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UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE VETERINARIA TRABAJO FIN DE MÁSTER Máster en Iniciación a la Investigación en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Septiembre 2012 Inhibición del crecimiento y de la biosíntesis de micotoxinas de mohos del Gº Fusarium mediante el uso de ácidos fenólicos Trabajo presentado por: JONATHAN MACANCELA QUIÑONEZ Departamento: Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Área: Nutrición y Bromatología Tutores: Dr. AGUSTÍN ARIÑO MONEVA Dra. MARTA HERRERA SÁNCHEZ AGRADECIMIENTOS En primer lugar quería agradecer a mi profesor/tutor Dr. Agustín Ariño Moneva por confiar en mí y darme la oportunidad de formar parte de su equipo de investigación, por su tiempo dedicado y los conocimientos que me ha transmitido, así como a mi tutora Dra. Marta Herrera Sánchez por su ayuda con el trabajo y la presente Memoria. De la misma forma quedo agradecido, a todos los compañeros y equipo de investigación que con su apoyo de forma incondicional han hecho posible el presente trabajo fin de máster. Por otra parte agradecer también al Gobierno de Aragón (DGA Grupo Consolidado de Investigación A01/2011) y al MICINN (Proyecto AGL2011-26808), que gracias a su financiación ha hecho posible mi pequeño aporte en estos grandes proyectos. Y como no agradecer a mis familiares y amigos, en especial a mi madre que con su confianza, apoyo y ejemplo de superación ha hecho de mí la persona que soy ahora. RESUMEN El maíz es uno de los principales cereales contaminados por micotoxinas, sobre todo, las producidas por especies fitopatógenas de mohos del género Fusarium, que son hongos ubicuos comunes del suelo y que contaminan el maíz en campo. Estos mohos tienen la capacidad para sintetizar toxinas cuando los cereales están todavía en el campo, así como durante su almacenamiento post-cosecha, sobre todo cuando los granos no son suficientemente desecados después de la cosecha y cuando se producen abusos de temperatura y humedad. Las principales micotoxinas producidas por las especies toxigénicas de Fusarium son: tricotecenos como deoxinivalenol, toxinas T-2 y HT-2, así como fumonisinas (FB1 y FB2) y zearalenona. Estas toxinas son potencialmente peligrosas tanto para el ser humano como para los animales de granja provocando intoxicaciones alimentarias denominadas micotoxicosis. La infección por Fusarium en grano progresa desde el exterior al interior del grano, pero esto puede estar limitado por la presencia de barreras físicas y ciertos componentes químicos como los ácidos fenólicos que se encuentran en su parte externa. Algunos autores han investigado anteriormente la capacidad in vitro que tienen algunos ácidos fenólicos de inhibir el crecimiento fúngico y la síntesis de algunas micotoxinas, como aflatoxinas y de algunos tricotecenos tipo B. Sin embargo no hay datos en la bibliografía disponible sobre la inhibición de toxinas de Fusarium como fumonisinas y zearalenona en grano de maíz. Por lo tanto uno de los objetivos de este estudio es evaluar in vitro el efecto de los ácidos fenólicos sobre el crecimiento y producción de micotoxinas en maíz. En el presente trabajo, las especies F. verticillioides, F. proliferatum, F. graminearum (y su teleomorfo G. zeae), F. sporotrichioides y F. langsethiae se han mostrado sensibles a los ácidos fenólicos ensayados (cafeico, clorogénico, ferúlico y pcumárico) en concentraciones de 0,5 a 10 mM, ya que se ha reducido su tasa de crecimiento con porcentajes de inhibición de hasta 100% dependiendo de la cepa, el ácido fenólico y la dosis utilizada. Sin embargo, los ensayos en grano de maíz con ácidos fenólicos a concentraciones inhibitorias, indican que la capacidad de biosíntesis de micotoxinas no se ve afectada significativamente, con algunas excepciones. ÍNDICE 1.Introducción .............................................................................................................. 1-2 1.1.Objetivos .................................................................................................................. 3 2.Revisión bibliográfica ............................................................................................. 4-17 2.1. Micotoxinas ......................................................................................................... 4-7 2.1.1. Fumonisinas .................................................................................................. 7-8 2.1.2. Zearalenona ................................................................................................ 9-10 2.1.3. Tricotecenos ............................................................................................. 10-11 2.1.3.1. Deoxinivalenol .................................................................................. 11-12 2.1.3.2. Toxinas T-2 y HT-2 ................................................................................ 12 2.2. Ácidos fenólicos .............................................................................................. 13-14 2.3. Métodos de análisis de micotoxinas ............................................................... 15-17 3.Material y métodos ............................................................................................... 18-27 3.1. Estudio de la inhibición del crecimiento de especies toxigénicas de Fusarium por adición de ácidos fenólicos .................................................................................... 18-21 3.2. Estudio de la inhibición de la biosíntesis de micotoxinas de Fusarium por adición de ácidos fenólicos ................................................................................................. 21-27 4.Resultados y discusión .......................................................................................... 28-38 4.1. Resultados ....................................................................................................... 28-36 4.1.1. Efecto de los ácidos fenólicos sobre el crecimiento de las especies toxigénicas de Fusarium ................................................................................... 28-32 4.1.2. Efecto de los ácidos fenólicos sobre la biosíntesis de micotoxinas de Fusarium ............................................................................................................ 33-36 4.2. Discusión ......................................................................................................... 37-38 5.Conclusiones .......................................................................................................... 39-40 6.Bibliografía ............................................................................................................ 41-45 7.Anexos. 1 1. INTRODUCCIÓN Los cereales son las principales materias primas afectadas por micotoxinas, especialmente el maíz (Zea mays L.) que es una matriz muy susceptible a la contaminación fúngica tanto en la cosecha, post-cosecha, manipulación, almacenamiento y durante su transformación en alimentos y piensos (Farnochi et al., 2005). La Organización para la Agricultura y Alimentación de las Naciones Unidas (FAO, 2004) ha estimado que aproximadamente cada año un 25% de los cultivos alimentarios a nivel mundial están contaminados por micotoxinas, causando una disminución en la calidad y rendimiento de las cosechas, lo que se traduce en importantes pérdidas económicas, así como una reducción en la producción animal y problemas de salud debido a su toxicidad (Magan et al., 2004). Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidas por hongos toxigénicos que se desarrollan en productos vegetales y son tóxicos para los seres humanos y animales, lo que explica la gran preocupación de las industrias alimentarias y de piensos en la prevención de su entrada en la cadena alimentaria. Los mohos y sus micotoxinas afectan negativamente a los alimentos elaborados cuando se usan materias primas contaminadas, ya sean vegetales contaminados o productos de origen animal procedentes de animales alimentados con piensos contaminados (Jean, 2007). Los mohos toxigénicos los podemos clasificar en dos grupos: mohos de campo y mohos de almacenamiento. Los mohos de campo incluyen las especies que pertenecen al género Fusarium e invaden los granos antes de la recolección, de ahí el importante papel de la prevención en campo durante el desarrollo del maíz. Los mohos de almacenamiento que comprenden un pequeño número de especies pertenecientes a los géneros Aspergillus, Eurotium y Penicillium, invaden el grano durante su almacenamiento y son los principales responsables del deterioro de los cereales y piensos (Soriano et al., 2007). Las especies fitopatógenas del género Fusarium son muy importantes desde el punto de vista agroalimentario, ya que pueden causar enfermedades en la mayoría de los cereales, principalmente en maíz pudiendo afectar también a otros vegetales y frutas. Son especies ubicuas que se encuentran ampliamente distribuidas tanto en suelos como en sustratos orgánicos (Soriano et al., 2007). Su importancia no se debe tan sólo a la pérdida de las cosechas, sino también a la producción de micotoxinas. Entre las toxinas 2 producidas por este género se encuentran los tricotecenos -deoxinivalenol (DON), nivalenol (NIV), toxinas T-2 y HT-2-, la zearalenona (ZEA) y las fumonisinas (FB1 y FB2) (Sanchis et al.,2000). Estas micotoxinas constituyen una familia de toxinas de gran interés para la agricultura y la seguridad alimentaria, así como también en la salud de los animales (Glenn, 2007). En el año 2006, se publicó el Reglamento CE nº 1881/2006 (modificado por el Reglamento CE nº 1126/2007) por el que se establecieron los contenidos máximos tolerables de las toxinas de Fusarium en cereales y derivados. Estas normativas ponen de manifiesto el interés que existe por estas toxinas, en la salud de los consumidores. En la actualidad, la mejor manera para reducir o evitar la contaminación de los cereales por toxinas de Fusarium es su prevención, que es esencial, ya que hay pocas formas de superar por completo los problemas producidos por estas micotoxinas una vez están presentes (Pierre, 2007). Diferentes estudios han demostrado que en los granos infectados por Fusarium tanto el micelio del hongo como las toxinas residen principalmente en las cubiertas externas del grano maduro. Esto sugiere que la infección progresa desde el exterior del grano al interior y que la penetración de hongos en el endospermo puede estar limitada por barreras físicas y ciertos componentes químicos de las partes externas del grano. Entre estos componentes químicos se encuentran los ácidos fenólicos que están presentes de forma natural principalmente en las partes externas del grano como el pericarpio y la capa de aleurona (Ruiz et al, 2008); también se han encontrado en el endospermo y embrión aunque en menor cantidad (Jing y Giusti, 2005). En este sentido, los ácidos fenólicos podrían ser buenos candidatos en cuanto a la inhibición del crecimiento fúngico y la síntesis de algunas micotoxinas como ha sido demostrado in vitro para aflatoxinas de Aspergillus (Nesci et al., 2009) y tricotecenos tipo B de Fusarium (Atanasova-Penichon et al., 2008; Boutigny et al., 2009 y 2010). Además el interés público por la disminución del uso de agentes químicos sintéticos en la industria agroalimentaria ha llevado a la búsqueda de fungicidas alternativos de origen natural, para el control de mohos toxigénicos (Sanchis et al., 2000). 3 1.1. OBJETIVOS Por todo lo expuesto anteriormente, en el presente trabajo se persiguen los siguientes objetivos: 1º) Puesta a punto de un método de determinación in vitro de la inhibición del crecimiento de Fusarium spp. por adición de ácidos fenólicos. 2º) Puesta a punto de un método de determinación in vitro de la inhibición de la biosíntesis de micotoxinas de Fusarium spp. mediante la adición de ácidos fenólicos. 3º) Evaluación in vitro del efecto de los ácidos fenólicos (cafeico, clorogénico, ferúlico y p-cumárico.) sobre el crecimiento y producción de micotoxinas (fumonisinas, deoxinivalenol y zearalenona) por las especies de F. verticillioides, F. graminearum, F. sporotrichioides, F. proliferatum y F. langsethiae. 4 Soriano et al., (2007) 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1. MICOTOXINAS Las micotoxinas, que deriva de las palabras griegas mikes y toxina que significan hongo y veneno respectivamente, son compuestos provenientes del metabolismo secundario de los hongos, cuya síntesis se produce cuando la fase de crecimiento llega a su etapa final y durante la fase estacionaria (Figura 1). Figura1. Fase de crecimiento fúngico y localización de la síntesis de micotoxinas Las micotoxinas afectan a un amplio rango de productos agrícolas, incluyendo cereales, frutos secos, granos de café, semillas oleaginosas y especias, los cuales son la base de la economía de muchos países en desarrollo. Estos cultivos son susceptibles a la contaminación por hongos y por tanto, a la producción de micotoxinas. Los mohos productores de micotoxinas pueden invadir la materia vegetal en el campo antes de la cosecha, en la post-cosecha, manipulación, almacenamiento y durante su transformación en alimentos y piensos. En el caso de los cereales podemos distinguir entre una micobiota de campo que incluye los géneros Fusarium, Alternaria, Cladosporium y Drechslera, que requieren un alto contenido de humedad para crecer (22-25%), e invaden los granos antes de la recolección, de ahí el importante papel de la prevención en campo durante el desarrollo del maíz. Por otro lado, la micobiota de 5 almacenamiento comprende un pequeño número de especies pertenecientes a los géneros Aspergillus, Eurotium y Penicillum. Su característica común es que son capaces de crecer con contenidos de humedad bajos y alta presión osmótica. Son los principales responsables del deterioro de los cereales y piensos almacenados (Soriano et al., 2007). Si bien los fusarios son tradicionalmente considerados hongos de campo, no se debe olvidar su capacidad para sintetizar toxinas en cereales almacenados, sobre todo en malas condiciones de almacenamiento cuando los granos no son suficientemente desecados después de la cosecha y cuando se producen abusos de temperatura. No en vano, Fusarium verticillioides es de los fusarios más xerófilos, capaz de sintetizar fumonisinas con valores de actividad de agua (aw) de 0.93 (Marin et al., 2004). Algunos mohos del género Fusarium sintetizan diversos tipos de micotoxinas como fumonisinas (ej. fumonisina FB1, FB2, FB3), tricotecenos (ej. deoxinivalenol, toxina T-2, toxina HT-2) y zearalenona. Además de estas toxinas, Fusarium puede sintetizar de manera esporádica otras micotoxinas como moniliformina, beauvericina y fusaproliferina. En la tabla 1 se muestran las especies de Fusarium productoras de micotoxinas más importantes desde el punto de vista agroalimentario, así como su forma teleomórfica o sexual, los principales cultivos afectados y su ubicación geográfica. El crecimiento fúngico y la producción de micotoxinas por parte de mohos micotoxigénicos depende de la interacción de varios factores, como los biológicos, medioambientales y los relacionados con la cosecha, almacenamiento y procesado de los cereales. El conocimiento de estos factores es muy importante para la predicción y el control de la entrada de micotoxinas en la cadena alimentaria. Uno de los factores más influyentes son las condiciones climáticas. Los climas cálidos con mucha humedad ambiental, así como las precipitaciones abundantes antes de la cosecha, favorecen la proliferación de los mohos y posterior biosíntesis de micotoxinas. Entre los factores biológicos se encuentra el daño producido por insectos. Los insectos provocan el deterioro de los granos de cereal en el campo o durante el almacenamiento, debido a que dañan la estructura externa del grano y facilitan la entrada e invasión de mohos micotoxigénicos. En Europa una de las plagas más 12 Toxicidad El Deoxinivalenol es clasificado en el grupo 3 por la IARC ya que no puede ser clasificado como carcinógeno en humanos y las evidencias para la carcinogenicidad en animales de experimentación son limitadas (IARC, 1993). Los cerdos son los animales más habitualmente afectados por esta toxina, la ingesta de granos contaminados puede producir toxicidad aguda con cuadros de vómitos, rechazo de alimento, pérdida de peso y diarrea. Los niveles superiores a 1 mg/g pueden considerarse potencialmente perjudiciales para estos animales (Richard, 1998). DON es inmunosupresor y puede causar problemas en los riñones de los animales (Pestka y Bondy, 1994). En los seres humanos se cree que exhiben un síndrome de vómito similar a los cerdos cuando consumen cereales contaminados con DON (Richard, 2007). 2.1.3.2 TOXINAS T-2 – HT-2 Las toxinas T-2 y HT-2 son tricotecenos de tipo A producidos por diferentes especies de Fusarium como F. sporotrichioides, F. langsethiae y F. poae (Bottalico, 1998; Torp y Alder, 2004; Torp y Nirenberg, 2004). Estos hongos comúnmente colonizan los granos y pueden crecer a temperaturas de refrigeración, mientras que las toxinas T2 y HT2 generalmente se producen en un rango de temperatura entre 7-25 ºC. Estas micotoxinas pueden sintetizarse a mayores temperaturas, pero lo que sucede en la naturaleza es que a bajas temperaturas no compiten con hongos de otros géneros (Soriano et al., 2007). Los principales productos contaminados por toxinas T-2 y HT-2 son los cereales como cebada, centeno, avena, trigo, maíz y arroz. Así también se han encontrado en algunos productos preparados con estos cereales, como pan, pastas alimenticias, cereales para el desayuno, y alimentos para bebés y niños. 13 2.2. ÁCIDOS FENÓLICOS Los ácidos fenólicos son sustancias de origen vegetal, producto del metabolismo secundario de las plantas que pertenecen a un grupo muy amplio de compuestos fenólicos que incluyen más de 8000 compuestos, que constan de un anillo aromático de benceno con uno o más grupos hidroxilo. Estos compuestos fenólicos se encuentran ampliamente distribuidos en las plantas. Casi todas las frutas, vegetales frescos y granos de cereales contienen cantidades apreciables de fenoles naturales, aunque estos varían considerablemente entre los distintos tejidos y células vegetales (Dai et al., 1995). El maíz es el cereal que más fenoles totales contiene, en comparación con otros cereales como trigo, arroz o avena (Adorn y Liu, 2002), siendo el ácido ferúlico el más abundante, representando alrededor del 85% de los fenoles totales (De la Parra et al., 2007). Estos compuestos fenólicos se encuentran principalmente en el pericarpio, aleurona, endospermo y embrión (Fossen et al., 2001; Pascal et al., 2002; Jing y Giusti, 2005). Los ácidos fenólicos representan la forma más común de los compuestos fenólicos que se encuentran en los granos enteros y que constituyen uno de los grupos más complejos de fitoquímicos presentes en el grano de cereal (Piironen et al., 2008). Los ácidos fenólicos pueden ser divididos en 2 grupos, los derivados del ácido hidroxibenzoico que incluyen los ácidos p-hidroxibenzoico, protocatecuico, vaníllico, gálico, siríngico y elágico, y los derivados del ácido hidroxicinámico entre los que se encuentran los ácidos clorogénico, p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico. Estos ácidos se encuentran principalmente unidos a diferentes componentes de la pared celular como celulosa, lignina y proteínas. Los ácidos fenólicos más abundantes en el grano entero son el ácido ferúlico, p-cumárico, vaníllico y siríngico (Sosulski, et al., 1982). La importancia actual de los ácidos fenólicos, es debido al interés que despiertan por sus beneficios potenciales para la salud en determinadas patologías, por su actividad antioxidante y por su acción antimicrobiana. Este último efecto ha sido demostrado por diversos autores atribuyendo a los ácidos fenólicos una actividad antimicrobiana importante frente a bacterias y mohos. Además los ácidos fenólicos presentan efectos en la inhibición de la producción de varias micotoxinas como aflatoxinas y tricotecenos (Norton, 1999; Bakan et al., 2003; Atasanova-Penichon et al., 2008; Boutigny et al., 2009-2010). Así también Samapundo et al. (2007) demostraron que, los ácidos 14 Z. Zhao, M.H. Moghadasian / Food Chemistry 109 (2008) 691–702 fenólicos cafeico y vaníllico son capaces de retrasar o inhibir el crecimiento de cepas de Fusarium verticilliodes y Fusarium proliferatum en medios de cultivo cuando se usaron concentraciones de ≥ 2000 µg/g y con un valor de actividad de agua (aw) ≤ 0,948. El ácido ferúlico es el más abundante en maíz, y es un derivado del ácido transcinámico, producto de la biosíntesis de la fenilalanina y tirosina en las plantas y uno de los componentes de la lignina, se encuentra en los tejidos de las plantas en dos formas: libre y ligada y se concentra principalmente en la pared celular de los cereales, la piel de las frutas y las raíces de las verduras, donde se esterifica principalmente con arabinosa formando enlaces cruzados por puentes éter (Saulnier et al. 2007). Se han encontrado concentraciones de ácido ferúlico en diferentes productos vegetales que van desde 1,2-6,2 µg/g de materia seca para las fracciones de ácido ferúlico libre y de 163-721 µg/g en materia seca para la fracción ligada, siendo estas concentraciones más altas en cereales que en otros vegetales (Zhao et al., 2008). Además el ácido ferúlico es precursor de la síntesis de otros compuestos fenólicos de la planta. (Figura 2). . Figura 2. Estructura química y síntesis del ácido ferúlico y sus compuestos relacionados en las plantas. 15 2.3. MÉTODOS DE ANÁLISIS DE MICOTOXINAS Existen varios organismos internacionales que elaboran y publican métodos de análisis de micotoxinas en alimentos, como AOAC (Association of Official Analytical Chemists), CEN (Comité Europeo de Normalización) o ISO (Organización Internacional de Normalización). En España, la Asociación Española de Normalización y Certificación (AENOR) adopta y convierte las normas ISO y CEN en normas españolas (UNE). En la actualidad están vigentes varias normas de análisis de toxinas de Fusarium en alimentos:  UNE-EN 13585: 2002 - Determinación de fumonisinas B1 y B2 en maíz. Método por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con lavado por extracción en fase sólida.  UNE-EN 14352: 2005 - Determinación de fumonisinas B1 y B2 en productos a base de maíz. Método por HPLC con purificación en columna de inmunoafinidad.  UNE-EN 15850: 2010 - Determinación de zearalenona en harina de cebada, de maíz y de trigo, polenta y alimentos a base de cereales para bebés y niños. Método por HPLC con purificación en columna de inmunoafinidad y detección por fluorescencia.  UNE-EN 15891: 2011 - Determinación de deoxinivalenol en cereales, productos a base de cereales y en alimentos a base de cereales para bebés y niños. Método por HPLC con purificación en columna de inmunoafinidad y detección por UV. 16 De forma general el análisis de micotoxinas consta de las siguientes etapas: La toma de muestras tiene un papel fundamental en la precisión de la determinación del contenido de micotoxinas, que están distribuidas muy heterogéneamente en los lotes, por ello en el año 2006 se publicó el Reglamento (CE) 401/2006 de la Comisión, por el que se establecen los métodos de muestreo y de análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios. El método de extracción usado para separar la micotoxina de la matriz biológica depende de las propiedades físico-químicas de la toxina. Los analitos con cierta polaridad, tales como las fumonisinas, deoxinivalenol y zearalenona, suelen requerir la presencia de disolventes acuosos tales como metanol-agua o acetonitrilo-agua (Turner et al., 2009) El procedimiento de purificación (clean-up) es uno de los pasos más importantes, ya que la pureza de los extractos afecta a la sensibilidad de los resultados, puesto que cantidades traza de una molécula diana pueden ser enmascaradas por componentes interferentes presentes no sólo en la matriz sino también en los materiales y solventes utilizados en la técnica (Turner et al., 2009). Después de la extracción y purificación de la muestra se realiza la determinación de las micotoxinas, en la que podemos diferenciar entre las técnicas instrumentales, y técnicas de cribado o screening (que pueden ser utilizadas sin purificación previa). 17 Técnicas Instrumentales: Entre las más importantes tenemos: la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) que es un método exacto y preciso que ha sido aceptado como método oficial (AOAC International 994.08) y como método de referencia para algunas micotoxinas. Otros métodos de referencia son la Cromatografía de Gases (GC), que se utiliza para el análisis de tricotecenos y la Cromatografía de Capa Fina (TLC). Para la confirmación de los resultados se suele utilizar la cromatografía asociada a un espectrómetro de masas (GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS) (Muscarella, et al. 2008). Técnicas de cribado o screening: En los últimos años se han desarrollado métodos inmunoquímicos para facilitar el análisis. La ventaja de estos métodos es que son rápidos, simples y de bajos requerimientos instrumentales. Por consiguiente, en el caso de un gran número de análisis a realizar, los métodos inmunoquímicos representan una buena alternativa. Sin embargo, en algunos casos pueden presentarse interferencias que dan lugar a falsos positivos, por ello es aconsejable reconfirmar los resultados por técnicas instrumentales más robustas como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o la cromatografía líquida o de gases acoplada a un espectrómetro de masas (LC-MS o GC-MS). Entre las técnicas de cribado más importantes tenemos las técnicas de ELISA y las de Inmunoensayo de flujo lateral. Técnicas de flujo Lateral: Es un tipo de test usado para el análisis de micotoxinas y otras sustancias químicas, que permite el flujo de la muestra por capilaridad a lo largo de una membrana de nitrocelulosa. Esta técnica de inmunoensayo, puede ser cualitativa en la que se establece un valor límite de corte, o cuantitativa cuando se trabaja con un lector de bandas fotométricas. Las tiras reactivas para las micotoxinas están basadas en un formato de inmunoensayo competitivo en el que se utiliza un anticuerpo marcado para producir la señal analítica. Cuando la muestra es introducida en la tira va migrando a la membrana de nitrocelulosa, que tiene una zona de ensayo y una zona control. Si la muestra tiene micotoxinas en la zona de ensayo se formará una banda coloreada que puede ser medida con un lector de reflectancia fotométrica, que dará un resultado según la intensidad del color. En la zona control hay presentes anticuerpos específicos, por tanto, siempre será visible independientemente de la presencia del analito objeto en la muestra, lo que confirma que el desarrollo de la prueba ha sido correcto. 18 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. ESTUDIO DE LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE ESPECIES TOXIGÉNICAS DE FUSARIUM POR ADICIÓN DE ÁCIDOS FENÓLICOS. Se realizó por siembra de las cepas de Fusarium en medio sólido de Agar Corn Meal, el cual estaba enriquecido con ácidos fenólicos (cafeico, clorogénico, ferúlico y p-cumárico) a diferentes concentraciones, así como el correspondiente control sin enriquecer. Obtención de las cepas de referencia.- Las cepas de Fusarium utilizadas en este estudio se obtuvieron de la colección Española de cultivos tipo (CECT) y del Centralbureau voor Schimmelcultures de la colección Holandesa (CBS). En la tabla 4 se especifican las cepas utilizadas, la especie a la que pertenecen y su país de procedencia. Cepa Especie País CECT 2987 F. verticillioides España CECT 2150 F. graminearuma España CECT 20166 F. sporotrichioides España CBS 110261 F. graminearum Holanda CBS 119837 F. proliferatum Holanda CBS 113234 F. langsethiae Holanda a Cepa en estado teleomórfico (Gibberella zeae). Ácidos fenólicos.- Los ácidos fenólicos utilizados para este estudio (cafeico, clorogénico, ferúlico y p-cumárico) fueron suministrados por Sigma-Aldrich Chemie. Tabla 5. Tabla 4. Cepas del género Fusarium utilizadas, indicando la especie y país de procedencia. 19 Ácido fenólico Fórmula Empírica Grado de Pureza Peso molecular (gramos/mol) Ácido cafeico C9H8O4 ≥ 98 % 180,16 Ácido clorogénico C16H18O9 ≥ 95 % 354,31 Ácido ferúlico C10H10O4 99 % 194,18 Ácido p-cumárico C9H8O3 ≥ 98 % 164,16 Preparación del inoculo de las cepas de Fusarium. Las cepas de referencia de Fusarium que se encontraban liofilizadas, fueron almacenadas en congelación a -80 ºC en crioviales hasta su uso. Para su revivificación fueron llevadas con asa estéril a tubos de ensayo que contenían 9 ml caldo Sabouraud estéril, e incubadas durante 4 días a una temperatura aproximada de 25 ºC, para dar las condiciones óptimas de crecimiento, lo que se confirmó por la presencia de turbidez en todos los tubos. Las cepas revivificadas fueron cultivadas en agar patata dextrosa (PDA) el cual está compuesto por (g/litro de agua destilada): polvo de patata (300 g), glucosa (20 g), agar (20 g). El medio se agitó y se llevó a ebullición hasta obtener una suspensión homogénea que se esterilizó en autoclave durante 20 minutos. Posteriormente se vertió entre 18-20 ml de agar en placas de Petri y una vez solidificadas se realizó la siembra de las cepas de Fusarium al centro de la placa, que se incubaron a una temperatura aproximada de 25 ºC durante 7 días. Preparación de las soluciones madre de ácidos fenólicos. Se prepararon soluciones madre de los ácidos fenólicos a estudiar (cafeico, clorogénico, ferúlico y p-cumárico) a concentraciones de 202,5 mM en etanol-agua. En la tabla 6 se muestra a modo resumen la preparación de las soluciones madre de ácidos fenólicos. Tabla 5. Ácidos fenólicos utilizados en el estudio, indicando: su fórmula empírica, grado de pureza y peso molecular. 20 Ácido fenólico Pm (g/mol) Peso (g) Vol. etanol (ml) Vol. agua dest. (ml) Vol. total(ml) % etanol [mM] [mg/L] Cafeico 180,16 1,824 40 10 50 80 202,5 36482,4 Clorogénico 354,31 3,587 5 45 50 10 202,5 71747,77 Ferúlico 194,18 1,966 25 25 50 50 202,5 39321,45 p-Cumárico 164,16 1,662 25 25 50 50 202,5 33242,4 Pm: peso molecular. [mM]:milimolar. [mg/L] o ppm, partes por millón. Debido al grado de solubilidad que presentan los ácidos fenólicos se utilizaron diferentes proporciones de etanol:agua para su disolución. Las soluciones madre de ácidos fenólicos fueron almacenadas en congelación (-20 ºC) hasta su uso. Las concentraciones de ácidos fenólicos utilizadas en el estudio para cada cepa de Fusarium, se muestran en la tabla 7. a En su forma sexual (Gibberella zeae) Preparación del medio con ácidos fenólicos e inoculación de las cepas Fusarium. El medio de cultivo utilizado para el estudio de la inhibición del crecimiento de Fusarium spp fue el agar corn meal, que se preparó según las condiciones del fabricante. Una vez que el agar es llevado a ebullición se transfieren volúmenes de 20 ml a botes de vidrio, que son esterilizados en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. Se deja enfriar hasta una temperatura aproximada de 45 ºC y se adicionan Ác.Fenólicos Cepas Cafeico Clorogénico Ferúlico p-cumárico F. verticillioides 0,5 - 1 - 2,5 - 3 - 3,5 - 4 - 5 - 7 y 10 mM F. graminearum F. sporotrichioides F. graminearuma F. proliferatum F. langsethiae Tabla 7. Cepas de Fusarium y concentraciones de ácidos fenólicos utilizados en el estudio. Tabla 6. Resumen de preparación de soluciones madre de ácidos fenólicos. 21 los ácidos fenólicos según la concentración deseada, homogeneizando con un movimiento suave de muñeca. Luego esta mezcla agar/ácido fenólico se vierte en placas de Petri. Asimismo, se prepararon placas control sin adición de ácidos fenólicos. Las placas se dejan enfriar y cuando el medio está completamente solidificado se lleva a cabo la siembra de las cepas de Fusarium, del margen de un cultivo de 7 días en agar PDA. Una vez realizada la siembra se incuban a 25 ºC durante 7 días. Evaluación de los resultados.- Para saber el efecto que tuvieron los ácidos fenólicos sobre el crecimiento de las cepas de Fusarium, se realizaron mediciones de los diámetros de las colonias con regla graduada en dos direcciones perpendiculares en intervalos regulares de tiempo, durante 7 días, y que fueron comparadas con las cepas control (agar sin adición de ácidos fenólicos) para poder estimar el porcentaje de inhibición del crecimiento. 3.2 ESTUDIO DE LA INHIBICIÓN DE LA BIOSÍNTESIS DE MICOTOXINAS DE FUSARIUM POR ADICIÓN DE ÁCIDOS FENÓLICOS. El estudio de la inhibición de la biosíntesis de micotoxinas de Fusarium se realizó sobre un lote de maíz que fue contaminado in vitro por la adición de una suspensión de esporos de Fusarium spp. Cepas de referencia.- En este ensayo se utilizaron las mismas cepas de Fusarium que en el estudio anterior (tabla 8) excluyendo las cepas de F. sporotrichioides y F. langsethiae productoras de toxinas T-2 y HT-2, que se dejan para un estudio posterior. 28 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 RESULTADOS. 4.1.1. ESTUDIO SOBRE EL CRECIMIENTO DE FUSARIUM SPP. POR ADICIÓN DE ÁCIDOS FENÓLICOS. Para el estudio de la inhibición del crecimiento de las cepas de Fusarium se evaluaron dos parámetros: el porcentaje de crecimiento o inhibición y la tasa de crecimiento. Para el cálculo de los porcentajes de inhibición sobre el crecimiento se utilizaron los datos de crecimiento del séptimo día, con respecto a su control. Los resultados demuestran que a medida que aumentan las concentraciones de ácidos fenólicos el porcentaje de inhibición también aumenta de manera significativa, siendo este efecto mayor para los ácidos: ferúlico y p-cumárico. En la figura 3 se muestran los porcentajes de inhibición de las cepas Fusarium para cada ácido fenólico. La tasa de crecimiento de las colonias fue determinada como la pendiente de la curva de los datos recogidos durante los siete días de crecimiento. Los resultados obtenidos indican que a medida que la concentración de ácidos fenólicos es mayor, la tasa de velocidad de crecimiento diario disminuye. En la figura 4 se observa las tasas de crecimiento diario para cada cepa de Fusarium para cada concentración de ácido fenólico. De forma general los resultados muestran que las distintas cepas de Fusarium ensayadas se comportan de manera similar en lo atinente a la disminución del crecimiento frente a todos los ácidos fenólicos estudiados. ANÁLISIS ESTÁDISTICO.- Para el análisis estadístico de la inhibición del crecimiento de las cepas de Fusarium, se ha utilizado el programa Microsoft Excel (Microsoft Corporation). En el cual se ha realizado un análisis de correlación para establecer la medida de la intensidad de la relación que existe entre el porcentaje de inhibición del crecimiento al séptimo día y las concentraciones de ácidos fenólicos estudiadas. En el anexo 1 se muestra una tabla con el análisis de correlación realizado para cada una de las cepas de Fusarium así como para cada concentración de ácidos fenólicos estudiada. 29 Figura 3. Efecto de las concentraciones de ácidos fenólicos en el crecimiento de Fusarium spp. en agar corn meal. 30 Figura 3. Efecto de las concentraciones de ácidos fenólicos en el crecimiento de Fusarium spp. en agar corn meal. 31 Figura 4. Efecto de las concentraciones de ácidos fenólicos sobre la tasa de velocidad de crecimiento diario de las cepas de Fusarium, en agar corn meal. 32 Figura 4. Efecto de las concentraciones de ácidos fenólicos sobre la tasa de velocidad de crecimiento diario de las cepas de Fusarium, en agar corn meal. 33 4.1.2. ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE MICOTOXINAS DE FUSARIUM SPP. POR ADICIÓN DE ÁCIDOS FENÓLICOS. Los resultados de la producción de micotoxinas obtenidos mediante el test de cribado ROSA de flujo lateral, indican que de forma general no existen diferencias significativas entre el control y los tratamientos con ácidos fenólicos a concentraciones inhibitorias, por lo que a pesar del efecto reductor sobre el crecimiento fúngico, los ácidos fenólicos no parecen afectar a la biosíntesis de micotoxinas en las condiciones ensayadas, con algunas excepciones. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.- Para el análisis estadístico de la producción de micotoxinas de las cepas de Fusarium en maíz, se realizó un ANOVA de un factor (Analysis of Variance, en inglés) seguido de un test de comparación múltiple de Tukey (p < 0,05) para determinar si existen diferencias significativas entre el control y los tratamientos y entre estos últimos. El análisis estadístico fue realizado por “SPSS Statistics software version 20” (IBM Corporation). En el anexo 2 se muestran los resultados del análisis estadístico realizado para este ensayo (solo se muestran los resultados estadísticamente significativos). A continuación se muestran los resultados obtenidos por el test de flujo lateral (ROSA) con su interpretación para cada cepa de Fusarium, a cada concentración de ácido fenólico ensayado. F. proliferatum: Se determinó la producción de fumonisinas totales, observando que los resultados obtenidos tanto para el control como para los ácidos fenólicos ensayados son muy variados, sin embargo no se encontraron diferencias significativas con respecto a su control y entre los tratamientos. Con lo que se puede decir que a estas concentraciones de ácidos fenólicos no se aprecia ningún efecto en cuanto a la inhibición de la síntesis de fumonisinas (Tabla 11). 34 Fumonisinas(µg/g) CEPA MUESTRA R1 R2 MEDIA SD F.proliferatum Control 580 620 600 28,28 Ácido Cafeico [7 mM] 440 520 480 56,57 Ácido Cafeico [10 mM] 940 720 830 155,56 Ácido Clorogénico [5mM] 780 400 590 268,70 Ácido Clorogénico [7mM] 580 240 410 240,41 Ácido Ferúlico [5mM] 440 460 450 14,14 Ácido Ferúlico [7mM] 620 420 520 141,42 Ácido p-Cumárico [5mM] 1080 680 880 282,84 Ácido p-Cumárico [7mM] 700 700 700 0 R1: Réplica uno; R2: Réplica dos; SD: Desviación estándar; mM: Milimoles. F. verticillioides: Al igual que para Fusarium proliferatum se determinó la producción de fumonisinas totales. No se encontraron diferencias significativas con el control y entre los tratamientos. Excepto para el ácido p-cumárico a [10 mM] en el que se observa una disminución significativa en la producción de fumonisinas del 69,28 % con respecto a su control (tabla 12). Fumonisinas(µg/g) CEPA MUESTRA R1 R2 MEDIA SD F. verticillioides CONTROL 1180 1750 1465 403,05 Ácido Caféico [7 mM] 1500 1350 1425 106,06 Ácido Caféico [10 mM] 1350 1350 1350 0 Ácido Clorogénico [5mM] 600 650 625 35,35 Ácido Clorogénico [7mM] 800 800 800 0 Ácido Ferúlico [5mM] 800 1150 975 247,48 Ácido Ferúlico [7mM] 1600 1350 1475 176,77 Ácido p-Cumárico [7mM] 1250 1100 1175 106,06 Ácido p-Cumárico [10mM] 450 450 450* 0 R1: Réplica uno; R2: Réplica dos; SD: Desviación estándar. *Media con diferencia significativa respecto al control, con test de comparación múltiple de Tukey (p < 0,05). Tabla 11. Producción de fumonisinas por F. proliferatum en granos de maíz a 25 °C durante 28 días. Tabla 12. Producción de fumonisinas por F. verticillioides en granos de maíz a 25 °C durante 28 días 35 Gibberella zeae: Se determinó la producción de deoxinivalenol y zearalenona (tabla 13). En el análisis de DON en ninguno de los casos se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos y el control. En el caso de ZEA sí se encontraron diferencias significativas, produciendo un porcentaje de inhibición entre el control y los siguientes ácidos fenólicos: Ácido clorogénico [5 mM]  61,68 % Ácido ferúlico [1 mM]  79,21 % Ácido ferúlico [2,5 mM]  77,64 % Ácido p-cumárico [2,5 mM]  34,92 % Ácido p-cumárico [3,5 mM]  47,74 % F.graminearum: Se llevó a cabo la determinación de deoxinivalenol y zearalenona. En este caso los resultados no muestran una inhibición en la producción de las micotoxinas sino que se observa un efecto potenciador en su producción, siendo significativa solo para ciertos ácidos fenólicos (tabla 14). No obstante, hay que destacar que la capacidad micotoxigénica de esta cepa de F. graminearum es mucho menor que la de la cepa anterior de G. zeae. Por ejemplo, el ensayo control de G. zeae produjo 110 µg/g de deoxinivalenol, frente a únicamente 5,75 µg/g en su anamorfo F. graminearum. Asimismo, la tasa control de zearalenona fue de 15,92 y 1,11 µg/g, respectivamente. 36 Deoxinivalenol(µg/g) Zearalenona(µg/g) CEPA MUESTRA R1 R2 MEDIA SD R1 R2 MEDIA SD G. zeaea CONTROL 140 80 110 42,4264069 16,42 15,42 15,92 0,70 Ácido Caféico [4mM] 120 80 100 28,2842712 17,96 14,46 16,21 2,47 Ácido Caféico [5mM] 80 80 80 0 18,2 12,9 15,55 3,74 Ácido Clorogénico [5mM] 180 160 170 14,1421356 5,38 6,82 6,1* 1,0 Ácido Clorogénico [7mM] 160 200 180 28,2842712 10,24 13,82 12,03 2,53 Ácido Ferúlico [1mM] 80 80 80 0 3,02 3,6 3,31* 0,41 Ácido Ferúlico [2,5mM] 60 60 60 0 4,04 3,08 3,56* 0,67 Ácido p-Cumárico [2,5mM] 200 180 190 14,1421356 11,68 9,04 10,36* 1,86 Ácido p-Cumárico [3,5mM] 120 100 110 14,1421356 8,04 8,6 8,32* 0,39 R1: Réplica uno; R2: Réplica dos; SD: Desviación estándar. Deoxinivalenol(µg/g) Zearalenona(µg/g) CEPA MUESTRA R1 R2 MEDIA SD R1 R2 MEDIA SD F. graminearum CONTROL 5,8 5,7 5,75 0,07071068 1,23 0,98 1,11 0,17 Ácido Caféico [7mM] 5,5 5,7 5,6 0,14142136 2,45 1,34 1,90 0,78 Ácido Caféico [10mM] 14 12 13* 1,41421356 6,98 7,12 7,05* 0,09 Ácido Clorogénico [7mM] 12 17 14,5 3,53553391 8,56 6,54 7,55* 1,43 Ácido Clorogénico [10mM] 14 16 15* 1,41421356 1,12 0,56 0,84 0,40 Ácido Ferúlico [2,5mM] 12 15 13,5* 2,12132034 12,56 14,23 13,40* 1,18 Ácido Ferúlico [3mM] 9 8 8,5 0,70710678 4,58 2,94 3,76 1,16 Ácido p-Cumárico [4mM] 16 15 15,5* 0,70710678 3,12 4,89 4,01 1,25 Ácido p-Cumárico [5mM] 6 5 5,5 0,70710678 1,80 3,42 2,61 1,15 Tabla 13. Producción de deoxinivalenol y zearalenona por G. zeaea en granos de maíz a 25 °C durante 28 días. Tabla 14. Producción de deoxinivalenol y zearalenona por F. graminearum en granos de maíz a 25 °C durante 28 días. a Cepa en estado teleomórfico (Gibberella zeae), cuyo anamorfo es F. graminearum *Media con diferencia significativa, con test de comparación múltiple de Tukey ( p < 0,05). R1: Réplica uno; R2: Réplica dos; SD: Desviación estándar. *Media con diferencia significativa, con test de comparación múltiple de Tukey ( p < 0,05). 37 4.2. DISCUSIÓN 4.2.1. DISCUSIÓN SOBRE LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE FUSARIUM POR ADICIÓN DE ÁCIDOS FENÓLICOS. El presente estudio pone de manifiesto que los cuatro ácidos fenólicos estudiados (cafeico, clorogénico, ferúlico y p-cumárico) han conseguido inhibir significativamente el crecimiento de las cepas de Fusarium ensayadas (F. verticillioides, F. graminearum, F. sporotrichioides, F. proliferatum y F. langsethiae) sobre agar corn-meal. Este efecto es mayor para el ácido ferúlico y p-cumárico que consiguieron inhibir el 100 % de prácticamente todas las cepas, mientras que los ácidos cafeico y clorogénico muestran un menor grado de inhibición. En cuanto a las cepas de Fusarium fue F. graminearum la más sensible, produciéndose inhibiciones del 100 % a concentraciones por debajo de [3 mM] para los ácidos ferúlico y p-cumárico, y por debajo de [5 mM] para el ácido cafeico. Estudios similares han demostrado el efecto inhibitorio de ciertos ácidos fenólicos sobre el crecimiento de varios mohos. Como es el caso de (Nesci, et al., 2009) que demostraron que el ácido trans-cinámico y el ácido ferúlico a concentraciones de 10-20 mM son capaces de inhibir de forma significativa el crecimiento de Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus en medios de Czapek Dox (CD) y en agar corn meal extract (MMEA). Así también (Torres, et al., 2003) demostraron que los antioxidantes hidroxibutilanisol (BHA) y propil parabeno (PP) a concentraciones de 500 µg/g y a una aw de 0,95 son capaces de inhibir significativamente el crecimiento de las cepas de Fusarium verticillioides y Fusarium proliferatum. 44 Pascal T., Santos B.C., Rivas G.J.C. (2002). LCMS analysis of anthocyanins from purple corn cob. J. Sci. Food. Agric. 82: 1003-1006. Pestka J.J., Bondy G.S. (1994). Inmunotoxic effects of mycotoxins. In: Miller J.D., Trenholm H.L., (Eds), Mycotoxins in Grain-Compounds other than Aflatoxin. Eagan Press, St. Paul 339-358. Piironen V., Lampi A.M., Ekholm P., Salmenkallio-Marttila M., Liukkonen K.H. (2008). Micronutrients and phytochemicals in wheat grain In Wheat: Chemestry and Technology, 4th ed.; Khan K., Shewry P.R., Eds.; AACC: St. Paul, MN. Reglamento (CE) nº 1126/2007 de la Comisión, de 28 de septiembre de 2007 que modifica el Reglamento (CE) nº 1881/2006 por el que se fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios por lo que se refiere a las toxinas de Fusarium en el maíz y los productos del maíz. DO L 225: 14-17. Richard J.L. (2007). Some major mycotoxins and their mycotoxicoses – an overview. International Journal of food Microbiology 119: 3-10. Richard J.L. (2000). Mycotoxins - an overview. In: Richard J.L. (Ed.), Romer Labs`guide to Mycotoxins, 1: 1-48. Richard J.L. (1998) Mycotoxins, toxicity and metabolism in animals – a system approach overview. In Miraglia M., van Egmond H.P., Brera C., Gilbert J. (Eds). Mycotoxins and Phycotoxins-Developments in Chemestry, Toxicology and Food Safety. Alaken, Inc., Fort Collins 363-397. Ruiz N., Sánchez F., Hernández V., Figueroa D., Loarca G. (2008). Determinación de Compuestos Fenólicos y su Actividad Antioxidante en Granos de Maíz. 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ANEXOS ANEXO 1 Tabla con los cálculos de Correlación de los resultados del estudio de la inhibición del crecimiento de Fusarium spp. Cepa Ácido fenólico Coeficiente de correlación Coeficiente de Determinación(R^2) p-valor F. proliferatum Ácido Cafeico -0,984 0,968 < 0,001 Ácido Clorogénico -0,851 0,724 < 0,001 Ácido Ferúlico -0,958 0,917 < 0,001 Ácido p-cumárico -0,965 0,931 < 0,001 F. verticillioides Ácido Cafeico -0,977 0,954 < 0,001 Ácido Clorogénico -0,869 0,756 < 0,001 Ácido Ferúlico -0,919 0,845 < 0,001 Ácido p-cumárico -0,907 0,823 < 0,001 F. graminearum Ácido Cafeico -0,961 0,923 < 0,001 Ácido Clorogénico -0,931 0,867 < 0,001 Ácido Ferúlico -0,885 0,783 < 0,001 Ácido p-cumárico -0,948 0,899 < 0,001 Gibberella zeae Ácido Cafeico -0,828 0,685 0,00311663 Ácido Clorogénico -0,945 0,894 < 0,001 Ácido Ferúlico -0,927 0,859 0,00266052 Ácido p-cumárico -0,880 0,775 0,00891095 F. langsethiae Ácido Cafeico -0,965 0,930 < 0,001 Ácido Clorogénico -0,899 0,809 < 0,001 Ácido Ferúlico -0,970 0,940 < 0,001 Ácido p-cumárico -0,933 0,871 < 0,001 F. sporotrichioides Ácido Cafeico -0,955 0,911 < 0,001 Ácido Clorogénico -0,941 0,886 < 0,001 Ácido Ferúlico -0,917 0,841 < 0,001 Ácido p-cumárico -0,949 0,900 < 0,001 ANEXO 2 Test de Tukey de Comparaciones múltiples. Fusarium verticillioides / Fumonisinas. Ácido p-cumárico. (I) Concentración [mM] (J) Concentración [mM] Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0,00 7,00 1015,00000* 240,62419 ,049 9,4994 2020,5006 10,00 290,00000 240,62419 ,527 -715,5006 1295,5006 7,00 0,00 -1015,00000* 240,62419 ,049 -2020,5006 -9,4994 10,00 -725,00000 240,62419 ,112 -1730,5006 280,5006 10,00 0,00 -290,00000 240,62419 ,527 -1295,5006 715,5006 7,00 725,00000 240,62419 ,112 -280,5006 1730,5006 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05. Gibberella zeae / Zearalenona. Ácido clorogénico. (I) Concentración [mM] (J) Concentración [mM] Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0,00 5,00 9,82000* 1,62737 ,019 3,0197 16,6203 7,00 3,89000 1,62737 ,184 -2,9103 10,6903 5,00 0,00 -9,82000* 1,62737 ,019 -16,6203 -3,0197 7,00 -5,93000 1,62737 ,071 -12,7303 ,8703 7,00 0,00 -3,89000 1,62737 ,184 -10,6903 2,9103 5,00 5,93000 1,62737 ,071 -,8703 12,7303 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05. Gibberella zeae / Zearalenona. Ácido ferúlico (I) Concentración [mM] (J) Concentración [mM] Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0,00 1,00 12,61000* ,61346 ,001 10,0465 15,1735 2,50 12,36000* ,61346 ,001 9,7965 14,9235 1,00 0,00 -12,61000* ,61346 ,001 -15,1735 -10,0465 2,50 -,25000 ,61346 ,915 -2,8135 2,3135 2,50 0,00 -12,36000* ,61346 ,001 -14,9235 -9,7965 1,00 ,25000 ,61346 ,915 -2,3135 2,8135 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05. Gibberella zeae / Zearalenona. Ácido p-cumárico (I) Concentración [mM] (J) Concentración [mM] Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0,00 2,50 5,56000* 1,17496 ,036 ,6502 10,4698 3,50 7,60000* 1,17496 ,015 2,6902 12,5098 2,50 0,00 -5,56000* 1,17496 ,036 -10,4698 -,6502 3,50 2,04000 1,17496 ,328 -2,8698 6,9498 3,50 0,00 -7,60000* 1,17496 ,015 -12,5098 -2,6902 2,50 -2,04000 1,17496 ,328 -6,9498 2,8698 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05. Fusarium graminearum / Deoxinivalenol Ácido cafeico (I) Concentración [mM] (J) Concentración [mM] Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0,00 7,00 ,15000 ,82158 ,982 -3,2832 3,5832 10,00 -7,25000* ,82158 ,006 -10,6832 -3,8168 7,00 0,00 -,15000 ,82158 ,982 -3,5832 3,2832 10,00 -7,40000* ,82158 ,006 -10,8332 -3,9668 10,00 0,00 7,25000* ,82158 ,006 3,8168 10,6832 7,00 7,40000* ,82158 ,006 3,9668 10,8332 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05. Fusarium graminearum / Deoxinivalenol Ácido clorogénico (I) Concentración [mM] (J) Concentración [mM] Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0,00 7,00 -8,75000 2,19886 ,057 -17,9384 ,4384 10,00 -9,25000* 2,19886 ,049 -18,4384 -,0616 7,00 0,00 8,75000 2,19886 ,057 -,4384 17,9384 10,00 -,50000 2,19886 ,972 -9,6884 8,6884 10,00 0,00 9,25000* 2,19886 ,049 ,0616 18,4384 7,00 ,50000 2,19886 ,972 -8,6884 9,6884 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05. Fusarium graminearum / Deoxinivalenol Ácido ferúlico (I) Concentración [mM] (J) Concentración [mM] Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0,00 2,50 -7,75000* 1,29164 ,019 -13,1474 -2,3526 3,00 -2,75000 1,29164 ,231 -8,1474 2,6474 2,50 0,00 7,75000* 1,29164 ,019 2,3526 13,1474 3,00 5,00000 1,29164 ,061 -,3974 10,3974 3,00 0,00 2,75000 1,29164 ,231 -2,6474 8,1474 2,50 -5,00000 1,29164 ,061 -10,3974 ,3974 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05. Fusarium graminearum / Deoxinivalenol Ácido p-cumárico (I) Concentración [mM] (J) Concentración [mM] Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0,00 4,00 -9,75000* ,57879 ,001 -12,1686 -7,3314 5,00 ,25000 ,57879 ,905 -2,1686 2,6686 4,00 0,00 9,75000* ,57879 ,001 7,3314 12,1686 5,00 10,00000* ,57879 ,001 7,5814 12,4186 5,00 0,00 -,25000 ,57879 ,905 -2,6686 2,1686 4,00 -10,00000* ,57879 ,001 -12,4186 -7,5814 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05. Fusarium graminearum / Zearalenona Ácido cafeico (I) Concentración [mM] (J) Concentración [mM] Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0,00 7,00 -,79000 ,46801 ,343 -2,7457 1,1657 10,00 -5,94500* ,46801 ,002 -7,9007 -3,9893 7,00 0,00 ,79000 ,46801 ,343 -1,1657 2,7457 10,00 -5,15500* ,46801 ,003 -7,1107 -3,1993 10,00 0,00 5,94500* ,46801 ,002 3,9893 7,9007 7,00 5,15500* ,46801 ,003 3,1993 7,1107 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05. Fusarium graminearum / Zearalenona Ácido clorogénico (I) Concentración [mM] (J) Concentración [mM] Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0,00 7,00 -6,44500* ,86183 ,010 -10,0463 -2,8437 10,00 ,26500 ,86183 ,950 -3,3363 3,8663 7,00 0,00 6,44500* ,86183 ,010 2,8437 10,0463 10,00 6,71000* ,86183 ,009 3,1087 10,3113 10,00 0,00 -,26500 ,86183 ,950 -3,8663 3,3363 7,00 -6,71000* ,86183 ,009 -10,3113 -3,1087 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05. Fusarium graminearum / Zearalenona Ácido ferúlico (I) Concentración [mM] (J) Concentración [mM] Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 0,00 2,50 -3,84500* ,68825 ,023 -6,7210 -,9690 3,00 -2,65500 ,68825 ,061 -5,5310 ,2210 2,50 0,00 3,84500* ,68825 ,023 ,9690 6,7210 3,00 1,19000 ,68825 ,330 -1,6860 4,0660 3,00 0,00 2,65500 ,68825 ,061 -,2210 5,5310 2,50 -1,19000 ,68825 ,330 -4,0660 1,6860 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.