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UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Bioquímica y Biología molecular y celular Estudios funcionales de la proteína FurB en Anabaena sp. PCC 7120 Proyecto para optar al título de Máster en Biología molecular y celular Violeta Calvo Sein-Echaluce Resumen La proteína FurB pertenece a la familia Fur (ferric uptake regulator) de factores de transcripción, que regulan la homeostasis del hierro en Anabaena sp. PCC 7120 y otros microorganismos. En la cianobacteria coexisten tres parálogos de esta familia: FurA, que regula la homeostasis del hierro y es un regulador global de la transcripción; FurB, que modula también la homeostasis del zinc y se une de forma inespecífica al DNA para protegerlo del daño oxidativo y FurC, cuya transcripción se ve incrementada en condiciones de déficit de nitrógeno. El objetivo principal de este proyecto es aportar nuevos datos para dilucidar los procesos biológicos en los que interviene FurB en Anabaena sp. PCC 7120. Para ello, se ha realizado la caracterización fenotípica de un mutante de Anabaena sp. PCC 7120 con el gen furB delecionado y se ha obtenido un mutante sobreexpresando la proteína FurB, para su caracterización en futuros trabajos. Se ha estudiado también el nivel de expresión de la proteína en Anabaena sp. PCC 7120 bajo diferentes condiciones nutricionales y de estrés y su capacidad de unión in vitro a algunos promotores de genes implicados en la respuesta a estrés oxidativo. Los resultados obtenidos con el mutante de deleción de FurB sugieren la implicación de la proteína en la regulación transcripcional de genes que intervienen en la determinación de la morfología celular y en fotosíntesis y también que, la ausencia de FurB como proteína protectora en este mutante, podría llevar a la inducción de enzimas antioxidantes como la catalasa. Los estudios realizados con el mutante de sobreexpresión de FurB revelan que una mayor expresión de la proteína está ligada a una disminución en la expresión de FurA. Esto sugiere que FurB podría ejercer un efecto compensatorio para ciertas funciones de FurA. Los estudios de expresión de FurB en Anabaena sp. PCC 7120 muestran que su expresión aumenta bajo condiciones moderadas de estrés oxidativo causado por agua oxigenada pero disminuye en condiciones más extremas, seguramente debido a la destrucción de la proteína. Además, la expresión de la proteína aumenta en condiciones de iluminación alta y disminuye en condiciones de baja iluminación. En cambio, la expresión no se ve modificada bajo diferentes condiciones de disponibilidad de zinc, sugiriendo que una cantidad basal de proteína es suficiente para llevar a cabo su función reguladora. Por último, no se ha observado interacción de la proteína con los promotores de la Fe-SOD ni con el promotor de la glutation reductasa de Anabaena y, por lo tanto, no existiría una regulación directa de dichos genes por parte de FurB. Abreviaturas Abreviaturas Abs Absorbancia Amp Ampicilina AMS 4-acetamido-4’-maleimidylstilbene-2,2’-disulfonic acid APS Ammonium persulfate (persulfato de amonio) bp / pb Basepairs (pares de bases) BCA Ácido bicinconínico BrEt Bromuro de etidio BSA Albúmina sérica bovina Chl a Clorofila a Cm Cloramfenicol Da Dalton (g/mol) DNA Ácido desoxirribonucleico DNAsa I Desoxirribonucleasa I DO Densidad óptica DTT 1,4-ditiotreitol EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay Fur Ferric unptake regulator FW Fresh weight (peso freco) Km Kanamicina LB Medio Luria Bertani LBA LB con agar NBT NitroBlue Tetrazolium (nitro-azul de tetrazolio) Nm Neomicina O/N Over Night (toda la noche) PAGE Poliacrylamide gel electrophoresis (electroforesis en gel de poliacrilamida) PCC Pasteur Culture Collection (colección de cultivos del Instituto Pasteur) PCR Polymerase Chain Reaction PCV Packed Cell Volume (volumen celular empaquetado) pI Punto isoeléctrico PSI Fotosistema I PSII Fotosistema II PVDF Fluoruro de polivinilo ROS Reactive Oxygen Species (especies reactivas de oxígeno) Rpm Revoluciones por minuto RubisCO Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa SDS Sodium dodecyl sulfate (dodecil sulfato sódico) SOD Superóxido dismutasa St Estreptomicina Sp Espectinomicina TCA Ácido tricloroacético TMB 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina TPEN N,N,N′,N′-tetrakis-(2-Pyridylmethyl)ethylenediamine TRIS tris-hidroximetil-aminoetano UV Ultravioleta WB Western blot Aminoácidos Alanina, Ala, A Arginina, Arg, R Asparragina, Asn, N Aspartato, Asp, D Cisteína, Cys, C Glutamina, Gln Ácido glutámico, Glu, E Glicina, Gly, G Histidina, His Isoleucina, Ile, I Leucina, Leu, L Lisina, Lys, K Metionina, Met, M Fenilalanina, Phe Prolina, Pro, P Serina, Ser, S Treonina, Thr, T Triptófano, Trp, W Tirosina, Tyr, Y Valina, Val, V Indice de contenidos Índice de contenidos 1. Introducción .......................................................................................................... 2 1.1. Las cianobacterias ............................................................................................. 2 1.1.1. Origen y evolución ....................................................................................... 2 1.1.2. Clasificación ................................................................................................. 3 1.1.3. Características estructurales ....................................................................... 3 1.1.4. Diferenciación celular .................................................................................. 5 1.1.5. Fotosíntesis oxigénica ................................................................................. 6 1.1.6. Fijación del nitrógeno .................................................................................. 6 1.2. El hierro.............................................................................................................. 7 1.2.1. Importancia del hierro en los seres vivos ................................................... 7 1.2.2. Regulación del metabolismo del hierro por la familia Fur ......................... 9 1.3. Proteínas Fur en Anabaena sp. PCC 7120 ...................................................... 11 1.3.1. FurA........................................................................................................... 11 1.3.2. FurB ........................................................................................................... 12 1.3.3. FurC ........................................................................................................... 12 1.4. Estrés oxidativo en cianobacterias ................................................................. 13 1.4.1. Especies reactivas de oxígeno (ROS) ........................................................ 13 1.4.2. Eliminación de ROS ................................................................................... 14 2. Objetivos .............................................................................................................. 16 3. Materiales y métodos....................................................................................... 18 3.1. Condiciones de cultivo y cepas empleadas .................................................... 18 3.2. Técnicas de trabajo con ácidos nucleicos ....................................................... 19 3.2.1. Extracción de DNA plasmídico de E. coli .................................................. 19 3.2.2. Extracción de DNA genómico de Anabaena sp. ....................................... 20 3.2.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ............................................. 20 3.2.4. Digestión enzimática doble y ligación ...................................................... 21 3.3. Métodos genéticos .......................................................................................... 21 3.3.1. Transformación de E. coli mediante choque térmico ............................... 21 3.3.2. Conjugación triparental en Anabaena sp. ................................................. 22 3.4. Métodos analíticos .......................................................................................... 25 3.4.1. Determinación de la velocidad de crecimiento y tasa de duplicación ..... 25 3.4.2. Determinación de pigmentos fotosintéticos y proteínas totales ............. 25 3.4.3. Determinación de especies reactivas de oxígeno .................................... 27 3.4.4. Determinación de la actividad catalasa .................................................... 28 3.4.5. Determinación de la actividad superóxido dismutasa ............................. 28 3.5. Determinación de la tasa fotosintética y respiratoria ................................... 30 3.6. Microscopía ..................................................................................................... 31 3.6.1. Microscopía óptica y de fluorescencia ..................................................... 31 3.6.2. Microscopía electrónica ........................................................................... 31 3.7. Técnicas de estudio de proteínas ................................................................... 31 3.7.1. Western blot ............................................................................................. 31 3.7.2. Ensayos de retardo en gel (EMSA) ........................................................... 32 4. Resultados ............................................................................................................ 35 4.1. Caracterización fenotípica de Anabaena  furB ............................................. 35 4.1.1. Caracterización morfológica ..................................................................... 35 4.1.2. Determinación de la velocidad de crecimiento y tasa de duplicación ..... 38 4.1.3. Determinación de pigmentos fotosintéticos y proteínas totales ............. 40 4.1.4. Determinación de especies reactivas de oxígeno .................................... 41 4.1.5. Determinación de la actividad catalasa .................................................... 42 4.1.6. Determinación de la actividad superóxido dismutasa ............................. 42 4.1.7. Determinación de la tasa fotosintética y respiratoria .............................. 43 4.2. Obtención de una estirpe de sobreexpresión de FurB en Anabaena sp....... 44 4.2.1. Clonaje de furB en el vector lanzadera pAM2770 .................................... 44 4.2.2. Conjugación triparental en Anabaena sp. ................................................ 45 4.2.3. Selección del clon con mayor sobreexpresión de FurB ............................ 46 4.3. Expresión de FurB bajo diferentes condiciones nutricionales y de estrés en Anabaena sp. PCC 7120 ............................................................................................. 48 4.3.1. Expresión de FurB bajo estrés oxidativo .................................................. 48 4.3.2. Expresión de FurB bajo diferentes condiciones de iluminación .............. 49 4.3.3. Expresión de FurB en función de la cantidad de zinc del medio .............. 50 4.4. Afinidad in vitro de FurB a distintos promotores .......................................... 50 5. Discusión .............................................................................................................. 54 5.1. Caracterización fenotípica de Anabaena  furB ............................................... 54 5.2. Obtención de una estirpe de sobreexpresión de FurB en Anabaena sp. ........ 57 5.3. Expresión de FurB bajo diferentes condiciones nutricionales y de estrés en Anabaena sp. PCC 7120 .............................................................................................. 57 6. Conclusiones........................................................................................................ 60 7. Bibliografía ........................................................................................................... 63 Introducción 7 para la transferencia de electrones, aceptando los electrones que le transfiere el clúster Fe4S4 de la proteína Fe) y un centro Fe7Mo1S9 (acepta los electrones del clúster P). Este último centro es el que une el N2 y otros sustratos (N3-, N2O, HCN, CH3NC, CH3CN, entre otros) y cataliza su reducción.  Proteína Fe (60.000 Da): contiene un clúster Fe4S4, localizado entre dos subunidades idénticas de aproximadamente 32-40 kDa. Proporciona los equivalentes de reducción/electrones a la otra proteína, empleando para ello la energía derivada de la hidrólisis del ATP. Todos los complejos nitrogenasa estudiados hasta la actualidad han resultado ser inhibidos irreversiblemente por el oxígeno y por las ROS. El oxígeno altera la estructura del complejo y también, en algunas especies, inhibe su síntesis. Por lo tanto, las cianobacterias en las que coexisten la fotosíntesis oxigénica y la fijación del nitrógeno han desarrollado estrategias para el funcionamiento de ambos procesos a la vez (Berman-Frank et al., 2003): separación en el tiempo (la fijación del N2 se lleva a cabo por la noche, mientras no hay fotosíntesis) ó separación en el espacio (la fijación del N2 se realiza en los heterocistos, que proporcionan al complejo nitrogenasa el ambiente anaerobio necesario para su funcionamiento). 1.2. El hierro 1.2.1. Importancia del hierro en los seres vivos El hierro es un metal de transición muy abundante en la corteza terrestre, de hecho, es el cuarto elemento en abundancia. Hace unos 3 billones de años con la aparición de la fotosíntesis oxigénica, pasó de estado ferroso, relativamente soluble (0,1 M a pH7), a estado férrico, que es muy insoluble (10-18 a pH7). Además, el ión férrico reacciona rápidamente con oxígeno para dar lugar a óxidos insolubles e hidróxidos. Esto redujo drásticamente la biodisponibilidad de hierro, es decir, la capacidad de los seres vivos para incorporar y metabolizar este metal. El hierro es absolutamente esencial para la vida, ya que participa en gran cantidad de procesos biológicos importantes: fotosíntesis, fijación del N2, metanogénesis, ciclo del ácido tricarboxílico, transporte de oxígeno, regulación génica y síntesis del DNA. Lo hace fundamentalmente formando parte de proteínas, como especie mono- o binuclear o dentro de estructuras más complejas como clústers sulfoférricos o grupos hemo, lo cual le permite adquirir el potencial redox (-300 a +700 mV), geometría y estado de spin requeridos para llevar a cabo su función biológica. Sin embargo, es potencialmente tóxico bajo condiciones aeróbicas porque interviene en la denominada reacción de Fenton, resultando nocivo para los seres vivos. Introducción 8 Figura 4. Reacciones de Fenton y Haber-Weiss. El Fe3+ es reducido por los aniones superóxido del interior celular y, una vez en forma de Fe2+, cataliza la descomposición del agua oxigenada, dando lugar al radical hidroxilo. Tomado de Andrews et al., 2003. Por lo tanto, en presencia de oxígeno, el hierro está poco biodisponible y es potencialmente tóxico. Esto hace necesario que los microorganismos deban mantener la homeostasis del hierro para disponer de la cantidad suficiente para cubrir todas sus funciones pero sin que llegue a resultar tóxico. Esto es especialmente importante en microorganismos como las cianobacterias que, debido a su metabolismo fotosintético, tienen un requerimiento de hierro 10 veces superior al de los microorganismos heterótrofos. Las principales estrategias adoptadas por los microorganismos para enfrentarse al estrés férrico son las siguientes:  Producción de sideróforos: son moléculas de bajo peso molecular (<1000 Da) que tienen una gran afinidad y especificidad por el ión férrico (Kaff>1030) y que se secretan al exterior celular para captar el metal. Suelen ser sintetizados ante la carencia de hierro, aunque algunos permanecen siempre asociados con la envuelta celular, como las micobactinas de las micobacterias. Se han caracterizado alrededor de 500 diferentes y se clasifican dependiendo del grupo que emplean como ligando del metal.  Depósitos intracelulares de hierro: el metal es acumulado mediante proteínas de almacenamiento. Presentan las ventajas de que la bacteria puede disponer de hierro aunque éste sea escaso en el entorno y, además, se previene el daño celular porque el hierro está “aislado”. El hierro es captado por estas proteínas en la forma ferrosa soluble, pero se almacena en el interior en forma férrica. Para ello, el hierro es oxidado por el oxígeno (o por agua oxigenada) en un proceso catalizado por residuos de la propia proteína, concretamente, por residuos localizados en cada uno de los monómeros que componen la proteína y que permiten la unión de dos iones ferrosos. Existen tres tipos de proteínas de almacenamiento en las bacterias, los cuales pueden coexistir en un mismo microorganismo: o Ferritinas: se encuentran en procariotas y también en eucariotas. Constan de 24 subunidades iguales o muy similares entre ellas, que se ensamblan formando una esfera en cuyo interior se almacena el metal. Cada subunidad contiene un fardo de 4 hélices alfa. Como son relativamente grandes (aprox. 500 kDa) pueden acumular 2000-3000 átomos de hierro. o Bacterioferritinas: sólo están en eubacterias. Su estructura es muy similar a la de las ferritinas y almacenan una cantidad de hierro semejante. La Introducción 9 principal diferencia es que contienen hemo como grupo prostético. Se desconoce con exactitud la función de ese grupo hemo, pero se cree que puede intervenir en la liberación del hierro contenido en la proteína, ya que las bacterioferritinas mutantes carentes de este hemo almacenan más átomos de hierro que las bacterioferritinas que sí que lo tienen. o Dps: sólo se encuentran en procariotas. También se conocen con el nombre de mini-ferritinas porque constan de sólo 12 subunidades, por lo que son más pequeñas que las anteriores (aproximadamente 250 kDa) y acumulan menos hierro (500 átomos). Suelen emplear H2O2, en lugar de oxígeno, como oxidante del Fe2+. La primera proteína Dps se descubrió en E. coli, en donde se vió que se unía de forma inespecífica al DNA. Esto parece indicar que la función de esta proteína es la de proteger al DNA de la acción combinada del ión ferroso y el agua oxigenada, que dan lugar al radical hidroxilo mediante la reacción de Fenton antes mencionada.  En situaciones de carencia de hierro, disminución en la expresión de proteínas cuya síntesis requiere de este metal. Ejemplo: en E. coli la enzima superóxido dismutasa tiene dos isómeros, Mn-SOD (se expresa cuando los niveles de hierro son bajos) y Fe-SOD (se expresa cuando los niveles de hierro son altos) y, en algunas especies de cianobacterias como Anabaena sp. PCC 7120, se sustituye la ferredoxina por flavodoxina.  Empleo de sistemas de resistencia frente al estrés oxidativo: en algunas especies como Anabaena sp. PCC 7120, la carencia de hierro conduce a un aumento en la cantidad de ROS (Latifi et al., 2005). Esto hace necesario el funcionamiento de enzimas de degradación de estas especies (peroxidasa, superóxido dismutasa, catalasa) y de reparación del daño oxidativo. En definitiva, todos estos mecanismos son el resultado de la estricta regulación a nivel génico de la adquisición, almacenamiento y consumo de hierro en los seres vivos en función de los niveles de éste. 1.2.2. Regulación del metabolismo del hierro por la familia Fur La familia Fur es una de las familias más importantes de metalorreguladores en bacterias (Ma et al., 2009). Las proteínas metalorreguladoras actúan de forma conjunta para mantener la homeostasis de los diferentes metales en el interior de la célula; funcionando como reguladores transcripcionales de genes que intervienen en el transporte y metabolismo de los mismos. En microorganismos heterótrofos, las proteínas Fur tienen dos sitios de unión a metal, uno con carácter estructural, que es necesario para mantener la conformación adecuada y suele contener zinc en la mayoría de los casos, y un sitio regulador, en el que se localiza el metal cuya homeostasis está regulada por la proteína o un metal que cataliza una reacción necesaria para la detección de la especie regulada por la Introducción 10 proteína. En función del metal regulador que posean, las proteínas Fur se engloban dentro de distintas subfamilias y tienen diferentes funciones (Lee and Helmann, 2007): Fur (contienen hierro como metal regulador y, por lo tanto, regulan principalmente la homeostasis de este metal), Zur (contienen zinc como metal regulador), Mur (contienen manganeso), Nur (contienen níquel), PerR (contienen hierro como metal regulador y lo emplean para catalizar reacciones de oxidación y detectar así el estrés oxidativo) e Irr (contiene hierro hemínico como cofactor y, por lo tanto, interviene en la detección de los niveles de hemo intracelular). Pero, de ahora en adelante, cuando hablemos de proteínas Fur, nos referiremos exclusivamente a aquellas que contienen hierro como metal regulador y que regulan su homeostasis. De forma general, las proteínas Fur se caracterizan por tener un bajo peso molecular (entre 13 y 20 kDa), bajo contenido en triptófano, poseer el motivo rico en histidinas HHXHXXCXXC y unirse al DNA en forma de dímero, siendo el dominio N- terminal el de unión al DNA y el C-terminal el implicado en la dimerización. En cuanto a su función reguladora de la transcripción, Fur actúa como represor: reprime la transcripción de los genes de adquisición de hierro mediante interacción con el co-represor (Fe2+) en situaciones de alta concentración de éste. La represión se lleva a cabo gracias a la unión del dímero al DNA en los promotores de los genes a silenciar, de tal manera que se impide el acceso de la RNA polimerasa. Por el contrario, en condiciones de baja concentración de hierro, la proteína se encuentra en su forma apo (sin Fe2+) y se separa del DNA, permitiendo la transcripción de los genes de adquisición de hierro. Figura 5. Regulación transcripcional directa por medio de Fur. A alta concentración de hierro, Fur de une al promotor e impide la transcripción de los genes de adquisición de hierro. A baja concentración de hierro, Fur se separa del promotor y permite la transcripción de los genes. Adaptado de Andrews et al., 2003. El complejo Fur-Fe2+ se une normalmente entre los sitios -10 y -35 de los promotores de los genes a regular. Los sitios de unión contienen una secuencia consenso llamada iron box o Fur box (caja Fur), que consta de 19 pb y es palindrómica: Introducción 11 No obstante, Fur también actúa como activador de algunos genes, principalmente de almacenamiento y empleo de hierro. En E. coli, algunos de los genes activados por Fur son los de la superóxido dismutasa (sodB), aconitasa A (acnA), fumarasa A (fumA), succinato deshidrogenasa (sdhCDAB), bacterioferritina (bfr) y ferritina (ftnA). Pero dichos genes no contienen la secuencia consenso de la iron box y, por lo tanto, la activación por Fur se llevaría a cabo de forma indirecta: cuando los niveles de hierro son bajos, la proteína Fur no se une al DNA y no se reprime la síntesis del RNA antisentido pequeño, RyhB. Este sRNA impide la traducción de los mensajeros de los genes antes mencionados. Por el contrario, cuando los niveles de hierro son elevados, la proteína Fur se une al DNA e impide la transcripción de RyhB. Así, RyhB no puede unirse a los mensajeros diana y se sintetizan las proteínas anteriores (Masse and Gottesman, 2002). Experimentos más recientes sugieren que Fur podría actuar como activador transcripcional de forma directa en algunos genes, pero el mecanismo por el cual sucedería todavía no está claro. Figura 6. Regulación transcripcional indirecta mediada por Fur. Las flechas en rojo simbolizan represión. Adaptado de Masse and Gottesman, 2002. 1.3. Proteínas Fur en Anabaena sp. PCC 7120 El análisis genómico de Anabaena sp. PCC 7120 en busca del motivo rico en histidinas permitió encontrar tres proteínas Fur distintas en esta especie, que se denominaron: FurA (all169), FurB (all2473) y FurC (alr0957) (Hernández et al., 2004). A continuación se describen algunas de las características de estas proteínas, que son objeto de estudio en nuestro laboratorio: 1.3.1. FurA Es la que presenta una mayor homología (40-45%) con las proteínas Fur de bacterias heterótrofas. Concretamente, es idéntica a la proteína Fur identificada en Anabaena sp. PCC 7119, la cual tiene una gran similitud genética con Anabaena sp. PCC 7120. Además, FurA es el miembro de la familia Fur más abundante en cianobacterias bajo condiciones estándar de cultivo y parece ser esencial para ellas, pues todos los Introducción 12 intentos de inactivar su gen, llevados a cabo en distintos laboratorios, han sido en vano y resultaban en estirpes no viables. Además de intervenir en la captación de hierro y en su almacenamiento, participa en la regulación de numerosas vías metabólicas relacionadas con el metabolismo del nitrógeno y la homeostasis redox (López- Gomollón et al., 2007; González et al). Bajo condiciones reductoras y de suficiencia del metal co-represor, la proteína FurA se une a los promotores de los genes de la propia FurA, FurB y FurC y también a los promotores de los genes que regula. Por último, cabe destacar también que FurA es capaz de unirse al grupo hemo porque posee el motivo de unión Cys-Pro. Esa interacción disminuye la capacidad de FurA para unirse al DNA, por lo que se ha propuesto que el grupo hemo actuaría como un regulador de la proteína (Hernández et al., 2004). 1.3.2. FurB Al igual que FurA, FurB es capaz de unirse a todos los promotores (PfurA, PfurB, PfurC), pero lo hace más fuertemente en ausencia del metal co-represor. En ausencia de estrés oxidativo, la transcripción de esta proteína es baja y se une preferentemente a PfurA y PfurC. Sin embargo, bajo condiciones de estrés oxidativo, su nivel de transcripción aumenta y se une al DNA de forma inespecífica y lo protege del daño provocado por radicales hidroxilo y DNAsa I. Por lo tanto, se asume que FurB actúa como regulador génico o como protector del DNA dependiendo de su nivel de expresión (Lopez- Gomollón et al., 2009). Además, se ha descubierto recientemente que FurB modula la homeostasis del zinc en Anabaena sp., actuando como una proteína Zur. FurB/Zur se une a los promotores de los genes que regula de forma dependiente de zinc, disminuyendo su afinidad por el DNA en presencia de un quelante del metal (Napolitano et al., 2012). Al igual que FurA, FurB también es capaz de unirse al grupo hemo porque posee el motivo Cys-Pro-Val. Además, la unión de hemo inhibe completamente la unión de la proteína al DNA, concretamente, a PfurA. Se cree que tanto este motivo CPV como el motivo CP de FurA, son motivos reguladores que sirven para la unión no covalente de proteínas al grupo hemo. Como sucede con FurA, la sobreexpresión de FurB en E. coli produce un aumento de la resistencia de esta bacteria al estrés oxidativo (López-Gomollón et al., 2009). Esto sugiere que, al inducirse fuertemente estos genes en presencia de peróxidos o de metil viológeno, se activa la transcripción de genes de defensa frente al estrés oxidativo (superóxido dismutasa, catalasa, etc). 1.3.3. FurC A diferencia de las anteriores, FurC no se une a ninguno de los promotores fur. Estudios de retardo en gel sugieren que FurC podría modular la actividad de FurA y FurB, aumentando la habilidad de FurA de unirse al DNA y disminuyendo la de FurB (Hernández et al., 2004). No obstante, deberían realizarse más estudios a este respecto para poder determinar si es el comportamiento real in vivo. Introducción 13 Al contrario que FurA y FurB, FurC no es capaz de unir hemo, lo cual podría deberse a la ausencia del motivo Cys-Pro-Val en su secuencia. Y también, a diferencia de lo que sucedía con FurA y con FurB, la sobreexpresión de FurC en E. coli no aumenta la resistencia de la bacteria bajo condiciones de estrés oxidativo. No obstante, FurC podría estar involucrada en la regulación de procesos metabólicos presentes en cianobacterias pero no en E. coli, como por ejemplo todos los relacionados con la fotosíntesis. De hecho, la expresión de FurC aumenta enormemente cuando se añade metil viológeno al medio de cultivo, que es un generador de aniones superóxido como los que se producen en la célula cuando el oxígeno molecular oxida el PSI. Tabla 1. Características generales de las proteínas Fur de Anabaena sp. PCC 7120. Aminoácidos Peso molecular (Da) ε276 (M-1cm-1) pI nº Cys Motivos CXXC nº His Motivos ricos en His Unión de hemo FurA 149 17144 13760 6'8 5 2 12 H5X2CX2C + FurB 132 15116 5720 8'67 5 2 7 H2X2CX2C + FurC 149 17328 13490 5'34 3 0 6 HXHX2CX2T - 1.4. Estrés oxidativo en cianobacterias 1.4.1. Especies reactivas de oxígeno (ROS) La fotosíntesis oxigénica llevada a cabo por las cianobacterias da lugar a la formación de oxígeno molecular. Esta especie por sí misma no es capaz de oxidar el DNA ni los aminoácidos, pero sí que puede transformarse en especies potencialmente dañinas, las especies reactivas de oxígeno, por medio de la adquisición de electrones. Algunas de las especies reactivas de oxígeno más importantes son:  Ión superóxido (O2 -) Se produce por la reducción del oxígeno molecular. En organismos fotosintéticos se genera principalmente en el PSI: cuando los niveles de NADP+ no son muy altos, el O2 acepta el electrón que le correspondería al NADP+, generándose el ión. La principal diana del ión superóxido son los centros sulfoférricos presentes en muchas enzimas, de tal manera que se libera un Fe2+ del centro y la enzima queda inactiva (Latifi et al., 2009).  Peróxido de hidrógeno (H2O2) Se produce por dismutación (espontánea o inducida por la SOD) del ión superóxido o, en organismos fotosintéticos, por una oxidación incompleta del agua en el PSII. Esta especie actúa sobre las proteínas, oxidando las metioninas o los grupos tiol de las cisteínas, y también sobre los centros sulfoférricos. Introducción 14  Radical hidroxilo (OH·) Se forma por radiólisis del agua o por la ya mencionada reacción de Fenton. Es la ROS que más biomoléculas puede dañar, siendo una de sus dianas preferidas el DNA. 1.4.2. Eliminación de ROS Existen diferentes componentes celulares encargados de eliminar las ROS para minimizar los daños que puedan provocar, entre ellos se encuentran:  Superóxido dismutasa (SOD) Esta enzima cataliza la dismutación de dos moléculas superóxido, produciendo peróxido de hidrógeno y oxígeno. Requiere de un cofactor metálico para llevar a cabo su acción y existen cuatro tipos de SOD en función del metal que emplean como cofactor: Mn-SOD, Fe-SOD, Cu/Zn-SOD y Ni-SOD. En Anabaena sp. PCC 7120 se han identificado dos superóxido dismutasas, una dependiente de manganeso (sodA o Mn- SOD) y otra dependiente de hierro (sodB o Fe-SOD).  Catalasa Es la enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno o agua oxigenada en H2O y O2. Se ha identificado en todas las cianobacterias estudiadas hasta el momento.  Peroxidasa Reduce peróxido de hidrógeno a hidroperóxidos orgánicos gracias a los electrones suministrados por reductores como el ascorbato y el glutation. Suelen tener mayor afinidad por el H2O2 y menor kcat que las catalasas. 2. Objetivos Objetivos 16 2. Objetivos El objetivo general de este trabajo es aportar nuevos datos para dilucidar los procesos biológicos en los que interviene la proteína FurB en Anabaena sp. PCC 7120. Para ello se propusieron los siguientes objetivos específicos: 1. Caracterizar fenotípicamente el mutante de deleción del gen furB, Anabaena  furB, estudiando aspectos como su velocidad de crecimiento, morfología y actividad de enzimas antioxidantes 2. Generar una estirpe de sobreexpresión de FurB en Anabaena sp., tomando como estirpe parental la cepa PCC 7120, para su caracterización en trabajos posteriores 3. Analizar la expresión de FurB en cultivos de Anabaena sp. PCC 7120 bajo diferentes condiciones nutricionales y de estrés 4. Estudiar la afinidad in vitro de FurB a distintos promotores de genes involucrados en la regulación del estrés oxidativo Materiales y métodos 23 - Origen de replicación en E. coli - Origen de replicación en Anabaena - Marcador de selección en E. coli (KmR) - Marcador de selección en Anabaena (NmR) - Promotor petE de la plastocianina de Anabaena, que es inducible con cobre Figura 7. Esquema del vector pAM2770. El vector tiene un tamaño de 8384 pb. Se muestra el promotor petE, tras el cual se clonó furB. Se muestran también los genes de resistencia a antibióticos (Km/Nm) y la región repA necesaria para la replicación del plásmido. Imagen realizada con Vector NTI AdvanceTM 11 (Invitrogen). Se trata por lo tanto de un vector lanzadera, ya que tiene los elementos necesarios (origen de replicación y marcador de selección) para trabajar en E. coli y también en Anabaena sp. Así, para realizar la conjugación y obtener la cepa de sobreexpresión de FurB se siguió el protocolo que se describe a continuación: 1) Se introdujo el plásmido de sobreexpresión pAM2770::furB en células competentes de E. coli CPB1893 mediante transformación por choque térmico. 2) Se realizó un cultivo O/N a 37°C de la cepa CPB1893 transformada en medio LB/Km/Cm y otro de E. coli ED8654 en medio LB/Amp 3) Al día siguiente, se refrescaron ambos cultivos hasta alcanzar la fase exponencial de crecimiento. Una vez alcanzada, se lavaron de forma sucesiva con 10 y 5 ml de medio LB, para eliminar los antibióticos. 4) Se añadió la cepa CPB1893 sobre la ED8654 y se incubaron durante 2 horas en oscuridad y sin agitación. Con esto se consigue la transferencia del plásmido conjugativo desde ED8654 hasta CPB1893. 5) Transcurridas las dos horas, se añadió sobre las dos cepas de E. coli la cantidad adecuada del cultivo de Anabaena sp. PCC 7120 en fase exponencial de crecimiento (3µg de clorofila). Materiales y métodos 24 6) La mezcla de las tres cepas se extendió sobre un filtro estéril (Whatman) colocado sobre una placa de medio BG-11 con el 5% de LB, para permitir el desarrollo de las cepas de E. coli. 7) A las 24 horas, el filtro se cambió a una placa de BG-11 y, al cabo de otras 24 horas, a una placa de BG-11 con neomicina (Nm). 8) El filtro se cambió a una placa nueva de BG-11 con Nm cada 24 horas durante los primeros días, hasta eliminar completamente el fondo de cianobacterias no exconjugantes (al cabo de aproximadamente 20 días desde el inicio de la conjugación). Una vez eliminado el fondo, el filtro se cambió de placa cada 2-3 días hasta observar la aparición de colonias aisladas de cianobacterias (al cabo de aproximadamente 50 días desde el inicio). 9) Una vez que el tamaño de las colonias aisladas fue suficiente, se sembraron en placas de BG-11/Nm para obtener mayor cantidad de biomasa y después se realizaron cultivos líquidos de 50 ml, que se indujeron convenientemente para luego analizar el nivel de sobreexpresión de FurB. La conjugación triparental también se empleó para obtener la otra cepa de Anabaena sp. utilizada en este proyecto, la cepa con el gen furB delecionado: Anabaena  furB. Esta cepa fue cedida por el Dr. Ignacio Luque (Instituto de Bioquímica vegetal y Fotosíntesis, Sevilla) y se construyó de la siguiente manera: se amplificó mediante PCR un fragmento del genoma de Anabaena sp. PCC 7120 conteniendo el gen furB flanqueado por unas 600 pb por cada extremo y se clonó en un vector pSPARK (Canvax). El plásmido resultante se amplificó por PCR inversa con primers divergentes y se ligó con el cassette C.S3 (StR y SpR) en la misma orientación en la que estaba el gen furB. De esta manera se obtuvo un vector pSPARK con el cassette C.S3 flanqueado en cada extremo por los 600 pb ya mencionados. El fragmento del vector conteniendo el gen furB inactivado se clonó después en el plásmido pRL278. El plásmido obtenido (pCMN38) se introdujo por conjugación en Anabaena. Una vez dentro de la cianobacteria, por recombinación homóloga, se produce la inserción del cassette C.S3 en el gen furB del cromosoma, de tal manera que este gen queda inactivado. Para este proyecto, se comprobó la identidad de la cepa de deleción por medio de Western Blot con anticuerpos anti-FurB, tal y como se describe en el apartado 3.7.1, esperando no observar la banda correspondiente a la proteína FurB que sí que se observa en la cepa de Anabaena sp. silvestre. Materiales y métodos 25 3.4. Métodos analíticos A lo largo del proyecto se emplearon distintos métodos analíticos con el fin de caracterizar fenotípicamente el mutante de deleción del gen furB, Anabaena  furB. Para ello, se aplicaron los distintos métodos tanto a la estirpe silvestre como al mutante de deleción  furB. 3.4.1. Determinación de la velocidad de crecimiento y tasa de duplicación Para comparar el crecimiento de las cepas, se realizaron medidas de la densidad óptica de las células a 750 nm cada 2-3 días durante aproximadamente un mes. A partir de los valores obtenidos se calcularon la velocidad de crecimiento específica (µ) y la tasa de duplicación (τ) aplicando las siguientes fórmulas: Todas las medidas se realizaron por triplicado en un espectrofotómetro Cary 100 Bio UV-visible (Varian). 3.4.2. Determinación de pigmentos fotosintéticos y proteínas totales Se comparó el contenido en pigmentos fotosintéticos (clorofila a, carotenoides y ficobiliproteínas) de las cepas en la fase exponencial de crecimiento y también en la fase exponencial tardía. La determinación del contenido en clorofila a se llevó a cabo con ligeras modificaciones del método previamente descrito (Nicolaisen et al., 2008). Se añadió 1 ml de metanol sobre 200 µl de cultivo y se homogeneizó en vórtex durante un minuto para romper completamente las células. Se centrifugó durante 2 minutos a 14000 rpm para depositar los restos celulares. Por último, se midió la absorbancia del sobrenandante a 665 nm y se calculó la concentración de clorofila a de acuerdo con la siguiente fórmula: La determinación de carotenoides se llevó a cabo según el método previamente descrito (Davies, 1976). Se centrifugaron 50 ml de cultivo a 4000 rpm durante 10 minutos y 4°C y se lavó el pellet de células dos veces con 5 ml de agua destilada. Una vez resuspendidas en 5 ml de agua destilada, se sonicaron las células 5 veces con ciclos de 45 segundos y pausas de 30 segundos, empleando una amplitud del 80% y ciclo 0’5. Materiales y métodos 26 A continuación, se añadieron 4V de acetona, se centrifugó a 2500g durante 5 minutos y 4°C y se midió la absorbancia del sobrenadante a 480, 465 y 663 nm, empleando como blanco acetona al 80%. La concentración de carotenoides se calcula aplicando las siguientes fórmulas: La determinación de ficobiliproteínas se llevó a cabo por el método previamente descrito (Glazer, 1976). Se centrifugaron 50 ml de cultivo a 4000 rpm durante 10 minutos y 4°C y se lavó el pellet de células dos veces con 5 ml de agua destilada. Una vez resuspendidas en 5 ml de agua destilada, se sonicaron las células 5 veces con ciclos de 45 segundos y pausas de 30 segundos, empleando una amplitud del 80% y ciclo 0’5. A continuación, se midió la absorbancia del sobrenandante a 620 nm, empleando agua como blanco. La concentración de ficobiliproteínas se calcula aplicando la siguiente fórmula: La determinación de proteínas totales se llevó a cabo mediante el método del ácido bicinconínico (BCATM Protein Assay Kit, Thermo Fischer Scientific), con la sonicación previa de las células en las condiciones ya descritas. Este método se basa en la capacidad del enlace peptídico de reducir Cu2+ a Cu+ en medio alcalino. Los iones Cu+ se unen al BCA, cambiando su estructura electrónica y haciendo que absorba a 562 nm. La absorción del compuesto es proporcional a la concentración de proteína presente, de tal manera que es posible calcular esta concentración interpolando en la recta de calibrado del método. El contenido en pigmentos y proteínas se expresa como miligramos de pigmento/proteína por volumen celular empaquetado (PCV), en donde el PCV son los microlitros de células que hay en un mililitro de cultivo. Para calcular este PCV, se añadió 1 ml del cultivo correspondiente en un tubo hematocrito graduado, se centrifugó a 2000g durante 10 minutos y 4°C y se anotó el volumen ocupado por el pellet de células. Se emplea el PCV como medida alternativa del crecimiento porque es independiente del contenido en pigmentos de la cepa. Como se verá más adelante, las cepas empleadas difieren en su contenido en clorofila a, pero no en su tamaño celular. Por lo tanto, es más correcto expresar las medidas en función del PCV que en función del contenido en clorofila a. Materiales y métodos 27 Todas las medidas se realizaron por triplicado en un espectrofotómetro Cary 100 Bio UV-visible (Varian) y, en todos los casos, se mantuvieron los extractos proteicos en tubos protegidos de la luz para evitar la fotodegradación de los pigmentos. 3.4.3. Determinación de especies reactivas de oxígeno Se determinó la cantidad de ROS, concretamente de agua oxigenada, presente en ambas cepas en la fase exponencial tardía del crecimiento. Para ello se empleó el método del ferritiocianato, con algunas modificaciones del protocolo descrito por otros autores (Thurman et al., 1972; Molin et al., 2007; González et al., 2010). El método consiste en la oxidación del Fe2+ de la sal de Mohr (Fe(NH4)2(SO4)2) a Fe3+ por parte del agua oxigenada en medio ácido. El Fe3+ resultante forma un complejo con los iones SCN- del tiocianato potásico que absorbe a 480 nm. La absorbancia es proporcional a la concentración de agua oxigenada presente en la muestra, siendo el rango de linealidad del método de 0-7 µmol de H2O2 en las condiciones empleadas. El protocolo diseñado fue el siguiente: se añadieron unos 50-100 mg de células en un tubo eppendorf y se rompieron con TCA al 5%. A continuación, se centrifugó la mezcla a 12000 rpm durante 5 minutos y 4°C para depositar los restos celulares y proteínas. Por último, 800 µl del sobrenandante se mezclaron en una cubeta espectrofotométrica con 160 µl de Fe(NH4)2(SO4)2 10 mM (concentración final 1’3 mM), 80 µl de KSCN 2’5 M (conc. final 167 mM) y 160 µl de TCA al 50%, añadidos en este orden. Rápidamente, se midió la absorbancia de la mezcla a 480 nm, frente a un blanco conteniendo agua MQ en lugar de extracto. El valor de absorbancia obtenido se interpoló en la recta de calibrado del método (Abs vs. µmol H2O2), que fue realizada con los siguientes volúmenes de reactivos y que tiene un coeficiente de correlación >0’999. H2O MQ (µl) H2O2 0’194 M (µl) Fe(NH4)2(SO4)2 10 mM (µl) KSCN 2’5 M (µl) TCA 50% (µl) H2O2 (µmol) 800 0 160 80 160 0 794’8 5’2 160 80 160 1’0088 789’8 10’2 160 80 160 1’9788 784’4 15’6 160 80 160 3’0264 779’4 20’6 160 80 160 3’9964 774’2 25’8 160 80 160 5’0052 764 36 160 80 160 6’984 Tabla 6. Composición de los patrones de la recta de calibrado del método del ferritiocianato. El resultado se expresa como nmoles H2O2 por mg de peso fresco (FW). Todas las medidas se realizaron por triplicado en un espectrofotómetro Cary 100 Bio UV-visible (Varian). Materiales y métodos 28 3.4.4. Determinación de la actividad catalasa Para la determinación de la actividad catalasa se realizaron algunas modificaciones del protocolo descrito por otros autores (Beers and Sizer, 1952; González et al., 2010). La catalasa es la enzima que cataliza la descomposición del agua oxigenada (H2O2 →H2O+O2) y este método se basa en que el agua oxigenada absorbe a una longitud de onda de 240 nm, pero no así los productos de la reacción. De esta manera, si se añade agua oxigenada al extracto proteico de Anabaena que contiene enzima catalasa, la evolución de la reacción puede seguirse por la disminución de la absorbancia a 240 nm. El protocolo diseñado fue el siguiente: se centrifugaron 50 ml de cultivo (en la fase exponencial tardía) a 4000 rpm durante 10 minutos y 4°C y el pellet de células se resuspendió en 1 ml de buffer fosfato (KH2PO4/K2HPO4) 50 mM pH7. Se sonicaron las células y se determinó la cantidad de proteínas totales mediante el método del BCA. A continuación, unos 300-600 µg del extracto proteico se mezclaron en una cubeta de cuarzo con H2O2 hasta una concentración final de 20 mM y se midió rápidamente la absorbancia a 240 nm a lo largo del tiempo (a intervalos de 1 segundo durante 5 minutos). Se empleó un blanco conteniendo la misma cantidad de extracto proteico pero no agua oxigenada. Finalmente, la actividad de la enzima catalasa se calcula como:  Nota: se define 1U como la cantidad de enzima que cataliza la descomposición de 1 µmol de H2O2/minuto. Todas las medidas se realizaron por triplicado en un espectrofotómetro Cary 100 Bio UV-visible (Varian). 3.4.5. Determinación de la actividad superóxido dismutasa La actividad superóxido dismutasa (SOD) se determinó con algunas modificaciones del método previamente descrito (Winterbourn et al., 1975; Lai et al., 2008; González et al., 2010). La SOD es la enzima que cataliza la reacción: O2- + 2H+ H2O2 + O2 y el fundamento de este método se basa en su capacidad para bloquear la reducción del colorante nitro-azul de tetrazolio (NBT) por los aniones O2-. La forma oxidada del NBT es incolora, mientras que la reducida es azul (absorbe a 560 nm). Los aniones O2- se generan por la reducción del oxígeno del aire por parte de la riboflavina adicionada (ver esquema a continuación). Materiales y métodos 29 El protocolo empleado fue el siguiente: se centrifugaron 50 ml de cultivo a 4000 rpm durante 10 minutos y 4°C y se eliminó el sobrenadante. El pellet se resuspendió en 1 ml de buffer fosfato 67 mM pH7’8 y se sonicó en las condiciones ya descritas. A continuación, se centrifugó el sonicado durante 5 minutos a 14000 rpm y 4°C para depositar los restos celulares. Se determinó la concentración de proteínas del extracto resultante mediante el método del BCA y, en cubetas espectrofotométricas de plástico, se prepararon las mezclas de reacción: Cubeta Extracto Buffer fosfato 67 mM pH7’8 EDTA 100 mM (conc final 6’4 mM) NBT 1’2 mM (conc final 41 µM) Volumen total (µl) Blanco (x2) - 900 65 35 1000 C. negativo - 900 65 35 1000 Muestra 600 µg Completar 65 35 1000 A continuación, se añadieron 20 µl de riboflavina (conc. final 2’4 µM) a las cubetas del control negativo y de la muestra, se homogeneizaron adecuadamente y se incubaron durante 10 minutos bajo iluminación de 20W. Transcurrido ese tiempo, se midió la absorbancia de la muestra a 560 nm frente al blanco, tomando medidas cada 1 segundo durante 5 minutos. Finalmente, se determina la Abs560/min en el control negativo (en el cual la variación será máxima porque no hay SOD) y en la muestra. El porcentaje de inhibición de la SOD se calcula como:    Puesto que 1 U de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que provoca una inhibición del 50%: Por último, dividiendo las U entre los mg de proteínas de extracto proteico que hemos añadido en la cubeta, se tiene la actividad expresada como U/mg. Materiales y métodos 30 3.5. Determinación de la tasa fotosintética y respiratoria La determinación de la tasa fotosintética y respiratoria se llevó a cabo mediante la medida de la producción/desaparición de oxígeno a lo largo del tiempo con un electrodo de tipo Clark, que consta de un cátodo de platino y un ánodo de plata (ver figura 8). Concretamente, en este trabajo se empleó el dispositivo Oxytherm (Hansatech), que contiene el electrodo de oxígeno recubierto de una cámara de reacción termostatizada. Figura 8. Electrodo de oxígeno. A la izquierda, esquema de funcionamiento del electrodo: al aplicar un potencial, el platino se carga negativamente y la plata positivamente. El oxígeno difunde a través de la membrana y es reducido en la superficie del cátodo, generándose una corriente eléctrica. La plata se oxida y el AgCl formado se deposita en el ánodo. La corriente generada es proporcional al oxígeno reducido. A la derecha, imagen real del electrodo, en el cual, el ánodo y el cátodo se encuentran insertados en una resina epoxi. Tomado de Hansatech. Para la preparación del electrodo, se añadieron unas gotas de KCl 2 M sobre el ánodo y el cátodo y se cubrieron de forma sucesiva con una lámina de papel y con una membrana PTFE de teflón permeable a oxígeno, que se fijaron con aros de goma. De esta manera el ánodo y el cátodo quedan comunicados por un puente de la disolución de KCl. A continuación se llevó a cabo la calibración del electrodo, simulando las condiciones extremas de concentración de oxígeno: - Concentración máxima: se introdujo en la cámara de reacción agua destilada bien aireada - Concentración mínima: se introdujo una disolución de ditionito de sodio, que consume el oxígeno a través de esta reacción: Na2S2O4 + O2 + H2O → NaHSO4 + NaHSO3. Una vez calibrado el instrumento, se procedió a tomar las medidas en cultivos en la fase exponencial de crecimiento. Las medidas se realizaron por duplicado y empleando los siguientes parámetros: temperatura de 25°C y agitación del 65% (para asegurar la distribución homogénea del oxígeno dentro de la cámara). Para determinar la evolución del oxígeno durante la fotosíntesis se empleó una iluminación de 400 µE/m2·s y, para determinar la evolución durante la respiración, se cubrió Materiales y métodos 31 completamente la cámara de reacción con papel de aluminio, minimizando la entrada de luz del exterior. Finalmente, la variación total en la cantidad de oxígeno se calculó como la suma de la variación durante la fotosíntesis y la respiración. Todos los resultados vienen expresados como µmolO2/mg Chl a·h. 3.6. Microscopía Se emplearon técnicas de microscopía para comparar la morfología, fluorescencia intrínseca y ultraestructura de las cepas Anabaena  furB y silvestre. 3.6.1. Microscopía óptica y de fluorescencia La morfología y fluorescencia intrínseca de las células se analizaron con un microscopio Nikon Eclipse 50i Epi-fluorescence acoplado con una cámara Nikon DXM 1200F. Para ello, se tomaron muestras de cultivo líquido de ambas cepas en la fase exponencial del crecimiento. 3.6.2. Microscopía electrónica La ultraestructura de las células se analizó por microscopía electrónica de transmisión con un microscopio TECNAI a 120V y también por microscopía electrónica de barrido con un microscopio SEM JEOL JSM 7001FA. Para ello, se fijaron las células en fase exponencial del crecimiento con glutaraldehído al 2’5% (Polysciences) y se enviaron al Laboratory of Bioenergetics and Microbiology (University of Geneva, Switzerland), en donde se realizó el tratamiento posterior: fijación de las muestras con tetróxido de osmio al 2%, deshidratación con etanol, infiltración en una resina Spurr, corte de las secciones con ultramicrotomo y tinción con acetato de uranilo. 3.7. Técnicas de estudio de proteínas Se aplicaron distintas técnicas de estudio de proteínas para analizar el nivel de expresión de FurB en diferentes condiciones de cultivo y analizar su capacidad de unión in vitro a distintos promotores. 3.7.1. Western blot Este técnica se empleó para determinar la colonia exconjugante de Anabaena con mayor sobreexpresión de FurB durante el proceso conjugativo de obtención del mutante VCS2770FurB, y también para comparar el nivel de expresión de la proteína FurB en Anabaena sp. PCC 7120 sometida a diferentes condiciones nutricionales y de estrés. Materiales y métodos 32 En todos los casos, se concentraron 50 ml de cultivo en la fase adecuada de crecimiento hasta un volumen final de 1-5 ml y se determinó la concentración de proteínas del extracto mediante el método del ácido bicinconínico ya descrito. Así, se cargaron 10-30 µg de proteínas totales en geles de SDS-PAGE al 17% y se sometieron a un amperaje de 35 mA durante 45-60 minutos. A continuación, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF, aplicando un voltaje de 15V durante 60 minutos. La membrana se bloqueó durante una hora a temperatura ambiente en una disolución de TBST (50 mM TRIS-HCl pH7’5; 150 mM NaCl; 0’1 % Tween 20) y leche descremada al 4 %. Tras efectuar 3 lavados de 5 minutos con TBST, se incubó durante una hora con los anticuerpos policlonales anti-FurB diluidos 1:1000 en TBST. Tras lavar de nuevo con TBST, se incubó durante otra hora con anticuerpo anti-IgG conjugado con peroxidasa. A continuación, se lavó 3 veces con TBST y 2 veces con tampón fosfocitrato (24’3 mM ácido cítrico; 5’14 mM Na2HPO4 pH5’3). Finalmente, se introdujo en la disolución de revelado (20 mg TMB; 80 mg DONS; 10 ml etanol absoluto; 15 µl H2O2) hasta observar la aparición de las bandas de proteína en color azul. 3.7.2. Ensayos de retardo en gel (EMSA) La afinidad in vitro de la proteína FurB con distintos fragmentos de DNA se analizó mediante ensayos de retardo en gel (Electrophoresis Mobility Shift Assay, EMSA). Esta técnica se basa en que, al producirse la interacción DNA-proteína, se forman complejos que tienen un mayor peso molecular que el DNA libre. Por lo tanto, estos complejos pueden diferenciarse del DNA libre porque tienen una menor movilidad electroforética. En todos los casos, el ensayo se realizó en presencia de un DNA competidor al cual no se une FurB para asegurar que la interacción observada es específica. La proteína FurB empleada en estos ensayos contiene una cola de histidinas (necesaria para su prurificación por cromatografía de afinidad a zinc en una columna Matrix Chelating Sepharose Fast Flow de Amersham) y se encuentra en una disolución 100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl. Mediante estudios previos en este laboratorio, se determinó que la cola de histidinas no afectaba a la unión de FurB al DNA. Los fragmentos de DNA empleados se obtuvieron por la técnica de PCR, con los oligonucleótidos descritos en la tabla 5 del apartado 3.2.3. Se purificaron y cuantificaron como también se ha descrito en ese apartado. Para el ensayo se emplearon geles no desnaturalizantes con un porcentaje de poliacrilamida del 6% (ver composición en la tabla 7), que es un procentaje lo suficientemente bajo como para permitir la migración de los posibles complejos. Resultados 39 A partir de los valores de densidad óptica que se muestran en la figura 14, se calcularon la velocidad de crecimiento específica (µ) y la tasa de duplicación (τ) para ambas cepas en el intervalo de máximo crecimiento de cada una de ellas: PCC 7120  furB µ (días-1) 0,08 0,05 τ (días) 8,77 13,76 Tabla 8. Parámetros de crecimiento. Se muestran los valores obtenidos en Anabaena sp. PCC 7120 y en Anabaena  furB. Las unidades se indican entre paréntesis. En la tabla 8 puede apreciarse como la cepa ∆furB tiene una menor velocidad de crecimiento y mayor tasa de duplicación que la estirpe silvestre, lo cual significa que su crecimiento es más lento en las condiciones estándar de cultivo empleadas. Un método adicional de estudiar el crecimiento de las cianobacterias consiste en efectuar mediciones de su contenido en clorofila a a lo largo del tiempo (figura 15). Estas mediciones se llevaron a cabo de manera simultánea a las de densidad óptica, empleando para ello los mismos cultivos. Figura 15. Evolución del contenido en clorofila a a lo largo del tiempo. En azul se muestran los valores para Anabaena sp. PCC 7120 y, en rojo, para la cepa  furB. Los valores corresponden a la media de tres medidas y la desviación estándar viene indicada por las líneas verticales. En la figura 15 se observa como el contenido en clorofila a de la cepa ∆furB es menor que en la estirpe silvestre durante gran parte de la fase exponencial del crecimiento, pero alcanza valores muy semejantes al llegar a la fase estacionaria final. 0 2 4 6 8 10 12 0 10 20 30 40 Clorofila a (µg/ml) Tiempo (días) Clorofila a PCC 7120 AfurB Resultados 40 4.1.3. Determinación de pigmentos fotosintéticos y proteínas totales La determinación de pigmentos fotosintéticos (clorofila a, carotenoides, ficobiliproteínas) y proteínas totales se llevó a cabo en la estirpe silvestre y en la cepa furB tanto en la fase exponencial del crecimiento como en la fase exponencial tardía. La determinación de estos pigmentos es interesante porque son necesarios para el proceso fotosintético. Las ficobiliproteínas son, cuantitativamente, las principales proteínas de las cianobacterias, pudiendo llegar a constituir hasta el 50 % del total de proteínas solubles. Se encuentran en los ficobilisomas, unas estructuras localizadas en la superficie de las membranas tilacoidales y encargadas de la captación de la energía luminosa durante la fotosíntesis. La clorofila a es el segundo pigmento fotosintético en abundancia y también interviene en la captación de energía luminosa. Por último, los carotenoides son los pigmentos fotosintéticos menos abundantes en las cianobacterias y, al igual que los anteriores, intervienen en la captación de luz. Con esta variedad de pigmentos, la cianobacteria asegura la captación de energía luminosa en un amplio rango de longitudes de onda. La determinación se llevó a cabo tal y como se indica en el apartado de materiales y métodos y se emplearon cultivos crecidos en Frascos Roux de vidrio con agitación mediante burbujeo constante de aire. Fase exponencial Fase exponencial tardía PCC 7120 furB PCC 7120 furB Clorofila a 2,16 ± 0,10 1,36 ± 0,04 2,63 ± 0,18 2,10 ± 0,11 Carotenoides 0,03 ± 0,00 0,04 ± 0,00 0,04 ± 0,00 0,04 ± 0,00 Ficobiliproteínas 11,79 ± 0,06 14,11 ± 0,20 17,28 ± 0,24 15,39 ± 0,80 Proteínas totales 49,14 ± 0,75 62,13 ± 0,91 64,83 ± 0,76 63,70 ± 0,92 Tabla 9. Contenido en pigmentos fotosintéticos y proteínas totales. Se muestran los valores obtenidos en Anabaena sp. PCC 7120 y en Anabaena furB. Los resultados son la media de tres determinaciones ± desviación estándar. Están expresados como µg pigmento ó proteína/PCV. Como se aprecia en la tabla 9, la estirpe silvestre presenta un aumento evidente en la cantidad de proteínas totales en la fase exponencial tardía con respecto a la temprana. Este aumento no es tan pronunciado en la cepa furB. No obstante, para facilitar el análisis de los datos se muestra la tabla 10, en la cual las cantidades de cada pigmento se expresan con respecto al total de proteínas: Resultados 41 Fase exponencial Fase exponencial tardía PCC 7120 furB PCC 7120 furB Clorofila a 4,40 2,19 4,06 3,30 Carotenoides 0,06 0,06 0,06 0,06 Ficobiliproteínas 24,00 22,71 26,65 24,16 Tabla 10. Porcentaje de pigmentos fotosintéticos. Se muestran los valores obtenidos en Anabaena sp. PCC 7120 y en Anabaena furB. El porcentaje de cada pigmento se ha calculado con respecto a las proteínas totales. Para simplificar la interpretación de los datos, se muestra únicamente el valor medio. En la tabla 10 se aprecia que el porcentaje de carotenoides es idéntico en ambas cepas, concretamente del 0,06%. Sin embargo, la cepa  furB tiene un menor porcentaje de clorofila a, concretamente de la mitad, que la estripe silvestre en la fase exponencial del crecimiento, aunque esta diferencia disminuye en la fase exponencial tardía. La cepa  furB tiene también un menor porcentaje de ficobiliproteínas que la estirpe silvestre en ambas fases del crecimiento. 4.1.4. Determinación de especies reactivas de oxígeno Puesto que la proteína FurB protege al DNA frente al daño causado por especies reactivas de oxígeno como son los radicales hidroxilo (Lopez-Gomollón et al., 2009), se consideró interesante la determinación de ROS, concretamente de agua oxigenada, en la estirpe silvestre y en la cepa  furB. Los cultivos se crecieron en Frascos Roux de vidrio con agitación mediante burbujeo de aire y la determinación de ROS se realizó cuando éstos se encontraban en la fase exponencial tardía de crecimiento, que es la fase en la que presumiblemente va a haber más ROS dentro de la célula. Figura 16. Contenido en ROS (H2O2). En gris oscuro, contenido en Anabaena sp. PCC 7120 y, en gris claro, en la cepa  furB. Los valores son la media de tres experimentos y la desviación estándar viene representada por las líneas verticales. Están expresados como nmol H2O2/mg de peso fresco. 0 5 10 15 20 25 ROS (nmol H2O2/mg FW) PCC 7120 AfurB Resultados 42 En la figura 16 se aprecia que la estirpe silvestre tiene un contenido en agua oxigenada de 17,41 ± 2,67 nmol H2O2/mg FW, mientras que la cepa furB tiene un contenido 20 veces menor, concretamente de 0,70 ± 0,20 nmol/mg FW. 4.1.5. Determinación de la actividad catalasa Debido a las diferencias observadas en el contenido de agua oxigenada entre Anabaena sp. PCC 7120 y Anabaena furB, se decidió llevar a cabo la determinación de la actividad catalasa, enzima encargada de descomponer el agua oxigenada, en ambas cepas. La determinación se efectuó en cultivos en la fase exponencial tardía crecidos en Frascos Roux de vidrio con agitación mediante burbujeo de aire. Figura 17. Actividad catalasa. En gris oscuro, la actividad catalasa en Anabaena sp. PCC 7120 y, en gris claro, en la estirpe  furB. Los valores son la media de tres experimentos y la desviación estándar viene representada por las líneas verticales. Están expresados como U/mg de proteínas totales. Como se aprecia en la figura 17, la estirpe silvestre tiene una actividad catalasa de 0,44 ± 0,04 U/mg, mientras que la estirpe  furB tiene más del doble de esta actividad, concretamente de 0,94 ± 0,04 U/mg. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en el apartado anterior: la cepa silvestre tiene una actividad catalasa menor y, por lo tanto, mayor cantidad de agua oxigenada que cepa de deleción de furB. 4.1.6. Determinación de la actividad superóxido dismutasa Se decidió evaluar la actividad de otra enzima involucrada en la eliminación de ROS, la superóxido dismutasa, que cataliza la dismutación de dos moléculas de superóxido. De nuevo, la determinación se efectuó en cultivos en la fase exponencial tardía crecidos en Frascos Roux de vidrio con agitación mediante burbujeo de aire. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Actividad catalasa (U/mg) PCC 7120 AfurB Resultados 43 Figura 18. Actividad SOD. En gris oscuro, la actividad SOD en Anabaena sp. PCC 7120 y, en gris claro, en la estirpe  furB. Los valores son la media de dos experimentos y la desviación estándar viene representada por las líneas verticales. Están expresados como U/mg de proteínas totales. En la figura 18 se aprecia que la actividad SOD en la estirpe silvestre es de 2,59 ± 0,09 U/mg, una actividad muy similar a la presente en la cepa ∆furB: 2,49 ± 0,20 U/mg. 4.1.7. Determinación de la tasa fotosintética y respiratoria La presencia de un menor porcentaje de ficobiliproteínas y clorofila a en el mutante de deleción  furB, nos llevó a pensar que tal vez la capacidad fotosintética de este mutante estuviera alterada con respecto a la estirpe silvestre. Por ello se procedió a medir la tasa de fotosíntesis de ambas cepas. Pero, puesto que las cianobacterias simultanean el proceso fotosintético con la respiración (figura 19), se midió la tasa fotosintética y también la tasa de respiración. Figura 19. Esquema de la fotosíntesis y respiración en cianobacterias. Durante la fotosíntesis, el agua es oxidada dando lugar a oxígeno atmosférico. Los electrones son empleados para obtener poder reductor y sintetizar así moléculas orgánicas complejas a partir del CO2. En la respiración se consumen las moléculas orgánicas y el oxígeno, produciéndose CO2 y agua. Adaptado de Essential Cell Biology, Garland Science. Se emplearon cultivos en la fase exponencial, crecidos en Frascos Roux de vidrio con agitación mediante burbujeo de aire. Para la medición de la tasa fotosintética se 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Actividad SOD (U/mg) PCC 7120 AfurB Resultados 44 introdujo un mililitro de cultivo en la cámara de reacción del electrodo y se iluminó con una intensidad de luz saturante (400 µE/m2·s). Para la medición de la tasa de respiración se mantuvo la cámara en completa oscuridad, cubriéndola con papel de aluminio. Parámetro PCC 7120 ∆furB Tasa fotosíntesis 7,06 ± 0,31 4,94 ± 0,01 Tasa respiración 2,00 ± 0,21 1,20 ± 0,18 Evolución total O2 9,06 ± 0,52 6,14 ± 0,18 Tabla 11. Tasas fotosintética y respiratoria. Se muestran los resultados para Anabaena sp. PCC 7120 y Anabaena  furB. La evolución total de oxígeno se ha calculado como la suma de las tasas fotosintética y respiratoria. Los valores son la media de dos determinaciones ± desviación estándar. Se expresan en nmol O2· ml-1· min-1· mg Chl a-1. De los datos mostrados en la tabla 11 se obtiene que el mutante ∆furB tiene una tasa fotosintética un 30% menor que la estirpe silvestre y una tasa respiratoria un 40% menor. Esto hace que tenga una menor evolución total de O2 a lo largo del tiempo. 4.2. Obtención de una estirpe de sobreexpresión de FurB en Anabaena sp. La estirpe de Anabaena sp. sobreexpresando el gen furB se obtuvo mediante conjugación triparental, introduciendo en Anabaena sp. PCC 7120 el vector replicativo pAM2770::furB. A continuación, se realizaron cultivos en medio BG-11 líquido de algunos de los clones exconjugantes, se indujo la transcripción y se seleccionó el clon de mayor sobreexpresión mediante Western blot empleando anticuerpos anti-FurB. 4.2.1. Clonaje de furB en el vector lanzadera pAM2770 La mezcla de ligación del gen furB y el vector pAM2770 se transformó en células competentes de E. coli DH5α. Se verificaron por PCR amplificando el gen furB, las colonias conteniendo el plásmido pAM2770::furB. Asimismo, la correcta inserción del gen furB en el vector pAM2770 se comprobó mediante una PCR adicional, empleando los mismos oligonucleótidos que se usarían luego en la secuenciación (ver tabla 5 en el apartado de materiales y métodos). Resultados 45 Figura 20. Clonaje de furB en pAM2770. Se muestra un gel de electroforesis con dos líneas de pocillos. Arriba: resultado de la PCR con oligonucleótidos de furB. Abajo: resultado de la PCR con oligonucleótidos de secuenciación. El contenido de los carriles es el siguiente: 1 (marcador ɸX174/HaeIII), 2 (control negativo de PCR), 3 (vector pAM2770 vacío), 4 (DNA extraído de la colonia 4), 5 (DNA extraído de la colonia 5), 6 (DNA extraído de la colonia 6), 7 (marcador 1Kb DNA Ladder). Según se observa en la figura 20, la colonia 4 era la que contenía el plásmido pAM2770::furB porque se obtuvo un producto de ~400 pb al amplificar con los oligonucleótidos de furB (399 pb) y un producto de ~600 pb al amplificar con los oligonucleótidos de secuenciación. Las demás colonias analizadas contenían el vector pAM2770 vacío, por eso no había amplificación con los oligonucleótidos de furB pero sí con los de secuenciación, correspondiéndose el producto con el que se obtiene en el vector vacío (carril 3 del gel inferior). Adicionalmente, se verificó la correcta orientación del gen dentro del vector mediante secuenciación. Por lo tanto, se aisló el plásmido pAM2770::furB de la colonia 4 y se empleó para transformar células competentes de E. coli CPB1893 y continuar así con el proceso conjugativo. 4.2.2. Conjugación triparental en Anabaena sp. Una vez que el filtro con la mezcla de conjugación (E. coli CPB1893, E. coli ED8654 y Anabaena sp. PCC 7120) fue colocado en una placa de medio selectivo (BG-11/Nm), transcurrieron aproximadamente 20 días hasta observar la muerte de la mayor parte de las cianobacterias; aquellas que no habían adquirido el plásmido pAM2770::furB (figura 21B). Aproximadamente 30 días después de eliminar el fondo de cianobacterias no exconjugantes, se observó la aparición de pequeñas colonias aisladas de Anabaena, las cuales se dejaron crecer sobre el filtro hasta alcanzar el tamaño que se muestra en la figura 21C. Resultados 46 Figura 21. Etapas de la conjugación. Se muestra el filtro de conjugación colocado sobre la placa de medio sólido. A) Mezcla de conjugación en el día 0 del proceso; el color verde se debe a la presencia de multitud de células vivas de Anabaena. B) Mezcla de conjugación en el día 20; el color amarillo se debe a la muerte de la mayoría de las células de Anabaena. C) Mezcla en el día 50 de la conjugación; se observan colonias aisladas de la cianobacteria. A continuación , algunas de las colonias obtenidas en la conjugación se sembraron en placas de BG-11/Nm para obtener mayor cantidad de biomasa de cada clon exconjugante (figura 22). Figura 22. Siembra de los clones tras la conjugación. Se observa crecimiento de algunas colonias (13, 14, 17, 18), pero no de otras (15, 16). 4.2.3. Selección del clon con mayor sobreexpresión de FurB Con el fin de identificar el clon con mayor sobreexpresión de FurB, algunas de las colonias crecidas anteriormente (13, 17 y 18) se inocularon en medio líquido BG- 11/Nm empleando erlenmeyers de 250 ml y se incubaron hasta alcanzar una densidad óptica a 750 nm de aproximadamente 0.3. En ese momento, se indujo la expresión de furB con CuSO4 0’4 µM estéril durante 72 horas (Buikema and Haselkorn, 2001). Las células se colectaron por centrifugación, se sonicaron y se cargaron 6’5 µg de proteínas totales de cada uno de los cultivos en un gel SDS-PAGE al 17%. Finalmente, se analizó el nivel de expresión de FurB mediante Western Blot empleando anticuerpos anti- FurB. Como controles en el Western blot se incluyeron: 6’5 µg de extracto proteico de Anabaena sp. PCC 7120 para analizar el nivel de expresión habitual de FurB y 6’5 µg de extracto proteico de Anabaena  furB para identificar correctamente las bandas obtenidas. Además, para garantizar que la cantidad de extracto cargada era efectivamente la misma en todos los carriles, se realizó simultáneamente otro gel de SDS-PAGE al 17% con 6’5 µg de proteínas totales y se tiñó con azul Coomasie. Resultados 47 Figura 23. Tinción con Coomasie (izquierda) y Western blot con αFurB (derecha) de los extractos proteicos de las colonias de conjugación. De izquierda a derecha en el WB los carriles corresponden a: extracto proteico de Anabaena sp. PCC 7120, extracto proteico de la colonia 13, extracto proteico de la colonia 17, extracto proteico de la colonia 18 y extracto proteico Anabaena  furB. Aparecen señaladas las bandas correspondientes al monómero de proteína (M), dímero (D) y trímero (T). Las bandas del marcador de peso molecular se indican en kDa. En el gel teñido con Coomasie (figura 23 izquierda) se observa como efectivamente la cantidad de extracto proteico empleada fue la misma en todas las muestras, porque todos los carriles presentan una intensidad semejante de las diferentes bandas. Las bandas más intensas, localizadas entre los 19-26 kDa, corresponden a las ficobiliproteínas, que son las proteínas más abundantes en Anabaena sp. En el Western blot (figura 23 derecha) se aprecia que las colonias 17 y 18 son las que presentan una mayor expresión de FurB. La proteína se encuentra como monómero (15kDa) y como trímero (45 kDa), pero la mayor parte está en forma dimérica (30 kDa). Además, las bandas observadas en el Western blot corresponden inequívocamente a la proteína FurB, ya que no aparecen en el carril del mutante de deleción. Por lo tanto y, a la vista de los resultados, se seleccionó el clon 18 como el de mayor sobreexpresión de FurB y pasó a denominarse Anabaena sp. VCS2770FurB. Adicionalmente, para visualizar el nivel de expresión de FurA en los clones exconjugantes anteriores, se llevó a cabo un Western blot de los mismos extractos proteicos, pero esta vez empleando anticuerpos anti-FurA diluidos 1:5000 en TBST. Figura 24. Western blot con αFurA de los extractos proteicos de las colonias de conjugación. De izquierda a derecha los carriles correcponden a: extracto proteico de Anabaena sp. PCC 7120, Resultados 48 extracto proteico de la colonia 13, extracto proteico de la colonia 17 y extracto proteico de la colonia 18. En todos los casos se cargaron 6’5 µg de proteínas totales. Las bandas del marcador de peso molecular se indican en kDa. En la figura 24 se aprecia como todos los extractos presentan la banda correspondiente a la forma monómerica de FurA (17 KDa) y como, además, las colonias en las que había mayor expresión de FurB (colonias 17 y 18), tienen una menor expresión de FurA. 4.3. Expresión de FurB bajo diferentes condiciones nutricionales y de estrés en Anabaena sp. PCC 7120 4.3.1. Expresión de FurB bajo estrés oxidativo Estudios previos del grupo demostraron que, in vitro y bajo condiciones de estrés oxidativo, FurB se une al DNA de forma inespecífica y lo protege del daño provocado por radicales hidroxilo y DNAsaI (Lopez-Gomollón et al., 2009). Por ello, se decidió analizar en este trabajo el nivel de expresión de FurB en Anabaena sp. PCC 7120 bajo diferentes condiciones de estrés oxidativo causado por agua oxigenada. En tubos Falcon con burbujeo de aire, se prepararon cultivos de Anabaena sp. PCC 7120 en la fase exponencial de crecimiento y con diferentes concentraciones finales de agua oxigenada: 0, 0’5 y 1 mM. A las 0, 6 y 24 horas de añadir el agua oxigenada, se tomaron muestras de los cultivos, que se concentraron y sonicaron. Tras determinar la concentración proteica mediante el método del BCA, se cargaron 30 µg de proteínas totales en un gel de SDS-PAGE al 17% para luego realizar un Western blot empleando anticuerpos anti-FurB (figura 25). Figura 25. Expresión de FurB en Anabaena sp. PCC 7120 bajo estrés oxidativo. En todos los carriles se cargaron 30 µg de extracto proteico. La cantidad de agua oxigenada del cultivo se muestra en la imagen, así como el tiempo al cual se tomó cada muestra. Las bandas del marcador de peso molecular se indican en kDa. Discusión 55 A lo largo de estos años, se ha intentado en diferentes laboratorios delecionar el gen furA de Anabaena, sin obtenerse resultados satisfactorios. Esto puede deberse a que se trate de un gen esencial para la supervivencia de la cianobacteria puesto que, además de mantener la homeostasis del hierro, es un regulador global de la transcripción (González et al., 2010). Sin embargo, sí que ha sido posible obtener el mutante de deleción de furB ya mencionado, por lo cual podría deducirse que, bajo las condiciones estándar de cultivo, FurB no es una proteína esencial en Anabaena sp. PCC 7120. No obstante, sí que hay que destacar que el mutante de deleción ∆furB presenta una menor velocidad de crecimiento que la estirpe silvestre (0,05 días-1 frente a 0,08 días-1) por lo que, aunque FurB no resulte esencial, sí que contribuye directa o indirectamente al crecimiento de la cianobacteria. En cuanto a la morfología del mutante ∆furB, no se aprecian cambios significativos en la longitud de las cadenas ni en el tamaño de las células. Tampoco hay cambios relevantes en la disposición de las membranas tilacoidales ni de los gránulos internos. Sin embargo, resulta interesante la menor superficie de contacto existente entre las células del mutante, que presentan uniones (septos) más pequeñas. Esto podría deberse a una alteración en la regulación de genes que controlan la morfología de la célula. Por ejemplo, se ha demostrado que FurA se une al operon mreBCD, que codifica para la actina MreB, la cual tiene un papel crítico en la determinación de la forma de las células de Anabaena (González et al., 2010) . Así, los resultados obtenidos podrían sugerir un papel directo o indirecto de FurB en la regulación transcripcional de este operon. Además, estudios realizados por otros autores, describen a FurB como regulador de varios genes de subunidades de sistemas ABC de transporte localizados en la membrana plasmática y también de receptores dependientes de TonB localizados en la membrana externa (Napolitano et al.). De esta manera, al no expresarse FurB en el mutante ∆furB, habría una desregulación de los genes de dichas proteínas, con la consecuente alteración de las membranas celulares. La menor superficie de contacto existente entre las células podría ser la causa de la fragilidad celular observada en el mutante ∆furB, que quedó patente al producirse la liberación de pigmentos fotosintéticos al cabo de 48 horas en ausencia de agitación. La autofluorescencia del mutante ∆furB tampoco pareció estar alterada. Hay que recordar que esta propiedad es debida a la presencia de una ficobiliproteína, la ficocianina. Por lo tanto, dado que el mutante presentó un porcentaje de ficobiliproteínas sólo ligeramente inferior al de la estirpe silvestre, tampoco eran de esperar cambios significativos en la fluorescencia de las células. Resulta destacable la apreciable disminución de la actividad fotosintética observada en el mutante  furB en comparación con la estirpe silvestre (4,94 ± 0,01 frente a 7,06 ± 0,31 nmolO2·ml-1·min-1·mg Chl a-1). Esta afectación podría deberse en parte a la gran Discusión 56 disminución del contenido de clorofila a y algo menor de ficobiliproteínas en el mutante. Sin embargo, no podemos descartar la influencia directa o indirecta de FurB en la regulación transcripcional de los genes involucrados en la fotosíntesis. Anabaena sp. dispone de múltiples enzimas detoxificantes como catalasas, peroxidasas, superóxido dismutasas y glutation reductasa (figura 30). Figura 30. Enzimas antioxidantes. Las enzimas se muestran en negrita. SOD: superóxido dismutasa, Cat: catalasa, GPx: glutation peroxidasa, GR: glutation reductasa, GSH: glutation reducido, GSSG: glutation oxidado. Además de regulador de la homeostasis del zinc (Napolitano et al.), estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado el papel relevante de FurB como proteína protectora del DNA frente a daño oxidativo (López-Gomollón et al., 2009). En este trabajo se ha observado un incremento considerable en la actividad catalasa del mutante  furB, llegando a duplicarse lo observado en la estirpe silvestre (0,94 ± 0,04 U/mg frente a 0,44 ± 0,04 U/mg). Estos datos concuerdan con los obtenidos en la determinación del agua oxigenada en el mutante: al tener una mayor actividad catalasa, presenta un contenido 20 veces menor de agua oxigenada. Pero, debido a que el gen catalasa de Anabaena sp. PCC 7120 todavía no ha sido identificado, no se ha podido comprobar mediante ensayos EMSA si esta alteración en la actividad catalasa se debe a una regulación directa del promotor por la proteína FurB, que está ausente en el mutante, o si es un efecto indirecto. A la vista de los resultados, resulta lógico especular que la ausencia de FurB como proteína protectora en el mutante  furB podría conllevar a la inducción de enzimas antioxidantes, como la catalasa. Sin embargo, no se han encontrado cambios apreciables en la actividad superóxido dismutasa del mutante, lo cual coincide además con los ensayos EMSA realizados con el promotor de la Fe-SOD, en los cuales no se veía interacción de la proteína con el promotor. Tampoco se ha observado que haya una regulación directa del promotor de la glutation reductasa por parte de FurB. Discusión 57 5.2. Obtención de una estirpe de sobreexpresión de FurB en Anabaena sp. Aunque ya se ha citado la importancia de los mutantes de deleción para el estudio de los regulones de factores de transcripción, también es notable la importancia de los mutantes de sobreexpresión. La sobreexpresión de reguladores transcripcionales ha sido empleada en Anabaena sp. (Buikema and Haselkorn, 2001; González et al., 2010) y en otras bacterias (Marr et al., 2006) como herramienta para determinar los mecanismos de regulación génica. Así, aunque para este trabajo ya se disponía del mutante de Anabaena sp. con el gen furB delecionado, se consideró interesante obtener además un mutante sobreexpresando la proteína FurB. Debido a la gruesa pared celular presente en Anabaena, se decidió recurrir a la conjugación triparental como método más eficaz para introducir el plásmido de sobreexpresión en la cianobacteria (Elhai et al., 1997). Esta técnica se llevó a cabo de forma satisfactoria, obteniéndose clones exconjugantes y demostrando que es posible sobreexpresar la proteína FurB sin que la cianobacteria sufra alteraciones importantes que impidan su desarrollo. Además, es destacable que las colonias exconjugantes con un mayor nivel de expresión de FurB, presentaron una expresión de FurA menor. Esto podría ser debido a la existencia de un mecanismo de compensación entre ambas proteínas. Aunque las proteínas FurA y FurB comparten una baja homología en sus secuencias y al parecer cumplen diferentes funciones en la célula (Hernández et al., 2007; López-Gomollón et al., 2007; López-Gomollón et al., 2009; González et al., 2010; Napolitano et al.), se ha observado que tanto FurA como FurB confieren resistencia frente a estrés oxidativo cuando son sobreexpresadas en E. coli (López-Gomollón et al., 2009). En tal sentido, la sobreexpresión de FurB podría ejercer un efecto compensatorio para ciertas funciones de FurA. La estirpe de sobreexpresión de FurB obtenida será una importante herramienta para futuros trabajos, ya que la caracterización fenotípica de la misma nos permitirá corroborar los datos obtenidos en el mutante de deleción  furB. 5.3. Expresión de FurB bajo diferentes condiciones nutricionales y de estrés en Anabaena sp. PCC 7120 A pesar de que el mutante  furB presentó el doble de actividad catalasa que la estirpe silvestre, sugiriendo una relación directa o indirecta FurB-catalasa, los estudios de expresión de FurB llevados a cabo en Anabaena sp. PCC 7120 bajo diferentes situaciones de estrés oxidativo causado por agua oxigenada (0’5 mM y 1 mM), sólo Discusión 58 mostraron pequeñas diferencias en el nivel de expresión de FurB tras la exposición al agua oxigenada. Se observó un ligero aumento en la expresión al cabo de 6 horas con agua oxigenada a una concentración de 0’5 mM, lo cual concuerda con la suposición de que, a elevadas concentraciones, FurB actúa como protector del DNA frente al estrés oxidativo (Lopez-Gomollón et al., 2009). Por el contrario, se apreció un descenso en la expresión de FurB al cabo de 24 horas con agua oxigenada 1 mM, que podría ser debido a una destrucción de la proteína a causa del excesivo estrés oxidativo al cual está sometida (Cabiscol et al., 2000). En cuanto a los ensayos de expresión de FurB realizados sobre la estirpe silvestre bajo diferentes condiciones de iluminación (50, 10 y 500 µE/m2·s), se apreció una ligera disminución en la expresión de la proteína a lo largo del tiempo en condiciones de baja iluminación y, por el contrario, un ligero aumento de la expresión en condiciones de iluminación alta. Esto podría deberse a que, en condiciones de baja iluminación, la tasa fotosintética es menor y, como consecuencia, hay una menor generación de especies reactivas de oxígeno. En estas condiciones no serían necesarias cantidades elevadas de proteína FurB para proteger al DNA del daño provocado por las especies reactivas. En cambio, en condiciones de iluminación alta, la tasa fotosintética aumenta y hay mayor producción de especies reactivas, por lo que la célula requeriría niveles mayores de FurB. Aunque se ha propuesto que FurB es un regulador de la captación de zinc al interior de la célula (Napolitano et al.), en los estudios de expresión llevados a cabo en la estirpe silvestre bajo diferentes situaciones de disponibilidad de zinc, no se observaron diferencias en el nivel de expresión de la proteína. Esto podría implicar que tal vez una cantidad basal de FurB es suficiente para reprimir los genes encargados del transporte de zinc. De hecho, Napolitano et al. han observado que la unión de FurB a los promotores de estos genes es de alta afinidad, con una constante de 2’5·10-9M, por lo que bastaría una cantidad muy pequeña de FurB para reprimirlos. En futuros estudios se profundizará en la influencia del ambiente en la regulación de la expresión de FurB y se estudiará la influencia de otros parámetros ambientales mediantes técnicas analíticas más sensibles como la RT-PCR. Asimismo, como continuación de este estudio, pensamos que resultará de gran relevancia la caracterización fenotípica de la estirpe de Anabaena sp. sobreexpresando la proteína FurB. 6. Conclusiones Conclusiones 60 6. Conclusiones 1. Se ha caracterizado el mutante de Anabaena sp. con el gen furB delecionado, obteniéndose lo siguiente: 1.1. Tiene una velocidad de crecimiento menor y una tasa de duplicación mayor que la estirpe silvestre por lo que, aunque FurB no resulta esencial, su deleción sí que afecta al crecimiento de la cianobacteria. 1.2. Aunque no presenta modificaciones en el tamaño de las células, longitud de las cadenas, autofluorescencia de las células ni disposición de las membranas tilacoidales, sí que presenta una menor superficie de contacto entre las células y una mayor fragilidad celular que la estirpe silvestre. Esto podría deberse a una alteración en la expresión de genes que controlan la morfología de la célula o de genes de proteínas que forman parte de la membrana plasmática y de la membrana externa y que estarían regulados por FurB. 1.3. Presenta un contenido apreciablemente menor de algunos pigmentos fotosintéticos como la clorofila a y ligeramente menor de otros como las ficobiliproteínas, lo cual podría ser una de las causas de la menor tasa fotosintética que presenta este mutante, que es un 30% de la tasa fotosintética de la estirpe silvestre. 1.4. Presenta una actividad catalasa mayor que la estirpe silvestre, lo cual concuerda con su menor contenido en agua oxigenada. Esto podría significar que la ausencia de FurB como proteína protectora en el mutante  furB implica la inducción de enzimas antioxidantes como la catalasa. 1.5. No presenta alteraciones apreciables en la actividad superóxido dismutasa, ni tampoco se observa que haya una regulación directa del promotor de la Fe- SOD por parte de FurB. Tampoco se ha observado interacción directa de FurB con el promotor de otra enzima involucrada en el control del estrés oxidativo, la glutation reductasa. 2. Se ha obtenido de forma satisfactoria el mutante de Anabaena sp. sobreexpresando la proteína FurB, al cual se ha denominado Anabaena sp. VCS2770FurB. El aumento en la expresión de FurB está ligado a una disminución en la expresión de FurA, lo cual podría sugerir que FurB ejercería un efecto compensatorio para ciertas funciones de FurA. Conclusiones 61 3. Los ensayos de expresión de FurB en Anabaena sp. PCC 7120 en diferentes condiciones de estrés oxidativo causado por agua oxigenada sugieren que la expresión se induce bajo condiciones moderadas de estrés, pero que la proteína es destruida cuando el estrés es más pronunciado. 4. Los ensayos de expresión de FurB en Anabaena sp. PCC 7120 bajo diferentes condiciones de iluminación muestran que la expresión de la proteína desciende ligeramente a lo largo del tiempo en condiciones de baja iluminación y, por el contrario, aumenta en condiciones de iluminación alta. Esto concuerda con la hipótesis de que FurB actuaría en la célula como protector frente al daño oxidativo. 5. Los ensayos de expresión de FurB en Anabaena sp. PCC 7120 bajo diferentes condiciones de disponibilidad de zinc muestran que la expresión de la proteína no varía en las condiciones ensayadas. Esto se debe posiblemente a que la alta afinidad de FurB por los promotores a regular hace que sólo sea necesaria una cantidad basal de proteína para llevar a cabo su función represora. 7. Bibliografía Bibliografía 63 7. Bibliografía 1. Adams, D.G. and P.S. Duggan, Heterocyst and akinete differentiation in cyanobacteria. New Phytologist, 1999. 144: p. 3-33. 2. Adams, D.G. and P.S. 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