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Trabajo Fin de Máster Relación entre la concentración plasmática de Lipoproteína(a) y la expresión del gen LPA Autora Ana Aramburu Carmona Directores Ana Cenarro Lagunas Fernando Civeira Murillo Laboratorio de Investigación Molecular Hospital Universitario Miguel Servet Facultad de Ciencias 2011-2012 Universidad de Zaragoza 2 Máster en Biología Molecular y Celular 3 ÍNDICE 1. ANTECEDENTES 5 1.1. Estructura y características de la Lp(a) 5 1.2. Concentración plasmática de Lp(a) 7 1.3. Genética 8 1.4. Metabolismo 9 1.5. Modelos de estudio 11 2. OBJETIVOS 12 3. METODOLOGÍA 13 3.1. Procesamiento de la muestra 13 3.2. Determinación de la concentración plasmática de Lp(a) 13 3.3. Extracción de RNA total 13 3.4. Retrotranscripción 18 3.5. PCR cuantitativa en tiempo real 20 4. RESULTADOS 24 4.1. Concentración plasmática de Lp(a) 24 4.2. Extracción de RNA 26 4.3. Retrotranscripción 27 4.4. PCR cuantitativa en tiempo real 28 4.5. Análisis estadístico 30 5. DISCUSIÓN 32 6. CONCLUSIONES 37 7. BIBLIOGRAFÍA 38 Máster en Biología Molecular y Celular 5 1. ANTECEDENTES La lipoproteína (a) [Lp(a)] es una partícula lipoproteica descubierta por Kåre Berg en 1963 1; desde entonces han sido numerosos los estudios que han tratado de caracterizarla. El interés de esta lipoproteína ha ido en aumento al establecer su relación con las enfermedades cardiovasculares, llegando a determinarse su alta concentración plasmática como un factor independiente de riesgo cardiovascular 2. La función fisiológica de la Lp(a) se desconoce, pero, por su homología con el plasminógeno, parece estar implicada en los procesos de coagulación sanguínea. El sistema fibrinolítico asociado al endotelio juega un papel crítico en la aterosclerosis y se ha visto que las partículas de Lp(a) se depositan en las placas ateroscleróticas, a través de diferentes mecanismos, engrosando la lesión. La aterogenicidad de esta partícula también viene dada por su efecto proliferativo sobre las células de músculo liso 3, así como por su capacidad quimiotáctica sobre monocitos y leucocitos 4, 5. En condiciones normales, la concentración plasmática de Lp(a) en un sujeto es constante a lo largo de toda su vida y no se ve afectada, como otras lipoproteínas, por la dieta, el ejercicio, la edad, el sexo, u otros factores ambientales 6. Asimismo, se ha demostrado que esta lipoproteína no responde al tratamiento con fármacos que sí descienden los niveles plasmáticos de otras lipoproteínas 7, 8. Por tanto, se hace necesaria una profundización en el estudio de la Lp(a), con el fin de determinar una posible diana terapéutica para disminuir su concentración plasmática de esta lipoproteína; aunque son numerosos los estudios realizados sobre hasta la fecha, la Lp(a) es una lipoproteína que presenta una gran complejidad y son aún muchos los aspectos que quedan por dilucidar. 1.1. Estructura y características de Lp(a) La complejidad de la Lp(a) radica fundamentalmente en su gran variabilidad ,tanto morfológica, como de concentración plasmática. Básicamente, su estructura consiste en una lipoproteína de baja densidad (LDL) unida a una glicoproteína Universidad de Zaragoza 6 denominada apolipoproteína (a) [apo(a)]. La fracción lipídica está contenida en la partícula LDL y ésta se encuentra rodeada por una molécula altamente hidrofóbica de 512 KDa, la apolipoproteína B-100 (apo B-100) 9. La unión entre ésta y la apolipoproteína específica de Lp(a), la apo(a), se establece mediante un puente disulfuro entre la Cys 4057 de apo(a) y la Cys 4326 de apo B-100 (Figura 1). Figura 1: Estructura de la Lipoproteína (a) La gran heterogeneidad de tamaño que existe entre las distintas partículas de Lp(a) es debida a la apo(a), ya que su tamaño varía, aproximadamente, entre 280 y 800 KDa 10. La secuencia aminoacídica de apo(a) forma unas estructuras características denominadas kringles (K): son secuencias de 80 a 90 aminoácidos que se disponen formando una estructura terciaria rígida y estable en forma de lazo, separadas entre sí por secuencias espaciadoras. Para denominar los kringles, estos se agrupan bajo distinta numeración (KI-KV). La estructura de apo(a) presenta una alta homología con el plasminógeno (PLG); sin embargo, apo(a) tiene un tamaño mucho mayor, ya que, a pesar de carecer de los KI-KIII, presenta una amplificación del KIV, que está repetido 10 veces; además, la secuencia que codifica el KIV-2 es variable y puede estar a su vez, repetida entre 2 y 43 veces, lo que explica el polimorfismo de tamaño de apo(a) 11. Por otro lado, el KV contiene un dominio proteasa, que parece no ser funcional. PL, fosfolípido s CE, colesterol esterificado FC, colesterol libre TG, triglicéridos Dominio Proteasa Máster en Biología Molecular y Celular 7 Tabla 1: Características de Lp(a) y apo(a) Lp(a) Densidad 1,040 – 1,131 g/mL Peso molecular 3,8 – 4,66 x 106 Da Diámetro molecular 250 Å Concentración plasmática 0 – 200 mg/dl Colesterol libre 750 mol/mol Colesterol esterificado 2000 mol/mol Triglicéridos 350 mol/mol Fosfolípidos 1110 mol/mol Vida media 3,32 – 3,93 días apo(a) Peso molecular 280 – 800 KDa Aminoácidos 4529 En la Tabla 1 se presentan las principales características de Lp(a) y apo(a). La fracción lipídica de Lp(a) constituye entre un 64 y un 74% de la molécula: los fosfolípidos se disponen envolviendo la lipoproteína, mientras que en la zona central se encuentra fundamentalmente, el colesterol esterificado. El porcentaje restante lo constituye la fracción glicoproteica. El diámetro de Lp(a) es aproximadamente, de 250 Å y su densidad varía entre 1,04 y 1,13 g/mL 12. 1.2. Concentración plasmática de Lp(a) Un aspecto bien caracterizado de la Lp(a) es la existencia de una correlación inversa entre el tamaño de apo(a) y la concentración plasmática de Lp(a) 13, 14; de esta forma, los sujetos con isoformas grandes presentan bajas concentraciones de lipoproteína, mientras que los individuos con isoformas de pequeño tamaño muestran altos niveles plasmáticos de Lp(a). Este factor hace necesario el uso de un método adecuado para determinar la concentración de la lipoproteína, que no se vea afectado Universidad de Zaragoza 8 por la heterogeneidad de las isoformas. Si no se tiene esto en cuenta, se podrían sobreestimar los niveles de Lp(a) en sujetos con partículas grandes, mientras que la concentración se subestimaría en aquellos que presentan las isoformas pequeñas 15. Por tanto, al utilizar técnicas inmunoquímicas, es esencial que el epítopo de reconocimiento se encuentre en un fragmento que no sea repetitivo. Debido a que este es un problema exclusivo de este analito, la mayoría de los laboratorios clínicos determinan su concentración, en vez de reflejar el dato en unidades molares, que sería la medida adecuada, ya que se determinaría el número de partículas que presenta cada sujeto. En cualquier caso, teniendo en cuenta estas premisas, se ha establecido la concentración de 30 mg/dL como valor por encima del cual aumentan los eventos cardiovasculares 16. Como ya se ha comentado anteriormente, la concentración plasmática de Lp(a) es constante para cada individuo a lo largo de su vida y no se ve influenciada por factores ambientales; no obstante, en determinadas condiciones patológicas este valor sí se ve alterado. Por ejemplo, los sujetos con hipercolesterolemia familiar presentan unos niveles de Lp(a) superiores a la media 17. Por otro lado, las patologías que afectan directamente al hígado, órgano de síntesis de Lp(a), también modifican la estabilidad de este valor43. 1.3. Genética El gen LPA que codifica la proteína apo(a) se encuentra localizado en el brazo largo del cromosoma 6 (6q27) 18 y tiene un tamaño de 130 Kb, aproximadamente. La región reguladora del extremo 5’ presenta sitios de unión para diversos factores de transcripción como son el estrógeno, la hormona del crecimiento o el factor nuclear hepático (HNF-1) 19. Aunque existe cierta controversia sobre este punto, puede considerarse que la concentración de Lp(a) es un rasgo genético cuantitativo 20, y su herencia es de carácter autosómico 13. Progresivamente se han ido describiendo distintos alelos del gen LPA, según el número de repeticiones del KIV-2; actualmente se considera que son Máster en Biología Molecular y Celular 9 más de 34 las variantes diferentes que determinan el tamaño de apo(a), incluyendo alelos nulos 21, 22. La herencia de estos alelos parece seguir un patrón de codominancia 13. Los sujetos heterozigotos presentan dos isoformas de apo(a) en plasma, cada una en una concentración característica para esa isoforma. De esta manera, puede decirse que si el tamaño de apo(a) está determinado genéticamente, también lo estará la concentración plasmática de Lp(a). Los estudios epidemiológicos muestran que existe una distribución de concentraciones de Lp(a) heterogénea entre las poblaciones. La concentración dentro de un mismo grupo puede variar del orden de 1000 veces (de 0,2 a 200 mg/dL). Como norma general, la raza negra presenta los mayores niveles de Lp(a) y algunos asiáticos, la menor concentración de Lp(a). Por el momento no se ha encontrado una explicación razonable para las grandes diferencias interpoblacionales, en los niveles medios de Lp(a). 1.4. Metabolismo El principal órgano de producción de Lp(a) es el hígado, aunque también se ha descrito cierta actividad en testículo, cerebro, glándulas adrenales, pulmón y pituitaria. Está ampliamente demostrado que la concentración plasmática de Lp(a) viene determinada por su síntesis, más que por su catabolismo23. El proceso de síntesis es el siguiente: el RNAm transcrito a partir del gen es traducido por los ribosomas, dando lugar a un precursor de apo(a) de menor peso molecular 22, que deberá sufrir un proceso de maduración. En primer lugar, la proteína queda retenida durante un tiempo prolongado (30-120 min) en el retículo endoplásmico (RE) 24, donde es plegada correctamente gracias a la actividad de la chaperona calnexina, y tras glicosilarse es secretada al citoplasma. Posteriormente, se transporta al aparato de Golgi para terminar su maduración y poder ser liberada al exterior de la célula 25. Existen varios trabajos que explican algunos mecanismos postranscripcionales como posibles moduladores de la concentración plasmática de Lp(a), encaminados a localizar potenciales dianas terapéuticas. Por un lado, se ha descrito la acción Universidad de Zaragoza 16 - El tejido se homogeneizó en 500 µL de TRIZOL y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. - Para eliminar los restos celulares, se centrifugó a 12.000 g, durante 5 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. - Se añadieron 500 µL de etanol absoluto y se mezcló con vórtex. La solución se aplicó directamente en la columna y se centrifugó a 12.000 g, durante 1 minuto a temperatura ambiente. De esta forma, el RNA quedó adherido a la columna. Se desechó, por tanto, el eluido y se transfirió la columna a un nuevo tubo colector. - Sobre la columna se añadieron 400 µL de la solución de prelavado y después se centrifugó en las mismas condiciones que en el paso anterior. Esta etapa se repitió una vez más. - Se añadieron 700 µL de la solución de lavado, volviendo a centrifugar a 12.000 g, durante 1 minuto a temperatura ambiente y desechando el eluido. De esta forma se consiguió eliminar las impurezas de la columna. - Para secar la columna se centrifugó en un tubo vacío a 12.000 g, durante 2 minutos a temperatura ambiente. Después se transfirió cuidadosamente la columna a un tubo nuevo. - Para eluir el RNA, se calentó previamente el H2O DEPC a 70°C y, tras añadir 70 µL sobre la matriz de la columna, se dejó incubar durante 5 minutos. Después se hizo una última centrifugación a velocidad máxima, durante 1 minuto, a temperatura ambiente. - El RNA disuelto en H2O DEPC se almacenó a -80°C. Cuantificación del RNA extraído Para determinar la concentración de RNA total, se realizó un análisis espectrofotométrico con un equipo Nanodrop2000 (Thermo Scientific), Máster en Biología Molecular y Celular 17 utilizando como blanco el H2O DEPC en la que se disolvió el RNA extraído. Para cada muestra se midió la absorbancia a 260 nm. Para definir la pureza de cada muestra, se determinó que la relación de absorbancia A260/A280 fuera igual o superior a 1,7. Las muestras cuya concentración fuera menor de 400 ng/µL se descartaron, volviendo a repetir el proceso de extracción, ajustando las condiciones. Determinación de la calidad del RNA La espectrofotometría aporta información sobre la concentración de RNA y el grado de impureza de la muestra, pero no determina la calidad del RNA extraído, de modo que es necesaria otra técnica para analizar la integridad del RNA. Para ello, se realizó una electroforesis en gel de agarosa. El dato que determina la adecuada calidad del RNA es la visualización clara de dos bandas correspondientes a las dos subunidades del RNA ribosómico de 28S y 18S, siendo la banda superior de mayor intensidad que la inferior; la aparición de una banda difusa y continua indica que el producto está degradado. Tras probar distintas condiciones para la electroforesis, se utilizaron las que se describen a continuación: - Se preparó un gel de 40 mL al 1,2% de Agarosa (Life Technologies) en TAE 1x con 1µL de SYBR safe (Life Technologies). - En cada pocillo del gel se aplicaron 5 µL de RNA y 5 µL de tampón de carga 2x (Azul de Bromofenol). - Como marcador de peso molecular se utilizó O’Gene Ruler DNA Ladder Mix (MBI-Fermentas) y se aplicarion 3 µL con 5 µL de tampón de carga. - La electroforesis se realizó a 80 V, durante 1 hora y 15 minutos. - La visualización del gel se realizó en un transiluminador BT-20.M (UVI Tec), con el programa informático UVI Photo MW. Universidad de Zaragoza 18 Aquellas muestras que presentaron un patrón de RNA degradado, se descartaron y se repitió el proceso de extracción. 3.4 Retrotranscripción Con el fin de cuantificar posteriormente la expresión del gen LPA, se realizó una retrotranscripción del RNA total a cDNA. Las siguientes técnicas se realizaron en hielo y en cabina de flujo Mini-V/PCR (Telstar), específica para PCR. En cada una de las etapas se añadió un blanco con H2O DEPC, para comprobar que no hubiera contaminaciones. Tratamiento con DNasa En primer lugar se sometieron las muestras a un tratamiento con DNasa para eliminar la posible contaminación con DNA del experimento anterior. - Tras descongelar las muestras de RNA se tomaron entre 2,5 y 4 µg de RNA total según las concentraciones obtenidas por espectrofotometría. - Se añadió a cada muestra 1 µL de tampón 10x (Ambion) para la reacción de la DNasa, 0,4 µL de MgCl2 50 mM, 0,5 µL de TURBO DNasa I (Ambion) de 2U/µL y el volumen correspondiente de H2O DEPC hasta un total de 10 µL. - Las muestras se incubaron en un termociclador System 9700 (Applied Biosystems) con un programa térmico de dos etapas: una de 45 minutos a 37°C y otra de 10 minutos a 65°C para inactivar la DNasa I. - Se volvieron a poner las muestras en hielo y se centrifugaron. Retrotranscripción Se realizó una retrotranscripción con cebadores al azar, lo que requirió una etapa previa de ensamblaje de cebadores. - A los 10 µl obtenidos en el proceso anterior, se añadieron 0,5 µL de cebadores al azar a una concentración de 300 ng/µL y se completó con H2O DEPC hasta un volumen total de 11 µL. - Se incubó en el termociclador a 65°C durante 5 minutos. Máster en Biología Molecular y Celular 19 - Se volvieron a poner las muestras en hielo y se centrifugaron. - A cada muestra se añadió 1 µL de un mezcla de dNTP (Life Technologies) 10 mM, 4 µL de First Strand Buffer 5x (Life Technologies), 2 µL de DTT 0,1 M (Life Technologies) para desnaturalizar las estructuras secundarias, 1 µL de la enzima RNasa-OUT (Life Technologies) de 40U/µL para evitar la degradación del RNA y finalmente, 1 µL de la enzima de retrotranscripción SuperScript III de 200U/µL (Life Technologies). - El programa térmico aplicado fue de tres etapas: una primera de 10 minutos a 25°C, la segunda de 1 hora a 50°C y la tercera de 15 minutos a 70°C, para inactivar la reacción. PCR de comprobación Para constatar que la retrotranscripción se había realizado correctamente, se amplificó el cDNA del gen ABCA1, por medio de una reacción de PCR. Como control positivo de la reacción se añadió una muestra de DNA genómico. - Sobre el producto de la reacción anterior, se hizo una dilución para tener el cDNA a una concentración de 0,01 µg/µL. De cada una se tomó un volumen de 5 µL. De DNA genómico se añadieron 2 µL y se completó el volumen con 3 µL de H2O DEPC. - A cada una se añadieron 2 µL de tampón de PCR 10x (Life Technologies), 0,6 µL de MgCl2 50 mM y 9,9 µL de H2O estéril. - Posteriormente se añadieron 1,6 µL de una mezcla de dNTP 2,5 mM (Life Technologies), 0,4 µL de cada uno de los cebadores, D R219K y R R219K a una concentración de 10 µM, y finalmente 0,1 µL de Taq DNA Polimerasa de 5U/µL (Life Technologies). - El programa térmico aplicado fuel el siguiente: una primera etapa de 5 minutos a 95°C para desnaturalizar el DNA y 40 ciclos en las siguientes condiciones: 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 60°C y 1 minuto a 72°C; por Universidad de Zaragoza 20 último, una etapa de 10 minutos a 72°C, para permitir la extensión completa de todas las hebras de DNA. - El producto de la retrotranscripción, tanto el original, como la dilución, se conservaron en congelador a -20°C. Análisis del producto de PCR Para comprobar la amplificación del cDNA y por tanto, confirmar la reacción de retrotranscripción, se realizó una electroforesis en gel de agarosa en las siguientes condiciones: - Se preparó un gel de 40 mL al 1% de Agarosa (Life Technologies) en TAE 1x con 1µL de SYBR safe (Life Technologies). - En cada pocillo del gel se aplicaron 10 µL del producto de amplificación (para el DNA genómico sólo se añadieron 3 µL) y 4 µL de tampón de carga (Xylene Cyanole 1x) - La electroforesis se corrió a 90 V, durante 40 minutos. - La visualización del gel se realizó en un transiluminador BT-20.M (UVI Tec), con el programa informático UVI Photo MW. 3.5 PCR cuantitativa en tiempo real Esta técnica constituye la última etapa para la cuantificación de la expresión del gen LPA. La técnica seleccionada fue la de cuantificación relativa mediante la utilización de sondas TaqMan. El material utilizado fue el siguiente: - Sonda TaqMan y cebadores del gen diana, LPA, de Applied Biosystems, asociados a una zona no variable del gen. - Sonda TaqMan y cebadores del gen elegido como control endógeno, GAPDH. Máster en Biología Molecular y Celular 21 - TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems), que contiene entre los reactivos de PCR necesarios, la DNA Polimerasa AmpliTaq Gold. Además incluye un control interno pasivo de fluorescencia (ROX). - Equipo ViiA7 de Applied Biosystems y el programa, ViiA7 Software v 1.1. Todo el experimento se realizó en la cabina de flujo específica para PCR y sobre hielo. El proceso se diseñó en dos etapas: Determinación de la concentración óptima de cDNA En primer lugar se construyó una recta estándar para determinar la concentración adecuada de cDNA para poder cuantificar posteriormente la expresión tanto del gen de interés, LPA, como del control endógeno GAPDH. Para ello se realizaron los siguientes pasos: - En primer lugar se preparó una mezcla con el cDNA de todos los sujetos, obtenido tras la retrotranscripción y utilizado para realizar la PCR de comprobación. A partir de ésta se prepararon 3 diluciones seriadas a una concentración 1:10 en H2O destilada; de esta manera, las concentraciones de cDNA por fueron: Dilución 1 10 ng/µL de cDNA Dilución 2 1 ng/µL de cDNA Dilución 3 0,1 ng/µL de cDNA Dilución 4 0,01 ng/µL de cDNA - En cada pocillo de la placa de PCR se aplicaron 10 µL de la mezcla de reacción, 4 µL de H2O destilada, 1 µL de la solución con los cebadores y la sonda TaqMan del gen correspondiente, y los 5 µL de cada una de las cuatro diluciones preparadas, por triplicado para cada gen. También se añadió un blanco para cada uno, sustituyendo el cDNA por H2O destilada. Universidad de Zaragoza 22 Antes de colocar la placa en el equipo, se selló y se centrifugó durante 3 minutos a 3.000 rpm para eliminar las burbujas formadas. - El programa térmico aplicado presentaba una primera etapa de desnaturalización de 10 minutos a 95°C y otra segunda, con 50 ciclos repetitivos de 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C. La lectura de la fluorescencia emitida por la liberación del fluorocromo reportero se realizó en esta última etapa de cada uno de los ciclos. - De los resultados obtenidos se seleccionó la dilución a la cual la señal de fluorescencia comenzaba a aumentar entre los ciclos 20 y 25. En ambos casos, tanto para el gen GAPDH como para el gen LPA resultó ser la dilución 1, es decir, aquella cuya concentración de cDNA era máxima: 10 ng/µL. Análisis de la expresión génica Una vez determinada la concentración óptima de cDNA, se pasó a cuantificar la expresión del gen LPA de cada sujeto. - En cada pocillo de la placa de PCR, se aplicaron 10 µL de la mezcla de reacción, 4 µL de H2O destilada, 1 µL de la solución con los cebadores y la sonda TaqMan de cada gen, y 5 µL de la dilución 1 del cDNA de cada sujeto, por triplicado para cada gen. También se añadió un blanco para cada uno de los genes, sustituyendo el cDNA por H2O destilada.. Antes de colocar la placa en el equipo, se selló y se centrifugó durante 3 minutos a 3.000 rpm. - El programa térmico consistió, como en el caso anterior, en una primera etapa de 10 minutos a 95°C de desnaturalización y otra segunda, con 50 ciclos repetitivos de 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C. La lectura de la fluorescencia emitida se realizó en la última etapa de cada ciclo. Análisis de datos Dado que la eficiencia de la reacción de amplificación del gen diana y la del control endógeno fue igual, el cálculo de la expresión génica se realizó por el método Ct (Ct = Ciclo umbral). Máster en Biología Molecular y Celular 23 En primer lugar, de los triplicados de Ct, se eliminaron aquellos valores que elevaban la desviación estándar por encima de 0,38; con los Ct restantes se calculó una media para cada sujeto. La normalización de los datos se llevó a cabo calculando el valor de ΔCt, a partir del control endógeno. Para poder determinar el ΔΔCt se seleccionó como control el sujeto cuyo valor de ΔCt fuera mayor, de modo que en los resultados finales, todos los valores estuvieran por encima de éste. Es decir, se seleccionó el que presentaba la expresión de LPA menor. Finalmente, a partir de la siguiente fórmula, se calculó el número de veces que se sobreexpresaba el gen, con respecto al control. Cada una de las placas se analizó por separado y, posteriormente, se realizaron los cálculos para combinar los datos y poder establecer la comparación de la expresión de cada sujeto con respecto a un solo control. FC = 2 – ΔΔCt (FC, número de veces de cambio con respecto al control) Universidad de Zaragoza 24 4. RESULTADOS 4.1. Concentración plasmática de Lp(a) Dado que los sujetos en estudio sufren distintas patologías, para poder realizar una correcta estimación de la concentración de Lp(a), se recogieron, además del primer valor de Lp(a) plasmática, hasta un máximo de cinco determinaciones diferentes de la concentración de Lp(a) de cada uno. Además, se procuró que la toma de muestras estuviera separada por un espacio de tiempo superior a una semana. De los valores de Lp(a) obtenidos se descartaron aquellos que iban asociados a niveles de albúmina inferiores a 3 g/dL, ya que este valor sirve de indicativo de una correcta función hepática. Posteriormente se calculó la media con los valores restantes. La concentración plasmática de Lp(a) de cada sujeto seleccionado para este estudio se presenta en la Tabla 2: La primera columna corresponde al número de muestra asignado a cada sujeto; la segunda, recoge el número de determinaciones analíticas incluidas en el estudio; la tercera, presenta la concentración plasmática de Lp(a) del día en que se tomó la muestra de tejido hepático; la cuarta, muestra el valor medio de todas las determinaciones analíticas de Lp(a) calculado para cada sujeto; y la última, corresponde al ratio de Lp(a) con respecto a la concentración de albúmina, determinada con los datos de la primera analítica. De las 65 muestras recogidas, se pudo obtener una adecuada estimación de la concentración plasmática de Lp(a) en 44 casos. La exclusión del estudio de los 21 sujetos restantes se debió a la falta de más de una analítica fiable, bien por fallecimiento o porque el paciente no correspondía al sector médico del Hospital. Máster en Biología Molecular y Celular 25 Tabla 2: Resultados de las determinaciones analíticas de Lp(a) plasmática. MUESTRA Nº DE ANALÍTICAS 1ª CONCENTRACIÓN Lp(a) (mg/dL) CONCENTRACIÓN MEDIA Lp(a) (mg/dL) RATIO 1ª Lp(a) / Albúmina 2262 3 45,7 120 14,3 2271 3 0 0 0 2294 5 11 71,18 3,3 2295 3 34,7 44,1 2302 4 26,4 41,3 8,3 2381 3 10,4 20,25 4,3 2420 5 97,95 2432 4 0 2,59 2442 4 17,1 37,17 2448 3 10,5 4,77 3,3 2450 4 54,9 60,4 16,1 2468 3 19,2 22,1 2472 3 0 1,3 2505 4 3,2 3,31 1,2 2559 4 92,1 107,25 27,9 2560 3 43,1 109,7 14,4 2574 4 44,3 86,5 14,8 2582 3 83,8 78,67 23,3 2588 3 6,6 7,89 1,7 2593 2 5,4 5,56 1,7 2594 2 4,6 6,58 1,2 2600 3 5,8 7,28 1,7 2623 3 70,6 50,43 22,1 2628 2 5,2 10,02 1,4 2636 4 3,5 7,82 2645 2 8,2 7,79 1,9 2653 3 0 0,94 0 2656 4 38,9 44 12,5 2676 4 73,1 59,33 20,3 2683 2 3,7 3,35 1 2696 3 2,2 2,36 0,7 2713 4 3,4 4,36 0,9 2719 3 15,3 15,3 5,3 Universidad de Zaragoza 32 5. DISCUSIÓN La lipoproteína(a) es una lipoproteína definida como factor de riesgo cardiovascular independiente 2; y el hecho de que esté implicada en el proceso aterogénico ha favorecido que sean numerosos los esfuerzos dedicados a su estudio. Estos esfuerzos se han visto incrementados tanto por la complejidad de la partícula en sí, como por la carencia de modelos de investigación adecuados. La principal apolipoproteína de Lp(a), apo(a), está codificada por un gen que presenta más de 34 alelos, incluyendo alelos nulos 21, 22; esta diferencia de tamaño génico, que viene dada por el número de repeticiones del fragmento que codifica el Kringle IV-2, produce una proteína, que presenta múltiples isoformas con distintos pesos moleculares (de 280 a 800 KDa) 10, siendo en cualquier caso, de un tamaño superior que la mayoría de las proteínas de la especie humana. Cada sujeto presentará una o dos isoformas de apo(a) y de la lipoproteína resultante. Por otro lado, existe una relación inversa entre el tamaño de apo(a) y la concentración plasmática de Lp(a)23, que será constante para cada individuo a lo largo de su vida. Como describe Marcovina S. en numerosos artículos 15, 32, a esto hay que añadir la complicación que genera la presencia de las múltiples repeticiones del Kringle IV-2, que condiciona los métodos inmunoquímicos utilizados. Esto deberá tenerse en cuenta, para evitar una sobreestimación o subestimación de la concentración plasmática de Lp(a). En el presente estudio, el método inmunoquímico utilizado es independiente del tamaño de la partícula, ya que el epítopo de reconocimiento se encuentra en un fragmento no repetitivo. Tras la recogida de la primera analítica, para el estudio de expresión, se continuaron recogiendo datos de cada sujeto, para poder llegar a una correcta estimación de la concentración de Lp(a) de cada uno. Estos primeros resultados coinciden con lo ya descrito: existe una gran heterogeneidad en cuanto a los valores de Lp(a) de cada individuo, variando en este caso, en un rango de 0 a 130 mg/dL. Aunque la mayoría de los sujetos presentó unos niveles dentro del rango establecido (0-30 mg/dL), algunos presentaron valores superiores a 100 mg/dL, lo que podría sugerir la conveniencia de incluir la determinación de este analito en las analíticas rutina. A pesar de haberse establecido la Lp(a) como factor de riesgo cardiovascular, su Máster en Biología Molecular y Celular 33 determinación no es habitual entre la población y la interpretación de los valores analíticos no es del todo evidente. Las causas que explican este hecho son múltiples: por un lado, aunque clínicamente se ha establecido un valor límite de referencia, este varía entre las distintas poblaciones; además, se plantea la duda sobre cuáles son las unidades adecuadas para presentar los datos: mg/dL o molaridad. Marcovina afirma que lo correcto sería utilizar unidades molares, pero debido a la presencia de las distintas isoformas, no podría utilizarse un único factor de conversión 15. Debido a estas y otras complicaciones el Panel de Expertos Americano, ATPIII44, sugiere determinar el valor de Lp(a) sólo en aquellos sujetos que presenten previamente un primer factor de riesgo cardiovascular. Este es el caso de pacientes con historial familiar de enfermedad vascular, o bien sujetos con hipercolesterolemia de causas genéticas. Por otro lado, se ha descrito una correlación positiva entre Lp(a) y albúmina 33, por lo que se utilizó este valor para obtener un ratio; de esta forma, se normalizó el valor de la concentración plasmática de Lp(a), para poder realizar una comparación más ajustada entre los sujetos. Como ya se ha mencionado, otro de los aspectos que hacen compleja la caracterización de la lipoproteína (a), es la falta de modelos y material de estudio adecuados, ya que el gen LPA sólo está presente en algunos primates y en el erizo. Actualmente son muchos los grupos de investigación que trabajan con ratones transgénicos para apo(a), pero éstos no reflejan adecuadamente las condiciones fisiológicas de la especie humana. Otra alternativa son los cultivos celulares de hepatocitos humanos: por un lado, se han realizado numerosos estudios utilizando la línea HepG2; sin embargo, estas células no expresan apo(a), siendo necesaria la transfección. En cuanto a los cultivos primarios de hepatocitos, son muy pocos los trabajos publicados hasta el momento, ya que requieren un complejo proceso de aislamiento y su periodo de supervivencia es muy corto. A esto hay que añadir la dificultad de obtener tejido hepático humano sano. En este sentido, este es uno de los aspectos principalmente novedosos de nuestro estudio, ya que el trabajo realizado con tejido hepático humano permite confirmar en la especie humana, algunas de las conclusiones obtenidas en otros modelos animales. Universidad de Zaragoza 34 El objetivo principal de este trabajo fue analizar si la tasa de transcripción del gen LPA está asociado a la concentración plasmática de Lp(a). Como era de esperar, se obtuvo una correlación positiva (R = 0,444, P = 0,004) para ambas variables; esto, junto con el análisis de regresión lineal, nos permitió concluir que la concentración plasmática de Lp(a) depende, entre otros factores, de la tasa de transcripción. Estos datos contradicen el único trabajo realizado sobre expresión de LPA en tejido hepático humano 34, en el que se concluye que no existe una relación significativa entre la concentración de RNAm de LPA y los niveles plasmáticos de la lipoproteína. Sin embargo, el tamaño muestral en ese estudio fue de 25 sujetos y las técnicas utilizadas eran de menor sensibilidad que las actuales. Por otro lado, el trabajo de Azrolan y colaboradores en un modelo de primate contrapone sus resultados al trabajo anterior 35, siendo coherente con nuestros resultados. En esta misma línea de la etapa transcripcional, estudios más recientes se han centrado en el análisis del promotor y en la región de regulación génica como posibles dianas terapéuticas 36: Huby y colaboradores definieron en un modelo de ratón transgénico para apo(a), que la región reguladora ACR es dependiente de estrógeno, siendo éste un inhibidor de la transcripción 37; también se ha descrito que la aspirina reduce la expresión génica en cultivos primarios de hepatocitos humanos 38. Por otro lado, el análisis de nuestros resultados indica que la tasa de transcripción no explica de modo absoluto la variación de la concentración plasmática. El modelo de regresión planteado nos permite afirmar que la expresión del gen LPA determina en un 12,8% la concentración plasmática de Lp(a) (R2 corregida = 0,128), lo que demuestra que deben existir otros mecanismos postranscripcionales que regulen los niveles de Lp(a) plasmática. A este respecto, White y colaboradores analizaron diversos mecanismos celulares que afectan diferencialmente a las distintas isoformas de apo(a) sintetizadas. Por un lado concluyeron que, aunque la mayoría de las moléculas, tras su síntesis y maduración son secretadas, una fracción de éstas sigue una vía alternativa y es degradada por el proteosoma 26. La fracción de apo(a) secretada frente a la degradada es dependiente del tamaño de apo(a). El ejemplo más patente de este proceso son las proteínas del alelo nulo, que, aunque se transcriben y traducen son incapaces de madurar y ser secretadas. Estos resultados son consistentes Máster en Biología Molecular y Celular 35 con los obtenidos en nuestro estudio, ya que algunos sujetos presentaron una concentración plasmática de Lp(a) de 0, mientras que la expresión génica de LPA presentó valores por encima de 1. Otro de los mecanismos descrito por este grupo es el tiempo de retención diferencial en el RE en función del tamaño de apo(a) y, también en este caso, observaron diferencias entre las distintas isoformas 24. El mecanismo y localización del ensamblaje es uno de los aspectos más controvertidos en la síntesis de Lp(a) y otro posible modulador de la concentración plasmática de la lipoproteína. Becker y colaboradores describieron el ensamblaje como un proceso de dos etapas 39: las interacciones no covalentes entre apo(a) y apo B-100 de las LDL y posteriormente, la formación del puente disulfuro, que estaría facilitado por una actividad Lp(a) oxidasa secretada por el hepatocito 9. Este proceso podría estar localizado bien en el espacio extracelular, o asociado a la membrana celular 40. Aunque cada vez se conoce más sobre el metabolismo y la patogenia de la lipoproteína(a), el esfuerzo por encontrar dianas terapéuticas adecuadas se hace imprescindible, ya que actualmente, la única terapia viable para disminuir la concentración de Lp(a) en sujetos con alto riesgo cardiovascular es la aféresis. En relación con el presente estudio, algunos de los trabajos más recientes, dirigidos a la búsqueda de fármacos para descender los niveles de Lp(a) en los pacientes con riesgo cardiovascular, han centrado su objetivo en determinados aspectos de la maduración postranscripcional de la lipoproteína. Es el caso de Merki y colaboradores, que tras sintetizar un oligonucleótido antisentido dirigido contra el RNAm de apo B-100 (Mipomersen), lo inyectaron en ratones transgénicos; de este modo, lograron que la concentración de Lp(a) disminuyera hasta un 75% 41. Por tanto, el bloqueo del ensamblaje entre las dos subunidades de la lipoproteína, podría ser un tratamiento efectivo para la reducción de la concentración de Lp(a). No obstante, también se han descrito algunos efectos adversos asociados a este tratamiento 42, lo que exige una adecuada evaluación del mismo. Podría concluirse que la tasa de síntesis de apo(a) es dependiente de tamaño y está regulada, según los resultados obtenidos en este estudio, tanto a nivel transcripcional, como a través de los procesos postranscripcionales, siendo, también estos procesos, dependientes de la isoforma. De esta manera, los alelos con menor Universidad de Zaragoza 36 número de repeticiones presentarían una mayor tasa de transcripción; además, los procesos de maduración favorecerían la secreción de la mayoría de las partículas sintetizadas dando lugar a una elevada concentración plasmática de Lp(a). Por el contrario, los alelos de mayor tamaño se expresarían menos y darían lugar a proteínas cuyo tamaño dificultaría el proceso de maduración, y por tanto, la liberación a la circulación sanguínea sería menor; de esta forma, estos individuos tendrían niveles de Lp(a) más bajos o incluso, nulos. Máster en Biología Molecular y Celular 37 6. CONCLUSIONES Las conclusiones de este trabajo son las siguientes: - La concentración plasmática de Lp(a) presenta una gran variabilidad entre la población en estudio. - Existe una gran heterogeneidad interindividual en la expresión del gen LPA en tejido hepático humano. - La expresión génica de LPA determina en un 12,8% la concentración plasmática de la lipoproteína(a). Universidad de Zaragoza 38 7. BIBLIOGRAFÍA 1. BERG, K. A New Serum Type System in Man--the Lp System. Acta Pathol. Microbiol. Scand. 59, 369-382 (1963). 2. Danesh, J., Collins, R. & Peto, R. Lipoprotein(a) and coronary heart disease. Metaanalysis of prospective studies. 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