Repositorio Institucional de Documentos

U NIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Trabajo Fin de Máster curso 2011 Estudio de las proteínas presentes en la membrana glóbulo graso de la leche de vaca y oveja Máster en Iniciación a la Investigación en Ciencia y Tecnología de los NIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Trabajo Fin de Máster curso 2011 -2012 Estudio de las proteínas presentes en la membrana glóbulo graso de la leche de vaca y oveja Máster en Iniciación a la Investigación en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Tutoras: Mª Dolores PÉREZ Mª Lourdes SANCHEZ PANIAGUA Daniel Ripollés López Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Estudio de las proteínas presentes en la membrana del glóbulo graso de la leche de vaca y oveja Máster en Iniciación a la Investigación en Ciencia y Tecnología de los Mª Dolores PÉREZ CABREJAS Lourdes SANCHEZ PANIAGUA Daniel Ripollés López INDICE DE CONTENIDOS 1. RESUMEN ............................................................................. 1 2. INTRODUCCIÓN .................................................................... 2 2.1. Leche 2 2.1.1. Definición y composición ..................................................................... 2 2.1.2. Biosíntesis de la leche .......................................................................... 3 2.2. Fracción grasa de la leche 4 2.2.1. Membrana del glóbulo graso (MFGM) ................................................ 5 2.2.1.1. Estructura .................................................................................. 5 2.2.1.2. Proteínas .................................................................................... 5 2.2.1.3. Lípidos ........................................................................................ 8 2.3. Aislamiento de la membrana del glóbulo graso 9 2.4. Efectos beneficiosos de los componentes de la MFGM sobre la salud 11 2.4.1. Fracción lipídica de la MFGM ............................................................ 11 2.4.1.1. Actividad antibacteriana.......................................................... 11 2.4.1.2. Actividad anticolesterolémica ................................................. 12 2.4.1.3. Otros efectos a nivel intestinal ................................................ 12 2.4.2. Fracción proteica de la MFGM .......................................................... 13 2.4.2.1. Actividad antitumoral .............................................................. 13 2.4.2.2. Actividad anti-adhesión de agentes patógenos ...................... 13 2.4.2.3. Actividad antibacteriana.......................................................... 14 2.4.2.4. Otras actividades ..................................................................... 14 2.5. Propiedades tecnológicas de la MFGM 15 2.5.1. Capacidad emulsificante .................................................................... 15 2.5.2. Formación de liposomas a partir de MFGM ...................................... 15 3. OBJETIVOS ......................................................................... 17 4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................... 18 4.1. Materiales 18 4.2. Métodos 19 4.2.1. Preparación del buttermilk y el butterserum de vaca y oveja ........ 19 4.2.1.1. Desnatado de la leche y lavado de la grasa ............................. 19 4.2.1.2. Obtención del buttermilk y el butterserum ............................. 19 4.2.1.3. Centrifugación del buttermilk y el butterserum ...................... 19 4.2.2. Preparación de los buttermilk comerciales ....................................... 20 4.2.2.1. Incubación con quimosina ....................................................... 20 4.2.2.2. Incubación con citrato sódico .................................................. 20 4.2.3. Aislamiento de la butirofilina ............................................................ 21 4.2.3.1. Desnatado de la leche y lavado de la grasa ............................. 21 4.2.3.2. Aislamiento de la MFGM ......................................................... 21 4.2.3.3. Cromatografía de afinidad con Concanavalina- A - Sepharose 4B .......................................................................................................... 22 4.2.4. Aislamiento de la parte extracelular de la mucina-1 ......................... 22 4.2.4.1. Desnatado de la leche y lavado de la grasa ............................. 22 4.2.4.2. Aislamiento de la MFGM ......................................................... 23 4.2.4.3. Liberación de la parte extracelular de la MUC-1 mediante tripsinización ......................................................................................... 23 4.2.4.4. Cromatografía en DEAE-Sephadex A-50 .................................. 23 4.2.5. Electroforesis con SDS ....................................................................... 24 4.2.6. Métodos de tinción de las electroforesis .......................................... 25 4.2.6.1. Tinción con Azul de Coomassie ............................................... 25 4.2.6.2. Tinción específica para glicoproteínas (Glycoprotein Staining Kit) ......................................................................................................... 25 4.2.6.3. Tinción con plata de forma manual ......................................... 26 4.2.6.4. Tinción con plata en el Phast-System ...................................... 26 4.2.7. Secuenciación de bandas obtenidas en las electroforesis ................ 27 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................. 28 5.1. Caracterización electroforética del buttermilk y el butterserum de vaca y oveja 28 5.2. Caracterización electroforética de diferentes buttermilk comerciales clarificados con quimosina con y sin cloruro cálcico 31 5.2.1. Incubación con quimosina ................................................................. 31 5.2.2. Incubación con citrato de sodio ........................................................ 32 5.3. Aislamiento de la butirofilina 34 5.3.1. 1er Aislamiento .................................................................................. 34 5.3.2. 2º Aislamiento ................................................................................... 36 5.4. Aislamiento de la parte extracelular de la mucina-1 37 6. CONCLUSIONES .................................................................. 40 7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................... 41 INDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura de la membrana del glóbulo graso .................................................. 8 Figura 2. Procedimiento para el aislamiento de la membrana del glóbulo graso ......... 11 Figura 3. Fundamento de la cromatografía de DEAE-Sephadex. ................................... 24 Figura 4. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de las fracciones de buttermilk y butterserum de vaca.. .................................................................................................. 28 Figura 5. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de las fracciones de buttermilk y butterserum de vaca y oveja... .................................................................................... 29 Figura 6. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de fracciones de buttermilk y butterserum de vaca y de oveja. .................................................................................... 30 Figura 7. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS del α-serum powder tratado con quimosina y cloruro cálcico.. .................................................................................... 32 Figura 8. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de los diferentes sobrenadantes obtenidos de los buttermilk comerciales clarificados. ........................... 32 Figura 9. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS del Westland powder tratado con citratro sódico y sometido a microfiltración.. .......................................................... 33 Figura 10. Perfil de la cromatografía del 1 er aislamiento, realizada en Concanavalina-A- Sepharose 4B de la fracción enriquecida en proteínas de la MFGM de leche de vaca. ................................................................................................................................ 34 Figura 11. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de las fracciones de la cromatografía del 1 er aislamiento realizada en Concanavalina-A-Sepharose 4B. ......... 35 Figura 12. Perfil de la cromatografía del 2º aislamiento realizada en Concanavalina-A- Sepharose 4B de la fracción enriquecida en proteínas de la MFGM de leche de vaca. . 36 Figura 13. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, de las fracciones de las cromatografías del 2º y 1 er aislamiento en Concanavalina-A-Sepharose 4B ................. 37 Figura 14. Perfil de la cromatografía en DEAE-Sephadex de la fracción enriquecida en la parte extracelular de la mucina-1 obtenida tras la tripsinización de la fracción enriquecida en proteínas de la MFGM de leche de oveja. ............................................. 38 Figura 15. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de las diferentes etapas seguidas para el aislamiento de la parte extracelular de la mucina-1. ......................... 39 INDICE DE TABLAS Tabla 1. Composición media de la leche de vaca y oveja (Park et al., 2007) ................... 3 Tabla 2. Composición lipídica media de la leche (Varnam y Sutherland, 1995) .............. 4 Tabla 3. Proteínas de la membrana del glóbulo graso con sus respectivos pesos moleculares (Singh, 2006) ................................................................................................ 6 Tabla 4. Composición lípidica de la MFGM. Las diferentes clases de fosfolípidos aparecen en relación al total de fosfolípidos (Singh, 2006) ............................................. 9 Tabla 5. Composición de los diferentes buttermilk comerciales utilizados (Westland Milk Products. Hokitika, Nueza Zelanda) ........................................................................ 31 1. Resumen - 1 - 1. RESUMEN Las proteínas de la membrana del glóbulo graso representan del 25 al 70% del total de sus componentes. Se han descrito alrededor de 40 proteínas diferentes con pesos moleculares de entre 15 y 240 KDa, las cuales ejercen importantes funciones biológicas. La localización de estas proteínas en la membrana del glóbulo graso es diferente, pueden ser integrales, periféricas o bien establecer una interacción débil con la membrana, lo que condiciona la forma de obtenerlas. En general se trata de proteínas difíciles de aislar por su alto grado de hidrofobicidad y su baja concentración. En este trabajo se ha realizado una caracterización electroforética de las proteínas presentes en el suero de mantequilla (buttermilk) y en el suero obtenido de la fusión de la mantequilla (butterserum) de leche de vaca y oveja, así como en los buttermilk comerciales. Para ello las electroforesis realizadas con SDS se tiñeron con tres técnicas: Azul de Coomassie, nitrato de plata y un reactivo específico para glicoproteínas. Además, se llevaron a cabo los procedimientos descritos por otros autores para el aislamiento de la butirofilina y de la parte extracelular de la mucina-1. En el caso de la butirofilina, tras la obtención de una fracción rica en membranas del glóbulo graso se sometió a una cromatografía de afinidad con Concanavalina-A, en la que nuestra proteína de interés quedó retenida, para ser recuperada posteriormente en una elución con α-metil-manósido. Para el aislamiento de la parte extracelular de la mucina-1, se obtuvo una fracción enriquecida en membranas del glóbulo graso que se incubó con tripsina para liberar dicha parte externa a la membrana de 32 KDa. Finalmente se sometió a una cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sephadex en la que el fragmento quedó retenido y se eluyó con un gradiente de cloruro sódico. El presente trabajo fin de máster se engloba dentro de un proyecto cuyo objetivo es caracterizar las proteínas de la membrana del glóbulo graso con actividad defensiva, procedentes tanto de leche de vaca y oveja como de productos comerciales de mazada, y estudiar el efecto de los tratamientos tecnológicos sobre su integridad y actividad para su utilización en alimentos funcionales. 2. Introducción - 2 - 2. INTRODUCCIÓN En las últimas décadas se ha generado un gran interés por estudiar con mayor profundidad los componentes bioactivos de la leche, por una parte con el objetivo de relacionar dichos componentes con el desarrollo de los tejidos y el establecimiento de las funciones fisiológicas del recién nacido, y por otra, con el fin de poder utilizar eventualmente dichos componentes como ingredientes de alimentos que posean no sólo un valor nutritivo, sino también un valor funcional. En occidente, la leche se ha consolidado como un alimento cotidiano, incluso después de la infancia. Esto es debido al hecho de que la leche es un producto apetecible, que se digiere bien, barato y fácil de obtener. Debido también a la aplicación de las tecnologías térmicas de conservación de alimentos a la leche, desde hace unas décadas, podemos decir que se trata de un producto seguro y estable. Desde un punto de vista nutricional se podría considerar un alimento completo ya que contiene los tres macronutrientes básicos (proteínas, lípidos y carbohidratos) en una relación óptima y una gran cantidad de micronutrientes. Además la leche no es sólo un alimento, es también un vehículo que utilizan las madres para proporcionar al recién nacido las inmunoglobulinas y otras proteínas defensivas que necesitan para su completa protección (Riccio, 2004). 2.1. Leche 2.1.1. Definición y composición El CAE (Código Alimentario Español) define la leche como el “producto íntegro, no alterado ni adulterado, y sin calostros, obtenido del ordeño higiénico, regular, completo e ininterrumpido de las hembras domésticas sanas y bien alimentadas” (Decreto 2484/1967, del 21 de septiembre, por el que se aprueba el texto del código alimentario español). La leche es un fluido complejo cuya composición y propiedades físicas varían de una especie a otra en función de las necesidades de las crías. El constituyente mayoritario de la leche es el agua y contiene, según las especies, cantidades variables de lípidos, proteínas y carbohidratos que se sintetizan en la glándula mamaria. También se encuentran en la leche pequeñas cantidades de minerales, vitaminas y otros 2. Introducción - 3 - componentes lipo e hidrosolubles que proceden directamente del plasma sanguíneo, proteínas sanguíneas e intermediarios de la síntesis mamaria (Varnam y Sutherland, 1995). En la Tabla 1 se muestra la composición de la leche de vaca y oveja, que son las especies con las que se ha llevado a cabo este trabajo. Tabla 1. Composición media de la leche de vaca y oveja (Park et al., 2007) 2.1.2. Biosíntesis de la leche La leche es el producto de la glándula mamaria. Se sintetiza en el tejido secretor y se recoge en una serie de canales, que van siendo de mayor tamaño conforme la leche avanza hacia el pezón. El alvéolo es la unidad funcional de producción (en la glándula mamaria hay millones de ellos), tiene forma esférica con un lumen central de almacenamiento rodeado por una monocapa de células epiteliales secretoras. Los capilares sanguíneos y las células mioepiteliales rodean el alvéolo y la leche secretada se encuentra en la cavidad interna. Las células secretoras están orientadas de forma que el extremo apical, que tiene una membrana sencilla, está situado adyacente al lumen, mientras que el extremo basal está separado por la membrana basal de la sangre y la linfa. Los metabolitos entran a la célula por el extremo basal y son utilizados en la producción de leche por el retículo endoplásmico. El aparato de Golgi se transforma en las vesículas que transportan los componentes de la fase acuosa de la leche hasta la membrana plasmática apical. Las vesículas de Golgi, se unen con la membrana plasmática apical, fundiéndose hasta formar parte de la membrana y verter la fase acuosa en el lumen (Varnam y Sutherland, 1995). 2. Introducción - 10 - burbujas de aire y se aproximan entre sí, llegando a romper la estructura del glóbulo, formándose pequeños grumos de grasa y saliendo parte de la grasa líquida del glóbulo al exterior (Walstra et al., 2001). Finalmente, se produce una inversión de fases y se libera una fase acuosa denominada suero de mantequilla, mazada o en inglés buttermilk, que contiene fragmentos de la membrana del glóbulo, proteínas, lactosa y minerales (Vanderghem et al., 2010). Este proceso es similar al que se utiliza en la elaboración de la mantequilla. La composición del buttermilk es similar a la de la leche desnatada, aunque la concentración de lípidos polares sobre extracto seco es cuatro, cinco y diez veces más alta que en la leche desnatada, la leche entera y la nata respectivamente. La mayoría de los lípidos polares de la leche están presentes en la MFGM, que representa menos del 5% del total de sólidos del buttermilk. En cuanto a las proteínas, diversos estudios han confirmado que aproximadamente el 19% de las proteínas de la MFGM se encuentran en el suero de mantequilla (Vanderghem et al., 2010). En algunos métodos de obtención de la MFGM, con el objetivo de recuperar una mayor cantidad, se combina el buttermilk con el butterserum, que es el producto resultante de la fusión de la mantequilla a 40°C durante 5 minutos, y la posterior eliminación del aceite de mantequilla o butteroil por centrifugación. Finalmente, en este método, la MFGM es obtenida por ultracentrifugación, microfiltración, por precipitación a bajo pH o mediante la adición de sulfato de amonio. El concentrado proteico obtenido se puede someter a un lavado con solventes orgánicos (mezcla de cloroformo: metanol) con el objetivo de eliminar los lípidos presentes (Dewettinck et al., 2008). 2. Introducción - 11 - Figura 2. Procedimiento para el aislamiento de la membrana del glóbulo graso y las proteínas de ésta (El-Loly, 2011) 2.4. Efectos beneficiosos de los componentes de la MFGM sobre la salud 2.4.1. Fracción lipídica de la MFGM 2.4.1.1. Actividad antibacteriana Se ha indicado que los esfingolípidos de la MFGM podrían tener una actividad protectora frente a virus, bacterias y sus toxinas. Todos estos agentes patógenos interaccionan con glicoesfingolípidos de las células intestinales para su entrada en 2. Introducción - 12 - ellas. La competición con los esfingolípidos de la dieta permitiría inhibir la adhesión de los patógenos al intestino, previniendo la infección (Vesper et al., 1999). En diversos estudios se ha confirmado que cuando a los niños de corta edad se les suplementa la dieta con gangliósidos, se observa un mayor número de bifidobacterias y un menor número de Escherichia coli en sus heces, respecto a los microorganismos que se encuentran en el correspondiente grupo control. En otros estudios, se ha observado que la lisoesfingomielina posee una alta capacidad bactericida frente a Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes y Clostridium perfringens (Possemiers et al., 2005). 2.4.1.2. Actividad anticolesterolémica Los esfingolípidos participan también en la absorción intestinal del colesterol. Se ha demostrado que la esfingomielina reduce la absorción intestinal del colesterol y de la grasa en ratas de una manera dosis-dependiente. Esta inhibición ha sido explicada por el efecto que tienen los ácidos grasos saturados de la esfingomielina sobre la lipolisis luminal, la solubilización micelar y el transporte de micelas lipídicas hacia los enterocitos (Spitsberg, 2005). Así, los esfingolípidos de la dieta tienen un gran potencial para contribuir en el tratamiento de diversas enfermedades como la dislipidemia, algunas enfermedades cardiovasculares y la resistencia a la insulina. 2.4.1.3. Otros efectos a nivel intestinal En condiciones normales, las células intestinales se someten a una rápida renovación excepto en los procesos de cáncer, en los cuáles el crecimiento normal se detiene y la apoptosis se retrasa. Hay estudios realizados en animales de experimentación, que indican que la esfingomielina podría tener un efecto en el cáncer de colon, en el que sus metabolitos, la ceramida y la esfingosina, podrían detener el crecimiento de las células tumorales e inducir la apoptosis (Merrill et al., 2001). Otros estudios indican que la esfingomielinasa, que cataliza la conversión de esfingomielina a ceramida, podría tener efectos antiproliferativos en las células cancerígenas del colon (Duan et al., 2003). Cabe señalar que no se ha realizado ningún ensayo con humanos ni ningún 2. Introducción - 13 - estudio epidemiológico para evaluar la influencia de los esfingolípidos en el cáncer de colon, pero se ha demostrado que tanto la esfingosina como la ceramida inducen apoptosis en la línea celular humana HT29, un adenocarcinoma de colón (Dewettinck et al., 2008). La fosfatidilcolina presente en la MFGM es una fuente de colina, la cuál es un nutriente esencial para los humanos que promueve la síntesis y transmisión de los neurotransmisores, protege a la mucosa gastrointestinal frente a diversas toxinas y reduce el riesgo de aparición de enterocolitis necrotizante en neonatos prematuros hospitalizados (Dewettinck et al., 2008). Además este fosfolípido parece también contribuir a la recuperación del hígado del daño producido por ciertos agentes químicos e infecciones víricas (Kidd, 2002). 2.4.2. Fracción proteica de la MFGM 2.4.2.1. Actividad antitumoral Se ha demostrado que una de las proteínas aisladas de la MFGM, la proteína fijadora de ácidos grasos (FABP) inhibe la proliferación de varias líneas celulares de cáncer de mama (Spitsberg y Gorewit, 2002). Estos mismos autores demostraron en otra de sus investigaciones la presencia de una proteína producida por el gen BRCA 1, asociado al cáncer de mama, en la MFGM bovina y humana. Esta proteína es onco-supresora, y participa en los procesos de reparación del DNA (Spitsberg y Gorewit, 1998). En la MFGM hay también presente un inhibidor de la β-glucuronidasa que podría prevenir el cáncer de colon. Esta enzima está presente en muchas bacterias, liberando agentes tóxicos que podrían ser cancerígenos y podrían estimular la aparición de cáncer de colon (Dewettinck et al., 2008). 2.4.2.2. Actividad anti-adhesión de agentes patógenos Algunas enfermedades gástricas, como la gastritis tipo B, las úlceras pépticas y diversos cánceres se pueden atribuir a la colonización de la mucosa gástrica por Helicobacter pylori, microorganismo que puede causar hemoaglutinación in vitro (Dewettinck et al., 2008). Se ha observado que la MFGM inhibe la hemoaglutinación producida por 2. Introducción - 14 - Helicobacter pylori y que la misma fracción de MFGM exenta de lípidos tiene un efecto inhibitorio mayor (Wang et al., 2001). La proteína MUC-1 puede también desarrollar un papel como inmunoprotectora, debido a su capacidad para unirse a algunos microorganismos patógenos, como Escherichia coli, e inhibir su acción en el tracto intestinal (Dewettinck et al., 2008). 2.4.2.3. Actividad antibacteriana Una de las enzimas de la MFGM, la xantín-oxidasa, se expresa en diferentes células del revestimiento intestinal y su función antimicrobiana se relaciona con su capacidad para producir en el intestino, especies reactivas del hidrógeno (radical superóxido, peróxido de hidrógeno, etc). También puede catalizar la reducción del nitrito inorgánico a óxido nítrico y en presencia de oxígeno a peroxinitrito, ambos compuestos con propiedades bactericidas (Dewettinck et al., 2008). Las bacterias patógenas interaccionan, en condiciones normales, con el epitelio intestinal del tracto digestivo. A veces la MFGM puede evitar esta interacción, ya que algunas bacterias pueden unirse a ella mediante receptores similares a los de la pared intestinal, de modo que podrían quedar sometidas a la acción de la xantín-oxidasa. Esta enzima inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Salmonella Enteritidis (Martin et al., 2004). 2.4.2.4. Otras actividades La esclerosis múltiple es una enfermedad neurodegenerativa crónica que afecta al sistema nervioso central, en la cual hay una desmielinización, una pérdida de oligodendrocitos y una degeneración axonal. La butirofilina, una de las principales proteínas de la MFGM guarda una cierta similitud con una glicoproteína denominada MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein) que se encuentra en la vaina de mielina que recubre a los oligodendrocitos y que actúa como un auto-antígeno en la esclerosis múltiple. Debido al gran parecido de la MOG con la butirofilina podría existir una reacción cruzada entre ellas. Por lo tanto, se ha propuesto que el consumo de productos lácteos enriquecidos con MFGM, podría 2. Introducción - 15 - ayudar a modular la aparición de esta enfermedad, aunque este tema es muy controvertido y está aún por aclarar (Dewettinck et al., 2008). 2.5. Propiedades tecnológicas de la MFGM 2.5.1. Capacidad emulsificante Debido a su naturaleza anfipática y a su función de estabilizar los glóbulos de grasa en la leche, los fragmentos de la MFGM se pueden considerar unos emulsificantes muy eficientes (Corredig y Dalgleish, 1997). Sin embargo, el método de separación, el tipo de materia prima y el pre-tratamiento de la nata y del buttermilk pueden afectar a la composición de los fragmentos de MFGM aislados, y por lo tanto, a sus propiedades emulsificantes (Singh, 2006). La adición de 80 mg de MFGM/g grasa láctea, permite reconstituir los glóbulos de grasa de forma que tengan una estabilidad parecida a la que tenían en la leche original (Kanno et al., 1991). Corredig y Dalgleish (1997) comprobaron que los fragmentos de MFGM aislados de leche cruda son mejores emulsificantes para soluciones de aceite de soja en agua, que los obtenidos a partir de buttermilk industriales. Esto podría ser debido a la desnaturalización de las proteínas de la membrana, así como a su asociación con la βlactoglobulina durante los tratamientos térmicos o de batido que se aplican en la obtención del buttermilk (Morin et al., 2007). No se sabe con exactitud si son las proteínas o los fosfolípidos los componentes responsables de esta capacidad emulsificante que tiene la membrana del glóbulo graso, al igual que también se desconoce cómo afectan a esta propiedad, las interacciones de la MFGM con las caseínas y las proteínas del suero (Singh, 2006). 2.5.2. Formación de liposomas a partir de MFGM Los liposomas son unas vesículas esféricas con diámetros que oscilan entre 20 nm y varias micras, formadas por el auto-ensamblaje de moléculas anfipáticas, normalmente fosfolípidos, formando una o más bicapas y englobando un núcleo acuoso. Durante su proceso de formación, las moléculas hidrofóbicas se pueden incorporar a las bicapas lipídicas y las moléculas hidrofílicas pueden quedar atrapadas en ese núcleo acuoso. 2. Introducción - 16 - Muchos de los métodos estandarizados para la formación de liposomas son lentos y difíciles de llevar a la práctica, además de usar detergentes y solventes orgánicos, que son indeseables en los productos alimenticios. Un método que podría salvar en gran medida estas limitaciones es la microfluidificación, proceso que produce una gran cantidad de liposomas estables sin el uso de detergentes, solventes o alcoholes (Singh, 2006). Normalmente, para la producción de liposomas se han utilizado extractos de fosfolípidos obtenidos de aceite de soja o de yema de huevo. En trabajos recientes en los que se han utilizado fracciones ricas en fosfolípidos de la MFGM, se ha observado que los liposomas resultantes son completamente diferentes en cuanto a su estructura y a sus propiedades (Thompson et al., 2006). Dentro de las muchas aplicaciones que podrían tener los liposomas en la industria alimentaria hay que destacar su papel como protectores de ingredientes particularmente sensibles, su importancia para aumentar la eficacia de los distintos aditivos alimentarios y su capacidad para confinar algunos sabores indeseables (Dewettinck et al., 2008). 3. Objetivos - 17 - 3. OBJETIVOS Los principales objetivos del trabajo que se presenta en esta memoria han sido: • Obtención de las membranas del glóbulo graso de la leche de vaca y de oveja y caracterización de las proteínas por electroforesis utilizando diferentes métodos de tinción. • Caracterización electroforética de las proteínas de la membrana del glóbulo graso presentes en diferentes buttermilk comerciales. • Aplicación de un método de aislamiento para la obtención de la butirofilina de la membrana del glóbulo graso de leche de vaca. • Aplicación de un método de aislamiento para la obtención de la parte extracelular de la mucina-1 (MUC 1) de la membrana del glóbulo graso de leche de oveja. 4. Materiales y métodos - 18 - 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Materiales Muestras y reactivos Las leches de oveja y de vaca fueron suministradas por la quesería Villacorona (El Burgo de Ebro, Zaragoza). Los diferentes sueros de mantequilla o buttermilk comerciales fueron suministrados por la empresa Westland Milk Products (Hokitika, Nueva Zelanda). Los geles de poliacrilamida para electroforesis Phastgel™, los tampones conteniendo dodecil sulfato sódico (SDS-buffer strips) y los marcadores de peso molecular fueron suministrados por GE Healthcare (Uppsala, Suecia). Los geles de cromatografía fueron suministrados por diferentes compañías: Sephacryl™ S-200 (Amersham Pharmacia Biotech. Uppsala, Suecia), Con A Sepharose™ 4B (GE Healthcare) y DEAE-Sephadex A50 (Amersham Pharmacia Biotech). Los reactivos más específicos utilizados han sido los siguientes: • PhMeSO 2 F o PMSF (Boehringer. Mannheim, Alemania). • Tripsina, benzamidina y deoxicolato de sodio (Sigma Aldrich. St. Louis, Estados Unidos). • Quimosina recombinante EC. 3.4.23.4 (amablemente cedida por el laboratorio CHR Hansen. Madrid, España). • Azul de Coomassie y SDS (SERVA GmbH & Co. Heidelberg, Alemania). • Glicoprotein Staining Kit (Thermo Scientific. Meridian Rd. Rockford, Estados Unidos). • 2-Mercaptoetanol (Merck. Darmstadt, Alemania). • Metil-alpha-D-manopiranósido (Alfa Aesar. Karlsruhe, Alemania). • Nitrato de plata y citrato de sodio (Panreac Química S.A. Barcelona, España). El resto de productos utilizados a los que no se hace referencia fueron reactivos de tipo analítico obtenidos de diversas fuentes. 4. Materiales y métodos - 19 - 4.2. Métodos 4.2.1. Preparación del buttermilk y el butterserum de vaca y oveja 4.2.1.1. Desnatado de la leche y lavado de la grasa Se partió de leche cruda de vaca y oveja, de las que se obtuvo la grasa por centrifugación a 2000 g durante 15 minutos. La fracción grasa se sometió a tres lavados en cinco volúmenes de una solución de NaCl al 0,9%. Cada lavado consistía en la adición de la solución salina, agitación durante 15 minutos en un agitador de tubos (J. P. Selecta S. A., Barcelona, España) y después una centrifugación a 2000 g durante 15 minutos a 4°C, para volver a obtener la fracción grasa. Una vez realizados los lavados se dejó la grasa en refrigeración a 4°C durante 12 horas y después se añadió a la grasa un volumen del tampón Tris 50 mM, conteniendo NaCl 150 mM, EDTA 1 mM y el inhibidor de proteasas PMSF 1 mM, equivalente al peso de la grasa. 4.2.1.2. Obtención del buttermilk y el butterserum La fracción grasa extraída se mantuvo en la última solución durante 15 minutos en un agitador de tubos hasta que se formaron los granos de mantequilla. Para favorecer la formación de la mantequilla, los tubos se agitaron durante un minuto en un homogeneizador ultraturrax (IKA Vortex Genius 3. Staufen, Alemania). Para la obtención del suero de mantequilla o buttermilk se filtró la mantequilla por un paño de quesería. Para la obtención del butterserum, se calentó la mantequilla a 40°C durante 5 minutos y seguidamente se centrifugó a 3000 g durante 15 minutos a 30°C. Tras esta centrifugación, quedaron tres fracciones en los tubos, una fina capa de grasa superficial, una capa intermedia de aceite de mantequilla o butteroil y una inferior que corresponde al butterserum. 4.2.1.3. Centrifugación del buttermilk y el butterserum Los tubos con buttermilk, con butterserum o con una mezcla de ambos se centrifugaron a 100.000 g en una ultracentrífuga (Beckman Coulter TM , Palo Alto, California, Estados Unidos) durante 1 hora a 4°C, con el objetivo de obtener muestras 4. Materiales y métodos - 26 - 4.2.6.3. Tinción con plata de forma manual Una vez realizada la electroforesis las proteínas se fijaron en el gel con una solución compuesta por etanol al 58,3% y ácido acético al 11,6% en agua mili Q durante aproximadamente 30 minutos. Seguidamente el gel se sumergió en una solución compuesta por la solución anterior al 11,6% en agua mili Q durante otros 30 minutos. Antes de sumergirlo en las posteriores soluciones se realizaron tres lavados con agua mili Q cada 30 segundos. Posteriormente, el gel se sumergió en una solución de tiosulfato de sodio al 0,02% durante 1 minuto, y se volvió a lavar otras tres veces con agua mili Q cada 30 segundos. A continuación el gel se colocó en una solución con nitrato plata al 0,2 % y 0,075% de formaldehído al 75% en agua mili Q, durante 5 minutos. En este paso es cuando las proteínas del gel fijan la plata. Se realizaron tres lavados con agua mili Q para eliminar el nitrato de plata sobrante. Para revelar las bandas de proteína que fijaron la plata se utilizó una solución compuesta por 6% de carbonato de sodio, 0,05% de formaldehído al 37% y 2% de la solución compuesta por 0,02% de tiosulfato de sodio en agua mili Q. Hay que controlar cuidadosamente el tiempo de este revelado para que no aparezcan manchas pardoamarillentas en el gel, que dificulten la visión de las bandas de proteína. Después del revelado el gel se introdujo en una solución de ácido acético al 5% en agua mili Q durante 10 minutos y para finalizar la tinción, se sumergió en una solución de glicerol al 11,6% en agua mili Q durante 10 minutos, sin lavado entre ellas. 4.2.6.4. Tinción con plata en el Phast-System Para realizar la tinción con plata en la unidad de tinción del equipo Phast System, fue necesario preparar una serie de soluciones como se describe a continuación. La solución 1 estaba compuesta por etanol al 10% y ácido acético al 5% en agua destilada. Esta solución sirve de lavado y de fijación para las proteínas. El gel permaneció en contacto con la solución de fijación durante 6 minutos. A continuación 4. Materiales y métodos - 27 - se colocó la solución 2 compuesta por glutaraldehído al 5%, con la que el gel estuvo en contacto 6 minutos, tras los cuales se volvió a colocar el gel en la solución 1 otros 8 minutos para eliminar los restos de glutaraldehído. Antes y después de impregnar el gel durante 7 minutos con la solución 3 de tinción, compuesta por nitrato de plata al 0,4%, se lavó en agua destilada. A continuación, el gel se sumergió durante 5 minutos en la solución 4, compuesta por formaldehído al 0,13% y carbonato de sodio al 2,5%. Finalmente, el gel se lavó con la solución 5, compuesta por tiosulfato de sodio al 2,5%, pH 5,5, durante 2 minutos. Para la mejor conservación del gel se pasó por una solución de glicerol al 10%. 4.2.7. Secuenciación de bandas obtenidas en las electroforesis Las bandas de gel teñidas con Azul de Coomassie correspondiente a las proteínas que se querían identificar, se escindieron cuidadosamente y se transfirieron a un vial que contenía 50 μL de agua mili Q. Esta muestra fue analizada mediante HPLC y espectroscopía de masas (MALDI-TOF) por la Unidad de Proteómica del Parque Científico de Barcelona, según el protocolo que se describe a continuación. En primer lugar se realizó una reducción y alquilación de las muestras tras lo cual se llevo a cabo una digestión con tripsina. La identificación de los péptidos obtenidos se realizó mediante separación en cromatografía líquida acoplada a un sistema de análisis por espectrometría de masas tipo MALDI-TOF (Matrix assisted laser desorption/ ionization- Time of flight). Una vez obtenidos los resultados de dicho análisis se realizó una búsqueda en la base de datos de proteínas del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI de sus siglas en inglés) con los parámetros de búsqueda predefinidos en el servidor MASCOT. 5. Resultados y discusión - 28 - 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. Caracterización electroforética del buttermilk y el butterserum de vaca y oveja En la primera fase de este trabajo se ha puesto a punto un método para la obtención de las membranas del glóbulo graso de leche de vaca y se ha caracterizado la composición de sus proteínas. Los resultados de la caracterización electroforética se muestran en la Figura 4. En ellos se puede notar la gran importancia de la recuperación de las membranas que quedan atrapadas en los glóbulos grasos durante el proceso de batido de la grasa y que se recuperan con la obtención del butterserum. Esta fracción presenta una mayor concentración de proteínas de la MFGM que el buttermilk y enriquecen esta fracción en dichas proteínas cuando se combinan ambas fracciones. Aunque se observan algunas proteínas de bajo peso molecular en el buttermilk, correspondientes a caseínas y proteínas del lactosuero, la mayoría de bandas que se visualizan tienen pesos moleculares superiores a 45 KDa que corresponden principalmente con los pesos moleculares de las proteínas de la MFGM. Figura 4. Electroforesis en gel de poliacrilamida en gradiente (8-25%) con SDS de las fracci ones de buttermilk y butterserum de vaca. La tinción se ha realizado con Azul de Coomassie 1. Patrón de pesos moleculares, constituido por las siguientes proteínas: fosforilasa B (97,0 KDa), albúmina sérica bovina (67,0 KDa), ovoalbúmina (45,0 KDa), anhidrasa carbónica (30,0 KDa), inhibidor de tripsina (20,1 KDa) y α-lactalbúmina bovina (14,4 KDa) 2. Buttermilk de vaca 3. Butterserum de vaca 4. Precipitado del buttermilk de vaca 5. Precipitado del buttermilk + butterserum de vaca - KDa 1 2 3 4 5 5. Resultados y discusión - 29 - En la electroforesis que se muestra en la Figura 5 aparecen las fracciones obtenidas a partir de los precipitados del buttermilk y el butterserum derivados de la grasa de leche de oveja, en comparación con las obtenidas de la grasa de leche de vaca. Se puede ver que el perfil electroforético de las proteínas de los buttermilk y butterserum de vaca y oveja es bastante similar, pero en las fracciones de buttermilk de vaca aparecen más bandas que en el de oveja. Esto puede ser debido a una mayor concentración de proteínas en las muestras. Figura 5. Electroforesis en gel de poliacrilamida en gradiente (8-25%) con SDS de las fracciones de buttermilk y butterserum de vaca y oveja. La tinción se ha realizado con Azul de Coomassie 1. Patrón de pesos moleculares, constituido por las siguientes proteínas: fosforilasa B (97,0 KDa), albúmina sérica bovina (67,0 KDa), ovoalbúmina (45,0 KDa), anhidrasa carbónica (30,0 KDa), inhibidor de tripsina (20,1 KDa) y α-lactalbúmina bovina (14,4 KDa) 2. Precipitado del buttermilk de vaca 3. Precipitado del buttermilk + butterserum de vaca 4. Precipitado del buttermilk de oveja 5. Precipitado del buttermilk + butterserum de oveja Como se muestra en la Figura 6, en la electroforesis teñida con el kit específico para glicoproteínas observamos en todas las muestras, excepto en la del buttermilk de oveja, una serie de bandas con un peso molecular superior a 40 KDa, cuando se comparan las carreras con la correspondiente a la muestra utilizada como control positivo. Estas bandas podrían tratarse de algunas de las principales glicoproteínas de la MFGM, como la butirofilina, la mucina-1 y la lactadherina, entre otras. Por otra parte, se observan 1 2 3 4 5 5. Resultados y discusión - 30 - algunas proteínas con un peso molecular por debajo de 40 KDa que pueden corresponder con proteínas del lactosuero, que no se han eliminado completamente en el lavado de la grasa y que no se ven tan intensamente teñidas debido a que algunas de ellas no son glicoproteínas. El perfil de las carreras correspondientes a las muestras de buttermilk y butterserum muestran un arrastre que dificulta la visualización de las bandas y que puede deberse a la alta concentración de sales en las muestras, procedentes de las soluciones de lavado, por lo que sería conveniente eliminar las sales antes de analizar las fracciones utilizando este método de tinción. Figura 6. Electroforesis en gel de poliacrilamida en gradiente (8-25%) con SDS de fracciones de buttermilk y butterserum de vaca y de oveja. Tinción con el Glycoprotein Staining Kit 1. Control positivo: peroxidasa de rábano, peso molecular 40 KDa 2. Precipitado obtenido del buttermilk de vaca 3. Precipitado del buttermilk + precipitado del butterserum de vaca 4. Precipitado del buttermillk de oveja 5. Precipitado del buttermilk + precipitado del butterserum de oveja 6. Butterserum de oveja 7. Precipitado del butterserum oveja 8. Control negativo: inhibidor de la tripsina procedente de soja 1 2 3 4 5 6 7 8 - 5. Resultados y discusión - 31 - 5.2. Caracterización electroforética de diferentes buttermilk comerciales clarificados con quimosina con y sin cloruro cálcico 5.2.1. Incubación con quimosina En este trabajo se han analizado tres productos comerciales en polvo, procedentes de suero de mantequilla, y amablemente cedidos por la compañía Westland Milk Products de Nueva Zelanda, cuyas diferencias en cuanto a la composición aparecen en la Tabla 5. Tabla 5. Composición de los diferentes buttermilk comerciales utilizados (Westland Milk Products. Hokitika, Nueza Zelanda) Buttermilk Proteínas (% m/m) Grasa (% m/m) Humedad α - Serum Powder 38,9 5 4,3 Β - Serum Powder 30,3 22,2 3,7 Westland Powder 33,6 9,7 3,8 La presencia de una gran cantidad de caseínas en las soluciones obtenidas de los buttermilk comerciales, nos llevó a buscar un método para eliminarlas y facilitar así el análisis electroforético de las proteínas de la MFGM. En la electroforesis que se muestra en la Figura 8, se aprecia como los buttermilk a los que además de quimosina se les ha añadido cloruro cálcico se han clarificado mejor, puesto que la cantidad de caseínas que quedan en el sobrenadante final es mucho menor, como se resalta en rojo en la imagen. Esta clarificación podría facilitar la obtención de las proteínas de la MFGM, que se encuentran en estos productos comerciales en baja concentración, como se aprecia en las bandas que aparecen por debajo de las caseínas. En la Figura 7, vemos como con la tinción de plata realizada de forma manual, en comparación con la realizada en la unidad de tinción del Phast System, aparece un perfil proteico muy parecido pero las bandas correspondientes a las proteínas de la MFGM, se visualizan mejor. 5. Resultados y discusión - 32 - Figura 7 (derecha). Electroforesis en gel de poliacrilamida en gradiente (8-25%) con SDS del α-serum powder tratado con quimosina y cloruro cálcico. La tinción se realizó con plata de forma manual Figura 8 (izquierda). Electroforesis en gel de poliacrilamida en gradiente (8-25%) con SDS de los diferentes sobrenadantes obtenidos de los buttermilk comerciales clarificados. La tinción se realizó con plata en la unidad de tinción del Phast-System. Todas las muestras están diluidas 1/10 1 .α-Serum powder 2. β-Serum powder 3. α-Serum powder tratado con quimosina 4. α-Serum powder tratado con quimosina y cloruro cálcico 5. β-Serum powder tratado con quimosina 6. β-Serum powder tratado con quimosina y cloruro cálcico 7. Westland powder tratado con quimosina 8. Westland powder tratado con quimosina y cloruro cálcico Los resultados obtenidos con los productos comerciales derivados del suero de mantequilla, indican que la fracción derivada del producto α-serum powder tras tratamiento con quimosina, es la que presenta una mayor concentración de las proteínas de la MFGM, correspondiéndose con su composición. Sin embargo, habría que utilizar un método de concentración para poder obtener las proteínas del MFGM en una cantidad importante. 5.2.2. Incubación con citrato de sodio En los procedimientos de obtención de la MFGM a partir de la grasa láctea, las caseínas y las proteínas del suero son eliminadas en los lavados a los que se somete la fracción grasa con los diferentes tampones (Corredig et al., 2003). Sin embargo, esto no es aplicable en el aislamiento de MFGM a partir de los buttermilk comerciales. Por ello, en 5. Resultados y discusión - 33 - este trabajo se ha ensayado la utilización del citrato de sodio combinado con una microfiltración con filtros de tamaño de poro entre 0,1 y 1,4 µm según el procedimiento de Morin et al. (2004). El citrato de sodio provoca la disociación de las micelas de caseína, haciendo que pasen a través del filtro concentrando la MFGM en el retenido (Morin et al., 2007). En la Figura 9, observamos el efecto de la combinación del citrato de sodio y la microfiltración sobre uno de los buttermilk comerciales, el Westland powder. Figura 9. Electroforesis en gel de poliacrilamida en gradiente (8-25%) con SDS del Westland powder tratado con citratro sódico y sometido a microfiltración. La tinción se realizó con plata de forma manual 1. Patrón de pesos moleculares, constituido por las siguientes proteínas: fosforilasa B (97,0 KDa), albúmina sérica bovina (67,0 KDa), ovoalbúmina (45,0 KDa), anhidrasa carbónica (30,0 KDa), inhibidor de tripsina (20,1 KDa) y α-lactalbúmina bovina (14,4 KDa) 2. Westland powder. Dilución 1/50 3. Westland powder con citrato sódico. Filtro 0,2 µm. Concentrado. Dilución 1/100 4. Westland powder con citrato sódico. Filtro 0,2 µm. Permeado. Dilución 1/50 5. Westland powder con citrato sódico. Filtro 0,45 µm. Concentrado. Dilución 1/100 6. Westland poder con citrato sódico. Filtro 0,45 µm. Permeado. Dilución 1/50 Las caseínas presentes en el buttermilk comercial siguen apareciendo en los concentrados tanto de 0,2 como de 0,45 µm y dónde tendrían que salir sería en el permeado. En los concentrados sí que observamos sin embargo una mayor concentración de proteínas con pesos moleculares entre 66 y 97 KDa, las cuales se corresponden con las proteínas de la membrana del glóbulo graso. La presencia de caseínas en el buttermilk, a pesar de haber realizado la adición de citrato sódico y la 1 2 3 4 5 6 + _ KDa 5. Resultados y discusión - 34 - microfiltración, podría deberse a que se ha utilizado un sistema y unas condiciones de filtración diferente al utilizado por Morin et al. (2007). 5.3. Aislamiento de la butirofilina En este apartado se muestran los resultados de las cromatografías que se llevaron a cabo en la columna de Concanavalina-A-Sepharose 4B para la obtención de butirofilina, en dos aislamientos diferentes. En ambos aislamientos se partió de una fracción enriquecida en la MFGM de leche de vaca y se siguió el procedimiento descrito por Imam et al. (1981), en el cual a partir de leche cruda conseguían el aislamiento de una proteína de un peso molecular alrededor de 70 KDa, sometiendo al buttermilk a una serie de ultracentrifugaciones y a una posterior cromatografía en Concanavalina-A. 5.3.1. 1 er Aislamiento En el cromatograma del primer aislamiento (Figura 10) se observan dos picos, el primero corresponde con las proteínas que no son retenidas por la Concanavalina y el segundo contiene las proteínas retenidas, que han sido desplazadas por el α-metil-manósido. En el pico obtenido tras pasar por la columna el tampón de elución conteniendo α-metil- manósido debería localizarse la butirofilina. Figura 10. Perfil de la cromatografía del 1er aislamiento, realizada en Concanavalina-A-Sepharose 4B de la fracción enriquecida en proteínas de la MFGM de leche de vaca. Las fracciones recogidas fueron de 2 ml 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 0 10 20 30 40 50 Absorbancia (280 nm) Número de fracción α-metil-manósido En la figura 11 se muestra cromatografía anterior. Figura 11 . Electroforesis en gel de poliacrilamida cromatografía del 1 er aislamiento Azul de Coomassie 1. Patrón de pesos moleculares, constituid albúmina sérica bovina (67,0 KDa de tripsina (20,1 KDa) y αlactalbúmina bovina (14 2. Lactosuero obtenido por coagulación enzimática 3. Muestra aplicada a la columna de cromatografía 4. Fracción 22 5. Fracción 24 6,7. Fracción 39 8. Patrón de pesos moleculares constituido por las siguientes proteína α2-macroglobulina (170 KDa ), β deshidrogenasa (53 KDa) La banda mayoritaria que aparece en la carrera 6 de esta electroforesis, correspondiente al máximo del pico del secuenciar. El análisis evidenció que se por lo que parece que el ligando se estaba liberando de la fase estacionaria en la elución cromatográfica. También se envió a secuenc resultó corresponder con la secuencia de la lactadherina, una proteína cuantitativamente importante de la membrana del glóbulo graso con un pe de alrededor de 50 KDa. 5. Resultados y discusión - 35 - muestra la electroforesis de las fracciones obtenidas de la . Electroforesis en gel de poliacrilamida en gradiente (8-25%) con SDS de las fracciones de la aislamiento realizada en Concanavalina-A-Sepharose 4B. La t inción Patrón de pesos moleculares, constituid o por las siguientes proteínas: fosforilasa B (97 KDa ), ovoalbúmina (45,0 KDa ), anhidrasa carbónica (30 lactalbúmina bovina (14 ,4 KDa) Lactosuero obtenido por coagulación enzimática Muestra aplicada a la columna de cromatografía Patrón de pesos moleculares constituido por las siguientes proteína s: miosina (220 ), β -galactosidasa (116 KDa), transferrina (76KDa ), glutamato La banda mayoritaria que aparece en la carrera 6 de esta electroforesis, correspondiente al máximo del pico del eluido con el α-metil- manósido se envió a secuenciar. El análisis evidenció que se trata ba de un precursor de la por lo que parece que el ligando se estaba liberando de la fase estacionaria en la elución cromatográfica. También se envió a secuenc iar la banda mayoritaria de la carrera 3, que resultó corresponder con la secuencia de la lactadherina, una proteína cuantitativamente importante de la membrana del glóbulo graso con un pe Resultados y discusión la electroforesis de las fracciones obtenidas de la de las fracciones de la inción se realizó con fosforilasa B (97 ,0 KDa), ), anhidrasa carbónica (30 ,0 KDa), inhibidor s: miosina (220 KDa), ), glutamato - La banda mayoritaria que aparece en la carrera 6 de esta electroforesis, manósido se envió a ba de un precursor de la Concanavalina-A, por lo que parece que el ligando se estaba liberando de la fase estacionaria en la elución iar la banda mayoritaria de la carrera 3, que resultó corresponder con la secuencia de la lactadherina, una proteína cuantitativamente importante de la membrana del glóbulo graso con un pe so molecular 7. 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