Repositorio Institucional de Documentos

UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Proyecto Máster CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y FUNCIONAL DE CÉLULAS NATURAL KILLER. IMPLICACIÓN EN SENESCENCIA DEL SISTEMA INMUNE Y ARTRITIS REUMATOIDE. Presentado por: Ana B. Martínez Martínez Directores: Dr. Luis Martínez Lostao Dr. Felícito García-Álvarez García UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular D. Luis Martínez Lostao, Doctor en Medicina y Cirugía y Profesor del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza, y D. Felícito García-Álvarez García, Doctor en Medicina y Cirugía y Profesor Asociado en Ciencias de la Salud del Departamento de Cirugía, Ginecología y Obstetricia de la Universidad de Zaragoza, CERTIFICAN: Que el Proyecto Máster “Caracterización fenotípica y funcional de células Natural Killer. Implicación en senescencia del sistema inmune y artritis reumatoide“, ha sido realizado por la Licenciada en Bioquímica Ana Belén Martínez Martínez en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza bajo su dirección, y que reúne a su juicio, las condiciones requeridas para optar al título de Máster en Biología Molecular y Celular. Zaragoza, Septiembre de 2012 Fdo: D. Luis Martínez Lostao Fdo: D. Felícito García-Álvarez García i INDICE 1. Antecedentes y objetivos 1 2. Introducción 4 2.1. Biología de las Natural Killer (NK) 4 2.1.1. Descripción general de las células NK 4 2.1.2. Receptores de activación/inhibición de las células NK 6 2.1.3. Mecanismos de activación de las células NK 9 2.1.4. Mecanismos efectores de las células NK 10 2.2. Senescencia del Sistema Inmune (Inmunosenescencia) 12 2.2.1. Papel de las NK en la inmunosenescencia 14 2.3. Artritis Reumatoide (AR) 17 2.3.1. Papel de las NK en AR 17 3. Metodología 19 3.1. Pacientes incluidos en el estudio 19 3.2. Obtención y purificación de células mononucleares de sangre periférica humana 20 3.3. Separación magnética de células NK 21 3.4. Obtención y purificación de células mononucleares de líquido sinovial 22 3.5. Cultivos celulares 23 3.5.1. Congelación y descongelación de las líneas celulares 23 3.5.2. Determinación de la viabilidad celular 24 Indice ii 3.6. Estudio inmunofenotípico de las células NK 25 3.7. Estudio de citotoxicidad de las células NK 26 3.7.1. Citometría de flujo 29 3.8. Análisis de los resultados 30 4. Resultados 31 4.1. Estudio comparativo de las células NK según la edad 31 4.1.1 Estudio fenotípico de las células NK en sangre periférica según la edad 31 4.1.2 Estudio citotóxico de las células NK en sangre periférica según la edad 36 4.2. Estudio comparativo de las células NK de sangre periférica y líquido sinovial 38 4.2.1 Estudio comparativo del fenotipo de las células NK de sangre periférica y líquido sinovial 38 4.2.2 Estudio comparativo de la citotoxicidad de las células NK de sangre periférica y líquido sinovial 42 4.3. Estudio comparativo de la citotoxicidad de las células NK en artritis reumatoide 43 5. Discusión 44 6. Conclusiones 49 7. Bibliografía 50 1 1. Antecedentes y objetivos La inmunosenescencia se ha definido como un estado de desregulación de la función del sistema inmune con el aumento de la edad y que contribuye a un incremento de la susceptibilidad a infecciones, cáncer y trastornos autoinmunes (1). Las células NK forman parte del sistema inmune innato y juegan un papel importante en la defensa frente a las infecciones principalmente víricas y frente a tumores (2, 3). Diversos trabajos se han centrado en el estudio de las alteraciones producidas por la edad en las células NK, en lo referente a distintos parámetros relacionados con esta población celular: número absoluto de células presentes en sangre periférica, capacidad citotóxica y expresión de diversas moléculas de superficie relacionadas con su función (4-7). En lo referente al número total de células NK, diversos estudios han encontrado un número elevado de estas células con la edad (8, 9). Respecto a la capacidad citotóxica de las células NK, aunque se ha descrito que las células NK parecen mantener dicha capacidad con la edad, una redistribución de las subpoblaciones presentes dentro de las células NK (citotóxica y secretora) a favor de la subpoblación citotóxica, podría enmascarar una menor capacidad de las células NK de lisar a las células diana en individuos mayores (10-12). Sin embargo, otros trabajos han descrito una disminución de la actividad de las células NK conforme aumenta la edad (13-15). También se ha analizado la expresión de diversas moléculas de superficie de las células NK. En lo que se refiere a los receptores de tipo KIR (killer-cell immunoglobulinlike receptors), los resultados son discrepantes describiéndose tanto un aumento de estos receptores (16) como una disminución de su función con la edad (12). Trabajos previos de nuestro grupo han encontrado una correlación directa entre el porcentaje de células NK en sangre periférica y la edad en pacientes con fractura de cadera (17). Sin embargo, la valoración de distintos parámetros de la respuesta inmunológica a nivel sistémico no siempre representa la respuesta Antecedentes y Objetivos 2 inmunológica local generada en un determinado lugar del organismo, en este caso en la articulación afectada. Entendiendo el papel que juegan las células NK en la zona afectada se podrían diseñar estrategias para prevenir o tratar el daño producido (18). La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune sistémica caracterizada por una hiperplasia sinovial y una inflamación crónica articular que lleva a la destrucción del cartílago y del hueso (19). La implicación del sistema inmune en su patogénesis, no sólo los factores solubles sino también las interacciones célula-célula contribuyen a la progresión de la enfermedad promoviendo la destrucción articular (20). En lo referente al papel de las células NK en la AR, los datos en la actualidad son contradictorios atribuyéndoles tanto un papel regulador como patogénico en esta enfermedad (21). El objetivo principal de este trabajo ha sido estudiar diversos parámetros característicos de las células NK (expresión de diversas moléculas de superficie y capacidad citotóxica) y su variación con la edad, así como estudiar dichos parámetros en paralelo en muestras de sangre periférica y de líquido sinovial para analizar las posibles diferencias en la actividad y el fenotipo de las células NK a nivel sistémico y a nivel local. Para ello, se han realizado estudios inmunofenotípicos de las células NK así como ensayos de citotoxicidad con dichas células NK frente a la línea celular K562 (diana natural de las células NK) en muestras de pacientes candidatos a cirugía ortopédica del Servicio de Traumatología y Cirugía Ortopédica del Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. OBJETIVOS 1) Analizar la expresión de diversas moléculas de superficie características de las células NK procedentes de muestras de sangre periférica de pacientes candidatos a cirugía ortopédica y estudiar su relación con la edad. 2) Analizar la capacidad citotóxica de las células NK procedentes de muestras de sangre periférica de pacientes candidatos a cirugía ortopédica y estudiar su relación con la edad. Antecedentes y Objetivos 3 3) Estudiar las posibles diferencias en la expresión de diversas moléculas de superficie características de las células NK de sangre periférica y de líquido sinovial de pacientes candidatos a cirugía ortopédica. 4) Estudiar las posibles diferencias en la capacidad citotóxica de las células NK de sangre periférica y de líquido sinovial de pacientes candidatos a cirugía ortopédica. Introducción 10 18 y los IFNs de tipo I promueven la activación y proliferación de células NK incrementando su capacidad citotóxica e induciéndolas a la producción de, entre otras citocinas, IFN-γ y TNF-α (34). También se ha observado una activación de las células NK a través de quimiocinas como MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, 2, 3 y RANTES y como algunos receptores de quimiocinas (CCR2 y CCR5) expresados por células NK favorecen la migración de dichas células a sus células diana, así como su unión a ellas y el reclutamiento de otras células NK (28). 2.1.4. Mecanismos efectores de las células NK. Los mecanismos que llevan a la eliminación de las células por parte de las células NK son dos principalmente: 1. Vía de los receptores mortales. 2. Vía de la exocitosis granular. 1) La vía de los receptores mortales o vía extrínseca es un mecanismo de inducción de apoptosis que se activa por la unión de un ligando extracelular a un receptor especifico en la superficie de la membrana celular. Los ligandos mortales pertenecen a la superfamilia del TNF. Algunos de estos ligandos activan vías de señalización implicadas en respuestas proinflamatorias y de diferenciación celular como TNF-α, pero hay otros como FasL (Fas ligand) y Apo2L/TRAIL (Apo2 ligand/TNF-related apoptosis inducing ligand), que son capaces de inducir la muerte celular mediante apoptosis (35-37).Cada ligando mortal tiene su receptor o receptores mortales específicos. En el caso de FasL, el receptor es Fas/CD95/Apo1, y en el caso de Apo2L/TRAIL los receptores proapoptóticos son TRAIL- R1/DR4 y TRAIL-R2/DR5. Estructuralmente presentan características similares: son proteínas de membrana de tipo I y poseen entre una y cinco repeticiones de secuencias ricas en cisteína (CRD, cysteine rich domain) en su parte extracelular y un dominio mortal (DD, death domain) en su región intracelular (38, 39). El mecanismo de traducción de la señal apoptótica comienza cuando un homotrímero de ligando mortal se une a su correspondiente receptor a través de su Introducción 11 CRD de manera que las regiones intracelulares del receptor adoptan una conformación determinada que hace que recluten a la proteína adaptadora FADD (Fas associated death domain) a sus DD (40). Esta proteína contiene dominios mortales (DD) y dominios efectores de muerte (DED, death effector domain) que se unen a las procaspasas iniciadoras 8 y 10. A este conjunto formado por el receptor oligomerizado, la proteína adaptadora FADD y las procaspasas iniciadoras 8 y/o 10 se le denomina DISC (death inducing signalling complex). Una vez que las procaspasas iniciadoras se unen al DISC se procesan originándose las formas activas de dichas caspasas y se desencadena el mecanismo de apoptosis o muerte celular programada vía caspasas ejecutoras (-3, -6 y -7) o vía mitocondrial mediante el procesamiento de la proteína proapoptótica Bid originándose una forma truncada de dicha proteína (tBid) que es capaz a su vez de inducir la oligomerización de las proteínas proapoptóticas Bak/Bax promoviendo la formación de poros en la membrana permitiendo la liberación desde la mitocondria de factores apoptogénicos como el citocromo c (41). 2) La vía de la exocitosis granular es un mecanismo mediante el cual las células NK producen la muerte de la célula diana a través de la liberación de gránulos citotóxicos que contienen en su interior: perforinas y granzimas (42, 43). La interacción de las perforinas o citolisinas (proteínas que poseen una cierta homología estructural con el C9 del complemento) con la membrana de la célula diana se establece a través de fosfolípidos que contienen fosfatidilcolina resultando en formación de un canal en la membrana (poro). Este poro tiene una doble función: facilita la muerte de las células diana por osmolisis y provee una puerta de entrada a las otras moléculas efectoras, principalmente las granzimas. Las granzimas son unas serin proteínas capaces de inducir la apoptosis a través de la activación de las caspasas (vía caspasa 3) (44). Existen distintos subtipos de granzimas teniendo especial importancia en la inducción apoptótica la granzima B (45, 46). Se ha demostrado que la granzima B puede acceder a las células dianas en ausencia de las perforinas, pero en este caso quedan capturadas dentro de vesículas endocíticas sin poder ejercer su efecto apoptótico (47). Este hecho nos demuestra que la actividad apoptótica de la granzima B solo es posible si se encuentra libre en el Introducción 12 citoplasma y si las perforinas pueden actuar para proveerles la puerta de entrada la célula diana. Además de perforinas y granzimas, los gránulos contienen otras moléculas como TNF-β y condroitín sulfato A, un proteoglicano cargado negativamente que resiste a la acción de la proteasas y tiene la aparente función de proteger a la célula NK de la autolisis por sus propios agentes letales (48). También se ha descrito otro componente de los gránulos citotóxicos de las células NK a través del cual también pueden ejercen su actividad citolítica, la granulisina (49). La granulisina es un péptido de 15kDa con funciones anti-microbianas y anti-tumorales presente solo en humanos y que se ha comprobado que induce apoptosis en células infectadas y tumorales (50). 2.2. Senescencia del Sistema Inmune (Inmunosenescencia). Se ha definido la inmunosenescencia como un estado de desregulación de la función del sistema inmune observado en muchos organismos (incluido el ser humano) con el aumento de la edad que contribuye a un incremento de la susceptibilidad a infecciones, cáncer y trastornos autoinmunes (6). El sistema inmune innato está compuesto por un entramado celular que comprende neutrófilos, células NK, células NKT, monocitos, macrófagos y células dendríticas que intervienen en la defensa temprana frente a los patógenos. Con el incremento de la edad, se favorece un ambiente proinflamatorio constitutivo con un grado bajo pero persistente de activación de estas células que puede aumentar el daño tisular ocasionado por las infecciones (1). La inmunosenescencia en el sistema inmune innato tiene una complejidad considerable, ya que aunque muchas respuestas del sistema inmune innato disminuyen con la edad, hay también evidencias de que se produce una hiperreactividad de las células que componen dicho sistema inmune (Tabla 4). Introducción 13 Tabla 4. Cambios relacionados con la edad en el sistema inmune innato. Panda A et. al. Trends Immunol, 2009; 30(7): 325–333. Por otra parte, cuando se considera el sistema inmune y el impacto de la edad en su función es importante recordar que éste no funciona solo, es decir, hay que tener en cuenta los factores hormonales tales como las hormonas sexuales y las suprarrenales. La edad está asociada a un marcado cambio en el ambiente hormonal que contribuye a la variabilidad individual del declive del sistema inmune. Hay estudios que indican que el suplemento de hormonas dehidroepiandrosterona y dehidroepiandrosterona sulfato potencian in vitro la función de las células NK, los monocitos y los neutrófilos incrementando la protección frente a infecciones bacterianas en ratones (1). Se han observado alteraciones tanto en la actividad como en los mecanismos de regulación y en el número de células circulantes. Esta pérdida del sistema inmune innato asociada a la edad tiene importantes consecuencias. Una reducción de la actividad de neutrófilos y células NK implica un aumento de la mortalidad y morbilidad en adultos (51). La desregulación observada de la función de los TLR (Toll like Introducción 14 receptors) llevada a cabo por monocitos y macrófagos afecta tanto a la respuesta a vacunas como a infecciones víricas (52). 2.2.1. Papel de las células NK en la inmunosenescencia. Las células NK juegan un papel importante en la defensa del sistema inmune innato, principalmente en las infecciones frente a virus y tumores. En lo referente al número absoluto de células NK en sangre periférica, estudios previos han descrito un mayor número de células NK en personas mayores (53-55). Nuestro grupo ha encontrado una correlación directa entre el porcentaje de células NK y la edad en pacientes con fractura de cadera (17). Llama la atención el hecho de que el ejercicio físico evite este aumento de células NK asociado a la edad en mujeres (56). Hay estudios que indican que la actividad citotóxica de las células NK se mantiene con la edad (57). Sin embargo, se ha descrito que el número absoluto de células NK aumenta con la edad reflejándose en un aumento de las células CD56 dim (población con función principalmente citotóxica) (10, 58). También se ha descrito que conforme se avanza en edad, se produce una redistribución de las subpoblaciones de células NK produciéndose la expansión de la subpoblación CD56 dim y un descenso de la población CD56 bright (59). Este hecho puede enmascarar defectos funcionales de las células NK, es decir, la capacidad citotóxica de las células NK disminuye con la edad pero el aumento de población de las células NK compensa este defecto funcional. Por otra parte, hay trabajos que han descrito una disminución de la actividad de las células NK conforme aumenta la edad del individuo (14), en algunos casos asociada a una disminución en la producción de IFN-γ en respuesta a IL-2 y a IL-6 (13, 15). Parece que el defecto asociado a la función citotóxica de las células NK está relacionado con un defecto en la generación de inositol trifosfato que no afecta a la ADCC pero sí a la citotoxicidad natural (60). Dicha disminución de la capacidad citotóxica de las células NK supone un alto factor de riesgo de aparición de infecciones en pacientes de edad avanzada. Introducción 15 También se han relacionado estas alteraciones en la función de las células NK asociadas a la edad con cambios en la homeostasis del Zinc (factores nutricionales). Hay evidencias de que un suplemento de Zinc puede mejorar la función citotóxica de las células NK (61). Por otra parte, entre otras posibles causas planteadas para justificar la deficiencia funcional de las células NK en relación con la edad, se ha implicado el acortamiento de los telómeros (62) o la reducción en la producción o expresión de perforina (6). Recientemente se ha sugerido que el número de células NK se mantiene por un proceso de diferenciación continua asociado a la expresión de CD57 (63). Las células NK CD57+ muestran una mayor capacidad citotóxica, una alta sensibilidad a la estimulación vía CD16, una menor respuesta a la estimulación por parte de citocinas y una menor capacidad de proliferación. Se ha observado que la expresión de CD57 esta aumentada en las células CD56 dim , lo que podría explicar las características funcionales de las células NK en la vejez: una reducción de la salida a periferia de células CD56 bright mas inmaduras y una acumulación de células altamente diferenciadas CD56 dim CD57+ que lleva a la expresión alterada de algunos receptores de células NK, al descenso de la proliferación en respuesta a citocinas y a la preservación de la capacidad citotóxica mediada por CD16 (64). Esta remodelación de las subpoblación de células NK contribuye a la desregulación de la respuesta tanto innata como adaptativa ya que las citocinas producidas por las células CD56 bright no solo son críticas para la activación de las células dendríticas (DCs, dentritic cells), sino que también interaccionan con los monocitos promoviendo un estado inflamatorio. Otros cambios fenotípicos de las células NK observados en el estado adulto han sido una disminución de la expresión de los receptores de citotoxicidad natural NKp30 y NKp46 (65). Tanto NKp30 como NKp46 son receptores implicados en el mecanismo de reconocimiento y muerte de las células diana por parte de las células NK, de forma que alteraciones en su expresión pueden ser las responsables del decaimiento de la capacidad citotóxica observado con el aumento de edad. Además, NKp30 juega un importante papel regulatorio, ya que interviene en el reconocimiento por parte de las células NK de ligandos extraños presentados por las DCs (66). Este receptor puede producir directamente la muerte de las DCs inmaduras por acción de las células NK o Introducción 16 puede producir la secreción de IFN-γ y TNF-α para la posterior maduración de las DCs (67). De esta forma, al darse una disminución de la expresión de NKp30 en las células NK de individuos mayores debería verse afectada también la capacidad de inicio de una respuesta inmune adaptativa frente a virus y tumores, ya que las interacciones celulares entre células NK y DCs pueden verse modificadas. En lo referente a otros receptores activadores, como es el caso del receptor NKG2D no se han observado cambios de expresión fenotípica entre el estado adulto y joven (68). Respecto a los receptores de tipo inhibidor, los resultados obtenidos de los estudios realizados son discrepantes. Mientras que algunos autores indican que la función de los receptores KIR no está afectada significativamente (12), otros estudios muestran que se produce un incremento de los receptores inhibidores tipo KIR con la edad acompañado de una disminución de la expresión del receptor también inhibidor CD94/NKG2A (16). También se ha observado la disminución de los niveles de ciertas citocinas y quimiocinas reguladoras de la actividad inmunológica de las células NK. Se ha observado una disminución conforme avanza la edad de IL-2-inductora de la producción de IFN-γ y de IL-2 e IL-12 inductoras de la producción de quimiocinas tales como RANTES, MIP1α e IL-8 (69). Aunque la producción de IFN-γ por parte de las células NK se mantiene con la edad, se ha observado un descenso de la producción de IFN-γ en respuesta al estimulo de IL-2 o IL-12 (70). Considerando que estas quimiocinas están producidas fundamentalmente por las células NK CD56 bright , el decaimiento de esta población con la edad explica el hecho de dicha disminución. Estas citocinas y quimiocinas inmunoreguladoras modularán la respuesta inmune adaptativa mediada por linfocitos T helper, lo que sugiere que la amplia gama de activadores de células NK y de respuestas de dichas células proporcionará una eficiente respuesta inmune innata contra virus y tumores que desembocará en una repuesta inmune adaptativa (8). Las alteraciones del sistema inmune innato mediadas por células NK pueden promover por tanto las discapacidades del sistema inmune adaptativo que se muestran en enfermedades relacionadas con la edad como infecciones y tumores. Introducción 17 Todo ello sugiere que entre los factores que contribuyen en el riesgo asociado a la edad de padecer más infecciones, podría estar implicada una disfunción en la actividad de las células NK. 2.3 Artritis reumatoide (AR) La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune sistémica caracterizada por la producción de una inflamación crónica, principalmente en las articulaciones. Se caracteriza por una infiltración inflamatoria en el sinovio linfocitos y por una hiperplasia de la línea sinovial, potenciándose la angiogénesis y conduciendo todo ello a la destrucción del cartílago y del hueso (19). La AR es el trastorno autoinmune más común, con una prevalencia del 1% en los países desarrollados. Supone una reducción significativa de la movilidad y morbilidad de los pacientes afectados. Puede aparecer a cualquier edad, pero es más frecuente a partir de los 40-50 años siendo tres veces más frecuente en las mujeres que en los hombres. Aunque la RA es de etiología desconocida, es una enfermedad de base autoinmune en la que ciertas citocinas como el TNF-α juegan un papel muy importante en la inflamación producida y la progresión de la enfermedad. Mientras el sinovio de pacientes sanos permanece acelular, el de pacientes con AR contiene un gran infiltrado de células inflamatorias, no sólo macrófagos y células T sino también de células plasmáticas, células dendríticas y neutrófilos. De hecho, no sólo los factores solubles están implicados en la patogénesis de la AR sino que las interacciones célula-célula entre macrófagos, fibroblastos, células B y otras células residentes mantienen a las células en un estado activado permanente dentro de la articulación y también contribuyen a la progresión de la enfermedad tanto con una producción excesiva de citocinas proinflamatorias como promoviendo la destrucción articular (20). 2.3.1. Papel de las células NK en AR Se ha descrito que las células NK parecen jugar un importante papel en la regulación de diversas enfermedades autoinmunes (71, 72). Introducción 18 En el caso de la AR, los datos sobre el papel de las células NK son contradictorios atribuyéndoles tanto un papel regulador como patogénico en esta enfermedad (21). En cuanto a su posible papel regulador, se ha descrito la presencia de un incremento de células NK CD56 bright en líquido sinovial de pacientes con AR que podría modular la progresión de la enfermedad (73). En esta línea, se ha descrito una disminución de la capacidad citotóxica de las células NK de sangre periférica que podría suponer el deterioro de un importante punto de regulación de la respuesta inmune exacerbada que se produce en la AR (74). Distintos trabajos empleando el modelo experimental murino de AR (CIA, collagen-induced arthritis) han otorgando también un papel protector a las células NK (75, 76). Sin embargo y en contraste con lo anterior, otros autores empleando este mismo modelo de CIA han descrito que las células NK parecen tener un papel claramente patogénico en la AR (77). En definitiva, a la vista de los datos actuales sigue sin estar claramente definido si las células NK juegan un papel suprimiendo o promoviendo el desarrollo de la afectación articular en la AR. 19 3. Metodología 3.1. Pacientes incluidos en el estudio. Los pacientes han sido seleccionados al azar entre los candidatos a cirugía ortopédica del Servicio de Traumatología y Cirugía Ortopédica del Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, descartando aquellos con antecedentes de neoplasias, tratamientos inmunomoduladores, o enfermedades autoinmunes. Las artroplastias de rodilla corresponden a pacientes con artrosis degenerativas. El presente estudio incluye 19 pacientes con una media de edad de 66,5±14,0 años de los que 9 son hombres (47,4%) y 10 son mujeres (52,6%). En la tabla 5 se resumen las principales características epidemiológicas y el diagnostico de los pacientes incluidos en el estudio. Todos los pacientes han dado su aprobación para el presente estudio por escrito mediante un consentimiento informado acompañado de las informaciones pertinentes. Los procedimientos experimentales llevados a cabo en este estudio han sido aprobados por el Comité Ético de Investigación Clínica de Aragón. Las muestras de líquido sinovial se obtuvieron, bien a partir de cirugía articular, bien a partir de las artrocentesis evacuadoras realizadas en los pacientes como tratamiento por su patología articular. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron a partir de las extracciones sanguíneas realizadas mediante venopunción como consecuencia del estudio clínico de los pacientes. Se establecieron tres grupos para el posterior análisis de los resultados: • Pacientes entre 30-60 años (Pacientes 12, 18, 19, 20 y 23; n=5). • Pacientes entre 61-80 años (Pacientes 3-9, 13-15 y 21; n=11). • Pacientes mayores de 80 años (Pacientes 16, 17 y 22; n=3). Metodología 26 7. CD56- APC / NKp30-PE 8. CD56- APC / NKp44-PE 9. CD56- APC / NKp46-PE Para ello se centrifugaron las 10x10 5 células mononucleares, se eliminó el sobrenadante, se resuspendió el pellet celular en 900 µL de tampón PBS 5% FBS y se repartieron 100 µL en cada uno de los 9 tubos necesarios para cada uno de los marcajes. A cada tubo se añadió 2 µL de los anticuerpos monoclonales correspondientes y se incubaron 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. Posteriormente, se trasvasó el contenido a un tubo de citómetro al que se le había añadido previamente 100 µL de tampón PBS 5% FBS y se analizó mediante citometría de flujo empleando un citómetro FACScan (Becton & Dickinson). El análisis de los resultados se realizó empleando el software Weasel v3.0.1 (Walter Eliza Hall Institute). En todos los casos se realizó un doble marcaje en el que siempre se incluía el anticuerpo anti-CD56 para poder analizar dentro de la población CD56+ la presencia de los distintos marcadores previamente descritos. Los resultados del marcaje con CD16, de los marcadores de activación y de los receptores de activación y de inhibición se indican como el porcentaje de células positivas para cada marcador dentro de la población de células CD56+. 3.7. Estudio de citotoxicidad de las células NK. Para analizar la capacidad citotóxica de las células NK obtenidas de las muestras de sangre periférica y de líquido sinovial se realizaron co-cultivos de las células NK (células efectoras) con la línea celular tumoral K562 (células diana). Para poder analizar posteriormente la muerte celular específica de las células diana, previamente a realizar el ensayo de citotoxicidad, las células efectoras se marcaron con la sonda fluorescente Cell Tracker Green (CTG, Invitrogen). El CTG (5- chloromethylfluorescein diacetate) es un reactivo fluorescente (verde) que atraviesa libremente la membrana de las células y una vez dentro de éstas reacciona con los grupos tioles presentes en ellas a través de su grupo clorometilo por medio de una reacción mediada por la enzima glutation S-transferasa, de manera que queda retenido en el interior de la célula sin impedir su viabilidad. Metodología 27 A continuación se explica el método empleado para realizar el marcaje con CTG. Las células NK purificadas tras la separación por MACS a partir de sangre periférica, o las SFMCs obtenidas tras filtración del líquido sinovial y posterior centrifugación en gradiente de Ficoll, se centrifugaron durante 5 minutos a 1.200 rpm, se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 1 mL de PBS conteniendo CTG 0,1 mM por cada 2x10 6 células. Las células se incubaron durante 10 minutos a 37ºC tras lo cual se centrifugaron durante 15 segundos a 10.000 rpm. Posteriormente se eliminó el sobrenadante, se resuspendió el pellet en 1 mL de medio completo con FBS decomplementado (el FBS se trata 30 minutos a 56ºC para inactivar el sistema complemento) y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Luego, se centrifugaron las células durante 15 segundos a 10.000 rpm y se resuspendieron en el volumen adecuado de medio completo decomplementado para que su concentración fuera 5x10 6 cel/mL. Una vez marcadas con CTG las células efectoras están listas para el ensayo de citotoxicidad. Para realizar dicho ensayo, se empleó una placa de 96 pocillos de fondo redondo. En uno de los pocillos se co-cultivaron las células efectoras y las células diana en la siguiente proporción: 10 células efectoras (NK):1 células diana (K562) En el caso de las células efectoras obtenidas a partir de sangre periférica tras realizar la separación mediante MACS, como ya se ha indicado en todos los casos el porcentaje de células CD56+ obtenidas era superior al 90%, de modo que el número final de células efectoras que se disponían en el pocillo se determinaba directamente mediante contaje por tinción con azul tripán. Respecto a las células efectoras obtenidas a partir de líquido sinovial, no se realizó purificación de la población de células NK mediante MACS ya que el número de SFMCs obtenido era normalmente pequeño, de modo que el rendimiento de la purificación por MACS no era óptimo. Para obtener el número de células efectoras presentes en la muestra de SFMCs, éstas se incubaron con el anticuerpo monoclonal anti-CD56 conjugado con el fluoróforo FITC y se analizó mediante citometría de flujo. Sabiendo el número de SFMCs totales previamente obtenido mediante contaje con tinción con azul tripán y con el porcentaje de células CD56+ obtenido mediante Metodología 28 citometría de flujo se calculó en número de células efectoras presentes en la muestra de la siguiente manera: El volumen final en cada pocillo fue de 200 µL empleando en todos los casos medio completo decomplementado para evitar la muerte por la activación del sistema del complemento La incubación se realizó en un incubador termostatizado a 37ºC durante 4 horas, tras lo cual se procedió al análisis de los parámetros de muerte celular de las células diana mediante citometría de flujo tal y como se comenta en el siguiente apartado. En todos los ensayos se dispuso un pocillo con células K562 solas para determinar la muerte basal de estas células durante cada ensayo (Figura 2). Figura 2. Esquema de la placa de citotoxicidad. Al haber marcado las células efectoras (células NK) con CTG previamente al ensayo de citotoxicidad, se puede diferenciar las dos poblaciones presentes en el cocultivo (células efectoras y células diana) en el análisis por citometría de flujo. De este modo, se puede analizar específicamente la apoptosis en las células diana seleccionando la población celular CTG negativa (células K562). Para calcular la apoptosis inducida específicamente en las células diana (células K562) por las células efectoras (células NK) en cada ensayo de citotoxicidad, a la muerte celular observada en la población CTG negativa del pocillo en el que se había realizado el co-cultivo, se le restó la muerte celular basal observada en el pocillo control (con células K562 solas): Pocillo 10:1: 100 µl de células efectoras (5x10 6 cel/ml) + 100 µL células diana (5x10 5 cel/ml). Pocillo K562: 100 µl de K562 + 100 µL medio completo decomplementado. SP LS 10:1 K562 10:1 K562 SP: sangre periférica LS : líquido sinovial Metodología 29 3.7.1. Citometría de flujo. En el estudio de la muerte celular mediante citometría de flujo se analizaron dos parámetros característicos de la apoptosis: • Translocación de la fosfatidilserina (marcaje con Anexina V)). • Permeabilidad de la membrana celular (marcaje con 7AAD). La fosfatidilserina es un fosfolípido que se encuentra en la cara interna de la membrana plasmática. En etapas tempranas de la apoptosis se produce su translocación a la cara externa, de forma que queda accesible a proteínas que se unen específicamente a ella, como es la anexina V (Ann-V), la cual es dependiente de la presencia de calcio para su unión. La determinación de la permeabilidad de la membrana celular se realiza a través del marcaje con 7-AAD (7-amino-actinomycin D). Se trata de un colorante que se une al DNA intercalándose en la doble cadena mostrando autofluorescencia. En etapas tardías de apoptosis la membrana plasmática esta permeabilizada de forma que el DNA de células apoptóticas se encuentra accesible al 7-AAD. Habrá que tener en cuenta que este 7-AAD también se unirá al DNA de células necróticas, no solo apoptóticas, ya que la membrana también está permeabilizada en dicha situación. Para medir estos eventos indicadores de apoptosis se utilizó una Ann-V marcada con el fluoróforo APC detectable en el canal de fluorescencia FL-4 del citómetro de flujo y 7-ADD detectable en el canal FL-3 del citómetro de flujo. Para realizar el marcaje de fluorescencia se centrifugaron 5 minutos a 1.500 rpm las células a analizar, se eliminó el sobrenadante y se añadió 100µL de tampón ABB (annexin binding buffer), 3 µL de Ann-V-APC y 1.5 µL de 7-AAD. Las células se incubaron 15 minutos en incubador termostatizado a 37ºC tras lo cual se trasvasaron a un tubo de citometría que contenía 100 µL de tampón ABB 1X y se analizó empleando un citómetro FACScan y el análisis de los resultados se realizó mediante el software Weasel v3.0.1. Metodología 30 En la Figura 3 se muestra un esquema representando el procedimiento metodológico completo de los ensayos de citotoxicidad realizados en el presente trabajo. Figura 3. Esquema general del procedimiento completo empleado en los ensayos de citotoxicidad. 3.8. Análisis de los resultados Para todos los estudios de comparación entre variables cuantitativas ha sido aplicado el test de la t de Student. En todos los casos, se ha considerado como significativamente estadístico una valor de p <0,05. Los datos estadísticos han sido analizados usando el software SPSS for Windows Release 15.0 (SPSS Inc.). PBMC: PERIP HERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS SFMC: SYNOVIAL FLUID MONONUCLEAR CELLS SP (sangre periférica) L S (líquido sinovial) 31 4. Resultados 4.1. Estudio comparativo de las células NK según la edad. Se va a comparar tanto el fenotipo como la capacidad citotóxica de las células NK según los rangos de edad establecidos. Todos los resultados han sido analizados en base a tres grupos poblacionales con los siguientes rangos de edad: • Entre 30-60 años. • Entre 61-80 años. • Mayores de 80 años. 4.1.1. Estudio fenotípico de las células NK en sangre periférica según la edad. Para poder estudiar los marcadores fenotípicos en las células NK se realizó en todos los casos un doble marcaje en el que siempre se incluía el marcador de selección característico de las células NK (CD56), y el marcador a analizar. Tal y como se ha descrito en el apartado de Metodología, los resultados de los marcadores analizados (CD16, marcador de caracterización; CD69 y HLA-DR, marcadores de inhibición; NKG2A e ILT-2, receptores de activación; NKG2D, NKp30, NKp44 y NKp46, receptores de activación) se muestran como el porcentaje de células positivas para cada marcador dentro de la población CD56 positiva (Figura 4). Resultados 32 Figura 4 . Resultados del estudio inmunofenotípico de células NK en sangre periférica mediante citometria de flujo en una muestra representativa (Paciente 19). En la columna A se muestra el % de células doblemente positivas (para CD56 y para el marcador estudiado) en color azul. En la columna B se muestra el % de población CD56+ presente en la muestra en color rojo. En la columna C se muestra el % de células positivas para el marcador estudiado dentro de la población CD56+ en color morado. Los marcadores estudiados para cada muestra han sido: CD16, HLA-DR, NKG2A, ILT-2, NKG2D, NKp30, NKp44 y NKp46 Resultados 33 El análisis de los resultados se ha realizado dividiendo en los siguientes grupos los marcadores a estudiar: • Marcadores de selección: CD56. • Marcadores de caracterización: CD16. • Marcadores de activación: CD69 y HLA-DR. • Receptores de inhibición y de activación: NKG2A, ILT-2, NKG2D, NKp30, NKp44 y NKp46. • Marcador de selección CD56: se observa como la población de células NK aumenta con la edad (de un 3% a un 5%) hasta llegar a una edad superior a 80 años en la cual se observa una disminución de células NK (hasta aproximadamente un 2%), siendo significativo este descenso observado entre el grupo de edad de 61-80 años y el grupo >80 años (Figura 5). Figura 5. Gráfica que representa el promedio de células NK (CD56+) aisladas en los tres grupos poblacionales: entre 30-60 años (n=4), entre 61-80 años (n=3) y mayores de 80 años (n=2). En la tabla de la derecha se muestran los datos numéricos de la gráfica (media del porcentaje ± SD). * p<0,05. • Marcador de caracterización CD16: se observa una tendencia al aumento en el número de células CD16 positivas (desde casi un 56% hasta un 74%) conforme se aumenta de edad (Figura 6). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 30-60 AÑOS 61-80 AÑOS > 80 AÑOS células + (%) CD56 * EDAD % CD56 30-60 AÑOS 3,25 ± 1,43 61-80 AÑOS 5,15 ± 1,42 > 80 AÑOS 1,95 ± 0,02 Resultados 34 Figura 6. Gráfica que representa el porcentaje de células que expresan CD16 dentro de la población CD56+ (células NK) en los tres grupos poblacionales: entre 30-60 años (n=4), entre 61-80 años (n=3) y mayores de 80 años (n=2). En la tabla de la derecha se muestran los datos numéricos de la gráfica (media del porcentaje ± SD). Además del porcentaje de células CD16 positivas, también se ha estudiado el nivel de expresión de CD16 en la población CD56 positiva analizando la intensidad de fluorescencia media de la población CD16 positiva. Al igual que en el caso del número de células que expresan este marcador, se observa una tendencia al aumento en la intensidad media de expresión de CD16 dentro de la población CD16 positiva (desde 600 unidades arbitrarias -U.A.- hasta casi 800 U.A. de fluorescencia) conforme se aumenta de edad (Figura 7). Figura 7. Gráfica que representa la intensidad media de fluorescencia de CD16 de las células que expresan este marcador dentro de la población CD56+ (células NK) en los tres grupos poblacionales: entre 30-60 años (n=4), entre 61-80 años (n=3) y mayores de 80 años (n=2). En la tabla de la derecha se muestran los datos numéricos de la gráfica (media del porcentaje ± SD). 0 20 40 60 80 100 120 30-60 AÑOS 61-80 AÑOS > 80 AÑOS % células + (en células CD56+) CD16 EDAD % CD16 (en células CD56+) 30-60 AÑOS 55,97 ± 15,60 61-80 AÑOS 61,46 ± 40,07 > 80 AÑOS 74,35 ± 27,70 0 200 400 600 800 1000 30-60 AÑOS 61-80 AÑOS >80 AÑOS U.A. Fluorescencia Nivel de expresión de CD16 EDAD Expresión CD16 (U.A. Fluorescencia) 30-60 AÑOS 609,78 ± 128,26 61-80 AÑOS 751,43 ± 217,95 > 80 AÑOS 799,80 ± 64,77 Resultados 35 • Marcadores de activación CD69 y HLA-DR: en el caso de CD69, a pesar de la gran variabilidad en el grupo de edad de 61-80 años, se observa un aumento progresivo de células CD69 positivas conforme se avanza en edad (de un 15% hasta prácticamente un 40%). En el caso de HLA-DR, no se observan cambios destacables en los tres grupos de edad estudiados (Figur a 8). Figura 8. Gráfica que representa el porcentaje de células que expresan CD69 y HLA-DR dentro de la población CD56+ (células NK) en los tres grupos poblacionales: entre 30-60 años (n=4), entre 61-80 años (n=3) y mayores de 80 años (n=2). En la tabla inferior se muestran los datos numéricos de la gráfica (media del porcentaje ± SD). • Receptores de inhibición y de activación NKG2A, ILT-2, NKG2D, NKp30, NKp44 y NKp46: en el caso de NKG2A, a pesar de la variabilidad en el grupo >80 años, no se observa una gran variación con la edad. En el caso de ILT-2 parece observarse una tendencia a su disminución en el grupo >80 años. Respecto a los marcadores de activación (NKG2D, NKp30, NKp44 y NKp46) se observa una tendencia clara a su aumento conforme se avanza en edad. Este aumento es más pronunciado en el caso de NKp30, NKp44 y NKp46 (receptores de citotoxicidad natural) y sobre todo en el grupo de >80 años. Respecto a la expresión del receptor de 0 10 20 30 40 50 60 70 CD69 HLA DR % células + (en céulas CD56+) Marcadores de activación 30 - 60 AÑOS 61-80 AÑOS > 80 AÑOS EDAD % CD69 (en células CD56+) % HLA-DR (en células CD56+) 30-60 AÑOS 15,03 ± 5,03 24,51 ± 7,00 61-80 AÑOS 26,57 ± 38,25 17,22 ± 10,53 > 80 AÑOS 39,09 ± 12,99 29,65 ± 25,34 Resultados 42 Figura 16. Gráfica que representa el porcentaje de células que expresan NKG2A, ILT-2 NKG2D, NKp30, NKp44 y NKp46 dentro de la población CD56+ (células NK) en SP y LS. En la tabla inferior se muestran los datos numéricos de la gráfica (media del porcentaje ± SD). El número de pacientes analizado ha sido n=4. * p<0,05. 4.2.2. Estudio comparativo de la citotoxicidad de las células NK de sangre periférica y de líquido sinovial. También se analizó comparativamente la citotoxicidad de las células NK de SP y LS del mismo paciente en cada una de las muestras en las que fue posible, para estudiar las posibles diferencias de capacidad citotóxica entre las células NK implicadas en una respuesta inmune general (SP) y las células NK implicadas en un respuesta inmune local (LS) (Figura 17). 0 20 40 60 80 100 120 NKG2A ILT2 NKG2D KNP30 NKP44 NKP46 % células + (en células CD56+) Receptores de inhibición/activación SP LS * * * Receptores de INHIBICIÓN Receptores de ACTIVACIÓN % NKG2A (en células CD56+) % ILT-2 (en células CD56+) % NKG2D (en células CD56+) % NKp30 (en células CD56+) % NKp44 (en células CD56+) % NKp46 (en células CD56+) SP 30,94 ± 7,50 49,90 ± 19,77 5,23 ± 4,88 47,52 ± 47,76 38,39 ± 26,39 52,94 ± 31,42 LS 78,78 ± 24,73 76,14 ± 25,99 12,90 ± 4,33 75,55 ± 24,73 78,26 ± 17,09 89,66 ± 18,83 Resultados 43 Figura 17. Gráfica que representa los niveles de apoptosis mediante doble marcaje con Ann-V y 7-AAD dentro de la población K562 (muerte específica) en SP y LS. En la tabla de la derecha se muestran los datos numéricos de la gráfica (media del porcentaje ± SD). El número de pacientes analizado ha sido n=5. * p<0,05. En lo que al estudio comparativo de la citotoxicidad de las células NK se refiere, los resultados muestran como la muerte específica producida por las células NK es significativamente superior en SP (29%) frente a la producida en LS (5%). 4.2.3. Estudio comparativo de la citotoxicidad de las células NK de sangre periférica y de líquido sinovial en artritis reumatoide. En este trabajo también se ha analizado la capacidad citotóxica de las células NK de SP y LS de un paciente con artritis reumatoide (Tabla 6). Tabla 6. Representación de los niveles de apoptosis mediante marcaje con Ann-V, con 7-AAD y doble marcaje dentro de la población K562 (muerte específica) en SP y LS en paciente de artritis reumatoide. Como se observa, las células NK de SP de este paciente mostraron una menor capacidad citotóxica que las células NK de LS cuando se analiza tanto las células Ann-V positivas, las células 7-AAD positivas o las células dobles positivas (Ann-V y 7-AAD positivas). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 SP LS células Ann-V+ / 7-AAD+ % Muerte específica * % Muerte específica (células Ann-V+ / 7-AAD+) SP 29,24 ± 14,31 LS 5,38 ± 2,53 % Muerte específica %Muerte específica %Muerte específica (Ann-V+) (7-AAD+) (Ann-V+ 7-AAD+) SP -AR- 2,70 0,20 1,00 LS -AR- 12,30 12,40 8,30 44 5. Discusión Los cambios funcionales en los componentes del sistema inmune conforme se avanza en edad (inmunosenescencia) todavía no han sido completamente caracterizados. Se ha comprobado que se produce una desregulación del sistema inmune conforme aumenta la edad que conduce a una mayor propensión a infecciones, tumores, enfermedades autoinmunes y resistencia a la acción de ciertas vacunas (1, 9, 78). Entre los estudios que se están realizando en este campo, cada vez más estudios se están centrando en el sistema inmune innato y dentro de éste, en el papel que juegan las células NK (16, 58, 61). Se ha demostrado que el papel de las células NK es muy importante, no sólo por su capacidad citotóxica frente a las células diana, sino también por su capacidad inmunoreguladora que influye en la inducción de una respuesta inmune adaptativa eficiente (34, 79). En el presente trabajo se ha analizado la capacidad citotóxica y expresión de diversas moléculas de superficie en células NK de sangre periférica y su variación con la edad. Además, se ha estudiado estos mismos parámetros en paralelo en células NK de sangre periférica y de líquido sinovial para analizar las posibles diferencias en la actividad y fenotipo de las células NK a nivel sistémico y a nivel local, en este caso en la articulación afectada en muestras de pacientes candidatos a cirugía ortopédica del Servicio de Traumatología y Cirugía Ortopédica del Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. En el presente trabajo, en cuanto a los resultados obtenidos en el estudio de las células NK según la edad se refiere, los datos del análisis inmunofenotípico de células NK en sangre periférica indican un bajo porcentaje de células NK (CD56 positivas) en sangre en todos los grupos de edad estudiados. Aún así, se observa un aumento en el porcentaje de células NK en la población entre 61-80 años, lo cual se correlaciona con la mayor capacidad citotóxica de las células NK observada en este grupo de población. Según distintos estudios se ha observado que el número de células NK aumenta con la edad (1, 6), y este aumento se asocia a un aumento de células NK CD56 dim (población con un alto nivel de expresión de CD16) (10). En nuestro estudio no hemos observado Discusión 45 diferencias significativas en el nivel de expresión de CD56 dentro de la población celular positiva para este marcador (datos no mostrados), pero se ha observado una tendencia tanto al aumento del porcentaje de la población CD16 positiva como de su nivel de expresión conforme se avanza en edad lo que sugiere en concordancia con lo descrito previamente (10), que se puede estar produciendo una reorganización fenotípica de las células NK (de una subpoblación CD56 bright – más secretora-, a CD56 dim –más citotóxica-) en un intento de compensar la disminución de la capacidad citotóxica observada en el grupo de mayores de 80 años. Estudios previos han descrito un aumento de marcadores de activación conforme aumenta la edad en este caso en linfocitos T (80). En el presente trabajo también se ha analizado la expresión de marcadores de activación (CD69 y HLA-DR) ya descritos como tales en las células NK de sangre periférica (81). A pesar de la gran variabilidad observada (sobre todo en el grupo de edad de 61-80 años), los datos obtenidos indican que el marcador temprano de activación CD69 parece incrementarse con la edad (fundamentalmente en el grupo de mayores de 80 años), mientras que no se observan variaciones en el marcador tardío de activación HLA-DR, a diferencia de lo descrito en linfocitos T en los que el mayor aumento se observa en la expresión de HLA-DR. En lo referente a CD69, se ha descrito que entre otras funciones induce la actividad citolítica mediada por células NK (82). Sin embargo, en el presente trabajo el aumento observado de CD69 no parece conllevar un aumento de la capacidad citotóxica de las células NK (83). En este sentido, se ha descrito que CD16 es uno de los estímulos que aumenta la expresión de CD69 (84). La tendencia tanto al aumento del porcentaje de la población CD16 positiva como de su nivel de expresión junto con la tendencia al aumento paulatino de CD69 observado podría sugerir que las células NK conforme avanza la edad tienden a presentar un fenotipo “activado” temprano que correspondería con el estado de hiperreactividad de las células del sistema inmune observado en la inmunosenescencia, en un intento de compensar su menor capacidad citotóxica, mostrando un estado de activación inicial que no llegaría a mantenerse en el tiempo (no se observa variaciones con la edad del marcador tardío de activación HLA-DR). Este estado de activación que aumenta conforme avanza la edad, se observa principalmente en el grupo de población de mayores de 80 años sin Discusión 46 embargo, no es suficiente para mantener la capacidad funcional de las células NK, grupo en el cual se observa ademán un descenso significativo del porcentaje de células NK. En este sentido, el mantenimiento de los receptores de inhibición analizados (NKG2A e ILT2) así como el aumento en el porcentaje de células NK que expresan receptores de activación (especialmente NKp30 y NKp46) que se observa con la edad y sobre todo en la población de mayores de 80 años estaría en la línea de lo anteriormente expuesto. Sin embargo, estos datos contrastan con otros previamente publicados que indican que la reducción de la capacidad citotóxica se refleja en una disminución de la expresión de receptores de citotoxicidad natural NKp30 y NKp46 (9). Estas discrepancias pueden ser debidas a diversos motivos como los distintos protocolos experimentales empleados, y la distinta edad de corte seleccionada para el estudio. Los datos mostrados en el presente trabajo sugieren que las células NK presentan un mayor estado de activación conforme se avanza en edad en un intento de compensar sus defectos funcionales asociados a la edad contribuyendo al estado “proinflamatorio” observado en la inmunosenescencia. No obstante, el número de muestras analizado en el presente estudio ha sido reducido, de forma que para validar los resultados mostrados sería necesario ampliar el estudio a un mayor número de sujetos. El conocimiento del fenotipo y actividad de células del sistema inmune asociado a la edad podría ser útil para establecer biomarcadores de riesgo inmune que puedan ayudar a la prevención de enfermedades asociadas a la edad en una sociedad actual en el que el número de personas mayores ha aumentado considerablemente, con el gasto socio-económico que ello supone. Respecto a los resultados obtenidos en el estudio comparativo de células NK de LS y SP, se observa que el porcentaje de células NK es menor en LS respecto a SP. En lo referente a CD16, aunque se observa que aunque el porcentaje de células CD16 Discusión 47 positivas es similar en SP y LS no ocurre lo mismo con su nivel de expresión, siendo éste significativamente inferior en LS, lo que concuerda con los estudios que indican un incremento de células NK tipo CD56 bright en el sinovio de pacientes con lesiones inflamatorias candidatos a cirugía ortopédica (85). Se ha observado en LS que esta subpoblación de células NK además de una pobre expresión de CD16 se caracteriza por la secreción de grandes cantidades de citocinas proinflamatorias que influyen en la comunicación entre las células NK y otras células (DCs, macrófagos) promoviendo la activación de dichas células NK reflejada a través de un incremento significativo del marcador de activación HLA-DR (86), tal y como observamos en los resultados obtenidos en el presente estudio. Para confirmar este fenotipo inmunosecretor observado en LS sería necesario realizar mediciones de los niveles de citocinas secretadas en el sobrenadante de los cultivos obtenidos de células NK tanto de LS como de SP. En cuanto a los receptores de activación e inhibición, diversos estudios analizando la expresión en células NK de receptores de activación en el líquido pleural o lavado bronco-alveolar de pacientes con distintas patologías respiratorias, han reportado una amplia expresión de todos los receptores de activación como NKp30, NKp46, Nkp44 y NKG2D (87, 88). Los datos del presente trabajo obtenidos en este caso en LS de pacientes candidatos a cirugía ortopédica, están en la línea de los trabajos mencionados observándose un aumento significativo de los marcadores de activación NKG2D y NKp44, éste último marcador de activación sistémica de las células NK que no se observa en pacientes sanos (31). Además, se ha observado también un incremento del marcador de inhibición NKG2A en paciente con AR y que parece estar asociado a la disminución de la capacidad citotóxica observada en las células NK (89). En el presente estudio también se observa una disminución de la capacidad citotóxica en el LS y aunque la población incluida en el presente estudio no tiene patologías autoinmunes como la AR, su patología articular también puede conllevar un estado inflamatorio crónico. En este sentido, parece que el fenotipo de las células NK en LS puede estar asociado a lesión articular independientemente de su causa (artrosis o artritis) (18). Los datos obtenidos parecen indicar que existe un fenotipo de las células NK en LS diferenciado respecto al observado en SP. En LS se observa un fenotipo Discusión 48 marcadamente “activado” reflejado en el aumento tanto de los receptores de activación anteriormente descritos como de los marcadores de activación CD69 y sobre todo HLA-DR indicando éste último que se trata de una activación persistente en el tiempo. Sin embargo, se produce una disminución significativa de la capacidad citotóxica que podría estar relacionada con el aumento también observado del receptor de inhibición NKG2A y/o con la disminución de la expresión de CD16 (implicado en la ADCC) y con el aumento de la producción de citocinas (fenotipo inmunosecretor) que conducen a la disfunción de las células NK. La existencia de este posible fenotipo “activado e inmunosecretor” en células NK de LS y diferenciado del fenotipo de las células NK presentes en SP hace pensar en la importancia de estudiar una población celular en el entorno local en el que se está produciendo la afectación y no suponer el mismo fenotipo y capacidad funcional a nivel sistémico (SP), hecho también observado en otros estudios (87, 88) y que permitirá un mejor entendimiento de la patología asociada y así como de un diseño de la mejor estrategia terapéutica posible. A la vista de estos datos, resulta importante estudiar las células NK (y en general cualquier tipo celular inmunológico implicado) en el entorno local en que se encuentran (en el presente trabajo, en LS) ya que como se ha visto, el fenotipo y capacidad funcional observado a nivel sistémico (SP), no tiene por qué ser el mismo que el observado a nivel local. En cuanto al análisis funcional de las células NK en pacientes de AR, sólo se pudo realizar el ensayo de citotoxicidad en uno de los dos pacientes de los que se recibió muestra. En este paciente se observó que la capacidad citotóxica de las células NK era superior en LS respecto a SP, lo que contrasta con los estudios que indican que la capacidad citotóxica de las células NK está disminuida en LS (74). Sin embargo, el único dato de citotoxicidad del presente trabajo es muy preliminar y se debe realizar un estudio con un número más amplio de pacientes de AR para confirmar lo observado en este único paciente. 49 6. Conclusiones Los resultados expuestos en el presente trabajo permiten obtener las siguientes conclusiones: 1. Las células NK de sangre periférica tienden a presentar un fenotipo de activación inicial conforme se avanza en edad. 2. La capacidad citotóxica de las células NK en sangre periférica aumenta en el grupo de edad de 61-80 años para luego disminuir en el grupo de edad de mayores de 80 años. 3. Las células NK del líquido sinovial de pacientes candidatos a cirugía ortopédica muestran un fenotipo de activación persistente, en comparación con las células NK de sangre periférica de estos pacientes. 4. Las células NK del líquido sinovial de pacientes candidatos a cirugía ortopédica muestran una menor capacidad citotóxica en comparación con las células NK de sangre periférica de estos pacientes. 50 7. Bibliografía 1. Shaw AC, Joshi S, Greenwood H, Panda A, Lord JM. 2010. Aging of the innate immune system. Curr Opin Immunol 22: 507-13 2. Orr MT, Lanier LL. 2011. Natural killer cell licensing during viral infection. Adv Exp Med Biol 780: 37-44 3. Waldhauer I, Steinle A. 2008. NK cells and cancer immunosurveillance. Oncogene 27: 5932-43 4. Facchini A, Mariani E, Mariani AR, Papa S, Vitale M, Manzoli FA. 1987. Increased number of circulating Leu 11+ (CD 16) large granular lymphocytes and decreased NK activity during human ageing. Clin Exp Immunol 68: 340-7 5. Fietta A, Merlini C, Dos Santos C, Rovida S, Grassi C. 1994. Influence of aging on some specific and nonspecific mechanisms of the host defense system in 146 healthy subjects. Gerontology 40: 237-45 6. Mocchegiani E, Malavolta M. 2004. NK and NKT cell functions in immunosenescence. Aging Cell 3: 177-84 7. Ogata K, An E, Shioi Y, Nakamura K, Luo S, Yokose N, Minami S, Dan K. 2001. Association between natural killer cell activity and infection in immunologically normal elderly people. Clin Exp Immunol 124: 392-7 8. Panda A, Arjona A, Sapey E, Bai F, Fikrig E, Montgomery RR, Lord JM, Shaw AC. 2009. Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age. Trends Immunol 30: 325-33 9. Solana R, Tarazona R, Gayoso I, Lesur O, Dupuis G, Fulop T. 2012. Innate immunosenescence: Effect of aging on cells and receptors of the innate immune system in humans. Semin Immunol 10. Borrego F, Alonso MC, Galiani MD, Carracedo J, Ramirez R, Ostos B, Pena J, Solana R. 1999. NK phenotypic markers and IL2 response in NK cells from elderly people. Exp Gerontol 34: 253-65 11. Chidrawar SM, Khan N, Chan YL, Nayak L, Moss PA. 2006. Ageing is associated with a decline in peripheral blood CD56bright NK cells. Immun Ageing 3: 10 12. Le Garff-Tavernier M, Beziat V, Decocq J, Siguret V, Gandjbakhch F, Pautas E, Debre P, Merle-Beral H, Vieillard V. 2010. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell 9: 527-35 13. Ginaldi L, De Martinis M, D'Ostilio A, Marini L, Loreto MF, Quaglino D. 1999. The immune system in the elderly: III. Innate immunity. Immunol Res 20: 117-26 14. Penschow J, Mackay IR. 1980. NK and K cell activity of human blood: differences according to sex, age, and disease. Ann Rheum Dis 39: 82-6 15. Srinivasan V, Maestroni GJ, Cardinali DP, Esquifino AI, Perumal SR, Miller SC. 2005. Melatonin, immune function and aging. Immun Ageing 2: 17 16. Lutz CT, Moore MB, Bradley S, Shelton BJ, Lutgendorf SK. 2005. Reciprocal age related change in natural killer cell receptors for MHC class I. Mech Ageing Dev 126: 722-31 17. Garcia-Alvarez F, Gonzalez P, Navarro-Zorraquino M, Larrad L, Garcia-Alvarez I, Pastor C, Lozano R. 2008. Immune cell variations in patients with hip fracture. Arch Gerontol Geriatr 46: 117-24 18. de Matos CT, Berg L, Michaelsson J, Fellander-Tsai L, Karre K, Soderstrom K. 2007. Activating and inhibitory receptors on synovial fluid natural killer cells of arthritis patients: role of CD94/NKG2A in control of cytokine secretion. Immunology 122: 291- 301 Bibliografía 51 19. Harris ED, Jr. 1990. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med 322: 1277-89 20. Andersson AK, Li C, Brennan FM. 2008. Recent developments in the immunobiology of rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 10: 204 21. Ahern DJ, Brennan FM. 2011. The role of Natural Killer cells in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: major contributors or essential homeostatic modulators? Immunol Lett 136: 115-21 22. Huntington ND, Vosshenrich CA, Di Santo JP. 2007. Developmental pathways that generate natural-killer-cell diversity in mice and humans. Nat Rev Immunol 7: 703-14 23. Ritz J, Schmidt RE, Michon J, Hercend T, Schlossman SF. 1988. Characterization of functional surface structures on human natural killer cells. Adv Immunol 42: 181-211 24. Lanier LL, Phillips JH, Hackett J, Jr., Tutt M, Kumar V. 1986. Natural killer cells: definition of a cell type rather than a function. J Immunol 137: 2735-9 25. Ljunggren HG, Karre K. 1990. In search of the 'missing self': MHC molecules and NK cell recognition. Immunol Today 11: 237-44 26. Lopez-Botet M, Bellon T. 1999. Natural killer cell activation and inhibition by receptors for MHC class I. Curr Opin Immunol 11: 301-7 27. Griffiths GM. 2003. Endocytosing the death sentence. J Cell Biol 160: 155-6 28. Robertson MJ. 2002. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J Leukoc Biol 71: 173-83 29. Bryceson YT, March ME, Ljunggren HG, Long EO. 2006. Activation, coactivation, and costimulation of resting human natural killer cells. Immunol Rev 214: 73-91 30. Cheent K, Khakoo SI. 2009. Natural killer cells: integrating diversity with function. Immunology 126: 449-57 31. Moretta A, Bottino C, Vitale M, Pende D, Cantoni C, Mingari MC, Biassoni R, Moretta L. 2001. Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cellmediated cytolysis. Annu Rev Immunol 19: 197-223 32. Smyth MJ, Cretney E, Kelly JM, Westwood JA, Street SE, Yagita H, Takeda K, van Dommelen SL, Degli-Esposti MA, Hayakawa Y. 2005. Activation of NK cell cytotoxicity. Mol Immunol 42: 501-10 33. Lanier LL. 2005. NK cell recognition. Annu Rev Immunol 23: 225-74 34. Walzer T, Dalod M, Robbins SH, Zitvogel L, Vivier E. 2005. Natural-killer cells and dendritic cells: "l'union fait la force". Blood 106: 2252-8 35. Nagata S, Golstein P. 1995. The Fas death factor. Science 267: 1449-56 36. Pitti RM, Marsters SA, Ruppert S, Donahue CJ, Moore A, Ashkenazi A. 1996. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J Biol Chem 271: 12687-90 37. Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, Din WS, Huang CP, Nicholl JK, Sutherland GR, Smith TD, Rauch C, Smith CA, et al. 1995. Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis. Immunity 3: 673-82 38. Tartaglia LA, Ayres TM, Wong GH, Goeddel DV. 1993. A novel domain within the 55 kd TNF receptor signals cell death. Cell 74: 845-53 39. Tartaglia LA, Rothe M, Hu YF, Goeddel DV. 1993. Tumor necrosis factor's cytotoxic activity is signaled by the p55 TNF receptor. Cell 73: 213-6 40. Ashkenazi A. 2002. Targeting death and decoy receptors of the tumour-necrosis factor superfamily. Nat Rev Cancer 2: 420-30 41. Strasser A, O'Connor L, Dixit VM. 2000. Apoptosis signaling. Annu Rev Biochem 69: 217- 45 42. Anthony DA, Andrews DM, Watt SV, Trapani JA, Smyth MJ. 2010. Functional dissection of the granzyme family: cell death and inflammation. Immunol Rev 235: 73-92 43. Chowdhury D, Lieberman J. 2008. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol 26: 389-420