Repositorio Institucional de Documentos

DIRIGIDO POR EL DR. MARCELO DE LAS HERAS Y LA DRA. Mª CARMEN ACEÑA FABIÁN. |Departamento de Patología Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza. MARÍA URRA PALOS MÁSTER EN INICIACIÓN A LA INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS VETERINARIAS. TRABAJO FIN DE MÁSTER TUMORES DE MAMA EN PERRAS COMO MODELO DE CÁNCER. ESTUDIO DE SU CASUÍSTICA EN EL HOSPITAL VETERINARIO DE ZARAGOZA DURANTE EL CURSO 2011-2012 Zaragoza, 12 de Septiembre de 2012 Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 2 Índice 1. Resumen y palabras clave ………………………………………3 2. Introducción/ justificación e importancia del tema elegido….......4 3. Objetivos del trabajo…………………………………………….24 4. Metodología……………………………………………………..25 5. Resultados y discusión…………………………………………..42 6. Conclusiones…………………………………………………….49 7. Referencias bibliográficas…………………………………….....50 8. Anexos…………………………………………………………...56 9. Agradecimientos…………………………………………………60 Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 3 1.- Resumen Los tumores mamarios son el tipo de tumor que con más frecuencia aparecen en perras enteras, y más en nuestro país donde la esterilización rutinaria en perras jóvenes (antes de los dos años de edad) no se realiza de forma rutinaria. Dicha práctica a edades tempranas, representa el mejor procedimiento para la prevención de dichos tumores. Este trabajo aborda los tumores mamarios caninos (TMC) tanto desde un punto de vista clínico como anatomo-patológico. Se describen las características clínicas, el procedimiento diagnóstico, haciendo hincapié en el examen citológico y en la obtención de las distintas muestras tumorales. En el segundo se describe histológicamente la glándula mamaria normal y la importancia de la obtención de un diagnóstico histológico para determinar el pronóstico y el tratamiento más adecuado en cada caso. Asimismo se realiza un análisis de los casos clínicos recibidos en el Servicio de Oncología del Hospital Veterinario de la Universidad de Zaragoza durante el curso 2011-2012, observando un mayor número de casos de tumores benignos que malignos. Además este trabajo contempla otros objetivos tales como establecer las bases para la creación de un Banco de tumores mamarios en pequeños animales. Para ello es necesaria la creación de un protocolo normalizado de trabajo (PNT) para la toma de muestras y almacenamiento de los tumores de mama caninos y felinos, que permita que el trabajo desarrollado sea reproducible y garantice la continuidad del mismo. Palabras clave: tumores de mama, especie canina, citología, clasificación histológica, Banco de tumores, base de datos de TMC. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 4 2.- Introducción En la actualidad, desgraciadamente, la prevalencia del cáncer en los animales domésticos va en aumento y representa la principal causa de muerte de los mismos. Ello es debido a una gran variedad de razones pero principalmente a que viven más años y por ello aumenta la probabilidad a desarrollar neoplasias. La edad media de padecer neoplasias se sitúa entre los 8 y 10 años disminuyendo a continuación a partir de los 10. Su desarrollo se debe a factores genéticos, ambientales (exposición a pesticidas, herbicidas, insecticidas, tabaco o radiaciones), lesiones inflamatorias crónicas o a factores hormonales. La mejora en su calidad de vida es consecuencia de una buena alimentación, vacunas frente a distintas enfermedades infecciosas y mejor actuación de los clínicos veterinarios (formación continuada, medicina preventiva y tratamientos). Asimismo, el papel que nuestras mascotas desempeñan en el ámbito familiar y los lazos que con ellos se crean, hacen que aumente la preocupación por su bienestar aportándoles todos los cuidados posibles y por lo tanto esperando una actuación veterinaria de calidad. Deberemos mostrar empatía con el propietario y compasión por su mascota haciéndole saber, que haremos todo lo posible por mantener a lo largo del transcurso de la enfermedad su calidad de vida aconsejándole los tratamientos más óptimos (quimioterapia, tratamientos paliativos e incluso la eutanasia) e informándole del pronóstico. Existen una gran variedad de neoplasias que pueden desarrollar los perros, pero en el presente trabajo los tumores mamarios caninos serán el objeto de nuestra investigación. Los tumores mamarios caninos (TMC) son las neoplasias que aparecen con más frecuencia en las perras. Aunque mayoritariamente aparecen en hembras (62 veces mayor riesgo de aparición que en machos) también se han descrito en los machos con una incidencia de hasta un 2,5%. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 5 La esterilización antes del primer celo ha demostrado ser muy eficaz para evitar la aparición de los TMC. En países anglosajones, donde es habitual esta práctica, la incidencia de este tipo de tumores es prácticamente inexistente. La presentación clásica de una perra con tumores de mama es la de una hembra entera con una edad comprendida entre 9 y 11 años con uno o varios tumores palpables que afecten a una o ambas cadenas mamarias y que clínicamente no padece signos de enfermedad a menos que sufra otra enfermedad concomitante (a excepción de las que tienen una forma clínica especial denominada Carcinoma inflamatorio). La mayoría de las hembras desarrollan 5 pares de glándulas mamarias, divididas en dos cadenas: derecha (“right”, R) e izquierda (“left” ,L) ,aunque algunas pueden desarrollar 4 o 6 pares de manera excepcional. Normalmente existen dos mamas torácicas, dos abdominales y una inguinal. Se nombran de forma habitual con un número que indica su posición en la cadena (1, 2,3,4,5) y una letra ,R o L ,para mostrar a que cadena, derecha o izquierda, pertenece. La glándula mamaria es una glándula apocrina modificada que aparece solo en mamíferos. Está formada por una red de conductos rodeados de un estroma fibrovascular y rico en tejido adiposo. El desarrollo de esta glándula es único en el cual las últimas fases del desarrollo ocurren en la hembra adulta durante la gestación. Con cada gestación se produce una proliferación de los conductos, una diferenciación de los acinis productores de leche y una involución, finalmente, de los componentes secretores de la glándula preservando la estructura de los conductos. Cada mama posee entre 7 y 16 conductos y cada uno de ellos forma un lóbulo en la glándula adulta que funciona como una unidad independiente. Las glándulas mamarias continúan creciendo proporcionalmente al resto del cuerpo y hasta el momento de la pubertad los conductos se encuentran a una distancia corta del pezón (Goldschmidt et al., 2011). En la pubertad los cambios en la mama se producen como consecuencia de la liberación de estrógenos desde los ovarios. Con el inicio de la gestación y el aumento de los niveles de progesterona el crecimiento tiene lugar por un alargamiento y una ramificación del sistema ductal de los lóbulos. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 6 El diagnóstico apropiado y el tratamiento temprano de lo TMC son factores cruciales para aumentar la supervivencia del animal. En la actualidad en las perras que viven en ámbitos urbanos, los propietarios al acariciar en el abdomen a sus mascotas o el propio veterinario en revisiones rutinarias o visitas por otros motivos, detectan de manera precoz la presencia de tumores de mama. En ocasiones éstos cuentan con unos pocos milímetros de tamaño, lo cual como veremos más adelante mejora el pronóstico de los mismos. Es frecuente también, por el contrario, que perras que viven en ámbitos rurales cuyo contacto con sus propietarios es escaso posean tumores de un mayor tamaño en comparación con las anteriores. En muchos de esos casos no los ven a simple vista hasta que poseen un tamaño considerable lo que empeora el pronóstico y dificulta también la extirpación quirúrgica. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 7 La etiología de estos tumores es multifactorial, siendo los principales factores de riesgo la edad y la exposición a hormonas (endógenas y exógenas). Entre otros factores se incluyen la raza, la dieta, la obesidad en los primeros años de vida y factores genéticos (mutaciones genéticas: gen p53, BRCAI) (Peña L et al., 2011). 1. Edad. La edad constituye uno de los factores de riesgo más importantes en el desarrollo de los tumores mamarios caninos. Se han estudiado en diferentes grupos de poblaciones las edades de aparición de forma natural de los tumores mamarios coincidiendo que tienen lugar entre los 8 y 11 años. También se debe de tener en cuenta la esperanza de vida de cada especie. (Roszel et al., 1983; Holmberg L et al., 1993; Pérez Alenza et al., 2000). Por ejemplo, en un estudio realizado en una población de perras de raza Beagle se observó que el riesgo comenzaba a los 8 años de edad y aumentaba a partir de entonces (McFarland et al.,1976). Los animales jóvenes tienen una incidencia mayor de tumores benignos que los animales de más edad. Este hecho viene respaldado por diferentes artículos publicados pero el más reciente (Goldschmidt et al., 2009) apunta que los animales con una edad media de 8.5 años muestran tumores benignos, mientras que los que tienen entorno a 9.5 son malignos. Los TMC son raros en hembras por debajo de los 5 años de edad salvo aquellos que han sido tratados con hormonas exógenas como progestágenos. 2. Hormonales (esteroides sexuales). La exposición a hormonas endógenas en edades tempranas es una causa importante en el desarrollo de tumores mamarios en los perros, sobre todo durante los dos primeros ciclos. Los TMC poseen receptores de estrógenos, progestágenos y andrógenos en el tejido tumoral. Los niveles de dichas hormonas tanto en plasma como en el tejido mamario tumoral son Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 8 significativamente más altos en los tumores malignos que en los benignos y displasias (Peña et al., 2011). La esterilización temprana, supone un efecto protector frente a los TMC: antes del primer celo reduce el riesgo al 0,05%, si se realiza entre el primer y segundo celo esta cifra aumenta al 8% y después de los dos años al 26% (Scheneider et al., 1969; Sorenmo et al., 2000). No se demuestra una mayor relación entre la esterilización antes del primer celo y el desarrollo de incontinencia urinaria. Este riesgo es mayor en ovariohisterectomías (OHE)/ ovariectomías practicadas en perras menores de 3 meses de edad, por lo que se recomienda la esterilización de hembras mayores de 3 meses y menores de 1 año. (“Guía de actuación en los tumores mamarios caninos”. GEVONC. AVEPA, 2012). Por otro lado, la esterilización a edades adultas, (cuando el tumor aparece clínicamente) no parece tener valor preventivo frente al cáncer de mama, aunque sí previene la aparición de tumores benignos así como patologías uterinas y ováricas (hiperplasia endometrial quística, piometras, hemometras, mucometras, hidrómetras, tumores ováricos) (Morris et al.,1998; Lana et al., 2007). Otros factores reproductivos como la irregularidad en los ciclos, pseudogestaciones, gestaciones o edad del primer parto no se ha podido comprobar que influyan de manera significativa en el riego de padecer este tipo de tumores (Brodey et al., 1966; Scheneider et al., 1969; Taylor et al., 1976; Lana et al., 2007). 3. Tratamiento con estrógenos y progestágenos exógenos El tratamiento con estrógenos y progestágenos exógenos (especialmente el acetato de medroxiprogesterona) es utilizado con el fin de evitar el celo, tratar pseudogestaciones o como abortivos. La utilización rutinaria de estos productos no es recomendable pues aumentan el riesgo de aparición de TMC (Stovrring et al., 1997). Existen estudios que respaldan, que perros tratados con progestágenos desarrollan antes tumores y con más frecuencia benignos que malignos. En cambio, en aquellos animales tratados combinando estrógenos y progestágenos sintéticos, desarrollan más malignos (Conncanon et al., 1981; Giles et al., 1978; Selman et al., 1995). Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 9 4. Raza. Los TMC pueden aparecer en cualquier hembra de cualquier raza, aunque las razas miniatura y enanas (toy) y algunas razas grandes puras aparecen con más frecuencia en los estudios epidemiológicos. Sin embargo estos datos varían mucho dependiendo del lugar donde se realizan. Un ejemplo son las hembras de raza Bóxer que en artículos procedentes de Estados Unidos no aparecen como razas que frecuentemente padezcan tumores de mama (Brodey et al., 1983; Priester et al.,1971), a diferencia de los artículos Europeos en los que su aparición es cada vez más frecuente (Moe , 2001; Bronden et al., 2010). Las razas que más frecuentemente aparecen en los listados son: Springer Spaniel inglés, Cocker Spaniel, Setter inglés, Pointer, Pastor Alsaciano, Pastor alemán, Caniche, Bichón maltés, Chihuahua, Beagle y terriers en general (Gregory KO, Moore AS. Manejo del paciente oncológico (guía práctica para la atención compasiva). vol 2.p. 675- 687). 5. Obesidad. En un amplio estudio realizado (Sonnenschein et al., 1991) en el que se investigaba la asociación entre la dieta, la conformación corporal y el riesgo a desarrollar tumores de mama, se encontró un descenso significativo a desarrollar estos tumores cuando los perros estaban delgados entre los 9 y 12 meses de edad. Asimismo, la ingesta de una dieta rica en grasas y la obesidad en el año previo al diagnóstico de TM, no tuvieron influencias sobre su desarrollo. Otro estudio destacó que la obesidad en el primer año de edad casi triplicaba la incidencia de tumores mamarios en perras enteras. (Pérez Alenza et al., 1998.). En este informe, las perras con mayor ingesta de carnes rojas también tuvieron un riesgo más alto para desarrollar neoplasia mamaria. 6. Factores genéticos, como mutaciones en el gen p53, BRCA1. (Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1999; Muto et al., 2000). Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 16 Existen varias técnicas quirúrgicas y su elección dependerá del tamaño y localización de los tumores (uno o más de uno) y de si existe afectación ganglionar o no y, como ya hemos comentado del estado general del animal. Estas técnicas son: - Nodulectomía: escisión del nódulo sin eliminar la glándula completa. Se recomienda realizarla cuando hay un único nódulo menor de 5 mm, no adherido, bien encapsulado y en la periferia de la glándula. - Mastectomía simple o local: escisión del tumor y de la glándula afectada. Está indicada esta cirugía cuando el tumor está cerca del pezón, es una lesión única y de tamaño intermedio (0,5–3 cm). - Mastectomía regional o parcial: consiste en la extirpación de la glándula afectada y de las mamas localizadas en la línea de drenaje linfático; mamas 1,2 y 3 o mamas 4 y 5. Está indicada cuando los tumores son grandes (3-5 cm), adheridos y/o cuando existen varios tumores en dichas mamas. Cuando los tumores se sitúan en la tercera mama, éstas pueden drenar hacia el ganglio axilar y al inguinal por lo que hay autores que recomiendan la extirpación de la cadena completa (mastectomía completa). - Mastectomía completa o total: está indicada cuando los tumores son de gran tamaño (mayores o iguales a 5 cm), ulcerados, adheridos a piel y/o fascias o cuando hay varios tumores en toda la cadena independientemente del tamaño de los tumores. En el caso de que existan tumores en ambas cadenas se comenzará con la extirpación de la cadena completa de un lado y una vez cicatrizada completamente se procederá a la extirpación de la cadena contralateral (aproximadamente transcurre un mes y medio de tiempo entre ambas cirugías). (Lana et al., 2007). Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 17 Este mismo año ha sido formado un Grupo de Especialistas Veterinarios en Oncología (GEVONC) pertenecientes a la asociación Veterinaria de Especialistas en Pequeños Animales (AVEPA) que han publicado una guía de actuación en los tumores de mama caninos (no aplicable al carcinoma inflamatorio) que incluye tanto indicaciones como recomendaciones. El GEVONC, en las recomendaciones que propone, incluye una tabla en la que según el estadio clínico del paciente se recomienda un tipo de cirugía u otra. El cuadro es el siguiente: ESTADÍO CLÍNICO CIRUGÍA I con tumores <1cm en su T mayor Nodulectomía I con tumores >1cm en su T mayor Mastectomía local II Mastectomía local o regional III Mastectomía parcial (1 a 3 ó 4 a 5)/ completa* IV Mastectomía completa ** V Valorar cirugía paliativa *Cuando existen características clínicas de malignidad: adherencia, mala delimitación, infiltración, ulceración, crecimiento rápido… **Aunque existe controversia al respecto y son necesarios más exhaustivos, GEVONC recomienda cirugías radicales en estadios IV siguiendo los principios de la cirugía oncológica general´ Notas: a. Siempre se elegirá la cirugía menos agresiva para el paciente que permita unos márgenes quirúrgicos adecuados (al menos 2 cm). b. Cuando hay nódulos en varias mamas, se deben extirpar todos (mastectomías regional o completa). Aunque los tumores sean potencialmente benignos por sus características clínicas (pequeño tamaño, crecimiento lento…) siempre está indicada la cirugía puesto que con el tiempo tienden a malignizar. (Sorenmo et al., 2009). c. El 60% de las perras operadas de TMC desarrollan nuevos tumores en la cadena mamaria ipsilateral después de una mastectomía regional. (Stratmann et al., 2008). Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 18 Cuando se realiza una mastectomía, ya sea, simple, regional o completa, de las glándulas mamarias caudales, se extirpan también los nódulos linfoides inguinales superficiales. Estos nódulos se encuentran anatómicamente asociados a la quinta glándula mamaria. Es recomendable que dicho nódulo linfoide sea evaluado histológicamente en busca de posibles metástasis en los mismos. El conocimiento del tipo histológico tras la escisión quirúrgica de la neoplasia y el grado de malignidad en el caso de las neoplasias malignas, es fundamental para ajustar el tratamiento posterior a cada paciente y establecer el pronóstico. Los distintos tipos histológicos tienen diferente evolución (Misdorp W et al., 1999) (Tabla 1 en el anexo). Dada la complejidad de la clasificación histológica y debido a la repercusión en el pronóstico, es conveniente utilizar el sistema de gradación histológica adaptado del sistema humano para el cáncer mamario. (Peña et al., 2012). Entre los tumores benignos el tumor mixto benigno es el más frecuente (posee proliferación epitelial y mioepitelial además de metaplasias cartilaginosas) y entre los tumores malignos destaca el carcinoma sólido (Ettinger y Fledman, 2011). En general los tipos histológicos complejos son menos agresivos biológicamente. Es posible la malignización de tumores mamarios benignos, por lo que si no se extirpan pueden evolucionar a tipos histológicos malignos. Recientemente la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS), ha sido revisada y actualizada (Goldschmidt et al., 2011) incluyéndose nuevos tipos histológicos, renombrando algunos ya existentes y estableciendo criterios de malignidad específicos para los tumores mamarios malignos (tabla 2 en el anexo). En general se considera que la mitad de los tumores analizados son benignos y la otra mitad malignos, aunque en la práctica clínica diaria parece ser que los malignos son más frecuentes (Ettinger y Fledman, 2011). En las perras con neoplasias mamarias, en el resto de mamas (sin nódulo macroscópico) de manera frecuente existen displasias, por ello se producen neoplasias en ellas en pacientes en las que sólo se realizan nodulectomías y no mastectomías. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 19 El estudio anatomo-patológico de las muestras mamarias (biopsias) aporta el diagnóstico definitivo. Se deben enviar a un Servicio de Anatomía Patológica, todos los nódulos extirpados, correctamente identificados, así como los márgenes quirúrgicos para que el informe aporte información sobre los mismos indicando si existe invasión o no, así como conocer si existe invasión de los vasos linfáticos regionales. Es importante precisar la descripción de las características histológicas de cada mama de manera individual. Junto a estos datos es muy útil incluir el grado de malignidad de los tumores malignos epiteliales (no existe un sistema de gradación para los sarcomas mamarios). Existen tres grados de malignidad creciente I, II, III, basados en el estudio de tres características histológicas como son la formación de túbulos, pleomorfismo nuclear e índice de proliferación (tabla 3 en el anexo). El grado de malignidad está relacionado con el pronóstico y permite discriminar los tumores malignos que evolucionen de manera “verdaderamente maligna”(a mayor grado de malignidad peor pronóstico).En caso de que nos encontremos frente a diferentes tipos y grados histológicos el de mayor malignidad es el que emitirá el pronóstico. En líneas generales (a excepción del carcinoma inflamatorio) los sarcomas tienen peor pronóstico que los carcinomas. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 20 A continuación se expone un cuadro que resume los factores pronósticos de los TMC. (Withrow and MacEwen’s Animal Clinical Oncology. Ed Saunders Elsevier: 619 – 634, 2007). Buen pronóstico Mal pronóstico Indiferente <3 cm de diámetro >3 cm de diámetro Edad Bien delimitado Invasivo, ulcerado Raza (razas pequeñas suelen tener más tumores benignos) (Itoh et al.,2005) Ganglios regionales negativos Ganglios regionales positivos Estado reproductor en el momento de la cirugía Receptores a estrógenos y progesterona :+ Receptores a estrógenos: - Peso Tipo histológico (carcinoma-bien diferenciado, complejo, tubular, papilar) Tipo histológico (carcinomapoco deiferenciado, simple, sólido, anaplásico, carcinoma inflamatorio, sarcomas) Tipo de cirugía, simple o radical Tumor grado I Tumor grado III Número de tumores Índice de proliferación bajo de: AGNOR (argylophilic nucleolar organizar region), Ki- 67, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) Índice de proliferación alto de: AGNOR (argylophilic nucleolar organizar region), Ki- 67, PCNA (proliferating cell nuclear antigen).Mutaciones genéticas del gen p53 y ADN aneploide Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 21 El empleo de quimioterapia se sugiere en tumores de elevada malignidad (GHM III) o en estadios clínicos III y IV, como adyuvante postquirúrgico después de la cirugía, así como en estadio clínico V (existencia de metástasis a distancia). Existen diversos protocolos quimioterápicos a utilizar. Debe utilizarse el más apropiado en cada caso que el oncólogo considere ya que no existe un consenso ni referencias suficientes que establezcan que protocolo es el más adecuado. El GEVONC propone estos 5 protocolos que detallo a continuación:  5-fluoracilo (150mg/m2 IV 1 vez a la semana /4 dosis) + ciclofosfamida (100mg/m2 IV o PO 1 vez a la semana/4 dosis)  Mitoxantrona (5mg/m2 IV cada 3 semanas de 3 a 5 dosis) + AINE’s (preferentemente un coxib)  Gemcitabina (800mg/m2/semana IV 4 dosis)  Doxorubicina (30 mg/m2 IV/ 3 semanas 4-5 dosis)  Terapia metronómica oral en casos de estadio V empleando fármaco anticox2/24h + quimioterápico oral (ciclofosfamida 15 mg/m2/24h o clorambucilo 4mg/m2/24h) La quimioterapia en TMC puede emplearse de distintas formas:  Terapia neoadyuvante, previa a la cirugía en aquellos animales con afectación local avanzada.  Terapia adyuvante posquirúrgica, utilizada en animales sin metástasis a distancia pero con un pronóstico clínico e histológico malo con el fin de tratar la enfermedad micrometastática.  Cuando existan metástasis a distancia.  Terapia metronómica, que consiste en la administración de quimioterapia permanente (días alternos) a bajas dosis es eficaz para reducir el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la angiogénesis. Este tipo de terapia resulta útil en perras con tumores mamarios en estadios clínicos III y V (ciclofosfamida a dosis de 12,5-25 mg/m2/24h PO o clorambucilo a dosis de 6-8 mg/m2/48h PO). (Leach et al., 2011). Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 22 También es importante en la elección del protocolo, la comodidad con el uso de los distintos fármacos del propio veterinario así como disponer de medidas de protección adecuadas (campana de extracción, guantes estériles, bata, gafas, mascarilla, sistema Phaseal) por su potencial teratogénico, carcinogénico o irritante. También se deberá depositar el material empleado en contenedores específicos para residuos citotóxicos. Asimismo en los pacientes durante el tratamiento y al menos 48 h después de finalizar el tratamiento, tanto las heces como la orina deberán ser manipuladas con precaución y se deberán eliminar diluidas en gran cantidad de agua. Existen determinados citotóxicos que requieren alargar dicho período de precaución para el manejo de las excretas tras la quimioterapia. Precisamente en dicha lista aparecen la ciclofosfamida (permanece 3 días en orina y 5 en heces tras fin de tratamiento), la doxorubicina (permanecen 6 días en orina y 7 en heces) y la mitoxantrona (6 días en orina y 7 en heces). Es importante que el clínico lo conozca e informe a los propietarios tanto en cómo realizar una correcta manipulación de los fármacos quimioterápicos en casa como en la manipulación de orina y heces de sus mascotas (especialmente si convive con personas inmunodeprimidos y mujeres embarazadas). (Prevención de riesgos laborales, departamento de salud, consumo y servicios sociales de la Diputación general de Aragón). 5 Figura 5 . Campana de extracción del Hospital Veterinario de Zaragoza Figura 6 . Sistema Phaseal (comercializado en España por Grifols) Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 23 Además de la quimioterapia existen otras alternativas terapéuticas como la radioterapia, desgraciadamente no disponible todavía en nuestro país; el tamoxifeno (con efecto antiestrógenicos) en desuso. También el medicamento aglepristone (Alizine R), antirreceptor de progesterona, en perras enteras en fase lútea parece disminuir el tamaño de algunos tumores de mama antes de la extirpación quirúrgica, por lo que resulta útil antes de la cirugía en estos casos (De Andrés et al., 2006). El seguimiento de nuestros pacientes es fundamental para el mantenimiento de su calidad de vida, especialmente en los casos de tumores con características clínicas de malignidad o tumores malignos en un tumor benigno: revisiones cada 6 meses durante 2 años; y los casos de tumores malignos deberás revisarse cada 3 meses durante 2 años. En dichas revisiones se incluirán exploraciones físicas completas, analíticas sanguíneas, radiografías de tórax y ecografías de abdomen. (Guía de actuación en los tumores mamarios caninos. Sección A: indicaciones). En caso de que los propietarios no acudan a las revisiones propuestas es aconsejable, en la medida de lo posible, contactar telefónicamente con ellos para interesarnos por su salud. Figura 8 . Contenedor de residuos citotóxicos del Hospital Veterinario de Zaragoza. Figura 7 . Guantes de exploración, gafas protectoras y mascarilla Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 24 3.- Objetivos del trabajo La elevada incidencia de los TMC hace necesario establecer tratamientos individualizados multidisciplinares a cada paciente dependiendo del tipo histológico que presente. Ello conlleva trabajar estrechamente con el Servicio de Anatomía Patológica de manera continuada. La preocupación creciente del bienestar de las mascotas por parte de los propietarios y la empatía que se muestra hacia esta patología junto con la obligación de prestar un servicio veterinario de calidad, hacen merecedoras las neoplasias de mama de ser objeto del presente trabajo. En el presente trabajo se presenta un análisis de los casos recibidos en el Hospital Veterinario de Zaragoza de todos los pacientes que padecen TMC, desde octubre de 2011 hasta junio de 2012 con el fin de ampliar el conocimiento sobre este tipo de tumores. Para ello es necesaria la creación de una ficha clínica para cada paciente e incluirlas en la base de datos informática creada especialmente para este fin. De esta forma se pretende conocer el número de casos recibidos en nuestro Hospital y las características que presentan los TMC. Otro de los objetivos que se pretenden es el establecimiento de las bases para la creación de un Banco de tumores mamarios procedente de muestras de pequeños animales (cánidos y félidos). Esta meta es un pilar fundamental del grupo de investigación de la Diputación General de Aragón de “Oncología Comparada” en el que participo como becaria y es dirigido por el Dr. Marcelo de las Heras, Catedrático de Anatomía Patológica de nuestra Facultad. Se persigue la creación de un protocolo normalizado de trabajo (PNT) para la toma de muestras y almacenamiento de los tumores de mama caninos y felinos, que permita que el trabajo desarrollado sea reproducible y garantice la continuidad del mismo, así como la creación de una ficha donde se recojan datos del estudio histopatológico de dichas muestras y se emita el diagnóstico definitivo. Además se pretende iniciar la colección de muestras en dicho Banco de tumores a partir de los casos procedentes de nuestro Hospital. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 25 5.- Metodología Para lograr cumplir con los objetivos planteados se tratarán a continuación los recursos utilizados en cada uno de ellos de manera independiente. 5.1.- Análisis de los casos recibidos en el Hospital Veterinario de Zaragoza de todos los pacientes que padecen TMC, desde octubre de 2011 hasta junio de 2012. 5.1.1.- Selección de los animales para el estudio. Ante la llegada de manera aleatoria de cada paciente que padecía nódulos, en una o varias mamas, o en una o en ambas cadenas al Hospital Veterinario, concretamente al Servicio de Oncología, se inicia un protocolo diagnóstico encaminado a valorar si efectivamente ese paciente es susceptible de realizarle un tratamiento quirúrgico. Durante este curso fueron tratadas además, 3 perras diagnosticadas de carcinoma inflamatorio que fueron excluidos del estudio por no estar indicada la cirugía en este tipo de tumores, como hemos comentado anteriormente. Asimismo, se diagnosticaron otros 6 casos, de los cuales 3 no fueron TMC y otros 3, no se operaron por decisión de los propietarios. Los animales seleccionados fueron un total de 25 perras, siendo en todos los casos su primera visita al Hospital por la aparición de tumores mamarios. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 32 5.2.3.- Protocolo normalizado de trabajo (PNT). Para la realización de la ficha que aúna como realizar la toma de muestras y el almacenamiento de los tumores en el Banco, nos basamos en el protocolo empleado en el “Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas”, concretamente al descrito en los “Servicios de Apoyo al sistema Nacional De Salud, Banco de tumores” (www.cnio.es). Siguiendo dicho modelo empleado para la especie humana, ha sido establecido un protocolo similar para los pequeños animales. Dicho protocolo consta de 5 apartados bien diferenciados en los que se describen las características del método empleado.  Traslado del tejido desde los quirófanos hasta el Servicio de Anatomía Patológica. Cuando la escisión de la cadena mamaria completa ha sido realizada, se introduce la misma envuelta en papel (el papel empleado ha sido el que protege a los guantes estériles) en una bolsita de plástico transparente sin líquido alguno en su interior. Dicha bolsa se coloca sobre placas de refrigerante congelado en el interior de un contenedor de transporte cerrándola correctamente. Esta actividad se realiza en el quirófano. El personal encargado debe ir con indumentaria apropiada, en este caso debe hacer uso de una bata y guantes de exploración hasta finalizar la actividad. A continuación, dicho contenedor es transportado desde el Hospital Veterinario hasta el Servicio de Anatomía Patológica. Se realiza la anotación del tiempo de salida del quirófano. Figura 9 . Contenedor refrigerante (de color azul), máquina identificadora y caja para almacenar las muestras. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 33  Examen de la biopsia y selección de la pieza quirúrgica en el Servicio de Anatomía patológica. Una vez en el laboratorio de la unidad y con la campana de bioseguridad conectada, procedemos a la extracción de la muestra de la bolsa y la colocamos sobre una superficie destinada para ello para proceder a su tallado. Antes de iniciarlo anotamos el tiempo de inicio del procesado de la muestra. Comenzamos la exploración y palpación de cada una de las mamas comprobando las características de cada mama con la ayuda del esquema cumplimentado en la ficha clínica en la consulta de Oncología. Se obtendrán muestras de todas las mamas con tejido neoplásico y muestras de tejido no neoplásico procedente de mamas distintas a las neoplásicas. En algunos casos se obtuvieron un número de muestras mayor que en otras ya que depende de las características concretas de cada caso. Para ello necesitamos el siguiente material: unas pinzas y unas hojas de bisturí. Se recomienda la obtención de 4 fragmentos tanto del tejido neoplásico como del no neopásico. 2 fragmentos irán destinadas a su congelación para formar parte del Banco y las otras 2 para su conservación en parafina de cada uno de los tipos de tejido. Se debe anotar a que cadena mamaria pertenecen (derecha o izquierda) y a que glándula mamaria de la misma (T1, T2, A1, A2, inguinal) en ambos casos. Una vez seleccionadas y talladas se anota el tiempo del fin del procesado de la muestra. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 34  Congelación. El tejido neoplásico y el no neoplásico se distribuye en fragmentos con un tamaño no superior a 1,5 x 1 x 0,5 cm y se introducirán en criomoldes estándar (Cryomold Standard, Tissue – Tek 4557) previamente rellenado con OTC- Compound y se dispone para congelar. Se congela en 2-metil – indol previamente enfriado con nitrógeno líquido hasta conseguir densidad pastosa (gel). Cuando la pieza cambie de color al blanco se termina de congelar directamente sumergido en el nitrógeno líquido. Las muestras irán identificadas con el número de historial utilizado en el Hospital Veterinario de Zaragoza con una etiqueta de poliuretano hecha con la máquina (LabPal, Brady. Cintas PAL 500 461). Las muestras tumorales en las etiquetas muestran una cuña cortada con tijeras, mientras que las procedentes de mamas normales no.  Fijación en formol neutro tamponado. Las piezas de tejido seleccionadas se colocarán en un casete de color blanco e identificado con el número de historial utilizado en el Hospital Veterinario de Zaragoza, para ser fijado en formol tamponado al 10% durante 48h e incluido en parafina según procedimiento rutinario. El resto de la biopsia quirúrgica se fijará en formol neutro tamponado para su examen histopatológico. Se debe de tener la precaución de reservar una muestra de tumor para este análisis. Es importante emitir un informe lo antes posible ya que tiene mucha importancia su diagnóstico tanto para el clínico como para el propietario del animal. Para realizar el examen histológico se diseñó una plantilla para rellenar en cada caso. Dicha plantilla se denomina “Ficha de observación histopatológica. Banco de neoplasias de mama”. La citada ficha contiene un primer formulario a cumplimentar acerca del animal: historia clínica, número de biopsia asignada, la fecha de la observación, la especie animal (canina o felina), el sexo, la raza y la edad. A continuación se procede a realizar la descripción histológica de Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 35 cada una de las glándulas mamarias indicando a que cadena pertenecen (derecha o izquierda) y a su localización en ella (T1, T2, A1, A2 e inguinal). Asimismo se deben describir los linfonodos inguinales superficiales y las características de los bordes quirúrgicos. Cada una de las mamas es clasificada según la clasificación histopatológica de la Organización Mundial de la Salud (Misdorp et al., 1999) y se realiza también su gradación histológica (tabla 3 en anexo). La ficha de observación histopatológica diseñada se adjunta a continuación. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 36 FICHA DE OBSERVACION HISTOPATOLOGICA BANCO NEOPLASIAS MAMA Nº Historia: B- / Fecha: Especie: Can / Fel Sexo: Raza: Edad: 1.-Descripción histológica por glándula mamaria. Localización CMD/CMI Descripción Nº Mamas: : Lc Axillaris Toracica 1 Toracica 2 Abdominal 1 Abdominal 2 Inguinal Lnn inguinalis superficiales propii Bordes quirúrgicos 2.-Clasificación histopatológica (Misdorp et al., 1999). Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 37 Localización CMD/CMI T1 T2 A1 A2 Inguinal GRADACIÓN HISTOLOGICA DE NEOPLASIAS DE MAMA Localización CMD Mamas normales CMI Mamas neoplásicas Aspecto histológico Gradación Componente celular EPITELIAL Componente celular CONJUNTIVO 1. Formación de túbulos. 1.Bien marcados 2.Moderado 3.Escaso/nulo 2.Figuras mitóticas/n. hipercromático 1.Ocasional 2. 2-3 por campo 3.> de 3 x campo 3. Pleomorfismo tamaño, forma, tinción núcleos. 1. Uniforme 2. Moderado 3. Marcado Total Calificación Grado 0 (1-3) Comentarios: Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 38 Grado I (3-5) Grado II (6-7) Grado III (8-9) 4. Tipo de sustancia intercelular Fibrosis Baja Moderad a Alta Mixoide Baja Moderad a Alta 5. Inflamación. Intratumor 0-1 2 3 Peritumor 0-1 2 3 6. Capsulación. De 0 a 3 7. Tipo de crecimiento. Infiltrante Expansivo 8. Invasión vascular local. Sanguíneo Linfático 9. Invasión nódulos linfoides regionales Lc Axillare Lnn inguinalis superficiales propii Comentarios Fecha: Firma: Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 39  Conservación del tejido. Las muestras congeladas se conservan en un congelador situado en el Hospital veterinario de Zaragoza a -80ºC dentro de una caja de plástico NALGENE 5050-001 (Nalge Nunc Storage Box, Polycarbonate). Las muestras conservadas en parafina se guardan el lugar destinado para ello, en el Servicio de Anatomía patológica. Cada protocolo deberá ir con la fecha y la firma del ejecutor del proceso. La ficha generada para el PNT que reúne las características descritas anteriormente es la que se adjunta a continuación. Figura 10 . Congelador del Hospital Veterinario. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 40 Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 41 Cada hembra sometida al procedimiento quirúrgico posee su correspondiente protocolo cumplimentado. Poseerán uno o dos PNT dependiendo de si han sido sometidas hasta el momento a una o dos cirugías. Este procedimiento ha requerido un entrenamiento largo en su ejecución y perfeccionamiento de la técnica hasta lograr la máxima excelencia del mismo. Debido a ello fue necesario multitud de intentos hasta decidir aprobar su uso rutinario, lo que provocó que diversas muestras de tejidos se desecharan para su conservación en el Banco aunque su diagnóstico histológico fue emitido normalmente para cada paciente. Las secciones en parafina se conservan en el archivo de la unidad de Anatomía Patológica (tanto las que forman parte del Banco, como las que no) y los bloques, de mamas tumorales y mamas normales en el archivo del Banco también en dicha unidad. En la actualidad se encuentran conservadas 10 muestras procedentes de 4 hembras distintas. El Banco de tumores de nuestra Facultad es el único en España, aunque todavía se encuentre en vías de crecimiento. La financiación para ello procede del grupo de investigación de Oncología Comparada de la Diputación General de Aragón. Se encuentra en vías de creación además una plataforma informática de acceso para otros profesionales para poder solicitar muestras y poder realizar estudios multicéntricos futuros. En dicha plataforma además se pretende volcar los datos almacenados de los casos en Medicina humana del Hospital Miguel Servet de Zaragoza con el que trabajamos. De esta forma se pretende crear, además de la Red de Bancos de Tumores (RBT) promovida y coordinada por el CNIO, una red informática común en medicina humana y veterinaria con protocolos homogéneos de recogida, procesamiento y almacenamiento de muestras. Ello supondría una herramienta para promocionar la investigación oncológica Todo ello todavía se encuentra en proceso de creación en la actualidad. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 48 6.2.- Establecimiento de las bases para la creación de un Banco de tumores mamarios procedente de muestras de pequeños animales (cánidos y félidos). Ha sido posible cumplir los objetivos previstos en este campo, diseñando con detalle un protocolo de trabajo que resulte comprensible y reproducible por otro investigador garantizando así su continuidad en el tiempo. Incluye como hemos visto una ficha del PNT para cada caso que debe ser correctamente cumplimentado y otra ficha para su estudio histopatológico, reuniendo así dos formularios por cadena mamaria analizada para cada uno de los animales. Estas bases son utilizables también para la recogida y almacenamiento de tumores mamarios en la especie felina. Se encuentran disponibles 10 muestras congeladas de TMC correctamente identificadas y diagnosticadas histopatológicamente. Su almacenamiento en el banco no supone un incremento en el gasto para el propietario. Su utilidad se pondrá de manifiesto cuando pueda servir para realizar estudios multicéntricos o diagnósticos moleculares a otros investigadores a través de la red de Banco de Tumores. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 49 7.- Conclusiones De los resultados que se han obtenido mediante la realización de este trabajo, pueden extraerse las siguientes conclusiones:  Según los resultados estadísticos de este estudio, el hallazgo más sobresaliente ha sido que el porcentaje de tumores benignos (86%) observados es superior al de malignos. Este hecho podría deberse a una detección precoz de los mismos y especialmente al pequeño tamaño de la mayoría de ellos en el momento del diagnóstico.  Recomendamos el uso de la técnica citológica para el trabajo cotidiano, por su bajo coste y mínimo daño para el animal, ya que a pesar de no poder emitir un diagnóstico certero del mismo acerca de la naturaleza del tumor (en el caso de los TMC) antes de biopsiarlo, si podemos diagnosticar otros nódulos de distinta naturaleza evitando así procedimientos quirúrgicos innecesarios para el animal que suponen un importante gasto para el propietario.  La creación de la base de datos de los tumores mamarios en pequeños animales, permitirá su utilización en los próximos casos que aparezcan, así cómo realizar un estudio retrospectivo de los mismos en el Hospital Veterinario de Zaragoza. Esta última línea de trabajo la vamos a iniciar este próximo curso. Para obtener datos estadísticos más concluyentes deberá completarse el estudio ampliando el número de casos clínicos.  El establecimiento de los protocolos a seguir en la formación del Banco de tumores animal resulta un trabajo novedoso en nuestra Facultad. Además de recopilar un mayor número de muestras y completar el diseño de la página web para su puesta en funcionamiento, se plantea la posibilidad de hacerlo extensivo al almacenamiento de otros tipos de neoplasias en el futuro. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 50 7.- Referencias bibliográficas Brodey RS, Fidler IJ, Howson AE. The relationship of estrus cycle irregularity, pseudopregnancy, and pregnancy to the developement of canine mammary neoplasms. J Am Animal Hosp Assoc. 1966; 149:1047- 1049. Brodey RS, Goldschmidt MH, Roszel JR. 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Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 54 Tauler ML, Turrau R. Mammary Gland Surgery. IV EVSSAR congress proceedings; 2004 June; Barcelona .p. 243-246. Taylor GN, Shabestari L, Williams J, Mays CW, Angus W, Mcfarland S. Mammary neoplasia in a closed Beagle Colony. Cancer Research. 1976 ; 36:2740- 2743 Yuzbasiyan-Gurkan V, Cao Y, Venta P, et al. Loss of heterogenozygosity at the BRCA1 locus in canine mammary carcinoma. Proc Vet Cancer Soc. 1999; 19:7. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 55 Imágenes  Figura 1- Cedida por la Profesora Amaya Unzueta Galarza, responsable del Servicio de radiología del Hospital Veterinario de Zaragoza.  Figura 2- Cedida por María Borobia Frías, responsable del Servicio de ecografía del Hospital Veterinario de Zaragoza.  Figura 3,4,5,6,7 y 8- Cedidas por la Dra. Carmen Aceña Fabián, responsable del Servicio de oncología del Hospital Veterinario de Zaragoza.  Figura 9 y 10- Realización propia. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 56 8.- Anexo 1.- Misdorp W et al. Histological Classification of Mammary Tumors of the Dog and the Cat.2nd ed.1999. Tumores de mama en perras como modelo de cáncer. Estudio de su casuística en el Hospital Veterinario de Zaragoza durante el curso 2011-2012 Máster en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 57 2.- Goldschmidt M, Peña L, Rassotto R, Zapulli V. Classification and Grading of Canine Mammary Tumors. Vet Pathol.2011; 48-117.