante, ya hemos hablado de la importancia que tienen los animales de compañía, como transportadores de estos microorganismos en el ambiente (EMEA, 2009). Teniendo en cuenta las características epidemiológicas de estas bacterias, estos resultados, pueden ayudar a hacernos una idea de la magnitud del problema de la resistencia a antibióticos de estos microorganismos en la población humana, y por tanto, debemos considerar que su presencia en animales, constituye un punto crítico en la transmisión de estas cepas al hombre y por ende, un problema a corto plazo para la Salud Pública.
56 Al analizar las cepas aisladas, la misma proporción de cepas de S. aureus y de S. intermedius/ pseudointermedius (alrededor de un 40% en ambos casos), resultaron positivas a la presencia del gen mec-A (test PBP2a), lo que se identifica con la presencia de resistencia (actual o potencial) a los –lactámicos, y por extensión en la mayoría de los casos, resistentes a otros antibióticos (EMEA, EFSA y ECDC, 2009). Desde el punto de vista de su diagnóstico, en medicina veterinaria la detección de resistencia a antibióticos se realiza, salvo situaciones muy excepcionales, mediante técnicas básicas como los test de KB o la determinación de CMIs, en el mejor de los casos. Mediante los test de difusión de KB, en lo que a S. aureus se refiere, el 100% de las cepas son resistentes a un aminoglucósido, la estreptomicina, y presentan porcentajes muy altos de resistencia para β-lactámicos como ampicilina y penicilina. Los menores porcentajes de resistencia, fueron para las quinolonas; quizás se deba a que la utilización de estas, está considerado desde hace tiempo, como un factor de riesgo en la adquisición de MRSA, tanto en humanos como en perros, y su uso, está restringido a situaciones, en las que no existan otras alternativas terapéuticas (Rubin y Chirino, 2011). En S. intermedius/ pseudointermedius, las cepas más resistentes son para los mismos antibióticos que para S. aureus, aunque es destacable, que los βlactámicos meticilina y oxacilina, así como una cefalosporina (cefoxitina), presentan un menor número de cepas resistentes. Es curioso este bajo porcentaje a cefalosporinas, y en concreto a cefoxitina, ya que es el tratamiento de elección para las infecciones por S. pseudointermedius en perro, sobre todo en la pioderma canina (Kawakami et al, 2010), una de las principales patologías causadas por este microorganismo. Las variaciones en cuanto a la meticilina (penicilina de referencia para el tratamiento de S. aureus en Salud Pública), van desde un 43,75% en el caso de S. aureus, a un 16, 36% en S. intermedius/ pseudointermedius, y prácticamente ocurre lo mismo en el caso de la oxacilina, que es otra de las penicilinas sintéticas de elección. Debido a la aparición de cepas resistentes a la meticilina, se empezó a utilizar la vancomicina como tratamiento alternativo frente a S. aureus en humanos. El hecho de que ya aparezcan cepas resistentes a vancomicina, es un punto a reflexionar. Otros antibióticos que presentan grandes diferencias entre estas dos especies de Staphylococcus, son la lincomicina y la tetraciclina; ambos están representados por un alto porcentaje de cepas resistentes a ellos en S. intermedius/ pseudointermedius; quizás la gravedad de los efectos secundarios producidos por las tetraciclinas limita su uso sobre todo a animales (Pantosti, 2012). Las diferencias en cuanto a la lincomicina entre estas dos especies de Staphylococcus, pueden ser debidas al menor uso de
57 este antibiótico en humanos, por la aparición de nuevas moléculas dentro de su misma familia, como la clindamicina, con un mayor espectro de actuación. Estas diferencias en los patrones de resistencia y sensibilidad entre las especies de Staphylococcus, también podrían ser ocasionadas, entre otros factores, por los diferentes criterios de selección de antibióticos en el tratamiento de enfermedades a nivel veterinario y médico, y probablemente a un uso no racional de los mismos; aunque también podrían deberse a intercambios de información genética entre cepas humanas y animales, puesto que existen estudios en los que sí se ha demostrado, que cepas susceptibles a estos antibióticos, pueden ser convertidas en resistentes en el laboratorio, lo que revela su facilidad de adquirir resistencia (Jiménez y Correa, 2009). No obstante, este es un estudio transversal, una radiografía de lo que está sucediendo en un momento determinado, y sería interesante conocer los patrones fenotípicos de resistencia a los antibióticos de ambos microorganismos, con el paso de los años en estos animales y en las personas, tanto de su entorno veterinario como sus dueños, para ver si dichas sensibilidades derivan en resistencias en el futuro. Así, se evidenciaría esa capacidad de los Staphylococcus de transferir información genética, incluida la de la resistencia a los antibióticos, conferida por el gen mec-A, que podría ser transferido desde los animales a otras cepas más patógenas para el hombre, hecho que se ha referenciado en numerosas ocasiones (Heymann, 2006). Cuando se analizaron las CMIs para los antibióticos de mayor interés en Salud Pública, se encontraron diferencias importantes entre microorganismos coagulasa positivos y negativos. Si bien los coagulasa positivos, no presentaron cepas resistentes a vancomicina, los negativos sí; pero cuando hablamos del caso de las penicilinas, en los estafilococos coagulasa negativos, todas las cepas fueron sensibles a las penicilinas, mientras que en S. aureus y S. intermedius/ pseudointermedius, aproximadamente un 50% de las cepas, fueron resistentes a ella. Lo más curioso, es que salvo en el caso de la oxacilina en las cepas coagulasa negativas, los porcentajes de cepas resistentes no coinciden exactamente con los obtenidos en los test de difusión de KB. Los casos más llamativos son los de la vancomicina en S. aureus y S. intermedius/ pseudointermedius, puesto que ya hemos dicho que mediante las CMIs no existen cepas de ambos microorganismos resistentes a este antibiótico, mientras que el test KB, evidencia entre un 37,50 % y un 32, 73% respectivamente de cepas resistentes. Pero cuando hablamos del número de cepas resistentes a vancomicina en los coagulasa negativos, las CMIs nos dan un porcentaje de 77,19%, mientras que el test de KB un 19,30%. Otra diferencia interesante, es el
64 Mediante la determinación de Kappa, se ha observado que, la única situación que ha presentado el valor máximo de concordancia (Kappa=1), es la que resulta de comparar el test PBP2a con el test KB para la meticilina en S. aureus (TABLA- 6). En todos los demás casos, se observa que los niveles de concordancia disminuyen mucho, tanto para el test KB como para las CMIs (TABLA-7). Como referencia para el uso de la PBP2a como gold standard en el estudio, debemos indicar que, además de los datos de otros autores que así lo indicaban en estudios previos (Hussain et al, 2002; Louie et al, 2001; Wilkerson et al, 1997), en un trabajo realizado paralelamente a este y del que no se presentan aquí los resultados (Ortega et al, 2011), se testaron 28 cepas de las aisladas y aquí estudiadas mediante PCR para detectar la presencia del gen mec- A, observándose máxima concordancia para S. aureus y muy alta para S. intermedius/pseudointermedius. También se observa un nivel de concordancia elevado (Kappa=0.61) entre el test KB para la Amoxicilina y la CMI para la Amoxicilina. En cambio, también en el caso de S. aureus, se ha observado una total discrepancia entre el test KB para la Vancomicina y la CMI para la misma Vancomicina, hecho que posiblemente esté ligado a la interpretación de las pruebas (antibiótico para el que existen diferentes criterios a la hora de establecer el punto de corte entre resistencia y sensibilidad), más que a su capacidad de detectar la resistencia, lo que ha generado un número mínimo de cepas resistentes a este antibiótico. Además de este desacuerdo entre pruebas, es muy significativa la falta total de concordancia (Kappa <0) entre la PBP2a y la CMI para la Penicilina, en S. aureus. Para el resto de situaciones estudiadas para las cepas de este microorganismo, el grado de acuerdo entre las pruebas es medio con valores que oscilan entre 0.29 y 0.58 (TABLA-7). Entre las cepas de S. intermedius/pseudointermedius, la situación es muy diferente; en todos los casos, la concordancia observada es baja o como mucho media, con un valor de Kappa más elevado para el test KB y la CMI en la Amoxicilina (TABLA-7), observándose un desacuerdo absolutos (Kappa<0) en el caso de antibióticos de referencia como la Oxacilina o la Vancomicina. Atendiendo a esa falta de concordancia en algunos casos, se ha tratado de definir la fiabilidad (mediante la sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivo y negativo) del test KB para la Meticilina, la Oxacilina y la Cefoxitina y la CMI para la Oxacilina como pruebas más frecuentemente utilizadas en el laboratorio para definir la resistencia a los –lactámicos, contrastándolas con la PBP2a como gold standard. Los resultados obtenidos pueden observarse en las tablas 8 y 9.
65 TABLA-8. Parámetros de fiabilidad de las pruebas utilizadas en el estudio para antibióticos de referencia en Salud Pública en el caso de S. aureus. Prueba evaluada S E VP+ VP- J-Youden KB Metic. 100 100 100 100 1 KB Oxac. 71.4 (37.9-100) 77.8 (50.6-100) 71.4 (37.9-100) 77.8 (50.6-100) 0.49 (0.06-0.92) KB Cefox. 57.1 (20.5-93.8) 100 100 70 (41.6-98.4) 0.57 (0.20-0.94) MICE Oxac. 71.4 (38.0-100) 100 100 78 (50.6-100) 0.71 (0.38-1) (S. aureus) TABLA-9. Parámetros de fiabilidad de las pruebas utilizadas en el estudio para antibióticos de referencia en Salud Pública, en el caso de S. intermedius/ pseudointermedius. Prueba evaluada S E VP+ VP- J-Youden KB Metic. 33.3 (13.2-53.5) 94.1 (86.2-100) 77.8 (50.6-100) 69.5 (56,3-82.9) 0.27 (0.05-0.49) KB Oxac. 23.8 (5.6-42.0) 88.2 (77.4-99.1) 55.6 (23.1-88.0) 65.2 (51.4-79.0) 0.12 (0.00-0.33) KB Cefox. 0 97.2 (91.8-100) 0 61.1 (48.1-74.1) NEGATIVO MICE Oxac. 4.8 (0-13.9) 97.2 (91.8-100) 50 (21.0-100) 62.3 (49.2-75.3) 0.02 (0.0-0.13) (S. pseudointermedius) En S. aureus, se observa que el test KB para la Meticilina ha presentado una sensibilidad y especificidad del 100%, hecho ratificado por que en todas las cepas estudiadas por esta prueba y la PBP2a ha existido coincidencia en sus diagnósticos (TABLA-8). En las otras tres situaciones estudiadas, el test KB para Oxacilina y Cefoxitina y la CMI para la Oxacilina, se observa que la especificidad de las pruebas se mantiene muy elevada, entre el 77.8% para el test KB en el caso de la Oxacilina y el 100% para el resto; pero su sensibilidad disminuye variando entre un 57.1% y un 71.4%, lo que sugiere que estas pruebas evitan la existencia de falsos positivos, pero que, salvo el test KB para la Meticilina, introducen falsos negativos, es decir, habría resultados negativos en las pruebas habituales que por el contrario presentarían reacción positiva a la PBP2a, cepas que por tanto presentarían el gen mec- A de resistencia a los – lactámicos (TABLA-8). Los valores predictivos positivo y negativo confirman aquellas interpretaciones en el caso de S. aureus, y así, un valor predictivo positivo del 100%, indica que, una cepa diagnosticada como positiva por la prueba será realmente una cepa positiva a la PBP2a, pero por el contrario, los valores predictivos negativos más bajos indican que los individuos considerados negativos por la prueba habitual pueden ser positivos en la PBP2a, es decir, falsos negativos (TABLA-8).
66 La fiabilidad global de las pruebas habituales, valorada respecto a la PBP2a y determinada por la J de Youden, es muy alta para el test KB con Meticilina (1) y alta (valores entre 0.49 y 0.71) en el caso del resto. En el de S. intermedius/pseudointermedius, se observa que los valores de sensibilidad y especificidad de las pruebas habituales en laboratorio son inferiores a lo observado para S. aureus (TABLA-9). La sensibilidad de las pruebas se ha reducido hasta un 33.3% en el mejor de los casos y la especificidad, si bien presenta valores elevados, también es inferior, entre un 88.2 y un 94.1%, lo que indica que, en estas cepas pueden presentarse algunos falsos positivos y un número muy elevado de falsos negativos, algo que confirman claramente los resultados obtenidos para los valores predictivos positivo y negativo (TABLA-9) Se puede concluir, por tanto, que en el caso de S. intermedius/pseudointermedius la fiabilidad de las pruebas habituales de laboratorio es baja, valores de la J de Youden inferiores a 0.27 en el mejor de los casos, luego, la probabilidad de error cuando se utilizan aquellas pruebas para diagnosticar cepas resistentes o sensibles a los –lactámicos, es elevada (TABLA-9). Discusión: Los resultados obtenidos, plantean la necesidad de considerar, hasta qué punto las pruebas utilizadas habitualmente para la detección de la resistencia a – lactámicos y vancomicina en S. aureus y S. intermedius/pseudointermedius, requieren ser interpretadas atendiendo, no sólo a los resultados del laboratorio, sino también a las características de sensibilidad y especificidad de las propias pruebas. A pesar de que algunos organismos, han tratado de definir protocolos y métodos de interpretación de las pruebas de laboratorio específicos, estos muchas veces no coinciden con los propuestos por otros grupos distintos (ej: interpretación de el test de KB para algunos antibióticos entre la CLSI y ERASS), lo que induce a algunos errores y a la dificultad de comparar datos y por tanto, a utilizarlos como modelos en estudios de riesgo. Por ello, se viene reclamando la necesidad de estandarizar de forma universal esos protocolos y de ese modo poder utilizar y contrastar la situación existente (EASAC, 2008; ECDC, 2010).
67 Desde ya hace tiempo, las pruebas para detección del gen mec- A mediante técnicas de biología molecular como la PCR se han definido en algunos estudios como la herramienta perfecta para detectar esas resistencias (actuales o potenciales) (Jona et al, 2002), ya que es rápida y dotada de una gran sensibilidad y especificidad (Jiménez y Correa, 2009). Sin embargo, su coste las hace poco viables en la clínica habitual, razón por la que se han buscado otras alternativas. Una de las alternativas propuestas, y utilizadas en nuestro estudio, es la detección del gen mec- A, mediante el test de aglutinación en látex de la proteína PBP2a. Esta prueba presenta una mejor fiabilidad, puesto que mejora la sensibilidad de las detecciones, disminuyendo el número de falsos negativos, algo fundamental cuando se trata de evaluar situaciones de riesgo de transmisión de esas resistencias (Wilkerson et al, 1997; Luie et al., 2001). Una segunda alternativa planteada por algunos autores para S. aureus, es el uso de medios de cultivo específicos para crecimiento de cepas de resistentes a meticilina (MRSA). No obstante, estos medios también tienen problemas de sensibilidad y por tanto de la existencia de falsos negativos (Pape et al, 2006). Los resultados de nuestro estudio, evidencian importantes diferencias en cuanto a la fiabilidad de las pruebas utilizadas entre S. aureus y S. intermedius/pseudointermedius. Al valorar la concordancia entre pruebas, salvo en el caso del test de KB para la Meticilina en S. aureus, hay una significativa falta de concordancia de las pruebas con la PBP2a, prueba utilizada como referencia, y de las otras pruebas entre sí. En el caso de los S. intermedius/ pseudointermedius, esas concordancias son mínimas e incluso inexistentes. Hay que destacar además, que en el caso de S. aureus, tanto Kappa como el resto de parámetros determinados, poseen una amplia dispersión de valores (rango), lo que se debe a que el número de cepas que finalmente se aislaron de esta especie no fue elevado, algo que no ocurre para S. intermedius/ pseudointermedius. Cuando se analizaron los parámetros de fiabilidad, se observó que, si bien los test de KB y las CMIs presentan una buena especificidad (respecto a la PBP2a), máxima en el caso de S. aureus, se produce una importante falta de sensibilidad, hecho que determina la existencia de “falsos negativos”.
68 La PBP2a determina en última instancia la presencia del gen mec- A, lo que no significa necesariamente, que esa cepa deba ser resistente en ese momento a los - lactámicos. También es cierto que la presencia de ese gen, debe ser considerado como un elemento de riesgo, para el desarrollo de resistencia a corto plazo. Por ello, consideramos estas dos pruebas habituales de laboratorio (KB y CMIs), como de “escasa” fiabilidad para determinar la existencia de cepas con resistencia, siendo su resultado solo un indicador de una situación puntual en ese momento, algo otorgado por otros estudios que llegan a poner en duda su utilidad para determinar la existencia de resistencia a –lactámicos en cepas de estafilococos (Rahbar, 2005). De una u otra manera, es evidente que ante la creciente importancia de las cepas de estafilococos con resistencia a β–lactámicos entre los animales, es necesario realizar programas de vigilancia más fiables y para ello, las técnicas clásicas de laboratorio para determinación de resistencia a antibióticos no son suficientes por su falta de sensibilidad, por lo que sería conveniente introducir métodos como la PBP2a como pruebas de rutina, que evidencien la presencia del gen mec- A responsable del desarrollo de esa resistencia a los –lactámicos, claves en el tratamiento de las estafilococias en medicina veterinaria y sobre todo en medicina humana.
69 CONCLUSIONES: La prevalencia de cepas de S. intermedius/ pseudointermedius es muy elevada en perros, mientras que en caballos, es S. aureus el que presenta la prevalencia más alta. Estos microorganismos, pueden formar parte de la flora habitual de personas y/ o animales de compañía, por lo que ambos son susceptibles de ser reservorios de estos patógenos. De ahí que sea necesario profundizar sobre el papel de los animales en la transmisión de esta bacteria, ya que la colonización de estos, está considerada como un factor de riesgo para la difusión de estas bacterias, tanto en humanos como en animales. Aunque las cepas de S. aureus aisladas, han presentado menor proporción de resistencia con respecto a los obtenidos en S. intermedius/ pseudointermedius, se ha observado resistencia en mayor o en menor medida, a todos los antibióticos analizados en nuestro trabajo, lo cual sugiere una importante probabilidad de fallos en la eficacia de los tratamientos de las infecciones causadas por estos patógenos en veterinaria. Este hecho, lleva implícitas una serie de consecuencias: la primera de ellas y más importante, es que el contacto directo entre personas y animales, puede permitir el intercambio de cepas bacterianas, o de información genética entre ellas, incluida la de la resistencia a antibióticos. Un alto porcentaje de cepas, resultaron positivas a la presencia del gen mec-A indicativo de resistencia a los βlactámicos, siendo ese porcentaje similar en S. aureus y en S. intermedius/pseudointermedius. Las cepas de S. intermedius/ pseudointermedius analizadas por PCR, fueron en su mayoría sensibles a meticilina, mientras que las cepas de S. aureus aisladas, prácticamente todas fueron resistentes, MRSA. Esta presencia de cepas MRSA, puede acompañarse de la adaptación de esos microorganismos a nuevos comensales, lo que podría originar nuevas enfermedades en un futuro. El principal patógeno en humanos es el S. aureus, pero ya se ha observado la presencia de S. pseudointermedius a nivel comunitario, independientemente del contacto más o menos directo con animales. A este nivel, los veterinarios, los cuidadores, y los propios dueños, son grupos de riesgo importantes, ya que pueden ser colonizados. Con esta perspectiva, sería interesante estudiar el papel de los fómites en el intercambio y transmisión de esas cepas bacterianas y de su resistencia a antibióticos, puesto que se ha demostrado en algunos casos, la existencia de contaminación a nivel ambiental por parte de Staphylococcus spp.
70 Desde el punto de vista diagnóstico, el estudio pone de manifiesto una baja fiabilidad y grado de concordancia, de la que gozan los diferentes métodos de detección de resistencia para los antibióticos de interés analizados, sobre todo en el caso de S. intermedius/pseudointermedius. Este hecho puede repercutir directamente en los tratamientos, y en la valoración de las prevalencias de estas cepas con resistencia por los Sistemas de Vigilancia. Por ello se hace necesaria una estandarización de los métodos de diagnósticos y de los protocolos de interpretación de resistencias en dichas pruebas.
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