Repositorio Institucional de Documentos

Puesta a punto y validación de un método de análisis de aflatoxinas en frutos secos y cereales Laura Herrero Querol Trabajo Fin de Máster Máster en Iniciación a la Investigación en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso 2011 ‐ ‐‐ ‐ 2012 Tutoras: Dra. Susana Lorán Ayala y Dra. Marta Herrera Sánchez Agradecimientos Este estudio ha sido financiado por el Gobierno de Aragón (DGA Grupo Consolidado de Investigación A01/2011) y por el MICINN (Proyecto AGL2011-26808) Índice general 1-Resumen…………………………………………………………………………………………………..……….1 2-Revisión bibliográfica…………………………………………………………………………………………2 2.1 Micotoxinas y aflatoxinas…………………………………………………………………….2 2.2-Hongos productores de aflatoxinas: factores que influyen en su desarrollo y en la producción de toxinas…………………………………….……..3 2.3-Propiedades físico-químicas de las aflatoxinas……………………………………5 2.4-Presencia de aflatoxinas en alimentos………………………………………………..6 2.5-Efectos toxicológicos de las aflatoxinas……………………………………………….8 2.6-Legislación…………………………………………………………………………………………..9 2.7- Métodos analíticos de determinación de aflatoxinas en alimentos…..10 2.7.1-Métodos instrumentales………………………………………………………12 2.7.1.1-Cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC)…..13 3-Objetivos…………………………………………………………………………………………………………..15 4-Material y métodos…………………………………………………………………………………………..16 4.1-Material, equipos y reactivos……………………………………………………………..16 4.1.1-Material……………………………………………………………………………….16 4.1.2. Equipos………………………………………………………………………………..16 4.1.3-Reactivos………………………………………………………………………………17 4.1.3.1-Preparación de reactivos………………………………………..17 4.1.3.2-Preparación y mantenimiento de patrones de calibración……………………………………………………………..18 4.1.4-Precauciones y normas de trabajo……………………………………….18 4.2-Muestreo y preparación de las muestras…………………………………………...19 4.3-Optimización y validación de un método analítico para la determinación de aflatoxinas en frutos secos y maíz………………….….…21 4.3.1-Optimización de las condiciones cromatográficas………….…...21 4.3.1.1-Tiempos de retención………………………………………..….21 4.3.1.2-Longitudes de onda de excitación y emisión………….22 4.3.1.3-Volumen de inyección……………………………………………22 4.3.1.4-Flujo de la fase móvil…………………………………………....22 4.3.1.5- Composición de la fase móvil..................................23 4.3.1.6-Temperatura del inyector………………………………….....23 4.3.2-Optimización de las etapas de extracción y purificación….....24 4.3.2.1-Extracción……………………………………………………….…….24 4.3.2.2-Purificación: elección de la columna de inmunoafinidad…………………………………………….……..…25 4.3.2.3-Purificación: elección del volumen de elución…..…..25 4.4-Método analítico para determinar aflatoxinas en frutos secos y maíz..26 4.5-Validación del método analítico………………………………………………………....27 4.5.1-Especificidad……………………………………………………………………..….27 4.5.2-Linealidad……………………………………………………………………….…….28 4.5.3-Sensibilidad…………………………………………………………………………..28 4.5.3.1-Limite de detección (LD)…………………………..……….……29 4.5.3.2-Limite de cuantificación (LC)…………………………….…….29 4.5.4-Exactitud (Recuperación)………………………………………………………29 4.5.5-Precisión…………………………………………………………………………….…30 4.5.5.1-Precisión en la inyección…………………………………..….…30 4.5.5.2-Repetibilidad del método……………………………………….31 4.5.5.3-Reproducibilidad del método ………………..………………31 4.6-Determinación de aflatoxinas en muestras de frutos secos y maíz.….…31 5-Resultados y discusión…………………………………………………………………………………….…32 5.1- Optimización y validación de un método analítico para la determinación de aflatoxinas en frutos secos y maíz………………………………………...........32 5.1.1-Optimización de las condiciones cromatográficas………………..32 5.1.1.1-Tiempos de retención………………………………………..………32 5.1.1.2- Longitudes de onda…………………………………………………..33 5.1.1.3-Volumen de inyección………………………………………..……..34 5.1.1.4-Flujo de la fase móvil………………………………………….……..35 5.1.1.5-Composición de la fase móvil……………………………..……..36 5.1.1.6-Temperatura del inyector…………………………………..……..38 5.1.2- Optimización de las etapas de extracción y purificación…….…..39 5.1.2.1- Extracción …………………………………………………………..……39 5.1.2.2- Purificación: elección de la columna de inmunoafinidad……………………………………………………....40 5.1.2.3-Purificación: Ensayo de volumen de purificación..…….40 5.2-Validación del método analítico…………………………………………………………….42 5.2.1-Especificidad……………………………………………………………………….…..42 5.2.2-Linealidad………………………………………………………………………….…….43 5.2.3-Sensibilidad…………………………………………………………………….……….45 5.2.3.1-Límite de detección……………………………………….………….45 5.2.3.2-Límite de cuantificación…………………………………………….45 5.2.3.3-Exactitud (Recuperación)…………………………………………..46 5.2.3.4-Precisión…………………………………………………………………….47 5.2.3.4.1- Precisión en la inyección…………...……………….47 5.2.3.4.2- Repetibilidad del método………….………………..48 5.2.3.4.3-Reproducibilidad del método…….…………………49 5.3-Determinación de aflatoxinas en muestras de frutos secos y maíz.…………50 6-Conclusiones………………………………………………………………………………………………………….55 7-Bibliografía…………………………………………………………………………………………………………….56 Índice de figuras Figura (1): A. flavus y A. parasiticus……………………………………………………………………………………...…4 Figura (2): Estructura química de las aflatoxinas………………………………………………………………………6 Figura (3): Esquema del proceso de purificación con columna de inmunoafinidad………………..12 Figura (4): Muestras de frutos secos con chocolate ……………………………………………………………..19 Figura (5): Muestras de frutos secos y muestras con chocolate analizadas………………………….…20 Figura (6): Fase móvil con interferencia……………………………………………………………………………….…23 Figura (7): Columna de inmunoafinidad Aflatest®………………………………………………………………..…25 Figura (8): Cromatograma a 425nm de patrón de 10 ng/mL para B 1 y G 1 , y de 3 ng/mL para G 2 y B 2 ………………………………………………………………………………………………………………………..33 Figura (9): Cromatograma a 429nm de patrón de 10 ng/mL para B 1 y G 1 , y de 3 ng/mL para G 2 y B 2 ………………………………………………………………………………………………………………………..33 Figura (10): Cromatograma a 435 de patrón de 10 ng/mL para B 1 y G 1 , y de 3 ng/mL para G 2 y B 2 ……………………………………………………………………………………………………………………..…34 Figura (11): Cromatograma a 455nm de patrón de 10 ng/mL para B 1 y G 1 , y de 3 ng/mL para G 2 y B 2 …………………………………………………………………………………………………………………..…34 Figura (12): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 0,125ng/mL para G 1 y B 1 , y de 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con un flujo de fase móvil de 0,3 mL/min ……………………………35 Figura (13): Cromatograma a 435nm de un patrón de 0,125ng/mL para G 1 y B 1 , y de 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con un flujo de fase móvil de 0,4 mL/min…………………………….35 Figura (14): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 0,125 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con fase móvil metanol/agua/ACN (20/60/20)……………………..36 Figura (15): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 0,125 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con fase móvil metanol/agua/ACN (18/60/22)……………………..36 Figura (16): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 0,125 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con fase móvil metanol/agua/ACN (18/52/30)……………………..37 Figura (17): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 0,125 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con fase móvil metanol/agua/ACN (18/65/17)……………………..37 Figura (18): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 0,125 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con fase móvil metanol/agua/ACN (18/47/35)……………………..37 Figura (19): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 0,125 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con fase móvil metanol/agua/ACN (30/55/15)……………………..38 Figura (20): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 1 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,3 ng/mL para G 2 y B 2 con el inyector a temperatura ambiente………………………………………………..38 Figura (21): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 1 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,3 ng/mL para G 2 y B 2 con el inyector a 10 ˚C……………………………………………………………………………..39 Figura (22): Cromatogramas superpuestos a 435 nm de avellana enriquecida a 2 ng/g para G 1 y B 1 , y 0,6 ng/g para G 2 y B 2. La línea azul correspondiente a la Norma UNE-EN 141123:2008 y la línea negra a la Norma UNE-EN ISO 16050:2011……………………..39 Figura (23): Representación de las áreas obtenidas con los diferentes volúmenes de purificación para la aflatoxina G 2 ………………………………………………………………………..41 Figura (24): Representación de las áreas obtenidas con los diferentes volúmenes de purificación para la aflatoxina G 1 ……………………………………………………………………..…41 Figura (25): Representación de las áreas obtenidas con los diferentes volúmenes de purificación para la aflatoxina B 2 …………………………………………………………………………41 Figura (26): Representación de las áreas obtenidas con los diferentes volúmenes de purificación para la aflatoxina B 1 …………………………………………………………………………42 Figura (27): Cromatograma del disolvente de inyección…………………………………………………………42 Figura (28): Cromatograma del blanco de proceso…………………………………………………………………43 Figura (29): Cromatograma de la muestra blanco de avellana………………………………………………..43 Figura (30): Recta de calibrado para G 2 con concentraciones de 0,0375 ng/mL a 3 ng/mL……..44 Figura (31): Recta de calibrado para G 1 con concentraciones de 0,125 ng/mL a 10 ng/mL……..44 Figura (32): Recta de calibrado para B 2 con concentraciones de 0,0375 ng/mL a 3 ng/mL………44 Figura (33): Recta de calibrado para B 1 con concentraciones de 0,125 ng/mL a 10 ng/mL………44 Figura (34): Ecuación de Horwitz donde C es la fracción de expresada como potencia de 10…48 5 La recolección de los frutos y semillas deberá comenzar tan pronto como sea posible para minimizar los problemas relacionados con la contaminación por Aspergillus, aplicando buenas prácticas de recolección, transporte y manipulación (Codex Alimentarius, 2006). Los alimentos deberán ser revisados y eliminar los que estén rotos o dañados. Además se tendrá que quitar la vaina de los frutos que la posean. (Rodrigues et al. 2012). El transporte hasta una instalación de almacenamiento, debe producirse tan pronto como sea posible. Se requiere el uso de contenedores limpios, secos y protegidos contra la lluvia y los insectos. Después del secado los frutos deben almacenarse a unos centímetros del suelo protegidos contra la lluvia y las plagas, y controlando las condiciones de temperatura y a una humedad relativa inferior al 80% (Rodrigues et al. 2012). 2.3-Propiedades físico-químicas de las aflatoxinas Las aflatoxinas se consideran como productos metabólicos secundarios, es decir que no tienen una función directa en el metabolismo vital fisiológico del moho sino parecen ser un factor de defensa para un medio hostil. Químicamente, se trata de compuestos fluorescentes con una estructura cumarínica condensada con un bifurano y una pentanona (aflatoxinas B) o una lactona (aflatoxinas G) (Figura 2). Sus pesos moleculares oscilan entre 312 y 350. La denominación B es resultado de la exhibición de fluorescencia de color azul bajo la luz ultravioleta mientras que la G se refiere a la fluorescencia verde de estas estructuras bajo la luz ultravioleta (AESAN, 2011). Se trata además de compuestos que presentan una baja solubilidad en el agua, mientras que son solubles en cloroformo, soluciones acuosas de metanol, acetonitrilo o acetona. En su forma pura son inestables a la luz y al aire y pueden dañarse asimismo con amoniaco o con soluciones de hipoclorito de sodio. Asimismo son termorresistentes con un punto de fusión superior a 250 ˚C y estables en un rango de pH entre 3 y 10 (Soriano del Castillo, 2007). 6 Figura (2): Estructura química de las aflatoxinas (Otta et al., 2000) 2.4-Presencia de aflatoxinas en alimentos Son numerosos los informes y artículos científicos que evidencian la presencia de aflatoxinas en distintas matrices alimentarias como consecuencia del desarrollo de los hongos tanto pre como post-cosecha. Es más, la toxina puede persistir en el alimento aunque el hongo toxigénico haya desaparecido y al presentar una elevada estabilidad térmica, son resistentes a la degradación bajo procedimientos de cocción normales, lo cual hace que sea difícil eliminarlas una vez que se producen. Sin embargo, durante el procesado del alimento puede lograrse el objetivo de reducir la exposición alimentaria a las aflatoxinas mediante la selección u otro tratamiento físico antes del consumo humano directo o de su utilización como ingredientes de productos alimenticios. (AESAN, 2011). En la siguiente tabla, se pueden observar diferentes niveles de concentración que han encontrado en frutos secos y cereales, proveniente de muestras diferentes y de países diferentes. 7 Tabla (1): Datos de concentración de aflatoxinas en el mundo Alimento País de procedencia Aflatoxinas Autor Cebada España 0,13 µg/kg AFB 1 1,89 x 10 -3 µg/kg AFB 2 0,01 µg/kg AFG 1 3,97 x 10 -3 µg/kg AFG 2 Ibáñez-Vea et al., 2012 Cacahuete Almendra Pakistán 6,34 µg/kg AFTs 2,13 µg/kg AFTs Luttfullan et al., 2011 Cacahuete China 1,0 µg/kg AFB 1 0,7 µg/kg AFB 2 0,2 µg/kg AFG 1 O,6 µg/kg AFG 2 Huang et al., 2010 Cacahuete China 1,0 µg/kg AFB 1 0,7 µg/kg AFB 2 0,2 µg/kg AFG 1 O,6 µg/kg AFG 2 Haung et al., 2010 Pistacho Irán 0,12 µg/kg AFB 1 0,06 µg/kg AFB 2 Ariño et al., 2009 Cacahuete China 0,13 µg/kg AFB 1 0,61 µg/kg AFG 1 Blesa et al., 2003 Pistacho Irán 6 µg/kg AFTs Abdulkadar et al., 2000 AFB 1 : Aflatoxina B 1 ; AFB 2 : Aflatoxina B 2 ; AFG 1 : Aflatoxina G 1 ; AFG 2 : Aflatoxina G 2 ; AFTs: Aflatoxinas totales A pesar de ser muchos los productos agrícolas que pueden contaminarse por aflatoxinas, estos compuestos afectan principalmente a frutos secos (almendras, avellanas pistachos, anacardos, etc), frutas desecadas, especias, aceites vegetales crudos y maíz (EFSA, 2009). En cereales como el trigo, el arroz, o la cebada la presencia de aflatoxinas es menos frecuente pero pueden aparecer con relativa facilidad. Un ejemplo de la importancia de estos contaminantes, lo encontramos en el elevado número de notificaciones generadas a través del Sistema de Alerta Rápida para Piensos y Alimentos de la Unión Europea (RASFF, Rapid Alert System for Food and Feed). Este sistema en forma de red, está destinado a notificar de forma semanal los riesgos directos o indirectos para la salud humana y que se deriven de alimentos o piensos como consecuencia de la presencia de todo tipo de peligros: físicos (vidrio, plástico...), químicos (contaminantes ambientales, micotoxinas…) y biológicos (Listeria, Salmonella…). En él participan los Estados miembros, la Comisión y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria. Además, al concluir el año se elabora un resumen de todas las alertas producidas. 8 En la siguiente tabla, se recoge la evolución de las notificaciones relacionadas con la presencia de aflatoxinas, registradas en los últimos años a través del RASFF. Tabla (2): Notificaciones relacionadas con la presencia de aflatoxinas en piensos y alimentos en los últimos años (RASFF, 2011) Año Notificaciones Año Notificaciones 2002 288 2007 705 2003 762 2008 902 2004 839 2009 638 2005 946 2010 649 2006 801 2011 585 A modo de ejemplo, en la tabla 3 se muestra la relación de alimentos que han dado lugar a estas notificaciones con respecto al año 2011. Estos datos confirman como los frutos secos y las semillas son los alimentos en los que más frecuentemente se detectan estos contaminantes, pues además, estos alimentos presentan una composición química con una elevada concentración de carbohidratos y bajo contenido acuoso que favorece la producción de las aflatoxinas (Essono et al., 2009). Tabla (3): Notificaciones de aflatoxinas por categoría de alimento (RASFF, 2011). Categoría de alimento Número de notificaciones Cereales y productos de panadería 13 Pienso 119 Frutas y verduras 78 Hierbas y especias 51 Frutos secos y semillas 320 Otras 4 2.5-Efectos toxicológicos de las aflatoxinas Las aflatoxinas B y G son micotoxinas genotóxicas y carcinogénicas. Su ingesta se ha asociado con el daño hepático agudo, cirrosis hepática, la inducción de tumores y efectos teratogénicos (Fu et al., 2008). De hecho, las aflatoxinas son consideradas por la Agencia Internacional para la Investigación del cáncer (IARC) como evidente cancerígeno en animales de experimentación y en humanos (IARC, 2002, 2012). Sin embargo, aunque la ruta más conocida de exposición de aflatoxinas para humanos y animales es a través de la dieta, existe evidencia de que las aflatoxinas pueden entrar 9 por vía respiratoria, siendo inhaladas como partículas de polvo y provocando casos agudos y crónicos de intoxicación por esta toxina. Una vez ingeridas, las aflatoxinas son absorbidas en el intestino delgado y transportadas por los glóbulos rojos y las proteínas plasmáticas hasta el hígado. Allí la toxina entrará en las células y serán metabolizadas (Soriano del Castillo, 2007). Las manifestaciones clínicas de la aflatoxicosis pueden ser de tipo agudo que se producirá cuando se ingieran grandes cantidades de aflatoxinas en periodos de tiempo relativamente cortos, y de tipo crónico que es la forma más frecuente y en cierta forma más difícil de identificar, y es debido al consumo de alimentos contaminados con niveles bajos durante largos periodos de tiempo (Soriano del Castillo, 2007). Las características del tipo agudo son vómitos, dolor abdominal, edema pulmonar, así como infiltración grasa y necrosis del hígado. Al llegar las aflatoxinas al hígado se producirá una infiltración de lípidos que originará necrosis y muerte celular hepática, produciéndose así todos los síntomas relacionados. No obstante, la aparición de este cuadro en seres humanos es sumamente escasa (Soriano del Castillo, 2007). La intoxicación crónica por aflatoxinas, se produce principalmente por la aflatoxina B1 que es un potente carcinogénico. Sus principales síntomas son cáncer de hígado, hepatitis crónica, hepatomegalia y cirrosis. 2.6-Legislación Debido a la toxicidad de estos compuestos y con el fin de garantizar una protección eficaz de la salud pública, son varios los países que desde hace tiempo han fijado límites para la presencia de aflatoxinas en piensos y alimentos. Así, en España, ya existía una norma reguladora desde el Real Decreto 475/1988, en la cual se establecían los límites máximos permitidos de aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 en alimentos para consumo humano, de 10 µg/kg para la suma de las cuatro aflatoxinas y de 5 µg/kg para la aflatoxina B 1 . Recientemente, en la Unión Europea se han armonizado los contenidos máximos admitidos de estos contaminantes, mediante el Reglamento 1881/2006 (y posteriores modificaciones) por el que se fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios. En la tabla 4 se muestran los límites máximos vigentes en la actualidad para las aflatoxinas objeto de estudio. Estos límites se corresponden con los publicados en el Reglamento (CE) Nº 165/2010, última actualización sobre los contenidos máximos para la aflatoxina B 1 y la suma de aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 en diversos alimentos, entre los 10 que se incluyen aquellos en los cuales la contaminación por este tipo de toxinas resulta más frecuente y puede resultar más peligrosa para la salud humana. Tabla (4): Límites máximos de aflatoxinas establecido por el Reglamentos (CE) 1881/2006 y sucesivas modificaciones Producto alimentario Límite máximo B1 (μg/kg) Límite máximo suma B1, B2, G1 y G2 (μg/kg) Almendra 12 15 Almendra procesada 8 10 Cacahuete 8 15 Cacahuete procesado 2 4 Maíz tostado 2 4 Avellana 8 15 Avellana procesada 5 10 Pistacho 12 15 Pistacho procesado 8 10 La actualización de los límites máximos establecida en el Reglamento (CE) Nº 165/2010 supone un incremento con respecto a los previamente establecidos en el Reglamento (CE) Nº 1881/2006. Éste aumento se produjo debido a una propuesta del Códex Alimentarius y en vista de los resultados obtenidos por el Panel Científico de Contaminantes de la EFSA (CONTAM), quien dictaminó que esta medida tendría poco impacto desde el punto de vista de exposición del consumidor, riesgo de cáncer y márgenes de exposición calculados (EFSA, 2007). Igualmente, para proteger la salud pública y la sanidad animal, se debe ejercer un control estricto de los productos destinados a la alimentación animal, para lo que se han dictado unos contenidos máximos de aflatoxinas en los productos destinados a la alimentación animal y están recogidos en la Directiva 2003/100/CE. 2.7- Métodos analíticos de determinación de aflatoxinas en alimentos Los programas de control y protección de la salud pública frente a los contaminantes tóxicos presentes en los alimentos dependen principalmente de los análisis laboratoriales realizados. Sin embargo, el muestreo y análisis de micotoxinas es un proceso complejo debido a la presencia de posibles interferencias y efectos de matriz que complican la determinación de estos analitos, los bajos límites de detección requeridos y a que su distribución en las matrices es muy heterogénea. 11 Por ello, el proceso de determinación de micotoxinas en alimentos sólidos y líquidos se realiza en varias fases que en términos generales incluyen el muestreo y preparación de la muestra (moler y homogeneizar en el caso de los alimentos sólidos y ultrasonicar en el caso de alimentos líquidos), extracción y posterior purificación para eliminar interferencias y finalmente determinación mediante técnicas instrumentales. Además, dichos análisis pueden llevarse a cabo mediante el uso de métodos cualitativos o de cribado y/o métodos cuantitativos. Estos primeros servirán para determinar la presencia/ausencia de un determinado analito en una muestra o presencia/ausencia por encima de un determinado nivel, con lo que continuaremos el proceso de análisis cuantitativo sólo con aquellas muestras que sean positivas. En el caso de las técnicas cuantitativas podremos determinar la concentración exacta de cada aflatoxina existente en la muestra. Así, en la literatura revisada, para la determinación de aflatoxinas en alimentos se ha descrito el uso de la cromatografía de capa fina (TLC, thin-layer chromatography), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, high-performance liquid chromatography) o la técnica inmunoenzimática ELISA (Haung et al., 2010). Sea cual sea la técnica empleada y con el fin de garantizar que los laboratorios de control utilizan métodos de análisis con niveles de eficacia comparables, el Reglamento (CE) nº 401/2006 de 23 de febrero de 2006 por el que se establecen los métodos de muestreo y de análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios, establece criterios generales a los que deben ajustarse los métodos de análisis de estos contaminantes. Además, existen varios organismos internacionales que elaboran y publican métodos de análisis de micotoxinas en alimentos. Algunos de estos organismos son la AOAC (Association of Official Analytical Chemists), CEN (Comité Europeo de Normalización) o la ISO (Organización Internacional de Normalización). En el caso de España, existe AENOR (Asociación Española de Normalización y Certificación), que adopta y convierte las normas ISO y CEN en normas españolas (UNE). En la actualidad están vigentes dos normas UNE que regulan de determinación de aflatoxinas en alimentos. Éstas son la UNE-EN ISO 16050:2011 : “ Determinación de aflatoxina B1, y contenido total de aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 en cereales, nueces y productos derivados. Método por cromatografía líquida de alta resolución”; y la norma UNE-EN 14123:2008 : “Determinación de aflatoxina B 1 y de la suma de las aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 en avellanas, cacahuetes, pistachos, higos y pimentón molido. Método por cromatografía líquida de alta resolución con transformación química postcolumna y purificación en columna de inmunoafinidad”. 12 En relación a las columnas de inmunoafinidad, éstas son muy utilizadas y constituyen el estándar actual para la purificación de micotoxinas en análisis de alimentos. La columna está constituida por un gel con anticuerpos monoclonales anti-aflatoxinas inmovilizados. En el momento de adicionar la muestra se produce una reacción antígeno-anticuerpo lo que le confiere una alta selectividad. Así, la proporción de impurezas que quedan fijadas a la columna es pequeña, y éstas se eliminan en una etapa de lavado con agua milliQ o PBS, para evitar cambios de pH que podrían afectar a la unión antígeno-anticuerpo. Para conseguir la elución de las aflatoxinas se utiliza metanol que rompe la unión de éstas con los anticuerpos. Figura (3): Esquema del proceso de purificación con columna de inmunoafinidad 2.7.1-Métodos instrumentales Una vez se haya realizado el proceso de purificación, se requiere de un método analítico para cuantificar la concentración de de aflatoxinas que contienen las muestras. Como se ha comentado anteriormente, existen varias posibilidades cromatográficas como la cromatografía en capa fina (TLC) o la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Además existen técnicas inmunoquímicas como el ELISA que es un método de cribado, que puede ser cualitativo o cuantitativo. Se ha rechazado el uso de la TLC ya que es una técnica con baja separación, precisión y sensibilidad. También se ha descartado el uso de la técnica de ELISA debido a que es un método de cribado y aunque es rápido y sensible puede dar bastantes falsos positivos (Huang et al., 2010). El método más utilizado para detectar aflatoxinas se basa en técnicas cromatográficas como el HPLC combinados con un detector de fluorescencia o con nuevos equipos como el UPLC (Ultra Pressure Liquid Chromatography) que mejoran sus características. La cromatografía es un procedimiento analítico que se basa en la separación, identificación y cuantificación de los constituyentes de una mezcla. El principio se 13 fundamenta en los equilibrios de concentración de los compuestos presentes entre dos fases no miscibles. Una de ellas, llamada fase estacionaria, está inmovilizada en una columna o fijada sobre un soporte y la otra, llamada fase móvil, se desplaza en el seno de la primera. La velocidad de elución de los analitos de interés presentes en la fase móvil dependerá de la solubilidad de éstos en la fase móvil y de la fuerza de interacción de dicho compuesto con la fase estacionaria. Las técnicas cromatográficas requieren conocer las características fisicoquímicas y la estructura molecular para una adecuada separación y determinación de las aflatoxinas dependiendo de su polaridad. En estas técnicas tanto la fase móvil como la fase estacionaria juegan un papel importante en la separación, lo que hace que la retención cromatográfica sea el resultado del trinomio fase móvil/fase estacionaria/analito. Utilizamos para el análisis de micotoxinas cromatografía en fase reversa que se basa en la utilización de solventes polares como el metanol o el acetonitrilo que constituyen la fase móvil. La línea base en el método de cromatografía corresponde al trazado obtenido en ausencia del compuesto eluído. La separación se completa cuando en el cromatograma aparecen tantos picos como analitos existan en la mezcla objeto de análisis. El tiempo de retención de cada uno de estos analitos es el tiempo que transcurre desde que se inyecta la muestra en el cromatógrafo hasta que el pico correspondiente a cada compuesto eluído alcanza su máximo de altura. 2.7.1.1-Cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC) El ULPC es un sistema de cromatografía líquida como el HPLC, pero incorpora nuevas características que lo hacen mucho más óptimo para el análisis de las aflatoxinas. Las siglas UPLC son una marca registrada de Waters Corporation, aunque se suele utilizar para designar a otros equipos con sus mismas características. La principal diferencia a destacar del UPLC (Ultra pressure liquid chromatography) si se compara con el HPLC es que funciona a más alta presión con lo que la optimización en reactivos y tiempo es considerable. Se trata de un sistema que consta de un reservorio de fase móvil, cuatro bombas, inyector, columna de separación (de longitud más corta y menor tamaño de partícula que las convencionales) y detector. En nuestro caso al ser toxinas fluorescentes necesitaremos un detector de fluorescencia (FLD). La muestra después de toda la preparación se hace pasar a través de una fase estacionaria (apolar) que se mantiene fija en una columna y los analitos de interés se 14 distribuyen entre la fase móvil y la estacionaria dependiendo de la afinidad por cada una de ellas. Se eluyen en primer lugar los compuestos mas solubles en la fase móvil, mientras que los que permanecen más tiempo retenidos son aquellos que son apolares. En el caso del HPLC para poder detectar las micotoxinas se requiere de una derivatización de las mismas para aumentar su señal. Se puede utilizar la derivatización precolumna, que es un proceso químico con compuestos como el ácido trifluoroacético (TFA) (Shakir et al., 2010). También existe la derivatización postcolumna, la cual puede ser con compuestos como el bromo, o con células de derivatización como kobra-cell o phRED. En el caso del sistema ACQUITY UPLC ® posee una celda de fluorescencia con un volumen de capacidad mucho mayor (13 µL en comparación de los 2 µL del HPLC), lo que le permite analizar las aflatoxinas sin ningún tipo de derivatización. El mayor volumen de su célula es suficiente para aumentar la señal fluorescente de las toxinas y que puedan ser captadas por el equipo (Fu et al., 2008; Han et al., 2010). Además este equipo puede trabajar a presiones de hasta 100 Mpa, lo que le permite ser mucho más rápido y ahorrar muchos reactivos. Esto produce que el UPLC con respecto al HPLC sea mucho más preciso y sensible (Novakova et al., 2006). 21 4.3-Optimización y validación de un método analítico para la determinación de aflatoxinas en frutos secos y maíz La metodología que se va a optimizar en este trabajo consiste en una extracción de las aflatoxinas presentes en las muestras por agitación en ultraturrax con una disolución metanólica, seguido de una filtración, dilución y purificación del extracto orgánico obtenido mediante columnas de inmunoafinidad y determinación final de las toxinas mediante cromatografía líquida UPLC. El método desarrollado se basa principalmente en la norma UNE-EN ISO 16050:2011: “Determinación de aflatoxina B 1 , y contenido total de aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 en cereales, nueces y productos derivados. Método por cromatografía líquida de alta resolución”, en la norma UNE-EN 14123:2008 para la “Determinación de aflatoxina B 1 y de la suma de las aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 en avellanas, cacahuetes, pistachos, higos y pimentón molido. Método por cromatografía líquida de alta resolución con transformación química postcolumna y purificación en columna de inmunoafinidad” y en la aplicación proporcionada por Waters (Rapid analysis of aflatoxins without derivation using ultra performance liquid chromatography and fluorescence detection). 4.3.1-Optimización de las condiciones cromatográficas 4.3.1.1-Tiempos de retención Para comprobar los tiempos de retención correspondientes a cada uno de los picos de las diferentes aflatoxinas se inyectaron al comienzo de la optimización del método seis replicados de un patrón de 10 ng/mL para G 1 y B 1 , y 3 ng/mL para G 2 y B 2 , calculando la media de los tiempos de retención obtenidos para cada analito. Una vez determinados el flujo y las proporciones de los disolventes que constituyen la fase móvil así como la temperatura del inyector se procedió a comprobar los nuevos tiempos de retención de los picos, ya que variaciones en estos parámetros tienen gran influencia en los tiempos de elución. Para ello, una vez finalizada su optimización se volvió a inyectar seis veces un patrón de 10 ng/mL para G 1 y B 1 , y 3 ng/mL para G 2 y B 2 y se obtuvieron los nuevos tiempos de retención. Además para comprobar que no varíen con el tiempo los tiempos de retención determinados y comprobar la estabilidad de los patrones en refrigeración se realizó una prueba de estabilidad de un patrón de 10 ng/mL para G 1 y B 1 , y 3 ng/mL para G 2 y B 2 , el cual se inyectó durante veinte días seguidos para ver si los tiempos de retención se mantenían constantes. 22 4.3.1.2-Longitudes de onda de excitación y emisión El siguiente paso en el desarrollo del método para determinar la concentración de aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 por UPLC fue la elección de las longitudes de onda de excitación y emisión óptimas para la determinación de dichos analitos, teniendo en cuenta la bibliografía consultada así como las recomendaciones de la casa comercial. Para la longitud de onda de excitación todos los autores coincidían en que fuera 365 nm. Pero para el caso de la longitud de emisión había varias opciones. Para seleccionar la longitud de onda de emisión se realizaron los análisis a 425, 429, 435 y 455 nm, y observamos sus correspondientes cromatogramas seleccionando para cada micotoxina la longitud de onda con la que se obtenía un área de pico mayor. 4.3.1.3-Volumen de inyección El volumen de inyección es la cantidad de muestra que es tomada por el inyector para realizar cada análisis. Con esta prueba se quiso comprobar si este volumen influía en alguna medida en la mejora de la señal. En el uso de UPLC se utilizan volúmenes de inyección menores al HPLC, siendo 10 µL un volumen que es usado frecuentemente en el primer caso (Fu et al., 2008). En nuestro caso, se ensayaron dos volúmenes de inyección: 10 µL al ser un volumen muy utilizado en la bibliografía y 1 µL por recomendaciones de la casa comercial. 4.3.1.4-Flujo de la fase móvil El flujo de la fase móvil es la velocidad a la cual ésta pasa por la columna arrastrando la muestra con ella. En los equipos de HPLC se necesita un flujo de 1 mL/min (Copetti et al., 2011), mientras que para los de UPLC la bibliografía muestra flujos algo más lentos, del orden de 0,3 mL/min (Huang et al., 2010). Esta diferencia es debida al tamaño de las columnas que utiliza cada uno de los equipos, ya que en el caso del UPLC son columnas de menor longitud y menor tamaño de partícula y por esto requieren un menor flujo de la fase móvil ya que son capaces de resistir presiones más elevadas que la cromatografía convencional. Se realizó un ensayo para determinar la velocidad de flujo más apropiada para nuestro proceso. Para ello se inyectó por duplicado un patrón de 0,125 ng/mL para G 1 y B 1 , y de 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con dos flujos diferentes: 0,3 mL/min, que es el dado por la bibliografía y otro de 0,4 mL/min que es el que se recomienda en la aplicación de la casa comercial. 23 4.3.1.5- Composición de la fase móvil Basándonos en la norma UNE-EN ISO 16050: 2011 y en el trabajo publicado por Ariño et al. (2009), se decidió utilizar como fase móvil una mezcla de metanol, agua y acetonitrilo. En un principio se probó con la fase móvil proporcionada por el fabricante del equipo (Abdulkadar et al., 2004) consistente en metanol/agua/acetonitrilo en proporción 18:64:18. Sin embargo, con esta fase móvil se observó una interferencia en el mismo tiempo de retención que la aflatoxina G 1 (Figura 6). Figura (6): Fase móvil con interferencia Para corregir este problema se probaron diferentes porcentajes experimentales de los reactivos que forman parte de la fase móvil agua, metanol y acetonitrilo (Tabla 5). Tabla (5): Porcentajes de fase móvil estudiados Metanol (%) Agua (%) Acetonitrilo (%) 20 60 20 18 60 22 18 52 30 18 65 17 18 47 35 30 55 15 4.3.1.6-Temperatura del inyector Durante los análisis realizados se vio que según cuál fuera la temperatura ambiental del laboratorio en el que se encontraba el equipo de UPLC, variaban los tiempos de retención de los picos cromatográficos correspondientes a las aflatoxinas estudiadas. Esto podía ser debido a que el inyector necesitara tener una temperatura fija. 24 Para comprobar cómo influía la temperatura en la detección de las toxinas se realizó una prueba con dos temperaturas diferentes del inyector: 10 ˚C (recomendación de la casa comercial) y temperatura ambiente (22-25˚C). 4.3.2-Optimización de las etapas de extracción y purificación Para los estudios de optimización y validación del método analítico se seleccionó como blanco de matriz una muestra de avellana en la que tras un análisis cromatográfico en el laboratorio no detectó la presencia de concentraciones de aflatoxinas superiores al límite de detección (LD)). La puesta a punto de las etapas de extracción y purificación de la muestra, se llevó a cabo tomando como referencia las dos norma citadas en el punto 4.3, la norma UNE- EN 14123:2008 y la norma UNE-EN ISO 16050. Así englobamos todo el abanico de frutos secos y cereales. Así, al basarnos en estas dos normas, consideramos los parámetros de validación en avellana como referencia para aplicar al resto de los frutos secos debido a la similitud en su composición. Además en la norma UNE-EN ISO 16050:2011, se incluyen los cereales, por lo que los resultados los consideraremos validos también para el caso del maíz. 4.3.2.1-Extracción Como se ha comentado anteriormente, para la extracción de las aflatoxinas de las muestras analíticas tomamos como referencia las dos normas de AENOR ya citadas (UNE-EN 14123:2008 y UNE-EN ISO 16050:2011). En ambos casos la extracción se realiza mediante agitación de la matriz en ultraturrax con un disolvente o mezcla de disolventes, que en el caso de la Norma UNE-EN 141123:2008 está constituida por una mezcla de metanol al 80% y hexano (66 partes de metanol al 80% y 33 partes de hexano) y en el caso de la Norma UNE-EN ISO 16050:2011 la disolución de extracción es metanol al 70%. Además, en el primer caso a la extracción le sigue una fase de centrifugación (15 minutos a 3500 rpm) y recogida de la fase metanólica mientras que en el segundo, la muestra homogeneizada con el disolvente, y se somete a una filtración con papel de filtro Whatman nº1. En ambos casos se le añaden 0,5 g de NaCl para mejorar la extracción (Ariño et al., 2009). Para cada una de las técnicas, se realizó un ensayo por duplicado con una muestra de a vellana enriquecida con 2 ng/g inyectaron en el UPLC y se calcularon las recuperaciones obtenidas en cada caso 4.3 .2.2 Se realizó un ensayo con dos tipos de columnas de diferentes para comprobar con cuál de las dos se conseguiría una mayor recuperación de las aflatoxinas presentes en las muestras. El primer tipo analizado es la columna Aflatest® (VICAM) utiliza como reactivo de lavado el agua. La otra columna es Aflaprep® (R que requiere PBS para el mismo proceso. Para llevar a cabo el estudio se realizó avellana enriquecida con 20 ng/g de la solución madre (20 ng G 2 y B 2 , respectivamente ) para cada tipo de columna, realizando todo el proceso según instrucciones de los fabricantes. que se desconocían las recuperaciones de las mismas. concentraciones de cada aflatoxina utilizando la ecuación de la recta y se compararon los resultados de las recuperaciones. Figura ( 4.3 .2.3 Esta prueba se llevó a cabo para comprobar la influencia del volumen de muestra extraída y filtrada en la eficacia de la purificación. El objetivo fundamental era evitar saturaciones de la columna de inmunoafinidad sin comprometer al mismo tiempo la sensibilid ad y precisión la técnica. Para ello, después de obtener el filtrado una diferentes de la misma (distinta cantidad de gramos de muestra) para posteriormente purificarlos a través de las columnas de inmunoafinidad. Se enriquecieron seis m uestras de avellana (dos para cada volumen de purificación) con 20 ng/g de aflatoxinas y dos muestras de avellana sin enriquecer. Se tomaron 4, 8 Para cada una de las técnicas, se realizó un ensayo por duplicado con una muestra de vellana enriquecida con 2 ng/g de G 1 y B 1 , y 0,6 ng/g para G 2 y B 2 . A continuación se inyectaron en el UPLC y se calcularon las recuperaciones obtenidas en cada caso .2.2 - Purificación: elección de la columna de inmunoafinidad Se realizó un ensayo con dos tipos de columnas de inmunoafinidad de dos fabricantes diferentes para comprobar con cuál de las dos se conseguiría una mayor recuperación de las aflatoxinas presentes en las muestras. El primer tipo analizado es la columna Aflatest® (VICAM) (Figura 7) como reactivo de lavado el agua. La otra columna es Aflaprep® (R que requiere PBS para el mismo proceso. Para llevar a cabo el estudio se realizó un ensayo por duplicado con 20 ng/g de la solución madre (20 ng /g de G 1 y B ) para cada tipo de columna, realizando todo el proceso según instrucciones de los fabricantes. Se utilizó una concentración elevada de aflatoxinas ya que se desconocían las recuperaciones de las mismas. S e calcularon las concentraciones de cada aflatoxina utilizando la ecuación de la recta y se compararon los resultados de las recuperaciones. Figura ( 7): Columna de inmunoafinidad Aflatest® .2.3 -Purificación: elección del volumen de purificación prueba se llevó a cabo para comprobar la influencia del volumen de muestra extraída y filtrada en la eficacia de la purificación. El objetivo fundamental era evitar saturaciones de la columna de inmunoafinidad sin comprometer al mismo tiempo la ad y precisión la técnica. Para ello, después de obtener el filtrado una muestra, se tomaron 3 volúmenes (distinta cantidad de gramos de muestra) para posteriormente purificarlos a través de las columnas de inmunoafinidad. uestras de avellana (dos para cada volumen de purificación) de aflatoxinas y dos muestras de avellana sin enriquecer. Se tomaron 4, 8 25 Para cada una de las técnicas, se realizó un ensayo por duplicado con una muestra de A continuación se inyectaron en el UPLC y se calcularon las recuperaciones obtenidas en cada caso . Purificación: elección de la columna de inmunoafinidad inmunoafinidad de dos fabricantes diferentes para comprobar con cuál de las dos se conseguiría una mayor recuperación (Figura 7) , con la cual se como reactivo de lavado el agua. La otra columna es Aflaprep® (R -biopharm) un ensayo por duplicado con muestras de y B 1 , y 6 ng/g de ) para cada tipo de columna, realizando todo el proceso según una concentración elevada de aflatoxinas ya e calcularon las concentraciones de cada aflatoxina utilizando la ecuación de la recta y se compararon purificación prueba se llevó a cabo para comprobar la influencia del volumen de muestra extraída y filtrada en la eficacia de la purificación. El objetivo fundamental era evitar saturaciones de la columna de inmunoafinidad sin comprometer al mismo tiempo la muestra, se tomaron 3 volúmenes (distinta cantidad de gramos de muestra) para posteriormente uestras de avellana (dos para cada volumen de purificación) de aflatoxinas y dos muestras de avellana sin enriquecer. Se tomaron 4, 8 26 y 10 mL del filtrado de las enriquecidas y 4 mL de la no enriquecida, y se añadieron 16, 32 y 40 mL de agua respectivamente y 16 mL para la no enriquecida, para después purificarlo. Estos volúmenes correspondían finalmente a 1, 2 y 2,5 g de la muestra inicial que se habían analizado. 4.4-Método analítico para determinar aflatoxinas en frutos secos y cereales Basándonos en los métodos previamente citados y con las modificaciones ensayadas y optimizadas, el protocolo final de análisis de aflatoxinas para distintas muestras de frutos secos y maíz es el siguiente: Extracción - Se pesan 5 gramos de las muestras previamente trituradas en un tubo Falcon y se añaden 20 mL de metanol al 70% y 0,5 g de NaCl. - Esta mezcla se agita en un homogeneizador Ultraturrax durante 1 minuto. - El extracto obtenido se filtra con papel de filtro. - Se recogen 4 mL del filtrado en otro tubo Falcon y se le añaden 16 mL de agua milliQ. Purificación - Se añaden los 20 mL de la muestra diluida a la columna de inmunoafinidad. - Para eliminar sustancias interferentes, la columna se lava haciendo pasar 10 mL de agua milliQ. - Las aflatoxinas se eluyen con 1 mL de metanol en un vial ámbar. El mililitro del vial se vuelve a pasar por la columna de inmunoafinidad tal y como recomienda el fabricante de las columnas de inmunoafinidad Aflatest® (VICAM). - El eluato obtenido se evapora a sequedad en un bloque calefactor a 40°C bajo corriente de nitrógeno. Determinación cromatográfica Una vez llevado el eluato a sequedad, se redisuelve en 1 mL de fase móvil (metanol/agua/acetonitrilo) (30/55/15). Finalmente se inyecta en el UPLC con las condiciones cromatográficas optimizadas: • Columna BEH C18 100 x 2,1 mm y 1,7 μm de tamaño de partícula. • Célula de derivatización de 13 µL. • Flujo: 0,4 mL/min. • Temperatura de la columna: 37°C. • Temperatura del inyector: 10 °C. • Volumen de inyección 1 µL. 27 • Longitudes de onda fijadas en el detector: o λ excitación: 365 nm y λ emisión: 435 nm para B 1 y B 2 (FLD) o λ excitación: 365 nm y λ emisión: 455 nm para G 1 y G 2 (FLD) 4.5-Validación del método analítico Tras optimizar el método de análisis con los ensayos previos anteriormente descritos, se procedió a la validación del método completo de análisis. La validación es el proceso mediante el cual se puede demostrar que los resultados producidos por un procedimiento analítico son fiables y reproducibles, y que se ajusta al propósito para el que fue desarrollado. La validación de este método se ha realizado tomando como referencia el Reglamento (CE) Nº 401/2006, por el que se establecen los métodos de muestreo y de análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios, y en la Decisión de la Comisión (2002/657/CE) de 12 de agosto de 2002 por la que se aplica de Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados. 4.5.1-Especificidad Este parámetro estudia la capacidad del método de distinguir el analito de cualquier otra interferencia presente en las muestras que se analizan. Para verificar que ninguna interferencia coincide en la región de elución del analito de interés, se identificaron por UPLC las aflatoxinas G 2 , G 1 , B 2 y B 1 , y aquellas interferencias procedentes de la matriz y/o de los materiales y reactivos utilizados en el procedimiento analítico. Para ello se analizaron: -Solución patrón de 10 ng/mL de aflatoxinas G 2 , B 2 y de 3 ng/mL para la G 1 y B 1 . -Disolvente de inyección. -Un blanco de proceso. -Muestra blanco de avellana. -Extractos de muestras de frutos secos enriquecidas con 2 μg/Kg para G 2 , B 2 y de 0,6 µg/Kg para la G 1 y B 1 . 28 Estos ensayos se realizan con el objeto de comprobar que no existen solapamientos de picos, que estos estén formados por un único componente y que la cuantificación sea correcta. El blanco de proceso se realiza todo el procedimiento analítico: preparación de material, extracción, purificación, y determinación cromatográfica pero omitiendo la muestra, para verificar que durante el proceso analítico no se genera ninguna interferencia. 4.5.2-Linealidad Es la capacidad de un método para obtener resultados directamente proporcionales a la concentración o cantidad de analito en un rango definido. Este parámetro es inherente a las técnicas instrumentales donde el analito genera una señal electrónica medida por el detector que se registra en el cromatograma. La linealidad viene representada a través de una recta de regresión, que se va a usar en la práctica como recta de calibrado para calcular, por interpolación, la concentración de aflatoxinas en las muestras problema. Al no existir efecto matriz mensurable en el análisis de los frutos secos y el maíz, la calibración se realizó por el método del patrón externo. Para la construcción de la recta de calibrado se utilizaron patrones analíticos a distintas concentraciones en un intervalo de 0,125 ng/mL a 10 ng/mL para B 1 y G 1 y 0,0375 ng/mL a 3 ng/mL para B 2 y G 2 (Ver punto 4.1.3.2). Los resultados se evaluaron utilizando las condiciones cromatográficas anteriormente optimizadas. Para verificar la linealidad se calculó el coeficiente de correlación (R 2 ) de la recta de calibración obtenida para cada compuesto estudiado. 4.5.3-Sensibilidad Es la capacidad del instrumento o de un método para discriminar pequeñas diferencias en la concentración del analito. Existen dos parámetros relacionados con la sensibilidad: el límite de detección y límite de cuantificación. 29 4.5.3.1-Limite de detección (LD) En el análisis instrumental, un factor que afecta directamente a la exactitud y la precisión de un análisis es el ruido. Este factor está presente en la representación de las señales analíticas instrumentales. Un parámetro que se utiliza para certificar la calidad de un método analítico es la relación señal/ruido (S/N). Siendo S la señal correspondiente al compuesto objeto de estudio a un determinado nivel (medida en altura) y N la señal del ruido de fondo (midiendo la señal eléctrica que da en altura el ruido). Para determinar el límite de detección se enriqueció una muestra blanco de avellana a distintas concentraciones en sentido decreciente hasta que la señal pudiera distinguirse del ruido de fondo. Se partió de una muestra blanco matriz y se enriqueció esta muestra a una concentración de 0,015 ng/g para G 2 y B 2 en la que podía distinguirse del ruido de fondo y se calculó la media de las seis muestras blancas enriquecidas a ese nivel mas tres veces la desviación estándar de las replicas para hallar el límite de detección. Posteriormente se analizaron otras seis muestras enriquecidas a 0,05 ng/g para G 1 y B 1 y se calculó el límite de detección de la misma manera que para las otras. Ya que no existían interferencias procedentes del chocolate, se consideró que el límite de detección obtenido a partir de la avellana se podía aplicar al resto de materias primas y a los productos con chocolate. 4.5.3.2-Limite de cuantificación (LC) Es la menor cantidad de analito de la muestra que puede ser medida cuantitativamente con una certeza estadística razonable. El límite de cuantificación se establece a un nivel que corresponde a la señal que se corresponde al nivel de muestra contaminada que se puede distinguir del ruido más diez veces la desviación estándar de éste. 4.5.4-Exactitud (Recuperación) Según la Decisión de la Comisión 2002/657/CE, la exactitud es el grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de referencia aceptado. La exactitud se calcula determinando la veracidad y la precisión (repetibilidad y reproducibilidad). 30 Al no disponer de material de referencia certificado, el estudio de la exactitud se llevó a cabo enriqueciendo una muestra blanco de avellana a dos niveles distintos de concentración: 1 y, 2 μg/Kg de aflatoxinas B 1 y G 1 , y 0,3 y 0,6 µg/Kg de B 2 y G 2 . Con estos dos niveles, se pretendía comprobar la validez del método para determinar niveles de aflatoxinas en valores próximos al menor límite máximo de residuo establecido por la legislación y en valores inferiores a él. El enriquecimiento de las muestras se realizó previamente a la etapa de extracción para obtener el porcentaje de recuperación global de las aflatoxinas con el método utilizado. En todos los niveles de enriquecimiento y para hallar el porcentaje de recuperación, se calcularon los resultados obtenidos en las muestras enriquecidas con las ecuaciones de la recta procedentes de las rectas de calibración. 4.5.5-Precisión Es el grado de concordancia entre ensayos independientes obtenidos bajo unas condiciones estipuladas. Estas condiciones dependen de los factores variables entre ensayos. Algunos factores que se pueden considerar son los siguientes: laboratorio, analista, equipo UPLC y día en el que se hizo el ensayo. Para determinar este parámetro se han analizado seis muestras de avellana independientes enriquecidas a 2 ng/g de aflatoxinas B 1 y G 1 y a 0,6 ng/g de B 2 y G 2 cada una. La precisión se estudia en dos parámetros que son repetibilidad y reproducibilidad. 4.5.5.1-Precisión en la inyección Este parámetro permite conocer las posibles fluctuaciones de las bombas y detectores en un corto periodo de tiempo, midiendo como afectan a los tiempos de retención y las áreas del patrón inyectado. Para evaluar la precisión de la inyección se calculó la repetibilidad de los resultados obtenidos al inyectar seis repeticiones de un patrón de 10 ng/mL para G 1 y B 1 , y de 3 ng/mL para G 2 y B 2 mediante la determinación de la desviación estándar relativa de las áreas de pico cromatográficas correspondientes a las aflatoxinas estudiadas. 37 Figura (16): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 0,125 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con fase móvil metanol/agua/ACN (18/52/30) Figura (17): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 0,125 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con fase móvil metanol/agua/ACN (18/65/17) Figura (18): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 0,125 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con fase móvil metanol/agua/ACN (18/47/35) 38 Figura (19): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 0,125 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,0375 ng/mL para G 2 y B 2 con fase móvil metanol/agua/ACN (30/55/15) 5.1.1.6-Temperatura del inyector Una vez realizados los análisis con las temperaturas de 10 ˚C y a temperatura ambiente, se observaron los cromatogramas obtenidos (figuras 20 y 21). A temperatura ambiente, los tiempos de retención de los picos cromatográficos de las cuatro aflatoxinas fluctuaban más entre las diferentes inyecciones y aparecían a un tiempo de retención mucho mayor que a la temperatura fija de 10°C. Tanto la cuantificación de las áreas como la resolución de los picos y la estabilidad de los tiempos de retención a 10 °C mejoraba considerablemente tal y como se representa en las figuras que se muestran a continuación (20 y 21). Figura (20): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 1 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,3 ng/mL para G 2 y B 2 con el inyector a temperatura ambiente 39 Figura (21): Cromatograma a 435 nm de un patrón de 1 ng/mL para G 1 y B 1 , y 0,3 ng/mL para G 2 y B 2 con el inyector a 10 ˚C 5.1.2- Optimización de las etapas de extracción y purificación 5.1.2.1- Extracción Al llevar a cabo la extracción según la Norma UNE-EN 141123:2008 con metanol al 80 % y hexano, se obtuvieron unas áreas de pico menores (línea negra del cromatograma de la figura 22) que en el caso del método basado en la Norma UNE-EN ISO 16050:2011 que su extracción es solamente con metanol al 70 % (línea azul del cromatograma de la figura 22). Figura (22): Cromatogramas superpuestos a 435 nm de avellana enriquecida a 2 ng/g para G 1 y B 1 , y 0,6 ng/g para G 2 y B 2. La línea azul correspondiente a la Norma UNE-EN 141123:2008 y la línea negra a la Norma UNE-EN ISO 16050:2011 Se registraron las áreas obtenidas para cada aflatoxina y se interpolaron en la ecuación de la recta, y así se obtuvieron las concentraciones de cada aflatoxina. A continuación se calcularon las recuperaciones obtenidas por cada uno de los métodos de extracción. 40 Tabla (6): Recuperaciones (%) obtenidas con cada una de las normas Disolvente de extracción Recuperación (%) AF G2 AF G1 AF B2 AF B1 Metanol al 80%/hexano (66:33) (UNE-EN 141123:2008) 59,86 60,89 73,35 68,349 Metanol al 70% (UNE-EN 16050:2011) 74,09 76,64 105,27 108,07 Como puede verse en la tabla (6) se obtuvieron mayores recuperaciones con el método basado en la norma UNE-EN 16050:2011, y por lo tanto fue el que se eligió. 5.1.2.2- Purificación: elección de la columna de inmunoafinidad Una vez obtenidos los cromatogramas de los dos tipos de columnas de afinidad estudiadas para la purificación de las muestras de avellana enriquecidas a 20 ng/g de G 1 y B 1 y con 6 ng/g de G 2 y B 2 se calcularon las recuperaciones obtenidas de cada aflatoxina con cada una de ellas: Tabla (7): Recuperaciones (%) obtenidas con las dos columnas Columna de inmunoafinidad Recuperación (%) AF G2 AF G1 AF B2 AF B1 Aflatest® (VICAM) 108,38 75,22 82,82 103,52 Aflaprep® (R-biopharm) 38,36 37,07 79,56 101,92 Tal y como se muestra en la tabla 7, las mejores recuperaciones para las cuatro micotoxinas estudiadas, se obtuvieron para la columna de inmunoafinidad Aflatest® que fue por tanto la elegida para llevar a cabo los análisis de las muestras. 5.1.2.3-Purificación: Ensayo de volumen de purificación Para la elección del volumen de muestra filtrada que se iba a hacer pasar por las columnas de inmunoafinidad, se representaron en una gráfica las áreas obtenidas para cada volumen filtrado para cada una de las aflatoxinas estudiadas. Con esto se puede comprobar si todos los volúmenes son lineales, es decir, al aumentar la cantidad de muestra aumenta proporcionalmente las áreas. Se observó que para las aflatoxinas G 1 , B 2 y B 1 al aumentar la concentración aumentaba proporcionalmente la señal eléctrica, pero en el caso de la G 2 se vio que el punto de 10 mL no era lineal con los otros dos (Figura 23). 41 Este fenómeno puede ser explicado por la saturación de la columna de inmunoafinidad al pasar la muestra de 10 mL del filtrado que correspondería con 2,5 g de la muestra. Figura (23): Representación de las áreas obtenidas con los diferentes volúmenes de purificación para la aflatoxina G 2 Figura (24): Representación de las áreas obtenidas con los diferentes volúmenes de purificación para la aflatoxina G 1 Figura (25): Representación de las áreas obtenidas con los diferentes volúmenes de purificación para la aflatoxina B 2 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 0 2 4 6 8 10 12 Áreas mL 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 0 2 4 6 8 10 12 Áreas mL 0 5000000 10000000 15000000 20000000 0 2 4 6 8 10 12 Áreas mL 42 Figura (26): Representación de las áreas obtenidas con los diferentes volúmenes de purificación para la aflatoxina B 1 Por esto se determinó que para los análisis de las muestras se tomaría un volumen de 4 mL del filtrado. Con este volumen, que se corresponde con 1 g de muestra, el factor de dilución del proceso será de 1, además de que al ser el menor volumen filtrado se optimiza y agiliza el protocolo de purificación al mismo tiempo que se consigue una buena sensibilidad de la técnica. 5.2-Validación del método analítico 5.2.1-Especificidad Tal y como se muestra en los cromatogramas correspondientes a una inyección de la fase móvil (Figura 27) y del blanco de proceso (Figura 28) se observó que tanto los disolventes de extracción y purificación como la fase móvil no aportaban ninguna interferencia al cromatograma en los tiempos de retención de las aflatoxinas estudiadas. Figura (27): Cromatograma del disolvente de inyección 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 16000000 0 2 4 6 8 10 12 Áreas mL 43 Figura (28): Cromatograma del blanco de proceso A continuación, observamos el cromatograma de la muestra de avellana blanco que se tenía en el laboratorio, y que se utilizó para los enriquecimientos. Se puede comprobar cómo no presentan ningún pico de aflatoxinas (Figura 29). Figura (29): Cromatograma de la muestra blanco de avellana Posteriormente, se analizó una muestra de avellana enriquecida con 2 ng/g para G 1 y B 1 , y a 0,6 ng/g para G 2 y B 2. A l calcular la recuperación de esta muestra no se observaron porcentajes de recuperación por encima de los valores establecidos que pudieran indicar la presencia de interferencias coincidentes con los picos cromatográficos de las aflatoxinas analizadas. 5.2.2-Linealidad Los resultados del análisis de seis rectas de calibrado para cada una de las aflatoxinas estudiadas mostraron unos valores medios de R 2 de 0,9999 para G 2 , 0,9998 para G 1 , 0,9998 para B 2 y 0,9999 para B 1 demostrando de este modo la linealidad de la calibración (Figuras 30-33). 44 Figura (30): Recta de calibrado para G 2 con concentraciones de 0,0375 ng/mL a 3 ng/mL Figura (31): Recta de calibrado para G 1 con concentraciones de 0,125 ng/mL a 10 ng/mL Figura (32): Recta de calibrado para B 2 con concentraciones de 0,0375 ng/mL a 3 ng/mL Figura (33): Recta de calibrado para B 1 con concentraciones de 0,125 ng/mL a 10 ng/mL y = 576736x + 5925,8 R² = 0,9999 0 250000 500000 750000 1000000 1250000 1500000 1750000 2000000 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Áreas Concentración (ng/mL) y = 129406x - 817,57 R² = 0,9998 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Áreas Concentración (ng/mL) y = 1E+06x - 734,1 R² = 0,9998 0 1000000 2000000 3000000 4000000 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Áreas Concentración (ng/mL) y = 324490x + 936,58 R² = 0,9999 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Áreas Concentración (ng/mL) 45 Revisando la bibliografía se observó como autores como Huang et al. (2010) también obtuvieron valores de R 2 mayores de 0,999 para todas las aflatoxinas. 5.2.3-Sensibilidad 5.2.3.1-Límite de detección Tras la inyección de las seis muestras enriquecidas, se calculó el límite de detección para cada una de las micotoxinas obteniéndose los siguientes valores: Tabla (8): Límites de detección para cada aflatoxina Aflatoxina LD (ng/g) G 2 0,016 G 1 0,057 B 2 0,015 B 1 0,050 Tal y como se muestra en la tabla 8, los bajos límites de detección obtenidos muestran cómo el método desarrollado es muy sensible, siendo esta sensibilidad mayor para las aflatoxinas G 2 y B 2 . Comparando nuestros resultados con los obtenidos por otros autores (Tabla 9), podemos concluir que nuestro equipo tiene una gran sensibilidad para detectar las aflatoxinas, ya que los límites de detección son mucho más bajos que los revisados en la tabla para las aflatoxinas G 2 , G 1 y B 2 . En el caso de la B 1 se ha llegado a detectar por otros autores hasta 0,008 µg/Kg. Tabla (9): Límites de detección obtenidos por otros autores Autor AF G2 (LD µg/Kg) AF G1 (LD µg/Kg) AF B2 (LD µg/Kg) AF B1 (LD µg/Kg) Equipo analítico Huang et al., 2010 0,212 0,085 0,056 0,009 UPLC Fu et al., 2008 0,19 0,32 0,19 0,32 UPLC Sook et al., 2007 1,25 0,40 0,13 0,008 HPLC 5.2.3.2-Lmite de cuantificación Posteriormente calculamos los límites de cuantificación tal como se ha descrito en el apartado de material y métodos (Tabla 10). 46 Tabla (10): Límites de cuantificación para cada aflatoxina Aflatoxina LC (ng/g) G 2 0,053 G 1 0,189 B 2 0,049 B 1 0,166 Como en el caso del límite de detección, la cifra para las aflatoxinas G 1 y B 1 es mucho más baja que para las otras dos. Esto refuerza la idea de que éstas son mucho más sensibles que la G 2 y B 2 . Según otros autores (tabla 11), los valores del límite de cuantificación varían mucho con respecto al método y equipo utilizados. Para el caso de las aflatoxinas G 2 y B 2 , se ha obtenido unos límites muy por debajo de los que se pueden observar en la revisión de la tabla (11). Mientras que para el caso de la G 1 coincidimos con el valor aportado por Huang et al. (2010), y para B 1 obtenemos un resultado similar a Sook et al. (2007). Tabla (11): Límites de cuantificación obtenidos por otros autores Autor AF G2 (LC µg/Kg) AF G1 (LC µg/Kg) AF B2 (LC µg/Kg) AF B1 (LC µg/Kg) Equipo analítico Huang et al., 2010 0,273 0,182 0,084 0,012 UPLC Fu et al., 2008 0,63 1,07 0,63 1,07 UPLC Sook et al., 2007 2,50 1,30 0,40 0,15 HPLC 5.2.3.3-Exactitud (Recuperación) Este parámetro se estudió mediante ensayos de recuperación analizando seis muestras de avellana enriquecidas a distintos niveles de concentración: 1 μg/Kg y 2 μg/Kg para G 1 y B 1 , y de 0,3 y 0,6 μg/Kg para G 2 y B 2 . Según el Reglamento (CE) 401/2006 de la Comisión de 23 de febrero de 2006 por el que establecen los métodos de muestreo y análisis para el control oficial del contenido de mico toxinas en productos alimenticios, las recuperaciones para concentraciones de 1 y 2 μg/Kg deben arrojar valores de entre el 70 y el 110%. En nuestro caso se han obtenido las siguientes recuperaciones: 53 Tabla (21): (Continuación) Autor Alimento Origen Aflatoxinas Ariño et al., 2009 Pistacho Irán 0,12 µg/Kg de B 1 0,06 µg/Kg de B 2 Castells et al., 2008 Maíz Argentina 2,6 µg/Kg de AFTs Sook et al., 2007 Cacahuete Pistacho Corea 0,20 µg/Kg de AFTs 3,41 µg/Kg de AFTs EFSA, 2007 Pistacho Almendra Avellana Cacahuete Maíz Unión europea 19,3 µg/Kg de AFTs 1,72 µg/Kg de aFTs 1,6 µg/Kg de AFTs 2,57 µg/Kg de AFTs 0,29 µg/Kg de AFTs AFTs: Aflatoxinas totales (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) Son varios los artículos que describen la existencia de altos niveles de contaminación en las muestras de pistachos. Según Cheraghali et al. (2007), el 7,5 % de las muestras de pistacho analizadas (10068 muestras procedentes de Irán) mostraron una contaminación por aflatoxinas superior a 15 µg/Kg. Juan et al., (2008), hallaron en su estudio que el 5 % de las muestras de pistacho (de un total de 20 muestras procedente de Marruecos) que analizó superaban los límites máximos. En nuestro caso, al tratarse de una sola muestra es lógico pensar en llevar a cabo una repetición del análisis realizado para descartar posibles errores de muestreo. Teniendo en cuenta que son muy pocas muestras y que el valor del pistacho muy contaminado no tiene que tomarse en cuenta debido a que está fuera de rango, se realizó un análisis de varianza ANOVA con el objetivo de comprobar si las diferencias encontradas entre las distintas muestras de materia prima eran significativas desde el punto de vista estadístico. El análisis realizado mostró que las diferencias encontradas entre los niveles de contaminación de las distintas materias primas no eran estadísticamente significativas (p > 0,05). Si nos fijamos ahora en las muestras que contenían chocolate, vemos que al contrario que en las muestras de materia prima que en algunas de ellas no se detectó ningún tipo de contaminación, en el 100% de éstas se identificaron una o varias de las aflatoxinas estudiadas en concentraciones por encima del límite de detección. Además se puede observar un patrón de contaminación diferente que en las muestras de materia prima, al detectarse un mayor número de aflatoxinas en las muestras estudiadas, siendo la B 1 la aflatoxina que mayor concentración presentó en todos los casos, seguida de la G 1 , a continuación la B 2 y por último la G 2 . Sin embargo, las muestras con chocolate presentan mayor incidencia de contaminación y por más tipos de aflatoxinas que las de materia prima, y esto puede ser explicado por la posible contaminación por micotoxinas en el chocolate de 54 cobertura. Así, Copetti et al. (2011) analizaron muestras de cacao en las que apareció contaminación por aflatoxinas, aunque a una concentración inferior a 0,5 µg/Kg. Es más, el chocolate, además del cacao, tiene otros componentes que le podrían aportar contaminación de aflatoxinas (la lecitina de soja o girasol, el almidón de maíz, la vainilla, etc). De la misma manera, hay muestras que tienen añadido cereal en su composición y también puede aportar contaminación al producto total. Además, en esta contaminación de las muestras con chocolate, también puede influir la forma de adición del mismo. Mientras que la materia prima está formada por unidades de frutos secos y la presencia de aflatoxinas es bastante heterogénea, en las muestras con chocolate, el recubrimiento se realiza en forma líquida y por lo tanto puede tener la contaminación por aflatoxinas repartida homogéneamente por todo el volumen. La concentración media de cada aflatoxina en el total de las muestras con cobertura de chocolate, se calculó igualmente considerando un valor igual a la mitad del límite de cuantificación para las muestras con aflatoxinas en concentraciones que estaban por debajo del límite de detección (Ariño et al., 2009). Así obtuvimos unos valores de 0,036 µg/Kg para G 2 , 0,12 µg/Kg para G 1 , 0,05 µg/Kg para B 2 y 0,18 µg/Kg para B 1 . Además, se pudo observar que mientras para G 2 las concentraciones son siempre de 0,04 µg/Kg, para G 1 varían entre 0,13 y 0,15 µg/Kg y para B 2 están entre 0,04 y 0,06, en el caso de los valores de las concentraciones de B 1 éstos mostraban mayor variabilidad con concentraciones que oscilaban entre 0,09 y 0,34 µg/Kg. Se realizó un análisis de varianza ANOVA entre las diferentes materias primas con cobertura de chocolate y se determinó que no había diferencias significativas entre ellas (p > 0,05). En cualquier caso y al igual que en las muestras de materia prima, las tasas de contaminación de estas muestras eran muy bajos e inferiores a los límites máximos establecidos en la legislación para estos productos. Finalmente, otro análisis de varianza ANOVA comparando todas las muestras de materia prima (con excepción del pistacho fuera de rango) con todas las muestras de chocolate reveló que tampoco había diferencias significativas (p > 0,05) entre ambas. 55 6-Conclusiones 1.-La metodología analítica optimizada y validada en este estudio garantiza la extracción de las aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 de forma selectiva de muestras de frutos secos y cereales con una disolución de metanol al 70% y cloruro sódico, la adecuada separación del analito del resto de sustancias interferentes que puedan aparecer durante el proceso mediante el uso de columnas de inmunoafinidad y la resolución óptima y detección sensible y selectiva de las diferentes aflatoxinas mediante cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC) con detector de fluorescencia. 2.- Esta metodología analítica ha demostrado capacidad para proporcionar resultados satisfactorios en el análisis de aflatoxinas en frutos secos y cereales, cumpliendo los criterios de especificidad, linealidad, sensibilidad, exactitud y precisión establecidos a nivel internacional. 3.-El perfil de contaminación de las muestras de materia prima refleja la presencia mayoritaria de las aflatoxinas B 1 y B 2 , salvo en el caso de la avellana en la que se detectaron también concentraciones de aflatoxina G 1 . El perfil de contaminación de las muestras con chocolate, sigue un patrón diferente, al estar la mayor parte de ellas contaminadas con las cuatro aflatoxinas. 4.- Las tasas de contaminación de aflatoxinas en las muestras con chocolate fueron superiores a las halladas en las muestras de materia prima, lo que añadido a la diferencia en el perfil de contaminación, hace pensar en un aporte adicional de micotoxinas por el chocolate añadido, aunque en ningún caso estas diferencias fueron estadísticamente significativas. 5.-Las tasas de contaminación de aflatoxinas en muestras de frutos secos y cereal, son bajas, del mismo orden que las detectadas actualmente en otros países y se encuentran por debajo de los límites máximos establecidos por la legislación para estos alimentos, salvo el caso de una muestra de pistacho con concentraciones de estos compuestos muy por encima de estos límites (393,6 ng/g para la suma de las cuatro aflatoxinas). 56 7-Bibliografía -Abdulkadar, A. H. 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