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CARACTERIZACIÓN DE LA FUNCIÓN REDOX DEL FACTOR DE INDUCCIÓN DE APOPTOSIS HUMANO (hAIF) Alejandro Usón Ferrando Máster en Biología Molecular y Celular Universidad de Zaragoza 2012 FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR PROYECTO MÁSTER CARACTERIZACIÓN DE LA FUNCIÓN REDOX DEL FACTOR DE INDUCCIÓN DE APOPTOSIS HUMANO (hAIF) Memoria presentada por ALEJANDRO USÓN FERRANDO bajo la dirección de la Dra. PATRICIA FERREIRA NEILA MÁSTER EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR ZARAGOZA, SEPTIEMBRE DE 2012 Índice Resumen 1 1. Introducción 1.1. Flavoproteínas, FAD y NADH 5 1.2. Apoptosis 6 1.3. Factor de inducción de apoptosis (AIF) 7 1.3.1. Descubrimiento, secuencias e isoformas 7 1.3.2. Función óxido-reductasa 9 1.3.3. Estructura molecular de AIF 11 2. Objetivos 17 3. Materiales y métodos 3.1 Material biológico 22 3.2 Expresión de hAIF ∆1-102 , de sus mutantes W483G, P173G, F310G, H454S y E413A/R422A/R430A, y de las variantes hAIF ∆1-54 y hAIF ∆1-340 21 3.2.1 Transformación 21 3.2.2 Pruebas de expresión 21 3.2.3 Cultivo a media escala 22 3.3 Purificación de hAIF ∆1-102 , de sus mutantes W483G, P173G, F310G, H454S y E413A/R422A/R430A, y hAIF ∆1-54 y hAIF ∆1-340 22 3.4 Caracterización espectroscópica de hAIF ∆1-102 y mutantes 23 3.4.1 Espectros UV-visible de hAIF ∆1-102 y mutantes, y determinación de sus coeficientes de extinción 23 3.4.2 Espectroscopía diferencial 23 3.5 Caracterización de la actividad óxido-reductasa de hAIF ∆1-102 y de sus mutantes 24 3.5.1 Caracterización cinética en estado estacionario 24 3.5.2 Caracterización cinética en estado pre-estacionario 24 Alejandro Usón 4. Resultados 4.1 Expresión y purificación de hAIF ∆1-102 , de sus mutantes W483G, P173G, F310G, H454S y E413A/R422A/R430A, y de hAIF ∆1-54 y hAIF ∆1-340 29 4.1.1 Expresión y purificación de hAIF ∆1-102 y de sus mutantes W483G, P173G, F310G, H454S y E413A/R422A/R430A 29 4.1.2 Expresión y purificación de hAIF ∆1-54 y hAIF ∆1-340 30 4.2 Caracterización espectroscópica de hAIF ∆1-102 y mutantes 33 4.2.1 Espectros UV-visible de hAIF ∆1-102 y mutantes, y determinación de sus coeficientes de extinción 33 4.2.2 Espectroscopía diferencial 34 4.3 Caracterización de la actividad óxido-reductasa de hAIF ∆1-102 y de sus mutantes 34 4.3.1 Caracterización cinética en estado estacionario 34 4.3.2 Caracterización cinética en estado pre-estacionario 35 4.3.2.1 Reducción de hAIF ∆1-102 con NADH en cantidades equimolares 35 4.3.2.2 Reacción de transferencia de hidruro desde el NADH a los mutantes de hAIF ∆1-102 36 5. Discusión 43 6. Conclusiones 49 7. Bibliografía 53 Resumen Alejandro Usón 6 Figura 2. A) Espectro de absorción UV-visible del FAD libre. B) Espectro de absorción UV-visible de una flavoproteína (Flavodoxina, pH7, 25ºC) en estado oxidado, semiquinona neutro e hidroquinona. Entre los compañeros redox más habituales de las flavinas se encuentran NAD + y NADP + , junto con sus formas reducidas NADH y NADPH. Este grupo de coenzimas presentan gran importancia biológica en los procesos de transformación de energía (Ying, 2008). Constan de una adenosina (fosforilada en 2´ de la ribosa en el caso de NADP + /H), un grupo pirofosfato, una ribosa y un anillo de nicotinamida, capaz de oxidarse o reducirse mediante la captación o cesión de un ión hidruro. Figura 3. A) Estructura de NAD + /H. B) Espectro UV-visible de NAD + /H. NAD + /H y NADP + /H presentan propiedades espectroscópicas similares. La forma reducida presenta máximos a 338 y 259 nm (ε 340 = 6.3 mM -1 ·cm -1 ), mientras que la oxidada presenta un único máximo a 259 nm. 1.2. Apoptosis: La apoptosis se define como un proceso fisiológico de muerte celular programada en el que se diferencian dos etapas principales (Kerr et al., 1972; Hacker, 2000). En primer lugar se produce una condensación nuclear y citoplásmica en la célula, lo que desemboca en la fragmentación celular en cuerpos apoptóticos. Los orgánulos se encuentran compactos pero íntegros dentro de estos cuerpos apoptóticos, los cuales pueden contener o no fragmentos nucleares. Finalmente, los cuerpos apoptóticos son fagocitados y procesados por enzimas lisosomales en los fagosomas. Introducción 7 Hasta la fecha se han descubierto dos rutas apoptóticas principales: la vía mediada por receptores mortales, conocida como extrínseca, y la mitocondrial o también llamada intrínseca (Elmore, 2007). Ambas rutas tienen lugar mediante múltiples mecanismos moleculares y se relacionan entre sí, de forma que los eventos moleculares de una influyen en la otra. Además existe una ruta adicional que implica citotoxicidad mediada por células T y los sistemas perforina/granzima. Estas tres rutas convergen finalmente en la activación de la caspasa 3, que desencadena la degradación celular. La vía mitocondrial o intrínseca también es conocida como la ruta independiente de caspasas. Las mitocondrias son conocidas principalmente por su papel en la obtención de energía, pero también participan en la muerte celular, no sólo por la pérdida de su función energética sino también por la liberación de proteínas al citosol (van Loo et al., 2002; Smith et al., 2008). Esta liberación se produce como resultado de la pérdida del potencial de membrana mitocondrial y la formación de poros en dicha membrana, que permiten el flujo de proteínas a través de ellos en ambas direcciones. Entre dichas proteínas se encuentra el factor de inducción de apoptosis (AIF), que participa en la ruta independiente de caspasas. En respuesta a un estímulo apoptótico, AIF es liberado del espacio intermembrana de la mitocondria al citosol. Posteriormente se produce su translocación al núcleo, donde induce la fragmentación del DNA (van Loo et al., 2002; Susin et al., 1999). 1.3. Factor de inducción de apoptosis (AIF): 1.3.1. Descubrimiento, secuencias e isoformas: El factor de inducción de apoptosis (AIF) fue descrito por primera vez por Susin y colaboradores como una flavoproteína de ~57 kDa con una gran homología con oxidorreductasas de bacterias, plantas y hongos (Susin et al., 1999). Así mismo, encontraron un alto grado de conservación (92% de identidad de aminoácidos) entre AIF humano (hAIF) y de ratón (mAIF), y demostraron que el gen humano de AIF se encuentra localizado en la región Xq 25-26 del cromosoma X, mientras que el de ratón se encuentra en la región A6 del mismo cromosoma (Susin et al., 1999; Daugas et al., 2000). El transcrito más abundante de AIF, llamado AIF1 o AIF exon2a, se traduce en el citoplasma dando lugar a una proteína de 613 aminoácidos (612 en ratón). AIF1 se pliega dando lugar a tres dominios: dominio de unión a FAD (residuos 123-262 y 401- 480), dominio de unión a NADH (residuos 263-400) y dominio C-terminal (residuos 481-613) (Figura 4). Además, presenta una secuencia de localización mitocondrial (MLS) en la región N-terminal y dos secuencias de localización nuclear: NLS1 (residuos 278-301) y NLS2 (residuos 446-452) (Susin et al., 1999; Ye et al., 2002; Lipton et al., 2002). Dicha secuencia de localización mitocondrial dirige su transporte al espacio intermembrana mitocondrial, donde es procesado en su forma madura de 62 kDa (hAIF ∆1-54 ). Una vez plegada correctamente con su cofactor flavínico, flavín adenín dinucleótido (FAD), se inserta con su extremo N-terminal (aminoácidos 54-102) en la membrana interna, quedando expuesto el resto de la proteína al espacio intermembrana (Otera et al., 2005). Ante un estímulo apoptótico, AIF es procesada por calpaína I y/o catepsinas B, L y S en su forma apoptótica (hAIF ∆1-102 ), la cual es liberada al citosol y posteriormente translocada al núcleo (Polster et al., 2005). En el núcleo se une al DNA, Alejandro Usón 8 lo que induce su fragmentación, la condensación de la cromatina y muerte celular independiente de caspasas (Lipton et al., 2002). Esta actividad pro-apoptótica de AIF requiere la presencia de endonucleasas, ya que AIF carece de un dominio efector de muerte. Algunos estudios sugieren que AIF coopera con la endonucleasa G o con la ciclosporina A (CypA) para provocar cromatinolisis (Zhu et al., 2007; Cande et al., 2004; Kitagawa et al., 2008). Además, la histona H2AX podría ser necesaria para el ensamblaje de un complejo de degradación del DNA en el que intervendrían AIF, CypA y la propia histona (Artus et al., 2010). Figura 4. Alineamiento de las secuencias aminoacídicas de AIF humana y de ratón. Los dominios de unión a FAD y NADH y el dominio C-terminal están en negrita, en rojo y en cursiva respectivamente. Las cajas amarillas muestran las secuencias de localización mitocondrial (MLS) y nuclear (NLS); la caja verde indica la secuencia PEST. Los residuos transmembrana están subrayados y las flechas muestran las posiciones de procesamiento y las peptidasas que intervienen. Los códigos del GenBank para AIF humana y de ratón son AF100928 y AF100927, respectivamente (Figura modificada de Ferreira et al., 2012). Estudios posteriores han mostrado la existencia de al menos dos variantes más de hAIF: AIF2 o AIF-exon2b (Loeffler et al., 2001), que contiene un exón alternativo 2b frente al Introducción 9 exón original 2, y AIFsh (Delettre et al., 2006), que se produce a partir de un inicio de transcripción alternativo situado en el intrón 9 de AIF. Se ha visto que AIF2 presenta la misma función que AIF1 y también se encuentra en la membrana interna mitocondrial, anclándose de forma más fuerte a dicha membrana. Sin embargo, AIFsh es una proteína citosólica que provoca los mismos efectos apoptóticos que AIF1 pero carece de función óxido-reductasa. También se han generado otras dos isoformas humanas, AIFsh2 y AIFsh3, que también presentan el exón alternativo 9b. AIFsh2 contiene los residuos 1- 322, mientras que AIFsh3 está formada por los residuos 87-322, es decir, ambas carecen del dominio C-terminal y de NLS2, y por ello no son translocadas al núcleo. AIFsh3 también carece de la secuencia MLS y por consiguiente tampoco es translocada a la mitocondria (Delettre et al., 2006) (Figura 5). Figura 5. Isoformas descritas de AIF y representación de sus dominios (Ferreira et al., 2012) 1.3.2. Función óxido-reductasa: Además de su participación en la vía apoptótica mitocondrial, AIF presenta actividad NAD(P)H óxido-reductasa gracias a su cofactor FAD. Existe una gran controversia sobre qué papel desempeña la actividad óxido-reductasa en el espacio intermembrana de la mitocondria en condiciones no apoptóticas. Se cree que es esencial para la obtención de energía en las mitocondrias, así como para el funcionamiento óptimo de la cadena respiratoria (Miramar et al., 2001; Sevrioukova, 2011). También se ha sugerido su implicación tanto en la eliminación de radicales libres (Klein et al., 2002) como en su formación. Además, algunos estudios relacionan su función redox con la biogénesis y/o ensamblaje de los complejos I y III de la cadena de transporte de electrones durante la fosforilación oxidativa, así como con el mantenimiento de las funciones de estos complejos (Vahsen et al., 2004) (Figura 6). Alejandro Usón 10 Figura 6: a) Esquema de la participación de AIF en el ensamblaje del complejo I. b) Esquema de la participación de AIF en el mantenimiento de los complejos respiratorios (Modjtahedi et al., 2006). La primera caracterización in vitro de la actividad óxido-reductasa de AIF se realizó con la forma truncada de ratón mAIF ∆1-120 (Miramar et al., 2001). Se vio que mAIF ∆1-120 es capaz de catalizar la transferencia de electrones a baja velocidad entre NAD(P)H y pequeños aceptores de electrones o citocromo c, y que esta transferencia se acompañaba por la formación de complejos de carga (CTC). Posteriormente se caracterizaron las formas mAIF ∆1-53 y mAIF ∆1-101 , las cuales presentaron también baja velocidad de transferencia y formación de CTC (Churbanova et al., 2008). Todas estas formas mostraron preferencia por NADH frente a NADPH, y fueron capaces de intercambiar electrones con aceptores de uno o dos electrones. Además, la reducción con NADH provoca una transición de monómero a dímero, lo que significa que AIF podría participar en vías de señalización celular (Sevrioukova, 2009). Por otra parte, cabe destacar que todavía no se ha podido establecer qué relación hay entre la actividad óxido-reductasa y la apoptótica. Inicialmente se sugirió que eran independientes entre sí, ya que el precursor de AIF recombinante se vuelve apoptogénico incluso en ausencia de FAD (Susin et al., 1999), y ni la adición de NAD(P)H ni la inhibición de la actividad óxido-reductasa alteran la actividad apoptogénica de AIF (Miramar et al., 2001). Además, AIFsh (Delettre et al., 2006) presenta actividad apoptótica pese a carecer de actividad óxido-reductasa, mientras que AIFsh2 (Delettre et al., 2006) presenta actividad óxido-reductasa pese a carecer de actividad apoptótica. Sin embargo, actualmente se piensa que ambas funciones están relacionadas, ya que la dimerización de AIF mediada por la reducción con NADH produce una reorganización estructural de los dominios proapoptóticos, impidiendo el acceso a las secuencias de unión al DNA y a NLS2. Además, las formas monomérica y dimérica se consideran dos formas funcionales diferentes de AIF. Estudios realizados por Churbanova y colaboradores (Churbanova et al., 2008) sugieren que la forma predominante en la mitocondria en condiciones fisiológicas sería la forma dimérica, y que probablemente AIF forma parte de un complejo multimérico. Además, los cambios en los niveles de NADH podrían afectar al estado oligomérico, lo que alteraría las interacciones de AIF con otras proteínas no sólo en la mitocondria sino también en el citoplasma y en el núcleo. Bajo condiciones apoptóticas se suele producir una bajada en los niveles mitocondriales de NADH. Esto podría aumentar la presencia de la forma monomérica, que es más susceptible a proteolisis en el N-terminal y a la translocación al citosol para producir apoptosis. Todo esto indicaría que la función apoptótica de AIF Introducción 11 estaría controlada por su actividad óxido-reductasa (Churbanova et al., 2008; Sevrioukova, 2009; Sevrioukova, 2011). 1.3.3. Estructura molecular de AIF: Se han determinado varias estructuras cristalográficas de AIF en su estado natural, tanto de la forma humana (residuos 128-608 en el PDB 1M61, Ye et al., 2002) (Figura 7) como de la de ratón (residuos 121-610 en el PDB 1GV4, Maté et al., 2002; residuos 128-610 en el PDB 3GD3, Sevrioukova, 2009). En todas ellas se observan tres módulos: los dominios de unión a FAD y NADH muestran un plegamiento tipo Rossman, mientras que el dominio carboxilo terminal está compuesto por cinco hojas beta antiparalelas (residuos 478-579) seguidas de dos hélices alfa (residuos 580-610). Además, en el dominio C-terminal de la forma oxidada de AIF, tanto en la humana como en la de ratón, se han encontrado varios motivos desordenados que no se han podido resolver (residuos 540-559 y 546-553 en los PDB 1M6I y 3GD3, respectivamente). Figura 7: Estructura cristalográfica de AIF humana (Ye et al., 2002). Se representa en verde el dominio de unión a FAD, en naranja el dominio de unión a NADH y en morado el dominio C-terminal. El cofactor FAD, en su forma natural oxidada, se representa en color azul. Como ya se ha mencionado anteriormente, AIF tiene como grupo prostético una molécula de FAD unida de forma no covalente por molécula de proteína, lo que le permite participar en procesos de óxido-reducción. Su anillo de isoaloxacina se estabiliza en la interfase entre los tres dominios y es parcialmente accesible por el solvente, mientras que la adenosina, el grupo pirofosfato y el ribitil del FAD están en contacto con el dominio de unión a FAD (residuos 138-140, 164, 232, 258-260 y 403). Esta disposición estructural de AIF es similar a la de las reductasas bacterianas de ferredoxina, que son sus homólogos más cercanos evolutivamente. Sin embargo, AIF se diferencia principalmente de dichas reductasas por la presencia de un bucle extra en el C-terminal (residuos 510-560 en hAIF), que le proporciona su función apoptótica (Maté et al., 2002). Este bucle contiene una secuencia PEST (residuos 529-560 en hAIF) y una secuencia rica en prolinas (residuos 544-554 en hAIF). Ambas secuencias suelen estar involucradas en interacciones proteína-proteína, y se ha sugerido su participación en la Alejandro Usón 12 unión con CypA (Artus et al., 2010). Esta unión permitiría el transporte de AIF al núcleo y la cromatinolisis del DNA. También se ha determinado la estructura de la forma reducida por NADH de AIF de ratón (residuos 128-610 en el PDB 3GD4, Sevrioukova, 2009) (Figura 8A). Tras la reducción por NADH se observa la dimerización de AIF y la formación de complejos de transferencia FADH 2 -NAD + muy estables. Según esta estructura, la estabilización del CTC se debe a tres motivos: (i) las interacciones de apilamiento entre los anillos de nicotinamida, isoaloxazina y F309 (F310 en la forma humana) (Figura 9); (ii) la redistribución de un gran número de residuos aromáticos situados en el C-terminal, probablemente actuando como un sitio de deslocalización electrónica; (iii) una amplia red de enlaces de hidrógeno en la que participa His453 (His454 en hAIF), un residuo clave que sufre un cambio conformacional para interaccionar y orientar de forma óptima la nicotinamida, favoreciendo la transferencia de carga. Estos cambios en el centro activo se transmiten a la superficie de AIF provocando la dimerización y restringiendo el acceso a NLS2. Además, el dímero formado está estabilizado por una serie de puentes salinos entre los residuos E412, R421 y R429 (E413, R422 y R430 de la forma humana) (Figura 8B). Todos estos datos apoyan la hipótesis de que tanto la función mitocondrial como la apoptótica están reguladas por NADH (Sevrioukova, 2009). Figura 8: A) Estructura cristalográfica del dímero mAIF red :NAD + (PDB 3GD4). Las dos moléculas de AIF se representan en verde y rojo. El cofactor FADH 2 se muestra en negro y la coenzima NAD + en amarillo. B) Modelado de las interacciones entre algunos residuos presentes en la zona de unión del dímero a partir del dímero mAIF red :NAD + (PDB 3GD4). Gracias a la estructura cristalográfica de mAIF en estado reducido por NADH, se puede predecir el lugar de unión del anillo de nicotinamida del piridín nucleótido en el entorno del anillo de isoaloxacina del FAD. De esta forma se puede predecir un modelo de interacción entre la enzima y el coenzima para la proteína humana. Así, el centro catalítico está formado por los residuos W483, F310, P173, H454, E314 y K177 (Figura 9). Estos dos últimos residuos no se han estudiado en este trabajo ya que las mutaciones realizadas en estos residuos (Villanueva, 2010) generaron proteínas inestables. Introducción 13 Figura 9. Centros activos superpuestos de mAIF reducida por NADH (pdb 3GD4) y la forma oxidada de hAIF (pdb 1M6I). Se muestra en color negro el cofactor FADH 2 y en azul la coenzima NAD + . Se muestran en verde los residuos del centro activo correspondientes a la forma oxidada y en rojo los residuos correspondientes a la forma reducida. Los guiones muestran una nueva interacción entre H454 y NAD + tras la reducción de AIF. Esta figura muestra los desplazamientos de algunos residuos del centro activo como consecuencia de la reducción de la proteína. Por ello se cree que estos residuos podrían estar modulando la reacción de transferencia de hidruro entre el NADH y la proteína, afectando por tanto a las propiedades de óxido-reducción de AIF. En este trabajo se propone estudiar el papel de los residuos W483, F310, P173 y H454, todos ellos pertenecientes al centro catalítico, así como el efecto producido por los residuos E413, R422 y R430, que participan en la dimerización de AIF. Estos tres últimos residuos fueron sustituidos por alaninas, lo que altera de forma notable la presencia de cargas y puentes estabilizadores de la dimerización. Estudios paralelos realizados por el grupo de investigación han comprobado que dichas mutaciones impiden la dimerización. Por otra parte, y con respecto al centro catalítico, el residuo W483 fue sustituido por una glicina. Se espera que este cambio afecte al entorno del anillo de isoaloxacina, ya que aumenta la polaridad del centro activo e impide la estabilización por el anillo indol del triptófano. También se sustituyó por glicina el residuo F310, lo que aumenta el espacio de unión de la nicotinamida en el centro catalítico. El cambio de P173 por glicina dota de mayor flexibilidad al FAD. Por último, el intercambio de H454 por serina impide que el cambio conformacional de la histidina, mostrado en la figura 9, oriente al NADH para la formación del complejo catalíticamente competente. 2. Objetivos Alejandro Usón 22 resuspendieron en 1 ml de fosfato 50 mM, pH 8. Las células se trataron con un sonicador Up200S (Hielscher), realizando 6 ciclos de 30 segundos con 30 segundos de descanso entre ellos. A continuación se centrifugó a 10000 rpm, 4ºC durante 5 minutos para separar pellet y sobrenadante, resuspendiendo el pellet en 1 ml de fosfato 50 mM, pH 8. Finalmente se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-Page) para ver el contenido en AIF de la fracción soluble y del pellet. Para ello se utilizaron geles de poliacrilamida al 12%, según el método de Laemmli (Laemmli, 1970), en un sistema Mighty Small II (Amersham Biosciences). 3.2.3. Cultivo a media escala Se tomaron colonias conservadas a -80ºC en glicerol al 20% para inocular 500 ml de medio LB con kanamicina (30 mg/l) y riboflavina (8 mg/l), y se incubó en las condiciones óptimas de las pruebas de expresión. Al día siguiente se inocularon 9 litros de medio LB suplementado con kanamicina (30 mg/l) y riboflavina (8 mg/l), y se incubaron en idénticas condiciones hasta alcanzar una D.O. 600nm = 0.8-1, momento en el que se añadió IPTG (1 mM). Tras la inducción, los cultivos se incubaron según su tiempo óptimo. Se recogieron las células y se guardaron a -20ºC hasta ser utilizadas. 3.3. Purificación de hAIF ∆1-102 , de sus mutantes W483G, P173G, F310G, H454S y E413A/R422A/R430A, y hAIF ∆1-54 y hAIF ∆1-340 La purificación de hAIF se realizó mediante cromatografía de afinidad utilizando el gel IMAC Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) activado con níquel. El pellet celular fue resuspendido en tampón Tris/HCl 50 mM, pH 8, 10% glicerol, y las células se lisaron mediante 10 ciclos de sonicación de 30 segundos con 30 segundos de descanso con el sonicador Up200S (Hielscher). Se centrifugó eliminando el pellet y se añadió imidazol al 4% y KCl 0,4M sobre el extracto crudo, que se incubó 1,5 horas a 4ºC en agitación con el gel de afinidad activado. Finalmente se cargó la disolución en la columna y se lavó con 3 volúmenes de fosfato 50 mM, pH 8, 10% glicerol, 40 mM imidazol. La elución de la proteína se realizó mediante un gradiente de imidazol entre 40 mM y 500 mM en fosfato 50 mM, pH 8, 10% glicerol. La razón de pureza (Abs 280 /Abs 450 ) para hAIF ∆1-102 es 12, de forma que los extremos que se alejaban de este valor se recogieron en pools diferentes. Para los mutantes esta razón de pureza variaba un poco, tomándose siempre el pool central como el mejor. La proteína se dializó en fosfato 50 mM, pH 8 y se concentró en centricones (MW 10.000). Se conservó congelada a -80ºC con un 20% de glicerol hasta su utilización. En la purificación de hAIF ∆1-54 sólo se obtuvo la apoproteína, por lo que se realizaron varias pruebas con el fin de reconstituir la proteína. Las condiciones de cultivo iniciales (LB, 37ºC, tiempo de inducción 18 horas) se alteraron con el fin de favorecer la formación del cofactor. De este modo, se llevaron a cabo dos cultivos diferentes: en LB a 37ºC, induciendo durante 10 horas a esta misma temperatura; y en LB a 30ºC, induciendo 18 horas a 16ºC. A partir de estos cultivos se obtuvo nuevamente la proteína sin el cofactor, por lo que se decidió incubar la proteína obtenida en estos cultivos (11.54 nM) con un exceso de FAD (300 nM) en tripa de diálisis, frente a una disolución de fosfato 50 mM, pH 8. La concentración de hAIF ∆1-54 fue determinada por el método de Bradford, usando BSA como estándar. Materiales y métodos 23 Se comprobó la posible incorporación del cofactor a hAIF ∆1-54 en un diodo Hewlett Packard. Tras comprobar que la proteína seguía en forma de apoproteína, se tomaron dos fracciones de la proteína, de las cuales una fue tratada con trombina para eliminar la cola de histidinas. Posteriormente se trataron por separado ambas fracciones con urea 4 M en fosfato 50 mM, pH 8, FAD 300 nM. Estas fracciones se dializaron en fosfato 50 mM, pH 8 con el fin de eliminar la urea y permitir el replegamiento. Por último, se tomaron medidas de dichas fracciones de proteína en un espectrofotómetro Cary 100 Bio UV-Visible. 3.4. Caracterización espectroscópica de hAIF ∆1-102 y mutantes 3.4.1. Espectros UV-visible de hAIF ∆1-102 y mutantes, y determinación de sus coeficientes de extinción Los espectros UV-visible de la enzima nativa hAIF ∆1-102 y de sus mutantes se obtuvieron en fosfato 50 mM, pH 8 en un espectrofotómetro Cary 100 Bio UV-Visible o en un diodo Hewlett Packard. Para determinar los coeficientes de extinción molar de hAIF ∆1-102 y de sus mutantes W483G, P173G, F310G, H454S y E413A/R422A/R430A, se desnaturalizó la proteína en Guanidina/HCl 3 M y se midió la absorbancia del cofactor libre a 450 nm. Por medio de la ley de Beer-Lambert, se determinó la concentración del cofactor libre, utilizando para ello el valor de su coeficiente de extinción ya descrito en cloruro de guanidinio (ε FAD = 11900 M -1 cm -1 ). La concentración hallada para el cofactor coincide con la de AIF, ya que la estequiometría es 1:1. Finalmente se determinó el valor del coeficiente de extinción de cada variante sustituyendo en la ley de Beer-Lambert el valor de absorbancia obtenido para la proteína plegada y la concentración determinada con el cofactor libre. El valor de absorbancia utilizado se corresponde con el obtenido en el máximo de absorbancia de la banda I de cada variante, el cual se sitúa en torno a 450 nm y varía para cada mutante. Los valores determinados para los coeficientes de extinción se utilizan para cuantificar la concentración de proteína de cada variante en los distintos experimentos de este proyecto. 3.4.2. Espectroscopía diferencial Se utilizó para determinar la unión entre la enzima nativa hAIF ∆1-102 y NAD + . Para ello se analizaron las diferencias espectrales motivadas por la formación del complejo hAIF:NAD + . Se utilizó un espectrofotómetro Cary 100 Bio UV-visible de doble haz y cubetas con dos compartimentos. Ambas cubetas contenían inicialmente hAIF (7 µ M) en tampón fosfato 50 mM, pH 8 en uno de los compartimentos, y el mismo tampón libre de proteína en el otro. Tras registrar en esas condiciones la línea base, se realizaron sucesivas adiciones del ligando NAD + (0 - 4.5 mM), añadiendo cada vez el mismo volumen en ambas cubetas; en la de referencia se adicionó sobre la disolución tampón, mientras que en la de muestra se añadió sobre la disolución de proteína. Se tomaron medidas tras cada adición, de forma que los espectros obtenidos correspondieron a la diferencia entre el espectro de absorción de hAIF ∆1-102 unida a NAD + y la suma de los espectros de las dos especies libres. De este modo, sólo se detectaron los cambios de absorbancia debidos a la unión. Alejandro Usón 24 3.5. Caracterización de la actividad óxido-reductasa de hAIF ∆1-102 y de sus mutantes 3.5.1. Caracterización cinética en estado estacionario Se ensayó la capacidad de hAIF ∆1-102 para catalizar la reducción in vitro de tres aceptores artificiales (1,4-benzoquinona, 1,2-naptoquinona y coenzima Q1) y uno natural (coenzima Q10) en presencia de β-NADH. Los ensayos se realizaron con una concentración 75 nM de AIF y 200 µ M de cada quinona. La concentración ensayada de NADH también fue 200 µ M, dado que el uso de concentraciones más elevadas inhibía la reacción, llegando en algunos casos a impedir la detección de la actividad. Al trabajar en condiciones no saturantes sólo pudo determinarse la actividad aparente de la enzima. Las medidas se realizaron en un espectrofotómetro Cary 100 Bio UV-visible. Las reacciones se siguieron a 340 nm, midiendo la variación de absorbancia por unidad de tiempo debida a la oxidación de NADH. Finalmente se utilizó el valor del coeficiente de extinción del NADH ( ε 340 = 6.3 mM -1 cm -1 ) y la variación de absorbancia para determinar la actividad aparente de AIF. Para ello se utilizó la ley de Beer-Lambert modificada del siguiente modo: )()()( )(min )(min aparente Act. 11 1 340 1- MCcmlcmM Abs AIFNADH nm µµε ⋅⋅⋅ ∆ = −− − donde ε es el coeficiente de extinción de NADH a 340 nm, l es la longitud de la cubeta y C AIF es la concentración de AIF en el ensayo. 3.5.2. Caracterización cinética en estado pre-estacionario Las reacciones de cinética rápida entre las distintas variantes de AIF y NADH se siguieron en condiciones anaeróbicas mediante un equipo de mezcla rápida con flujo detenido Applied Photophysics SX17.MV, al que se acopló un detector de diodos que registró los espectros de absorbancia durante el tiempo de medida entre 340 y 1000 nm. Los datos de los espectros fueron recogidos mediante el software X-SCAN (Applied Photophysics). El equipo de mezcla rápida con flujo detenido tiene dos jeringas idénticas en las que se introducen la proteína y el ligando, y cuyos émbolos se acoplan a un pistón movido por aire comprimido. Las salidas de ambas jeringas, tras pasar por una válvula, se juntan y llegan a una cámara de mezcla, que desemboca en una jeringa de parada (Figura 10). El proceso se inicia vaciando la jeringa de parada, seguido de un empuje repentino del pistón de empuje que hace que los émbolos de ambas jeringas avancen a la vez liberando un volumen equivalente al vaciado en la jeringa de parada. El contenido de las jeringas se mezcla en la salida y el producto se detiene en la cámara de medida. Esto permite seguir la evolución espectroscópica de la mezcla a lo largo del tiempo. Materiales y métodos 25 Figura 10. Esquema de aparato de flujo detenido acoplado a un sistema policromático En primer lugar se prepararon todos los reactivos en condiciones anaeróbicas utilizando un tren de anaerobiosis, el cual está conectado a una bomba de vacío y a una de argón. El argón se pasa por un catalizador para evitar trazas de oxígeno. Las muestras se preparan en tonómetros, que son tubos de vidrio con una llave en cada extremo. La superior se adapta al tren de anaerobiosis y la inferior a la entrada del aparato de mezcla rápida. Para conseguir la anaerobiosis, se hacen ciclos sucesivos de argón y vacío que desplazan el oxígeno presente inicialmente en las muestras. Para mantener las condiciones anaeróbicas en el aparato de mezcla rápida se hicieron tres lavados (18 disparos) en ambas jeringas con ditionito sódico, que elimina las trazas de oxígeno presentes en el equipo de mezcla rápida. A continuación se realizaron tres lavados (18 disparos) con tampón fosfato 50 mM, pH 8, también en ambas jeringas. Se cargó la proteína (10 µ M) en una de las jeringas manteniendo tampón en la otra para obtener un espectro propio de la proteína antes de la adición de NADH. Finalmente se realizó la reducción de cada variante de AIF por adición de concentraciones crecientes de NADH en exceso (78 µM – 20 mM). Los espectros obtenidos en la reducción de AIF se analizaron en el programa Pro- Kineticist (Applied Photophysics). Cada espectro se cargó en este programa y se analizó individualmente, ajustándolo al modelo más sencillo que representara un ajuste coherente tanto de la velocidad de reacción como de las especies generadas durante la reacción. Según las variantes de AIF, se hicieron ajustes a modelos cinéticos de una etapa, A>B, o dos etapas, A>B>C, lo que permitió determinar el valor de la constante observada para la cinética de reacción. Representando los valores de esta constante en función de la concentración de NADH, se pudo determinar los valores de las constantes de transferencia de hidruro (k red ) y de disociación (K d ) para la reducción de cada variante de AIF con NADH. Para la determinación de ambas constantes se realizó un ajuste a la siguiente ecuación: SK Sk k d red obs + ⋅ = donde S representa la concentración de NADH utilizada. 4. Resultados Resultados 29 4.1. Expresión y purificación de hAIF ∆1-102 , de sus mutantes W483G, P173G, F310G, H454S y E413A/R422A/R430A, y de hAIF ∆1-54 y hAIF ∆1-340 4.1.1. Expresión y purificación de hAIF ∆1-102 y de sus mutantes W483G, P173G, F310G, H454S y E413A/R422A/R430A Para la expresión de la proteína nativa y de los mutantes caracterizados en este trabajo se partió de colonias previamente transformadas por el grupo de investigación. Estas colonias se cultivaron a gran escala en medio LB a 180 rpm, 37ºC hasta que el cultivo alcanzó una D.O. 600 nm = 0.8-1, momento en el que se indujo la expresión de la proteína de interés con IPTG durante 18 horas. Al finalizar el proceso de cultivo se procedió a la purificación de la proteína por cromatografía de afinidad con colas de histidina. En primer lugar se sometió a las células a sonicación y tras los centrifugados, se produjo la unión de la proteína a la resina de la columna de afinidad, previamente activada con níquel. Una vez se hubo lavado la columna en las condiciones mencionadas en el apartado 3.4, se provocó su elución con un gradiente de imidazol. Para la purificación de la enzima nativa hAIF ∆1- 102 y de sus mutantes se obtuvo un perfil típico de elución, el cual se muestra en la figura 11 para una de sus variantes. El pico correspondiente a AIF se obtiene al tratar la columna con una disolución al 24-29% imidazol. Figura 11. Cromatograma de la purificación de hAIF ∆1-102 E413A / R422A / R430A, similar al de las otras variantes. Los espectros de absorción UV-visible de las fracciones correspondientes al pico de elución mostraron el espectro característico de hAIF. Se determinó la razón de pureza de cada fracción mediante el cociente Abs 280 /Abs 450 . Este cociente demostró que las fracciones centrales eran las que presentaban una mayor pureza, así como una mayor concentración, y por ello se recogieron dichas fracciones por separado. Alejandro Usón 30 4.1.2. Expresión y purificación de hAIF ∆1-54 y hAIF ∆1-340 Tras la transformación de células E. coli BL21 con los plásmidos pET28 α -hAIF ∆1-54 y pET28 α -hAIF ∆1-340 , se realizaron las pruebas de expresión de las variantes hAIF ∆1-54 y hAIF ∆1-340. Éstas se realizaron en medio LB o TB a 180 rpm, 37ºC, dejando pasar 3 ó 18 h en las mismas condiciones tras la inducción con IPTG. También se ensayó la expresión y producción de la proteína en medio LB o TB a 30ºC, dejando pasar 18 h tras la inducción con IPTG y manteniendo el cultivo a 180 rpm, 16ºC. En las figuras 12 y 13 se muestran los resultados de dichos ensayos de expresión. Figura 12. Expresión de hAIF ∆1-54 en diferentes clones de BL21 y a distintas temperaturas. A) Crecimiento en LB a 37ºC, inducción 18h. B) Crecimiento en LB a 37ºC, inducción 3h. C) Crecimiento en TB a 37ºC, inducción 18h. D) Crecimiento en TB a 37ºC, inducción 3h. E) Crecimiento en LB a 30ºC, inducción 18h a 16ºC. F) Crecimiento en TB a 30ºC, inducción 18h a 16ºC. En todas ellas los carriles 1-4 corresponden a la parte soluble de 4 colonias diferentes. El carril 5 es el marcador de peso molecular, que muestra 6 bandas de 97, 66, 45, 30, 20.1 y 14.4 kDa de arriba a abajo. El carril 6 corresponde a hAIF ∆1-102 purificada (1.5 µ M) y los carriles 7-10 corresponden a la parte insoluble de las células, a excepción de la figura E donde los carriles 6 y 9 están invertidos. Resultados 31 Figura 13. Expresión de hAIF ∆1-340 en diferentes clones de BL21 y a distintas temperaturas. A) Crecimiento en LB a 37ºC, inducción 18h. B) Crecimiento en LB a 37ºC, inducción 3h. C) Crecimiento en TB a 37ºC, inducción 18h. D) Crecimiento en TB a 37ºC, inducción 3h. E) Crecimiento en LB a 30ºC, inducción 18h a 16ºC. F) Crecimiento en TB a 30ºC, inducción 18h a 16ºC. En todas ellas, los carriles impares corresponden a la parte soluble de 4 colonias diferentes, mientras que los pares corresponden a la parte insoluble. El carril 5 es el marcador de peso molecular, que muestra 6 bandas de 97, 66, 45, 30, 20.1 y 14.4 kDa de arriba a abajo. El carril 6 corresponde a hAIF ∆1-102 purificada (1.5 µ M). La banda de proteína correspondiente a hAIF ∆1-54 se sitúa a una altura similar a la banda correspondiente a hAIF ∆1-102 purificada (figura 12). En este caso, los geles no muestran diferencias entre los cultivos realizados en medio LB o TB, siendo su expresión similar a la obtenida para hAIF ∆1-102 (Villanueva, 2010). Además, la reducción del tiempo de inducción supone un descenso en la producción de proteína, por lo que se tomaron como condiciones óptimas el cultivo en LB a 37ºC con un tiempo de inducción de 18 horas. Por otra parte, las pruebas de expresión de hAIF ∆1-340 desvelan una mayor producción de proteína en el medio de cultivo TB frente a LB. En este caso la banda de proteína se encuentra a la altura de la tercera banda del marcador molecular, con un peso aproximado de 30 kDa, y dicha banda muestra una mayor intensidad cuando las células transformadas se cultivaron en TB a 37ºC, con un tiempo de inducción de 18 horas. Sin embargo, la producción de proteína con un tiempo de inducción de 3 horas muestra una producción similar con una menor presencia de proteína en cuerpos de Alejandro Usón 38 Estas reducciones se llevaron a cabo utilizando distintas concentraciones de NADH (rango 78 µ M - 20 mM), lo que permitió determinar la constante observada para dicho proceso de reducción. Al representar los valores de la velocidad de reducción de la flavina (k obs ) en función de la concentración de sustrato (Figura 19), se observó una dependencia hiperbólica. El ajuste de dicha dependencia permitió calcular la constante de transferencia de hidruro y la de disociación, las cuales se muestran en la Tabla 3. Figura 19. Representación de la dependencia de la k obs respecto a la concentración de NADH en la reducción de los distintos mutantes de hAIF ∆1-102. Tabla 3. Constantes cinéticas para la reacción en estado pre-estacionario de hAIF ∆1-102 y NADH k HT (s -1 ) K d (µ µµ µM) k HT / K d CTC (750 nm) hAIF ∆1-102 (WT) * 1.00 ± 0.10 1213 ± 302 9.76 ·10 -4 2.27 ·10 -2 ± 1.03 ·10 -3 F310G 17.35 ± 0.68 5585 ± 499 3.11 ·10 -3 1.70 ·10 -2 ± 3.60 ·10 -4 H454S 3.73 ± 0.15 2743 ± 295 1.36 ·10 -3 No presenta P173G 4.90 ± 0.28 12060 ± 1289 4.06 ·10 -4 1.89 ·10 -2 ± 3.24 ·10 -4 E413A/R422A/R430A 0.39 ± 0.01 2314 ± 157 1.69 ·10 -4 2.06 ·10 -2 ± 1.42 ·10 -3 * Las cinéticas de todos los mutantes se realizaron a 24ºC en tampón fosfato 50 mM, pH 8. Los valores de los CTC representan la diferencia de amplitud a 750 nm entre el valor final, correspondiente a la proteína totalmente reducida, y el valor inicial, correspondiente a la proteína oxidada. Datos extraídos de Ferreira et al., 2012. Las constantes cinéticas obtenidas para los mutantes presentan grandes diferencias con respecto a las descritas para la enzima nativa hAIF ∆1-102 con anterioridad (Ferreira et al., 2012). Casi todos los mutantes estudiados presentan una velocidad de transferencia de hidruro mayor que la que se determinó para la forma nativa, siendo especialmente notable en el caso del mutante F310G al ser aproximadamente quince veces mayor. A diferencia del resto de mutantes caracterizados, la velocidad de transferencia de E413A/R422A/R430A fue tres veces menor que la obtenida para la proteína nativa. Además, todos los mutantes caracterizados en este proyecto presentan una constante de disociación mayor que la de la nativa, siendo este valor incluso aproximadamente diez veces superior en el caso del mutante P173G. Resultados 39 Por otra parte, la eficiencia catalítica, calculada como el cociente entre la constante de transferencia de hidruro y la de disociación, mostró valores dispares para los mutantes con respecto a la forma nativa hAIF ∆1-102 . P173G y E413A/R422A/R430A presentaron una eficiencia catalítica dos y cinco veces menor respectivamente, mientras que la eficiencia catalítica de H454S y F310G fue un cuarenta por ciento y tres veces superior respectivamente. 5. Discusión Discusión 43 AIF es una proteína conocida principalmente por su función apoptótica, la cual ha sido investigada profundamente. Sin embargo, en los últimos tiempos se ha puesto de manifiesto que esta proteína puede presentar también función óxido-reductasa a través de su cofactor FAD. Además, ambas funciones podrían estar relacionadas, por lo que es de vital importancia profundizar en el conocimiento sobre esta posible función. En este proyecto se busca comprender en mayor medida el mecanismo de acción de la actividad óxido-reductasa de hAIF. El estudio de la capacidad de hAIF ∆1-102 , una vez reducida por NADH, de reducir distintos sustratos de tipo quinona, mostró una actividad extremadamente baja con todos ellos. Esto sugiere que la reducción de quinonas no es relevante in vivo, especialmente al comparar estos resultados con los obtenidos en trabajos previos con otros aceptores de electrones como el DCPIP y el ferricianuro (Villanueva, 2010). Además, se observa que hAIF ∆1-102 muestra menor actividad con el coenzima Q1 y el coenzima Q10 que con 1,4-benzoquinona y 1,2-naptoquinona, las cuales no tienen relevancia fisiológica. Estos resultados sugieren que AIF no actúa como donador de electrones con sustratos de tipo quinona presentes en las mitocondrias o en la cadena de transporte de electrones. El estudio de la afinidad de hAIF ∆1-102 oxidada por NAD + no ha permitido obtener ningún resultado en el rango de concentraciones ensayados, por lo que la afinidad de la proteína oxidada por este compuesto es inexistente o al menos requiere un exceso de NAD + mayor la utilizado (1000x) para que se produzca dicha unión. Este resultado contrasta con el obtenido en estudios previos (Churbanova et al., 2008) para la forma reducida de hAIF ∆1-102 y NAD + , por lo que la unión entre la proteína y el coenzima se dirige por el estado de óxido-reducción de ambas especies. Por otra parte, se ha demostrado que hAIF ∆1-102 es capaz de reducirse por completo en concentraciones equimolares de NADH. Esta reducción se produce con la formación de complejos de transferencia de carga similares a los que ya se habían descrito para hAIF ∆1-102 tratada con exceso de NADH (Ferreira et al., 2011), lo que demuestra la independencia en la formación de estos complejos con respecto a la concentración de coenzima utilizada. Se piensa que estos complejos de transferencia de carga podrían preservar el estado reducido de AIF a la espera de su aceptor fisiológico. Se ha estudiado el papel de los residuos W483, F310, P173 y H454, pertenecientes al centro activo, y E413, R422A y R430, vinculados a la dimerización. La obtención de espectros UV-visible similares a los de la proteína nativa hAIF ∆1-102 para los mutantes de estos residuos no nos indica que estas mutaciones hayan producido cambios significativos en el entorno de la flavina, a excepción de la modificación del residuo P173, cuyos máximos están claramente desplazados. Los datos de mayor relevancia se obtienen en el análisis del mecanismo de transferencia de hidruro de NADH a hAIF ∆1-102 por medio de cinéticas en estado pre-estacionario. Tras la reducción con NADH, los mutantes estudiados se reoxidaban con el oxígeno presente en el aire, mientras que la forma nativa no reacciona preferentemente con él (Ferreira et al., 2011). Esta gran diferencia demuestra que las mutaciones realizadas afectan considerablemente al centro catalítico de hAIF. Se piensa que la interacción estérica entre el NAD + y el cofactor FAD permite la estabilización del complejo AIF red - NAD + , y que dicha estabilización ralentiza el intercambio de NAD + por NADH durante la reducción de la proteína por el coenzima. Además, cabe destacar que también se Alejandro Usón 44 observan diferencias notables, de varios órdenes de magnitud, entre las constantes de transferencia de hidruro y de disociación obtenidas para la proteína nativa y los mutantes estudiados. El residuo P173, que fue sustituido por glicina, mostró una constante de reducción 4 veces mayor que la forma nativa, lo que implica una mayor velocidad de transferencia de hidruro. Además, el valor de K d hallado para este mutante es el que presenta mayor diferencia con el de la forma nativa, al ser aproximadamente 10 veces superior al de ésta. Estos valores obtenidos para k HT y K d implican una eficiencia catalítica dos veces menor para este mutante con respecto a la proteína nativa. Por último, este mutante presenta una estabilidad ligeramente menor del complejo de transferencia de carga con respecto a la forma nativa. Todos estos resultados se explican por la sustitución de una prolina, que es un aminoácido cíclico, por una glicina, que presenta menor rigidez y además un tamaño claramente inferior, lo que seguramente implica una mayor presencia de moléculas de solvente en torno al cofactor. Esta sustitución posiblemente disminuye la interacción estérica entre la prolina y el FAD, otorgándole a éste una mayor libertad de movimiento. Esta mayor libertad de movimiento podría justificar que la unión del coenzima para este mutante sea más débil que para la enzima nativa hAIF ∆1-102 , y una menor estabilidad de los complejos de transferencia de carga. El residuo H454, modificado a serina, muestra también diferencias notables en sus valores de K d y k HT con respecto a la proteína nativa, al ser estos 2 y 3 veces mayor, respectivamente. La eficiencia catalítica para esta variante supera en un 40% a la de la proteína nativa. Anteriormente se había mostrado en mAIF la importancia de este residuo en las propiedades redox de la proteína, ya que se produce la formación de un puente de hidrógeno entre la histidina y el NAD + tras la reducción de la proteína con NADH (Sevrioukova, 2009). El intercambio de una serina por una histidina en esta posición seguramente impide la formación de dicho puente de hidrógeno, lo que proporcionaría una mayor flexibilidad al cofactor. Esto es coherente con el aumento del valor de K d . Sin embargo, lo más llamativo de esta variante es la supresión de la formación del complejo de transferencia de carga, lo que da idea de la importancia de este residuo en la unión de NAD + a la proteína. Esto podría justificar por qué el valor de k HT para este mutante es menor con respecto a otros mutantes, como P173G o F310G, ya que la mutación de este residuo reduce drásticamente la estabilidad del complejo de transferencia de carga, por lo que también podría limitar la unión inicial de NADH. Por otra parte, el residuo F310, sustituido también por glicina en este trabajo, es de vital importancia en el mecanismo de reducción por NADH, ya que su sustitución provoca los mayores cambios detectados en la constante de transferencia de hidruro. Además, el valor de la constante de disociación también se altera notablemente, así como la estabilidad del complejo de transferencia de carga AIF red -NAD + , cuya presencia disminuye nuevamente con respecto a la forma nativa. Pese a que la sustitución de fenilalanina por glicina no altera la carga del residuo, sí afecta drásticamente al tamaño del residuo, por lo que esta mutación implica la desaparición del efecto estabilizador anteriormente descrito (Sevrioukova, 2009). Además, estos resultados sugieren una implicación importante de este residuo no sólo en la estabilización sino también en alguna de las etapas del proceso de transferencia de hidruro. Por último, la triple sustitución de los residuos E413, R422 y R430 por alaninas también afecta sorprendentemente al mecanismo de transferencia de hidruro, pese a que estos Discusión 45 residuos están implicados en el mecanismo de dimerización y no forman parte del centro activo de la proteína. El cambio observado en la constante de transferencia de hidruro difiere del observado para el resto de mutantes, ya que en este caso dicha constante muestra un valor tres veces menor como consecuencia de las mutaciones realizadas. Sin embargo, la afinidad de este mutante por el coenzima disminuye también en este caso, siendo dos veces menor que la de la enzima nativa hAIF ∆1-102 . Así, la eficiencia catalítica para esta variante es cinco veces menor que la de la proteína nativa. Estos datos sugieren que la alteración en la dimerización de hAIF podría afectar también a su actividad óxido-reductasa. En definitiva, todos los residuos estudiados pertenecientes al centro activo de la proteína son esenciales para el funcionamiento de la actividad óxido-reductasa, ya que todas las alteraciones producidas sobre dichos residuos afectan notablemente al proceso de transferencia de hidruro, condicionando la unión entre la proteína y el coenzima. Estas mutaciones también afectan a la estabilidad de las especies intermedias formadas en dicho proceso de transferencia. Así, los cambios producidos en las interacciones entre estos residuos y el FAD durante el proceso de reducción de la proteína regulan la función óxido-reductasa de AIF. Sin embargo, se requieren nuevos estudios para llegar a entender por completo el mecanismo de transferencia de hidruro. En futuros estudios también se estudiará el papel de estos residuos en la actividad apoptótica de hAIF, con el fin de determinar si ambas funciones están relacionadas. Así mismo, también se intentará profundizar en el conocimiento del mecanismo de dimerización y las consecuencias de éste sobre las funciones apoptótica y óxido-reductasa. 6. Conclusiones Alejandro Usón 54 Lipton, S.A., et al., Dueling activities of AIF in cell death versus survival: DNA binding and redox activity. Cell, 2002. 111 (2): 147-150. 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