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TRABAJO FIN DE MASTER Efecto de la inclusión de distintas fuentes de grasa en la dieta y de la congelación sobre la calidad de la carne de cerdo. MÁSTER EN INICIACIÓN A LA INVESTIGACIÓN EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Ciencia y Tecnología de la Carne y el Pescado Dpto. Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Facultad de Veterinaria Universidad de Zaragoza 2012 Javier Tenas Gonzalvo Tutores: Verónica Alonso, José Antonio Beltrán 01/09/2012 2 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo AGRADECIMIENTOS: En primer lugar me gustaría agradecer a José Antonio Beltrán, tanto el haberme brindado la oportunidad de realizar este trabajo como por su supervisión a lo largo del mismo, porque sino nada habría sido posible. También me gustaría dar las gracias a Verónica Alonso por haber sido mi mano derecha durante todo el trabajo y solucionarme las innumerables dudas que me han ido surgiendo. Por último y no menos importante, quiero agradecer a todos mis compañeros de laboratorio (Juan, Laura, Elena, Pedro y Daniel) la ayuda que me han prestado en todo momento con todo el volumen de trabajo que he tenido. 3 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo INDICE Resumen ....................................................................................................................................... 4 1. Introducción .............................................................................................................................. 5 2. Objetivos ................................................................................................................................. 14 3. Material y Métodos ................................................................................................................ 15 3.1. Medición de pH por punción y homogenización ............................................................. 18 3.2. Medida instrumental del color (L*, a*, b*) ...................................................................... 18 3.3. Capacidad de retención de agua (CRA) ............................................................................ 19 3.4. Perfil de ácidos grasos de la grasa intramuscular por cromatografía de gases ............... 22 3.5. Oxidación lipídica (TBARS) ................................................................................................ 24 3.6. Oxidación proteica ........................................................................................................... 25 4. Resultados y Discusión ........................................................................................................... 27 5. Conclusiones ........................................................................................................................... 43 6. Referencias bibliográficas ...................................................................................................... 44 4 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo Efecto de la inclusión de distintas fuentes de grasa en la dieta y de la congelación sobre la calidad de la carne de cerdo. Resumen: En este trabajo se estudió el efecto de la inclusión de distintas fuentes de grasa en la dieta (grasa animal, aceite de soja y jabón cálcico de aceite de palma), junto con el efecto de la congelación sobre distintos parámetros de calidad y el perfil de ácidos grasos de la grasa intramuscular (GIM) en el M. Longissimus dorsi de cerdo. Para ello se utilizaron diferentes técnicas con el fin de cuantificar los parámetros de calidad y el porcentaje y el perfil de ácidos grasos de la grasa intramuscular. Los resultados obtenidos indican que los parámetros de calidad se ven poco afectados por la adición de distintas fuentes de grasa a la dieta de los animales, sin embargo, el tiempo de congelación sí que actúa sobre ellos negativamente produciendo pérdidas de color (descenso de L*, a* y b*) y aumentando las pérdidas de agua. Aunque la estabilidad oxidativa se mantiene constante a lo largo del tiempo de congelación, no superando 0,2 mg malonaldehido/Kg. Por el contrario, el perfil de ácidos grasos si se ve ampliamente modificado por la adición de distintas fuentes de grasa a la dieta, siendo las dietas con aceite de soja las que mayores modificaciones causan a la carne. Además, el perfil de ácidos grasos también es modificado durante la congelación por oxidación de los ácidos grasos poliisaturados, que induce a un cambio en el resto de porcentajes y dan como resultado un producto peor desde el punto de vista saludable, según los índices estudiados. 5 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo 1. INTRODUCCIÓN: En la bibliografía podemos encontrar distintos puntos de vista a la hora de hablar de la calidad de la carne. Para un productor, el ideal de calidad probablemente sea que la canal tenga un alto rendimiento, una buena conformación, abundantes masas musculares, que se encuentre poco engrasada y que esta grasa sea firme y blanca. Por otro lado, un carnicero valorará otros atributos de calidad como son un color estable, que no pierda líquido y que tenga una consistencia adecuada para el corte y manipulación. Sin embargo, un industrial que se dedique al procesado de productos cárnicos en general valorará positivamente aspectos como un pH adecuado, un elevado contenido en grasa intramuscular, una adecuada estabilidad oxidativa, la capacidad de formación de geles, etc. Finalmente, el consumidor demandará parámetros como el aspecto, color, jugosidad, dureza, tiempo de almacenamiento en nevera, etc. (López Bote, 2003). Una de las definiciones más extendidas de calidad de la carne fue propuesta por Hammond en 1995: "la calidad se puede definir como aquello que gusta al consumidor y por lo que está dispuesto a pagar más que el precio medio". Para profundizar un poco más en el concepto de calidad de la carne es necesario diferenciar distintos factores que determinan la aceptabilidad del producto para el consumidor, y en consecuencia, la calidad. Por tanto, en el término global de calidad se deben incluir distintas cualidades que a su vez están interrelacionadas en algunos casos: calidad higiénica, calidad nutritiva, calidad organoléptica y calidad según la aptitud para la conservación o la transformación. (Girard, 1984) Centrándonos en la calidad según la aptitud para la conservación y la transformación, alguno de los factores que podrían influir serían: la dieta de los animales y el tiempo de congelación. 1.1. Efecto de la dieta: Dietas con distintas fuentes de grasa Como introducción a este tema es importante definir antes ciertos conceptos: Los ácidos grasos son anfipáticos, es decir, tienen un grupo carboxilo (hidrofílico) en el extremo polar y una cadena de hidrocarbonos en el extremo no polar (hidrofóbico). Los ácidos grasos formados por enlaces simples se denominan “saturados” (Campbell, 1995). Si hay dobles enlaces entre los carbonos de la cadena del ácido graso, los ácidos grasos son llamados insaturados. El ácido oleico (C18:1n‐9) contiene un doble enlace y es denominado monoinsaturado. Un ácido graso con más de un doble enlace es llamado poliinsaturado y predominan en los aceites vegetales. Los ácidos grasos con 6 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo doce o más átomos de carbono son denominados como ácidos grasos de cadena larga y son típicos de las grasas de origen animal (Webb y O’Neill, 2008). Los ácidos grasos se pueden expresar por sus nombres triviales, por ejemplo, ácido linoleico, mientras que el nombre basado en su estructura sería ácido cis‐9, cis‐12‐octadecadienoico, y su abreviatura sería C18:2n‐6. Según la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC), la terminología correcta de los ácidos grasos de cadena son el nombre del hidrocarburo original. El modo oficial de denominar los ácidos grasos consiste en el número de átomos de carbono seguido por dos puntos y el número de dobles enlaces; la localización de los mismos se designa por el número del átomo de carbono donde empieza, contando a partir del extremo carboxílico (-COOH). No obstante, las nomenclaturas abreviadas o “n” (también conocido como omega o ω) describen los ácidos grasos insaturados de las familias n-3, n-6, n-7 y n-9 y dan la posición del enlace etilénico contando desde el grupo metilo terminal (CH3-), como C18:2 n-6 para el ácido linoleico. Los dobles enlaces en los ácidos grasos insaturados son generalmente del tipo cis, es decir, el grupo carboxilo y el grupo metilo respecto al doble enlace si sitúan geométricamente en el mismo lado (Webb y O’Neill, 2008). En la tabla 1 se muestra la nomenclatura de los ácidos grasos descritos en este proyecto. Tabla 1: Nomenclatura de los principales ácidos grasos encontrados en el cerdo (Bolton et al., 2008) 7 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo La utilización de grasas en la industria de la producción de piensos se ha visto incrementada paralelamente con las mejoras en el potencial productivo de las diferentes especies. Como fuente energética y de ácidos grasos esenciales, las grasas son muy superiores al resto de las materias primas que se encuentran en el mercado, y en condiciones normales de precios, su inclusión oscila entre el 50 y el 75 % de la grasa total presente en las dietas de los monogástricos. Además, la utilización de grasas tiene una serie de ventajas físicas y nutricionales que las hacen prácticamente insustituibles en la industria de piensos compuestos (Dolz, 1996). La grasa se caracteriza por una producción de calor baja y tiene la ventaja práctica de reducir el incremento de calor que produce la dieta en los cerdos en crecimiento o acabado durante los períodos de estrés térmico ambiental. Otra de las ventajas de la adición de grasa es que mejora la digestión de carbohidratos y proteínas en el intestino delgado. La alimentación que contiene una alta concentración de grasa se mueve a través del tracto gastrointestinal más lentamente que la que tiene concentraciones más bajas, lo que permite más tiempo para la digestión y absorción de otros nutrientes. Por el contrario, la cantidad de grasa añadida a las dietas está limitada por los problemas físicos de mezclado y manejo y por la menor rentabilidad de añadir grasa en las formulaciones de menor costo (Pettigrew y Moser, 1991). Los ácidos grasos pueden ser absorbidos en el intestino e incorporados sin cambios en el tejido adiposo de los cerdos. Los ácidos grasos poliinsaturados linoleico y α‐linolénico no pueden ser sintetizados in situ, por lo que las concentraciones tisulares pueden responder rápidamente a los cambios en la dieta. Por el contrario, los ácidos grasos saturados y monoinsaturados son sintetizados de novo, por lo tanto, sus concentraciones son menos influenciadas por ésta (Wood, 1984). Durante muchos años ha habido un fuerte interés en la modificación de la composición de grasa animal a través de la alimentación para cumplir con las recomendaciones dietéticas para los seres humanos, es decir, una relación óptima entre ácidos grasos saturados (AGS), ácidos grasos monoinsaturados (AGMI) y ácidos grasos poliinsaturados (AGPI). Por todo ello, una de las estrategias investigadas últimamente ha sido el cambio de la fuente de grasa adicionada al pienso, pasando de grasas animales (más monoinsaturadas) hacia grasas vegetales (más poliinsaturadas) (Rosenvold y Andersen, 2003). Existen muchas investigaciones que han comparado la adición de grasa animal a la dieta con la adición de diversas fuentes de grasa vegetal, como los aceites de soja (Apple et al., 2009; Bee et al., 2002; Monahan et al., 1992; Wiseman y Agunbiade, 1998), de palma (Wiseman et al., 2000), de colza (Corino et al., 2002; Miller et al., 1990; Wiseman y Agunbiade, 1998), de girasol (Miller et al., 1990; Mitchaothai et al., 2007; Realini et al., 2010), de maíz (Corino et al., 2002) y de linaza (Realini et al., 2010; Wiseman et al., 2000). 8 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo Las dietas enriquecidas con aceites vegetales que contienen un elevado porcentaje de AGPI podrían dar lugar a productos más saludables para los consumidores (Mitchaothai et al., 2007). Sin embargo, la calidad de la carne puede resultar alterada ya que estas grasas contienen un alto contenido de AGPI que podrían aumentar la susceptibilidad a la oxidación y, por lo tanto, reducir la vida útil del producto (Sheard et al., 2000). Además, los procesos oxidativos pueden afectar negativamente a los atributos de calidad de la carne para el consumo humano, ya que pueden contribuir a la rancidez y al sabor ''recalentado'' (Gray et al., 1996). Estos ácidos grasos también pueden producir una carne y productos cárnicos que pueden ser caracterizados como "suaves" y, por lo tanto, de menor calidad (Rosenvold y Andersen, 2003). 1.2. Efecto y cambios durante la congelación: Situación actual y legislación: Desde tiempos inmemoriales el hombre lleva conservando la carne a temperaturas bajas para alargar su vida útil, en cuevas o con hielo. Aunque el proceso de congelación no fue utilizado comercialmente por primera vez hasta 1842, y no fue hasta finales del siglo XIX cuando la conservación de alimentos congelados se llevo a una mayor escala, con la aparición de la refrigeración mecánica. En la actualidad, el Reglamento de la UE nº 853/2004 (D.O.U.E., 2004) indica que “la carne que vaya a congelarse deberá serlo de inmediato”, aunque añade que “no obstante, en caso necesario, se dejará transcurrir un tiempo de estabilización antes de proceder a la congelación”. Si nos referimos a temperaturas la normativa indica que “las carnes congeladas deberán alcanzar una temperatura interna igual o inferior a -12°C y no podrán almacenarse a continuación a una temperatura superior a ésta”. Estas temperaturas se establecen en base a criterios microbiológicos. Por ello, es importante el concepto de zona subcero, que comprende el rango de temperaturas entre -1 y -12°C. Por su contenido en sales minerales y sus uniones con las proteínas, el agua de la carne comienza a congelarse de -1,5 a -1,8°C, continuando el proceso a medida que desciende la temperatura. Pero, aunque aparentemente el producto se solidifique, queda siempre una parte de agua líquida. Esta fase acuosa residual disminuirá al bajar la temperatura porque se va congelando el agua y la fase líquida restante se concentra en solutos, disminuyendo así su aw y, por tanto, habrá una mayor inhibición microbiana. Alrededor de -7 a -8°C, puede crecer en la fracción liquida la flora psicrotrofa-psicrófila más resistente a las descensos de aw y entre -8 y -12°C prevalecen los mohos y las levaduras. No se ha detectado crecimiento de ningún microorganismo o éste es muy poco significativo por debajo de los -12°C. Consiguientemente, la temperatura a la que se almacena la carne congelada debería estar entre -12 y -20°C (Moreno García, 2006). 9 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo Modificaciones durante la congelación: Aunque desde el punto de vista sanitario estamos frente a un alimento seguro si congelamos y mantenemos en congelación correctamente. Predecir los aspectos de calidad de la carne congelada a lo largo del tiempo, tiene una gran importancia desde el punto de vista tecnológico, nutricional y sensorial (Hallenstvedt et al., 2012). Para ello nos centraremos en los posibles parámetros que puedan verse más afectados y comprometan en mayor medida la calidad final de un producto congelado como son: la oxidación lipídica y proteica, y las pérdidas de agua (exudado) por la formación de cristales de hielo, cambios de pH y color. Alteración de lípidos (oxidación lipídica): En las condiciones aconsejadas de temperatura de almacenamiento de la carne (-18°C), las reacciones químicas y bioquímicas tienen lugar muy lentamente, aunque no se paralizan por completo. Entre ellas, tienen mayor interés la lipólisis y la oxidación de las grasas, que dan lugar al enranciamiento. Este enranciamiento puede deberse tanto a la acción hidrolítica de las lipasas como por autooxidación. Las lipasas microbianas son más importantes cuanto mayor es la carga microbiana antes de la congelación, aunque también existen algunas lipasas tisulares cuyo papel es menos significativo. Las lipasas que permanecen activas a bajas temperaturas y aw, hidrolizan fosfolípidos y triglicéridos, siendo los ácidos grasos libres resultantes objeto de la oxidación, ya que son más oxidables que los esterificados, lo que origina una serie de compuestos responsables de los olores y sabores típicos del enranciamiento. La oxidación lipídica es una reacción en cadena promovida por los radicales libres que originan un producto que también es un radical y que, a su vez, reacciona y origina otro radical. Es un proceso de autooxidación que se inicia generalmente con la cesión de un átomo de hidrógeno por una molécula originándose un radical hidroxilo (Fig.1 (1)). Esta reacción puede estar catalizada por hidroperóxidos o iones metálicos. Posteriormente ocurren reacciones de propagación (Fig.1 (2)) en las que un radical lipídico se convierte en diferentes radicales lipídicos reactivos. En estas reacciones generalmente se cede un átomo de hidrógeno de una molécula lipídica o se incorpora una molécula de oxígeno a un radical alquilo. La entalpía de estas reacciones es relativamente baja en comparación con las reacciones de iniciación, de ahí que las reacciones de propagación ocurran más rápidamente que las de iniciación. En una presión atmosférica normal de oxígeno las reacciones de los radicales alquilo con el oxígeno son muy rápidas, y los radicales peroxilo se encuentran en mayor concentración que los radicales alquilo. La substracción de un átomo de hidrógeno tiene lugar preferentemente en átomos de carbono donde la energía de disociación del enlace sea baja, de modo que tiene lugar más rápidamente en el grupo metilo entre dos grupos alquenos de los ácidos grasos poliinsaturados. Este radical formado reacciona rápidamente con el oxígeno dando lugar a hidroperóxidos muy oxidantes. 16 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo Tabla 2. Composición y contenido de nutrientes de la dieta control y las suplementadas en grasas. Control GA 1% GA 3% AS 1% AS 3% JCaAP 1% JCaAP 3% Materias primas (%) Cebada Cervecera 36,00 36,00 36,00 36,00 36,00 36,00 36,00 Maíz Nacional 26,00 25,00 23,00 25,00 23,00 25,00 23,00 Trigo 15,00 15,00 15,00 15,00 15,00 15,00 15,00 Harina de Soja 44% (CP) 20,60 20,60 20,60 20,60 20,60 20,60 20,60 Grasa Animal -- 1,00 3,00 -- -- -- -- Aceite de Soja -- -- -- 1,00 3,00 -- -- Jabón Cálcico de Aceite de Palma -- -- -- -- -- 1,00 3,00 Cloruro Sódico 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 Carbonato Cálcico 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 Fosfato Bicálcico 0,66 0,66 0,66 0,66 0,66 0,66 0,66 Lisina 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 Mezcla de vitaminas y minerales 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 Análisis Nutricional (%) Materia Seca 88,74 88,86 89,11 88,86 89,11 88,81 88,96 Proteína Bruta 17,22 17,14 16,99 17,14 16,99 17,14 16,99 Grasa Bruta 2,23 3,18 5,09 3,18 5,09 3,03 4,64 Fibra Bruta 3,92 3,90 3,86 3,90 3,86 3,90 3,86 Cenizas 4,86 4,84 4,81 4,84 4,81 4,99 5,26 Lisina total 1,10 1,10 1,09 1,10 1,09 1,10 1,09 Energía Metabolizable (MJ/kg) 13,12 13,32 13,71 13,32 13,78 13,22 13,43 Control: sin suplemento de grasa; GA1: suplementado con 1% de grasa animal; GA3: suplementado con 3% de grasa animal; AS1: suplementado con 1% de aceite de soja; AS3: suplementado con 3% de aceite de soja; JCaAP1: suplementado con 1% de jabón cálcico de aceite de palma; JCaAP3: suplementado con 3% de jabón cálcico de aceite de palma. Los productos utilizados en este experimento fueron los siguientes: MAGNAPAC®: Es el producto resultante de la saponificación de los ácidos grasos libres del aceite de palma con el óxido de calcio. Su relación de ácidos grasos saturados e insaturados (50:50) le confieren una alta digestibilidad y permiten su uso en la fase de acabado de monogástricos. Su presentación sólida facilita su manejo y sus características termoplásticas permiten la inclusión de mayor porcentaje de grasa en la dieta sin perjudicar la calidad del pellet (Norel Animal Nutrition). 17 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo ACEITE DE SOJA: El aceite de soja es la grasa de origen vegetal de mayor disponibilidad en el mercado español. Procede de la industria del haba de soja tras la extracción y previo al refinado del aceite para consumo humano. El aceite de soja utilizado en la industria de piensos es muy rico en colina, fosfolípidos, antioxidantes y vitamina E, lo que favorece la digestibilidad y la conservación del aceite durante el almacenaje (FEDNA, 2003). GRASA ANIMAL: Son grasas mezclas de origen animal, sebos y mantecas. El músculo Longissimus thoracis et lumborum (LTL) se retiro de cada canal una vez pasadas 48 horas tras el sacrificio. Pasadas 24 horas a 4 ± 1°C, se partió el músculo LTL por la mitad y la porción más caudal se dividió en filetes de aproximadamente 2 cm para medir la oxidación lipídica, composición de ácidos grasos, pérdidas por goteo y otras medidas de color. El resto de muestras se envasaron al vacio y se congelaron en un arcón frigorífico a -20°C durante dos años; y éstas son las muestras con las que hemos trabajado en el presente estudio. En todas las pruebas realizadas partimos de filetes congelados envasados al vacío con un grosor de aproximadamente 2 cm, que descongelamos sumergiéndolos en agua fría y haciendo cambios de agua; para poder realizar varias pruebas que ahora detallaremos. Salvo en las determinaciones de pérdidas de agua que se explicarán en cada punto. Las pruebas realizadas fueron las siguientes:  Medición de pH por punción y homogenización  Medida instrumental del color (L*a*b*)  Determinación de pérdidas de agua por descongelación  Determinación de pérdidas de agua por goteo (Drip Loss)  Determinación pérdidas de agua por compresión  Determinación de pérdidas de agua por cocción  Perfil de ácidos grasos en grasa intramuscular por cromatografía de gases  Determinación del porcentaje de grasa intramuscular (GIM)  Oxidación lipídica (TBARS)  Oxidación proteica A continuación se muestra un resumen de los principales análisis físico-químicos realizados en este trabajo de investigación: 18 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo 3.1 Medición del pH La medición del pH se realizó por dos métodos diferentes. Primero se midieron los valores de pH mediante un pH-metro con un electrodo de punción (Crison PH 25 (Crison instruments, Barcelona, España). Las medidas fueron realizadas por triplicado en los filetes que tenían un grosor de aproximadamente de 2 cm. Evitando realizar la punción en zonas con excesiva cantidad de grasa, petequias, zonas con quemaduras por frío o desecadas, y limpiando el pH-metro entre muestras. El segundo método de medición utilizado fue una técnica de homogenización, para la que se usó un pH-metro (Crison phMeter Basic 20 (Crison instruments, Barcelona, España)) con un electrodo de homogeneización. Se picó una porción de filete en una picadora doméstica, eliminando previamente las zonas con excesiva grasa. Posteriormente, se pesaron 3 gramos en tubos de ensayo de plástico, se adicionó 30 ml de agua destilada y se homogeneizó mediante un Ultra‐Turrax (Janke & Kunkel, Staufen, Alemania) (lavando el vástago entre muestras), procediéndose después a la medición del valor de pH. Las lecturas se realizaron por triplicado al igual que el método anterior. Medición de pH por punción 3.2 Medida instrumental del color El color fue medido en la superficie del filete mediante un espectrofotómetro de reflectancia (Minolta CM-2002; Osaka, Japón) una vez que estaba totalmente descongelado y expuesto al aire durante dos horas. Los parámetros medidos fueron: L*, a*, b* (luminosidad, índice de rojo e índice amarillo, respectivamente); según CIE (Comisión Internacional d’Eclairage) (CIE, 1976). Se realizaron 10 mediciones en cada 19 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo filete y el valor final fue la media de todas ellas. Las mediciones se realizaron en las partes del filete más homogéneas, evitando las machas de sangre o porciones más grasas. Limpiando la lente del equipo entre muestras con algodón y etanol. Espectrofotómetro de reflectancia 3.3 Capacidad de retención de agua (CRA) Dentro de este apartado se incluyen todos los métodos relacionados con la medida de la capacidad de retención de agua en la carne utilizados en este estudio. Para estas determinaciones se partió de la mitad craneal de lomos congelados y envasados al vacío, que se descongelaron en agua fría. Tras hacer la primera determinación de perdidas por descongelación de la pieza entera. Se fileteó el lomo en porciones de 2 cm de grosor aproximadamente. Utilizando los filetes de la zona más caudal para la prueba de pérdidas por goteo y los filetes de la zona más craneal para las pruebas de compresión y cocción. 3.3.1 Pérdidas de agua por descongelación Se descongelaron los medios lomos envasados a vacio en agua fría y se realizó la medición del peso una vez eliminado el exudado, anotándose el peso. Los resultados se expresaron como porcentaje de pérdidas de agua, entre los valores anotados antes de la congelación (2 años atrás) y los valores finales. 20 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo 3.3.2 Pérdidas por goteo (Drip Loss) La técnica utilizada para medir las pérdidas por goteo está basada en el método de Honikel (1998). Los materiales necesarios en esta técnica fueron una balanza de precisión (± 0,05) y recipientes planos de plástico de cierre hermético (tipo tupperware) de unas dimensiones próximas a 24×17×7 cm. En el fondo de estos recipientes se colocó unas rejillas de plástico que impidió que la carne estuviese en contacto con el exudado, y una cámara frigorífica que mantuviese una temperatura constante (3 ± 1°C). El procedimiento fue: cortar filetes de 2 cm de grosor del músculo Longissimus dorsi (medias piezas) recién descongelado, pesarlos y apuntar el valor. Posteriormente se colocó cada uno de los filetes en el envase sobre la rejilla de plástico y se cerró para evitar evaporaciones. A continuación, se mantuvo en refrigeración, realizando mediciones del peso a las 24 y 48 horas. Para ello, se sacaba el filete y se secaba suavemente sobre papel de filtro por la cara que había estado en contacto con la rejilla antes de realizar la medición. Se realizaron 2 réplicas por muestra, colocadas en la misma bandeja. Los resultados se expresaron como el porcentaje de pérdidas de agua entre el peso inicial y final del filete descongelado. Bandejas utilizadas para las pérdidas por goteo 21 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo 3.3.3 Determinación pérdidas de agua por compresión La técnica utilizada es una modificación del método descrito por Grau y Hamm (1957). Utilizamos placas de metacrilato atornilladas de 12,5×7 cm, una báscula analítica y papel de filtro cortado en unas dimensiones aproximadas de 6,5×8,5 cm. Partimos de un filete de un grosor de 2 cm. Cortamos trozos de carne íntegros de 0,3 ± 0,02 gramos, y los colocamos sobre el papel de filtro pesado anteriormente. Anotando tanto el peso del papel como de la muestra por separado. Se colocó la muestra entre las dos placas de metacrilato ejerciendo una presión controlada y similar en todas, ajustando los tornillos adecuadamente. Transcurridos 5 minutos, se retiró con cuidado el papel mojado de la carne, para pesarlo de nuevo. Se realizarán 3 réplicas por cada muestra. Los resultados se expresaron como porcentaje de pérdidas de agua, entre la diferencia de peso del papel seco y mojado, haciendo referencia al peso inicial de la muestra. Placas de metacrilato 3.3.4 Determinación de pérdidas de agua por cocción La técnica utilizada es una modificación del método descrito por Lee et al. (1978). Se partió de un filete de un grosor de 2 cm. Se cortaron trozos de carne íntegros de 2 ± 0,05 gramos, y se introdujeron en tubos de ensayo dejando un espacio al fondo del tubo para acumular las pérdidas de agua sin que contactaran con la muestra. Se introdujeron en un baño de agua a 100°C durante 20 minutos. Transcurrido ese tiempo, se enfriaron los tubos en agua fría. A continuación, se sacaron los trozos de los 22 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo tubos, se secaron cuidadosamente sobre papel de filtro y se pesaron. Los resultados se expresaron como porcentaje de pérdidas de agua, entre la diferencia de peso en fresco y el peso cocinado. 3.4. Determinación del perfil de ácidos grasos y del contenido de grasa intramuscular 3.4.1. Cromatografía de gases para la determinación del perfil de ácidos grasos de la grasa intramuscular La cromatografía de gases para la determinación del perfil de ácidos grasos se basó en el método descrito por Bligh & Dyer (1959). Esta metodología se dividió en 3 fases diferentes: 1) Extracción de grasa, 2) Metilación y 3) Cromatografía de gases. Para la extracción de la grasa del músculo se necesitaron 10 gramos picados de éste (sin grasa subcutánea, petequias, zonas con quemaduras por frío o desecadas) junto con 20 ml de cloroformo, 20 ml de metanol, 10 ml de cloruro potásico al 0,88 % y 4 ml de agua. Todo ello homogeneizado con un Ultra‐Turrax (manteniendo la temperatura baja introduciendo los tubos en vasos de precipitados con hielo) y centrifugado a 4000 r.p.m. durante 10 minutos. Después de obtener la separación de fases mediante la centrifugación se pipeteó la fase inferior y se depositó en un vial de 30 ml previamente identificado junto con unas gotas de BHT de concentración 1 g de BHT/10 ml metanol. A continuación, se evaporó el cloroformo en atmósfera de nitrógeno sobre un baño de arena a 55°C. Las muestras obtenidas, para poder ser introducidas en el cromatógrafo primero debieron ser metiladas. Para ello, en un vial de 5 ml se introdujo 0,03 g de grasa, 2 ml de hexano y 2 ml de solución saturada de hidróxido potásico en metanol. El vial se agitó, consiguiéndose una separación de fases, y se extrajo la fase superior depositándose en un vial de 2 ml previamente identificado con el código de la muestra. Estos viales que contienen los ésteres metílicos de la grasa se introdujeron en un cromatógrafo de gases HP-6890 II (Hewlett–Packard, Waldbronn, Alemania), con una columna capilar SP-2380 (100 m x 0.25 mm x 0.20 μm), usando nitrógeno como gas portador. Se obtuvo un cromatograma de cada muestra analizada y se calcularon los porcentajes de los principales ácidos grasos. 23 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo Cromatografía de gases para la determinación del perfil de ácidos grasos. Ejemplo de cromatograma 3.4.2. Determinación del porcentaje de grasa intramuscular (GIM) Se realizó la extracción de la grasa mediante cloroformo‐metanol según la metodología de Bligh y Dyer (1959). Para ello, se pipeteó un mililitro de cloroformo (con la grasa ya disuelta en él) en una cápsula de aluminio y se dejó evaporar en una estufa a 100°C. Posteriormente, se pesó la cápsula con la grasa en el interior y por diferencia de pesadas se halló la cantidad de grasa (resultados expresados en gramos de grasa/100 g de carne). 24 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo Balanza analítica utilizada para la determinación de la GIM 3.5 Medida de la oxidación lipídica La medida de la oxidación lipídica se llevó a cabo por la determinación de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), de acuerdo con el método descrito por Pfalzgraf et al. (1995). Se homogeneizaron 10 g de músculo Longissimus dorsi con 20 ml de ácido tricloracético (TCA 10%) en tubos de plástico en un Ultra-Turrax unos 90 segundos a 20.000 r.p.m aproximadamente. Los tubos se centrifugaron durante 30 min a 4000 r.p.m a 10°C en una centrífuga refrigerada (Jouan CR 411, USA). Después de la filtración, se tomaron 2 ml del homogeneizado en un tubo mezclado con 2 ml de una solución 20 mM de ácido tiobarbitúrico (TBA) recién preparada. Por cada muestra se prepararon dos tubos. Los tubos se homogeneizaron con un rotatubos durante 30 segundos y luego se incubaron a una temperatura de 97°C durante 20 minutos en un baño de agua termostático (Grant W14, Cambridge, UK). Previamente a la lectura de las absorbancias a 532 nm de las muestras en el espectrofotómetro (Unicam 5625 UV/VIS, Cambridge, UK), los tubos se enfriaron en agua hasta alcanzar la temperatura ambiente y el aparato se calibró mediante un blanco (2 ml de TBA + 2 ml de agua destilada). Los resultados fueron calculados mediante una curva patrón usando 1,1,3,3 tetrametoxipropano (TMP). Se usó esta sustancia ya que el malonaldehído puede obtenerse por hidrólisis ácida del TMP en una reacción equimolecular. Las medidas fueron expresadas como sustancias reactivas al ácido 2-tiobarbitúrico (TBARS) en mg de malonaldehido/ kg de muestra. 25 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo 3.6 Medida de la oxidación proteica La medición de la oxidación proteica se basó en el método descrito por Oliver et al. (1987). Se partió de filetes descongelados, a los que se eliminó las zonas con excesiva grasa, petequias, zonas con quemaduras por frío o desecadas y se trituraron en una picadora doméstica. Se pesó 1 g de la muestra picada con exactitud en tubos Falcon y se adicionaron con una pipeta 10 ml de 10 mM fosfato potásico (K2HPO4) + 0.6 M NaCl. Posteriormente, se homogenizó en un Ultra‐Turrax durante 30 segundos a 12000 r.p.m. Se prepararon 3 réplicas por cada muestra en tubos eppendorf de 2 ml, cada una de las réplicas constó de 2 eppendorf para determinar tanto carbonilos como proteína. Se adicionaron en todos ellos 0,1 ml de la muestra y 1 ml de TCA al 10% para precipitar las proteínas, y se centrifugaron durante 5 minutos a 5000 r.p.m. y a una temperatura de 4°C. Posteriormente se desechó con cuidado el sobrenadante. A continuación, se adicionaron a los eppendorf donde se mediría la proteína 1 ml de 2 N HCl, y en los eppendorf donde se medirían los carbonilos 1 ml de 2 N HCl + DNPH. Se agitaron en un rotatubos y se dejaron en oscuridad durante 1 hora, agitándolos a periodos de 15 minutos. Tras la hora de reposo, se añadió 1 ml de TCA 10% a todos los eppendorf, se agitaron en un vortex y se centrifugaron 5 minutos a 5000 r.p.m. a 4°C. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante con cuidado utilizando pipetas Pasteur de vidrio y se añadió 1 ml de etanol:acetato de etilo (1:1 v/v), se agitó en un vortex y se centrifugó 5 minutos a 10000 r.p.m. a 4°C. Este paso fue repetido 3 veces hasta que se comprobó que el precipitado quedaba totalmente limpio. En el último lavado fue eliminado el sobrenadante y posteriormente evaporado hasta sequedad con nitrógeno. Para finalizar se añadió 1,5 ml de 6 M guanidina HCl 20 mM Fosfato potásico, y se agitó en vortex. Posteriormente se centrifugó durante 2 minutos a 5000 r.p.m. a 4°C. La lectura se realizó en un espectrofotómetro a 280 nm en el caso de las proteínas, y a 370 nm para los carbonilos. La concentración de proteína se calculó interpolando en una recta patrón utilizando BSA (albumina sérica bovina) (2 mg/ml) en 6 M guanidina HCl, 20 mM fosfato sódico pH 6.5, como estándar y midiendo la absorbancia a 280 nm. La cantidad de carbonilos se expresó como nmoles de carbonilo por miligramo de proteína utilizando un coeficiente de adsorción de 21.0 nM-1 1 cm-1 a 370 nm. 32 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo Figura 3. Gráfico que muestra la interacción existente entre el efecto dieta y el tiempo de congelación sobre los valores de oxidación lipídica (TBARS) en la carne de cerdo. Diferentes letras en la misma fila indican diferencias significativas entre las medias de los valores; ns = p>0,1; t = p≤0,1; * = p≤0,05; ** = p≤0,01; *** = p≤0,001.GA1: grasa animal al 1%; GA3: grasa animal al 3%; AS1: aceite de soja al 1%, AS3: aceite de soja al 3%; JCaAP1: Jabón cálcico de aceite de palma al 1%; JCaAP3: Jabón cálcico aceite de palma al 3%; y SED: Error estándar de la diferencia. 4.2. PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS: 4.2.1.Efecto de la dieta: La composición en ácidos grasos de la carne de cerdo está determinada por factores genéticos como por ejemplo la raza, el sexo y el genotipo, y por factores ambientales de los cuales la dieta es el más importante (Averette et al., 2002; De Smet et al., 2004; Raes et al., 2004). En este trabajo de investigación se ha estudiado el efecto que tiene la inclusión de distintas fuentes de grasa en la dieta sobre el contenido y el perfil de ácidos grasos de la grasa intramuscular. El interés del perfil de ácidos grasos de la grasa intramuscular está justificado por la imposibilidad de separar este tipo de grasa de la carne y el impacto que ésta tiene sobre la salud humana (De Smet et al., 2004), y por tanto, es importante conocer tanto su cantidad como su perfil de ácidos grasos. Tanto la grasa como los ácidos grasos del tejido adiposo y muscular contribuyen de una manera importante en varios aspectos de la calidad de la carne, y son fundamentales en su valor nutricional (Wood et al., 2008). Además, el contenido de grasa intramuscular tiene una gran importancia puesto JCaAP1 JCaAP3 33 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo que ha sido relacionado de manera positiva con otros atributos como son la jugosidad, terneza y flavor (Wood, 1993). Al analizar los resultados expresados en la Tabla 5 podemos observar que el contenido de grasa intramuscular fue significativamente mayor (p ≤ 0,05) en los cerdos alimentados con GA3 que en los cerdos alimentados con AS1, mientras que entre las dietas control, GA1, AS3, JCaAP1 y JCaAP3 no encontramos diferencias significativas. La gran mayoría de investigaciones previas no han logrado detectar diferencias a nivel de la grasa intramuscular entre dietas con aceite de soja y dietas con aceite de palma (Olivares et al., 2009; Teye, Sheard, et al., 2006), o con dietas con grasa animal (Morel et al., 2006; Morgan et al., 1992). En nuestro estudio, la dieta con GA3 tenía una elevado porcentaje de grasa en el pienso, y por lo tanto, la cantidad de energía disponible para la deposición de grasa sería mayor, dando como resultado un mayor contenido de grasa intramuscular, de acuerdo con los estudios realizados por otros autores (Bee et al., 2002). Si comparamos de forma individual los distintos ácidos grasos encontramos diferencias significativas entre las distintas dietas (Tabla 5). Dentro de los ácidos grasos saturados, tanto el ácido palmítico (C16:0) como el esteárico (C18:0) presentaron diferencias significativas (p ≤ 0,05) siendo la dieta con AS3 la que presentó los menores porcentajes. En relación al sumatorio de AGS, de nuevo l dieta con AS3 tuvo el menor porcentaje, mientras que las dietas control, GA1 y GA3 fue el mayor. Otros autores (Apple et al., 2009) también han encontrado diferencias significativas entre la dieta control y los animales alimentados con la dieta de aceite de soja al 3%. Sin embargo, varios estudios no han podido detectar diferencias significativas en el porcentaje total de AGS entre las dietas con aceite de soja y grasa animal (Apple et al, 2009;. Morel et al, 2006;. Morgan et al, 1992) o con dietas con aceite de palma (Olivares et al., 2009). Las dieta con aceite de soja al 1 % es la que obtuvo una menor proporción de ácido palmitoleico (C16:1 n-9) (p ≤ 0,001) comparado con las dietas suplementadas en grasa animal. Esta dieta también obtuvo el porcentaje más bajo en el sumatorio de los ácidos grasos monoinsaturados (AGMI) (p ≤ 0,01) y en C18:1 (p ≤ 0,05), con diferencias significativas respecto a las dietas control, grasa animal 1 y 3% y JCaAP1. Por otro lado, la carne de cerdo de los animales alimentados con AS1 y AS3 presentaron los porcentajes más altos en el sumatorio de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) (p ≤ 0,001). Más específicamente, los cerdos alimentados con AS1 y AS3 presentaron los niveles más altos en el sumatorio de los ácidos grasos poliinsaturados n-6 (p ≤ 0,001) incluyendo entre ellos el ácido linoleico (C18:2) (p ≤ 0,001). El sumatorio de los AGPI n- 3 también fue significativamente mayor en las dietas con AS1 y AS3 (p ≤ 0,001), incluyendo el ácido α-linolénico (C18:3) (p ≤ 0,001). Se ha demostrado en repetidas ocasiones que las dietas para cerdos enriquecidas en aceite de soja reducen el porcentaje del ácido oleico y el sumatorio total de ácidos grasos monoinsaturados y 34 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo aumentan la proporción de ácidos grasos poliinsaturados en comparación con dietas enriquecidas con grasa animal (Apple, Maxwell, Galloway, Hutchison, et al, 2009;. Bee et al, 2002;. Monahan et al, 1992) o aceite de palma (Olivares. et al., 2009) o con dietas control (Apple, Maxwell, Galloway, Hutchison, et al., 2009). Como acabamos de observar los cerdos alimentados con aceite de soja mostraron los menores porcentajes de AGMI y los mayores de AGPI. Es ampliamente conocido que las dietas ricas en AGPI de la familia n-6 pueden inhibir la actividad de la enzima Δ9‐estearoil‐CoA desaturasa (SCD) (Kouba & Mourot, 1998), la cual cataliza la síntesis de AGMI (principalmente C16:1n‐9 y C18:1n‐9) a partir de AGS (C16:0 y C18:0) (Enoch et al., 1976). Esta inhibición asociada al incremento de C18:2 n-6 en las dietas con aceite de soja podría explicar la menor concentración de AGMI en la carne de los cerdos alimentados con aceite de soja. Los ratios relacionados con la salud humana se encuentran en la Tabla 5. Las recomendaciones nutricionales para una dieta saludable establecen que la proporción de AGPI/AGS debería ser menor que 0,4 y la ingesta de AGPI n-3 se debería aumentar en relación a los AGPI n-6 (Departamento de Sanidad, 1994). Las dietas con aceite de soja tenían los ratios más altos (p ≤ 0,001) del índice AGPI/AGS (0,047 para AS1 y 0,048 para AS3), por lo que se considera que es la carne producida con mejor valor nutritivo para el ser humano. Este resultado estuvo de acuerdo con Apple, Maxwell, Galloway, Hutchison, et al. (2009) y Morel et al. (2006), quienes encontraron que la carne de cerdo procedente de las dietas de AS tenía mayores ratios AGPI/AGS en comparación con el resto de las dietas. Por otro lado, la relación n-6/n-3, fue significativamente mayor (p ≤ 0,001) en los animales con dietas suplementadas con JCaAP. Se ha recomendado un valor máximo de 4,0 en la ingesta para el índice n-6/n-3, ya que es un factor de riesgo en la cardiopatía coronaria (Departamento de Sanidad, 1994). El cerdo se caracteriza por tener unos niveles altos de C18:2 n-6, debido a una dieta a base de cereales, lo que hace que la relación de ácidos grasos poliinsaturados n-6/n-3 se incremente; siendo indeseable para la salud humana (Wood et al., 2003). 35 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo Tabla 5. Efecto de la adición de distintas fuentes de grasa a la dieta y el tiempo congelación sobre el perfil de ácidos grasos de la GIM. (media y error estándar de la diferencia (SED)). Efecto de la dieta Efecto de la congelación Control GA1 GA3 AS1 AS3 AP1 AP3 Sign. 0 2 AÑOS Sign. SED N 16 20 20 18 8 12 8 51 51 Grasa intramuscular 2,73ab 2,52ab 3,00b 2,24a 2,41ab 2,36ab 2,4ab * 2,16a 2,96b *** 0,10 C12:0 0,07ab 0,07a 0,07b 0,06a 0,07a 0,07a 0,07a *** 0,07a 0,07b *** 0,00 C14:0 1,21bc 1,18abc 1,28b 1,09a 1,08a 1,15ab 1,12ab *** 1,1a 1,24b *** 0,02 C16:0 23,24b 23,18b 23,33b 22,64ab 22,44a 23,31b 22,97ab * 22,65a 23,47b *** 0,12 C16:1 3,32abc 3,38bc 3,6c 2,96a 3,13ab 3,3abc 3,13ab *** 3,28 3,30 ns 0,06 C18:0 11,46c 10,62ab 10,65ab 11,01bc 10,3a 10,47ab 10,78ab ** 10,45a 11,14b *** 0,11 C18:1 n-9 41,47b 40,87b 41,03b 38,81a 39,87ab 40,86b 40,17ab * 39,79a 41,21b ** 0,31 C18:1 n-7 4,4b 4,51b 4,48b 4,12a 4,1a 4,46b 4,02a *** 4,40 4,28 ns 0,05 C18:2 n-6 8,58a 9,45ab 9,5ab 12,3b 12,63b 9,8ab 11,00bc *** 10,79b 9,68a * 0,28 C18:3 n-6 0,08ab 0,09b 0,07a 0,08ab 0,08ab 0,08ab 0,09b * 0,09b 0,07a *** 0,00 C20:1 0,76b 0,75b 0,76b 0,67a 0,67a 0,78b 0,64a *** 0,72 0,74 ns 0,00 C18:3 n-3 0,33a 0,35ab 0,39b 0,47c 0,71d 0,36ab 0,38ab *** 0,43b 0,39a ** 0,01 C20:2 n-6 0,31a 0,32a 0,33a 0,39b 0,44c 0,34a 0,33a *** 0,35 0,35 ns 0,01 C20:2 n-3 0,09bc 0,11c 0,08b 0,1bc 0,06a 0,09bc 0,1bc *** 0,11b 0,08a *** 0,00 C20:3 n-6 0,3ab 0,3ab 0,26ab 0,32b 0,24a 0,32b 0,3ab * 0,34b 0,25a *** 0,01 C20:3 n-3 0,06a 0,07a 0,07a 0,08b 0,11c 0,06a 0,06a *** 0,07 0,07 ns 0,00 C20:4 n-6 1,74a 2a 1,57a 2,24b 1,73a 2,01a 2,17b * 2,23b 1,59a *** 0,09 C20:5 n-3 0,1ab 0,11ab 0,09a 0,13b 0,11ab 0,1ab 0,12ab t (0,064) 0,13b 0,09a *** 0,00 C22:5 n-3 0,3a 0,32ab 0,28a 0,4b 0,32ab 0,31a 0,35ab * 0,39b 0,27a *** 0,01 C22:6 n-3 0,12b 0,13b 0,12ab 0,15b 0,09a 0,13b 0,15b ** 0,15b 0,1a *** 0,01 ∑ AG Sat 36,76b 35,88b 36,08b 35,53ab 34,59a 35,73ab 35,7ab * 35,03a 36,69b *** 0,20 ∑ AG MI 50,49b 50,1b 50,5b 47,01a 48,21ab 49,9b 48,46ab ** 48,72a 50,07b * 0,38 ∑ AG PI 12,05a 13,28ab 12,79ab 16,69c 16,56c 13,63ab 15,07bc *** 15,1b 12,97a *** 0,40 ∑ N-3 1a 1,09a 1,03a 1,33b 1,41b 1,06a 1,15a *** 1,27b 0,99a *** 0,03 ∑ N-6 11,04a 12,18ab 11,75ab 15,35c 15,14c 12,56ab 13,9bc *** 13,81b 11,96a ** 0,37 ∑ AG PI/∑ AG Sat 0,33a 0,37ab 0,36ab 0,47c 0,48c 0,38ab 0,43bc *** 0,43b 0,36a *** 0,01 ∑ N-6/∑ N-3 11,12ab 11,33bc 11,51bc 11,57c 10,76a 11,96d 12,11d *** 10,82a 12,11b *** 0,07 Diferentes letras en la misma fila indican diferencias significativas entre las medias de los valores; ns = p>0,1; t = p≤0,1; * = p≤0,05; ** = p≤0,01; *** = p≤0,001.GA1: grasa animal al 1%; GA3: grasa animal al 3%; AS1: aceite de soja al 1%, AS3: aceite de soja al 3%; JCaAP1: Jabón cálcico de aceite de palma al 1%; JCaAP3: Jabón cálcico aceite de palma al 3%; y SED: Error estándar de la diferencia 4.2.2.Efecto de la congelación: En este apartado estudiaremos cómo afecta la congelación sobre el perfil de ácidos grasos de la grasa intramuscular. Los resultados se muestran en la Tabla 5, comparando los animales a día cero, con los mismos animales tras los 2 años de almacenamiento en congelación. El porcentaje de grasa intramuscular ha tenido un aumento significativo (p ≤ 0,001) tras la congelación, posiblemente debido a la concentración de la grasa al aumentar las pérdidas de agua que ocurren tras la descongelación. También observamos como todos los ácidos grasos saturados aumentan de manera significativa (p ≤ 0,001), en los que podemos resaltar el ácido palmítico (C16:0) y el esteárico (C18:0) como los más representativos. Lo que provoca que el sumatorio de ácidos grasos saturados como era de esperar, aumente de forma significativa (p ≤ 0,001). En los ácidos grasos monoinsaturados solo se encuentran diferencias significativas en el ácido oleico (C18:1 n-9) (p ≤ 0,01), lo que provoca que también encontremos diferencias significativas en el sumatorio total de AGMI (p ≤ 0,05), aumentando su valor en ambos casos. Por último, si hablamos del porcentaje de los ácidos grasos poliinsaturados nos encontramos con diferencias significativas entre las muestras a día cero y a los dos años de congelación, entre ellos los más representativos son: el acido linoleico (C18:2 n-6) (p ≤ 0,05), el ácido αlinolénico (C18:3 n-3) (p ≤ 0,01); y los ácidos grasos de cadena larga: araquidónico (C20:4 n-6), eicosapentaenoico (C20:5 n-3) y decosahexaenoico (C22:6 n-3) (p ≤ 0,001). Lo que consigue que en el sumatorio de ácidos grasos poliinsaturados totales haya un descenso significativo (p ≤ 0,001) a los dos años de congelación, esto puede ser debido a que los AGPI se oxidan dando lugar a otras moléculas residuales que no cuantificamos en la cromatografía, por tanto los niveles totales disminuyen. Todos estos cambios son debidos a que las pérdidas por oxidación de los AGPI provocan un desajuste en los porcentajes totales de los AGS y AGMI, originando un aumento relativo de éstos. En el sumatorio de los AGPI n-3 se puede ver un descenso (p ≤ 0,001) al igual que en el sumatorio de los AGPI n-6, lo cual era de esperar al ver los descensos de todos ellos por separado. Sin embargo, la relación n-6/n-3 sufre un aumento (p ≤ 0,001) probablemente debido a que los n-3 son más fácilmente oxidables (López Bote et al., 1997) y su descenso es mucho mayor que los n-6, haciendo así que el cociente de los valores se eleve porque aunque ambos disminuyen, siempre lo hará en mayor medida n-3. El valor final del índice n-6/n-3 es de 12,11, lo que se aleja todavía más del valor recomendado por el Departamento de Sanidad en 1994, que indica que la relación n- 6/n-3 debe tener un valor próximo a 4.0, obteniendo pues un producto menos saludable nutricionalmente tras el proceso de congelación. En relación al otro ratio que hemos estudiado (AGPI/AGS), se observa un descenso significativo (p ≤ 0,001) de 37 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo 0,43 hasta 0,36, disminuyendo por debajo de 0,4 y alejándonos de los valores recomendados para la salud. 4.3. ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES (PCA) PARA LOS PARÁMETROS FÍSICOQUÍMICOS Y EL PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS DE LA GRASA INTRAMUSCULAR DE LA CARNE DE CERDO ANTES Y TRAS DOS AÑOS DE CONGELACIÓN 4.3.1. Efecto de la inclusión de distintas fuentes de grasa en la dieta y del tiempo de congelación sobre la calidad de la carne de cerdo En la figura 4 se representan los dos primeros ejes del análisis de componentes principales que explican el 80,04 % de la variabilidad total del estudio. El primero de los componentes principales (62,67 %) está caracterizado por los ácidos grasos poliinsaturados (C18:2 n-6, C20:4 n-6, C20:5 n-3, C22:5 n-3, C22:6 n-3), sus sumatorios (n-3, n-6 y AGPI) y uno de los índices con los que están relacionados, AGPI/AGS, junto con los parámetros de color a* y b*. En el lado opuesto encontramos los ácidos grasos saturados (C16:0 y C18:0) y monoinsaturados (C18:1 n-9), así como sus sumatorios (AGS y AGMI) y el porcentaje de grasa intramuscular. También encontramos el índice n-6/n-3 y varios parámetros de calidad como son: pH por punción, y las pérdidas por goteo a 24 y 48 horas. En resumen, el perfil de ácidos grasos, el porcentaje de grasa intramuscular y algunos parámetros de calidad (a*, b*, pH por punción y pérdidas por goteo a 24 y 48 horas) parece que explican un gran porcentaje de las diferencias entre los animales del estudio que hemos realizado y reflejan la importancia de éstos en la calidad de la carne. El segundo de los ejes explica el 17,37 % y está caracterizado principalmente por la oxidación lipídica (TBARS), L* y el C16:1 n-9 El porcentaje de GIM estuvo correlacionado positivamente con los principales ácidos grasos saturados C16:0 (0,70), C18:0 (0,31), al igual que con su sumatorio (0,59) (p = 0,001). A su vez también se correlacionó positivamente con los ácidos grasos monoinsaturados, entre ellos el C16:1 n-9 (0,55), C18:1 n-9 (0,63) y con su sumatorio (0,62) (p = 0,001). Por el contrario, el porcentaje de grasa intramuscular se correlacionó negativamente con los principales ácidos grasos poliinsaturados C18:2 n-6 (-0,66), C18:3 n-3 (-0,27), C20:4 n-6 (-0,83), C20:5 n-3 (-0,81), C22:5 n-3 (-0,82), C 22:6 n-3 (-0,75), y con su sumatorio (-0,74); todos ellos con un nivel de significación de p ≤ 0,005. Generalmente, los porcentajes de AGS y AGMI se incrementan conforme aumenta el contenido de GIM, mientras que el porcentaje de AGPI desciende (De Semet et al., 2004). Esto se explica debido a que los lípidos de los músculos están compuestos principalmente por fosfolípidos, que forman parte de las membranas celulares, y por triglicéridos, que se encuentran en los adipocitos que están localizados a lo largo de las fibras musculares. El contenido de fosfolípidios es independiente de la cantidad de grasa y se mantiene bastante constante, en cambio, el contenido de 38 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo triglicéridos está fuertemente relacionado con la grasa total y es más variable (Fernández et al., 1999). Los fosfolípidos son componentes de membrana ricos en AGPI y estrictamente controlados mientras que los triglicéridos tienen mayores cantidades de AGS y AGMI. Aunque el contenido de AGPI de los triglicéridos puede ser influenciado por la dieta, este efecto es diluido por la síntesis de ácidos grasos de novo (consistente en AGS y AGMI) conforme aumenta la deposición de grasa en el animal, y por tanto, causando un descenso de la relación AGPI/AGS. También hay que señalar la correlación negativa que hay entre la GIM y el índice de rojo (a*) (-0,34) (p = 0,001), probablemente debido a que el mayor vetado graso del filete provoca que la medición no sea del todo precisa al contar con una superficie muscular menor en comparación a un filete con menos grasa intramuscular. Por el contrario, encontramos una correlación positiva entre la GIM y la L* (0,20) (p = 0,041), al igual que otros autores (Carrapiso y García, 2005; Oliver et al., 1993) describen que la carne con mayor contenido de GIM se asociaba a un valor L* más elevado. Esto probablemente se deba a la mayor cantidad de grasa en el filete, que hace que éste tenga una mayor superficie con un color blanco-amarillento debido al veteado de grasa, y que es difícil de evitar cuando se mide el color en la superficie. La oxidación lipídica se correlaciona negativamente con los ácidos grasos saturados C16:0 (-0,29) y C18:0 (-0,29), al igual que con su sumatorio (-0,34) (p ≤ 0,003). El índice de oxidación lipídica también se correlaciona negativamente con la relación n-6/n-3 (- 0,21) (p = 0,033). Es bien conocido que la oxidación en la carne de cerdo depende de la composición de ácidos grasos de los lípidos y es iniciada en los fosfolípidos de las membranas celulares (microsomas y mitocondrias) (Gray y Pearson, 1987). Algunos trabajos indican que los ácidos grasos n‐3 son particularmente susceptibles a la oxidación, e incluso pequeños incrementos en la concentración de estos ácidos en la fracción polar (fosfolípidos) de la grasa podrían ser de crítica importancia en el desarrollo de la oxidación (López‐Bote et al., 1997). Por lo tanto, si hay diferencias en el índice n‐6/n‐3 de la dieta, éstas se reflejarían en la relación n‐6/n‐3 de las membranas (López‐Bote et al., 1999). De acuerdo con todo esto, se esperaría una mayor oxidación lipídica cuando la relación n‐6/n‐3 fuera inferior. Por último, en la figura se muestra también la proyección gráfica de las observaciones de las siete dietas estudiadas (antes y después de congelar) en el plano definido por los dos primeros componentes principales. En el cuadrante superior derecho encontramos las dietas Control, GA1, GA3 y JCaAP1 antes de congelar, todas ellas relacionadas con las coordenadas de color (L*, a*, b*) y la oxidación lipídica; mientras que estas mismas dietas pero tras la congelación, las encontramos en el cuadrante superior izquierdo y se relacionan principalmente con los AGS, AGMI y sus principales representantes y el porcentaje de GIM. En el cuadrante inferior izquierdo podemos ver las dietas con JCaAP3 y AS1 tras la congelación, que se relacionan con los parámetros de pérdidas 39 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo por goteo (24 y 48 horas) y con el pH por punción. La dieta con AS1 además tienen una cierta tendencia hacia los AGPI, sus principales representantes, los sumatorios n-6 y n- 3, y los índices AGPI/AGS y n-6/n-3. Por último en el cuadrante inferior derecho encontramos AS3 tras la congelación, muy cerca del cuadrante inferior izquierdo y que tiene un comportamiento muy similar al explicado en ese cuadrante. También encontramos las dietas AS1 y AS3 y la dieta JCaAP3 (antes de congelar), que aunque se encuentre en el cuadrante superior izquierdo sigue el mismo comportamiento que estos últimos, relacionándose todas ellas con los AGPI y sus principales representantes, los sumatorios n-3 y n-6 y el índice AGPI/AGS. Figura 4: Proyección de los parámetros: ( ) pH por punción, color (L*,a*,b*), pérdidas por goteo ( 24 y 48 horas) e índice de oxidación lipídica (TBARS), ( ) porcentaje de grasa intramuscular (%GIM (Bligh y Dyer, 1959)), ( ) perfil de ácidos grasos de la grasa intramuscular (% ácidos grasos totales) (C16:0, C18:0, C16:1 n-9, C18:2 n-6, C18:3 n-3, C20:4 n-6, C20:5 n-3, C22:6 n-3, , AGS, AGMI, AGPI, n-6, n-3) e ( ) índices C GA1 GA3 AS1 AS3 JaCAP1 JCaAP3 C GA1 GA3 AS1 AS3 JaCAP1 JCaAP3 GIM C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:4 C20:5 C22:5 C22:6 AGS AGMI AGPI n-3 n-6 AGPI/AGS n-6/n-3 pH punción L* a* b* TBARS P. por goteo 24 h P. por goteo 48 h -3 -2 -1 0 1 2 3 -3 -2 -1 0 1 2 3 CP 2 (17,37 %) CP 1 (62,67 %) 40 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo relacionados (AGPI/AGS, n-6/n-3) en el plano definido por los dos primeros componentes principales. Proyección de las observaciones de los 14 tratamientos estudiados en el plano definido por los dos primeros componentes principales: Dieta control (( )día 0, ( ) 2 años), Dieta con grasa animal al 1% (( )día 0, ( ) 2 años), Dieta con grasa animal 3% (( )día 0, ( ) 2 años), Dieta con aceite de soja al 1% (( )día 0, ( ) 2 años), Dieta con aceite de soja al 3% (( )día 0, ( ) 2 años), Dieta con jabón de aceite de palma al 1% (( )día 0, ( ) 2 años), Dieta con jabón de aceite de palma al 3% (( )día 0, ( ) 2 años). 4.3.2. Efecto de la inclusión de distintas fuentes de grasa en la dieta sobre la calidad de la carne de cerdo después de la congelación La figura 5 presenta el segundo análisis de componentes principales realizado, en la que los dos primeros ejes explican el 63,45 % de la variabilidad total del estudio. El primero de los componentes principales (47,07 %), está caracterizado en el lado derecho por la mayoría de ácidos grasos poliinsaturados, C18:2 n-6, C18:3 n-3, C20:5 n- 3, C22:5 n-3; los sumatorios n-3, n-6, AGPI y el índice AGPI/AGS. En el lado opuesto del eje encontramos los sumatorios de AGMI y AGS, junto a sus principales representantes, C16:0, C18:0, C16:1 n-9, C18:1 n-9; además del porcentaje de GIM y las pérdidas por compresión. El segundo de los componentes principales explica el 16,38% y se caracteriza por el resto de parámetros de calidad (Oxidación proteica, L*, a*, pérdidas por cocción y las pérdidas por descongelación), además de los ácidos grasos C20:4 n-6 y C22:6 n-3, y el índice n-6/n-3. Los valores de TBARS, pH por punción y homogenización, b* y las pérdidas por goteo (24 y 48 horas) se encuentran muy cerca del centro de ambos componentes principales y por ello fueron poco caracterizados por estos ejes. Sin embargo, estuvieron mejor representados por el componente principal 3 (datos no representados) que explicaba un 14,17% de la variabilidad del estudio. Ahora vamos a fijarnos más detenidamente en las variables nuevas que hemos introducido en este PCA. El pH por homogenización se correlaciona positivamente con el pH de punción (0,80 (p = 0,001)), indicando así que ambas técnicas son similares. Además encontramos una correlación negativa entre el pH por homogenización y la L* (-0,50 (p = 0,001)), y con las pérdidas por descongelación (-0,60 (p = 0,001)). Coincide con la afirmación de que un mayor valor de pH es asociado a una mayor CRA, lo que se traduce en una menor pérdida de agua durante el almacenamiento (Barbut et al., 2008). ). Además, un pH final alto puede modificar las características de absorción de la mioglobina y la superficie de la carne se aprecia más oscura. También parece más oscura ya que no 41 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo dispersa tanto la luz como una carne con un pH más bajo, debido a que retiene mayor cantidad de agua (Lawrie, 2006). Por último, la oxidación proteica se correlaciona positivamente con las pérdidas por descongelación (0,290) (p = 0,039). Efecto ya estudiado por otros autores, por el cual la oxidación proteica disminuye la capacidad de retención de agua, una de las propiedades funcionales de las proteínas y por tanto, aumentan las pérdidas de agua tras la descongelación (Estévez et al., 2011). La capacidad de retención de agua de la carne es una de las propiedades más importantes para la calidad de los productos crudos (Huff‐Lonergan y Lonergan, 2005) y a su vez está muy relacionada con diversos parámetros importantes para la calidad final de la carne como son la jugosidad, terneza, firmeza y apariencia (Trout, 1988). En esta figura se muestra también la proyección gráfica de las observaciones de las siete dietas estudiadas (después de congelar) en el plano definido por los dos primeros componentes principales. En el cuadrante superior izquierdo encontramos la dieta con JCaAP1, que sigue un comportamiento muy similar a las dietas encontradas en el cuadrante inferior izquierdo (C, GA1, GA3); relacionándose todos ellos como hemos visto en el anterior PCA con los AGS, AGMI, sus principales representantes y el porcentaje de GIM. En el cuadrante superior derecho se encuentra casi en el límite con el cuadrante superior izquierdo, la dieta con JCaAP3, que se encuentra relacionada con la oxidación proteica, como veíamos en los resultados, aunque no había diferencias significativas, las dietas con jabón cálcico de aceite de palma eran los que presentaban niveles más altos. En este cuadrante también se encuentra la dieta con AS1 que tiene una relación similar a la dieta AS3 (que se encuentra en el cuadrante inferior derecho) con los AGPI, sumatorios n-3, n-6 y AGPI/AGS. 48 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo Teye, G. A., Sheard, P. R., Whittington, F. M., Nute, G. R., Stewart, A., y Wood, J. D. (2006a). Influence of dietary oils and protein level on pork quality. 1. Effects on muscle fatty acid composition, carcass, meat and eating quality. Meat Science, 73, 157‐165. Teye, G. A., Wood, J. D., Whittington, F. M., Stewart, A., y Sheard, P. R. (2006b). Influence of dietary oils and protein level on pork quality. 2. Effects on properties of fat and processing characteristics of bacon and frankfurter‐style sausages. Meat Science, 73, 166‐177. Trout, G. R. (1988). Techniques for measuring water‐binding capacity in muscle foods ‐ A review of methodology. Meat Science, 23, 235‐252. Webb, E. C., y O’Neill, H. A. (2008). The animal fat paradox and meat quality. Meat Science, 80, 28‐36. Wiseman, J., y Agunbiade, J. A. (1998). The influence of changes in dietary fat and oils on fatty acid profiles of carcass fat in finishing pigs. Livestock Production Science, 54, 217‐227. Wood, J. D. (1984). Fat deposition and the quality of fat tissue in meat animals. En J. Wiseman (Ed.), Fats in animal nutrition (pp. 407‐435). London, UK: Butterworths. Wood, J. D. (1993). Production and processing practices to meet consumer needs. En E.Batterham (Ed.), Manipulating pig production IV (pp. 135‐147). Attwood, Australia: Australasian Pig Science Association. Wood, J. D., Richardson, R. I., Nute, G. R., Fisher, A. V., Campo, M. M., Kasapidou, E., Sheard, P. R., y Enser, M. (2003). Effects of fatty acids on meat quality: A review. Meat Science, 66, 21‐32. Wood, J. D., Enser, M., Fisher, A. V., Nute, G. R., Sheard, P. R., Richardson, R. I., Hughes, S. I., y Whittington, F. M. (2008). Fat deposition, fatty acid composition and meat quality: A review. Meat Science, 78, 343‐358. Xia,X., Baohua.K, Qian.L , Jing,L. (2009). Physicochemical change and protein oxidation in porcine longissimus dorsi as influenced by different freeze–thaw cycles. Meat Science 83, 239–245. XLSTAT (2004). XLStat trial (version Pro 7.5). Program of Microsoft Excel. Paris, France: Addinsoft SARL 49 Trabajo Fin de Máster. Javier Tenas Gonzalvo Ciencia y Tecnología de la Carne y el Pescado Dpto. Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Facultad de Veterinaria Universidad de Zaragoza