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Estudio de los vasos extraembrionarios en el embrión de pollo (Gallus gallus domesticus) TRABAJO FIN DE MASTER presentada por: Amaya Loidi Castillo Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza CERTIFICACIÓN D. Julio Gil García, Profesor Titular de Universidad en la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza Certifica: Que el trabajo titulado, Estudio de los vasos extraembrionarios en el embrión de pollo (Gallus gallus domesticus), que se recoge en el presente Trabajo Fin de Máster, ha sido realizado bajo mi dirección por D. Amaya Loidi Castillo, en los laboratorios del Departamento de Anatomía, Embriología y Genética Animal. Estando en condiciones de realizar su defensa. Y para que conste firmo el presente escrito en Zaragoza a 27 de agosto de 2012. Fdo. Julio Gil García DEDICATORIA / AGRADECIMIENTOS Agradezco al grupo SADA por los ejemplares donados para la realización de este trabajo. Y a la Dra. Teresa Tejedor, sus sugerencias para escoger las pruebas estadísticas más adecuadas a los datos obtenidos. Quiero dedicar este trabajo a mi familia y amigos por haber estado siempre a mi lado, apoyándome, escuchándome y ayudándome cuando veían que les necesitaba. A mis compañeras de departamento por hacerme el trabajo más ameno. Y finalmente al director del mismo, el Dr. Dn. Julio Gil García por la paciencia y comprensión mostrada, su dedicación y el trato recibido. ÍNDICE página I ÍNDICE ÍNDICE página II ÍNDICE página III Introducción 1 - Formación de los vasos sanguíneos extraembrionarios. 3 - La circulación corioalantoidea. 5 - Objetivo del trabajo. 6 Material y métodos 7 - Embriones. 9 - Estadio 14 de desarrollo. 9 - Estadio 15 de desarrollo. 10 - Estadio 16 de desarrollo. 11 - Estadio 17 de desarrollo. 12 - Estadio 18 de desarrollo. 13 -Protocolo de incubación. 14 - Material gráfico. 15 - Codificación de los vasos. 17 - Medida de la densidad vascular. 20 - Análisis estadístico. 23 - Filmación del desarrollo. 24 -Bloqueo de los vasos. 25 Resultados 29 - Material gráfico. 31 - Medida de la densidad vascular. 31 - Correlación dentro de cada estadio. 35 - Correlación entre estadios. 45 - Test de Kolmogorov-Smirnov. 51 - Filmación del desarrollo. 61 - Bloqueo de los vasos. 61 Discusión 63 Conclusiones 69 Bibliografía 73 ÍNDICE página IV INTRODUCCIÓN página 1 INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN página 2 MATERIAL y MÉTODOS página 9 Embriones Se han utilizado embriones procedentes de huevos fértiles de gallina (Gallus gallus domesticus, Linneo 1758) variedad Ros con 38-40 semanas de edad. En total se han utilizado 606 huevos que habitualmente se manipulaban en lotes de 30. Los embriones utilizados se incubaron entre los estadios 14 y 18 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915), que morfológicamente están caracterizados por: Estadio 14. 22 somitos. 50-53 horas. En la flexura craneal los ejes del prosencéfalo y del rombencéfalo forman un ángulo casi recto. La flexión cervical describe una amplia curva. La rotación del cuerpo se produce a la altura de los somitos 7-9. Detrás de este nivel, aparece una ligera flexura conocida como la flexura del tronco. Los arcos viscerales 1 y 2 y las hendiduras 1 y 2 se definen. Los arcos posteriores no están definidos. La vesícula óptica primaria comienza a invaginarse; la lente se forma. Se abren los conductos auditivos. La bolsa de Rathke se puede reconocer. La torsión ventricular del corazón se encuentra ventral al canal atrio-ventricular. El amnión se extiende por los somitos 7-10. Figura 1: Estadio 14 (Hamburger y Hamilton, 1915) Estadio 15. 50-55horas. Los pliegues laterales del cuerpo se extienden hasta los somitos 15-17. Las posibles áreas donde se desarrollaran las extremidades todavía no están demarcadas. Existe una discreta condensación de mesodermo a la altura de la futura ala. Hay unos 24-27 somitos. El amnión se extiende por los somitos 7-14. En la flexura craneal: los ejes del prosencéfalo y del romboencéfalo forman un ángulo agudo. Los contornos ventrales de ambos están casi paralelos. La flexura cervical describe una amplia curva. El tronco está definido. La rotación se extiende de los somitos 11 a 13. El arco visceral 3 y la hendidura 3 se definen. Este último es más corto que la hendidura 2 y normalmente tiene forma oval. La copa óptica está completamente formada; un doble contorno se define en la región del iris. Figura 2: Estadio 15 (Hamburger y Hamilton, 1915) página 10 MATERIAL y MÉTODOS Estadio 16. 51-56horas. Los pliegues laterales del cuerpo se extienden por los somitos 17-20, entre las alas y las patas. Las alas se forman a partir de blastodermo de los pliegues laterales del cuerpo, se observa una cresta. El primordio de la pierna está todavía plano, representado por una condensación de mesodermo. Hay unos 26-28 somitos. El amnión se extiende por los somitos 10-18. Todas las flexuras están más acentuadas que en el estadio 15. La rotación se extiende por los somitos 14-15. El primordio de la cola es un cono corto y recto, delimitado por blastodermo. La tercera hendidura todavía tiene forma oval. Alargamiento del prosencéfalo; las constricciones entre las partes del cerebro se acentúan. La epífisis está indefinida o sin formar todavía. Figura 3: Estadio 16 (Hamburger y Hamilton, 1915) página 11 MATERIAL y MÉTODOS Estadio 17. 52-64horas. Los pliegues laterales del cuerpo se extienden alrededor de toda la circunferencia del cuerpo. Los primordios de las alas y de las patas se forman a partir de blastodermo de los pliegues laterales del cuerpo. Ambos están definidos por una zona inflamada de igual tamaño. Hay unos 29-32 somitos. Existe una considerable variabilidad en el amnión; el tronco posterior y la cola desde aproximadamente el somito 26 están sin cubrir excepto en un orificio oval sobre los somitos 28-36. La flexura craneal no cambia. La flexura cervical está más curvada que en estadios anteriores pero su ángulo todavía es mayor de 90º. La flexura del tronco se define en el nivel braquial. La rotación se extiende a los somitos 17-18. El primordio de la cola se curva centralmente. Está formado por mesodermo. La epífisis se define como una protuberancia. Existen indicios de las fosas nasales. El alantoides no está todavía formado. Figura 4: Estadio 17 (Hamburger y Hamilton, 1915) página 12 MATERIAL y MÉTODOS Estadio 18: 65-69horas. Los primordios de las extremidades se agrandan; los primordios de las piernas crecen más ligeramente que los primordios de las alas. Hay unos 30-36 somitos. El amnión normalmente está cerrado, a veces aparece un orificio oval en la región lumbar. En la flexura cervical, el eje de la medula forma, aproximadamente, un ángulo recto con el eje del tronco posterior. La flexura del tronco se desplaza a la región lumbar. La rotación se extiende a la parte posterior del cuerpo. El primordio de la cola se gira a la derecha formando un ángulo de unos 90º con el eje del tronco posterior. El proceso maxilar está ausente o no se aprecia. La cuarta hendidura está sin definir o ausente. El alantoides es una bolsa pequeña y gruesa, todavía no es vesicular. Figura 5: Estadio 18 (Hamburger y Hamilton, 1915) página 13 MATERIAL y MÉTODOS Protocolo de incubación. El protocolo de trabajo conlleva las siguientes fases: - La cáscara del huevo se limpiaba con agua y etanol (Panreac) al 90%. - De cada huevo se extraían unos 7ml de albúmina, mediante un orificio practicado en el polo más agudo del huevo. Orificio que luego se cerraba con cinta adhesiva. Con esto se consigue disminuir el nivel hidrostático del albumen que envuelve al embrión, quedando protegido en manipulaciones subsiguientes. - Incubación (incubadora marca Memmert) durante un máximo de tres días, a 38ºC y humedad a saturación, mediante la inclusión de recipientes con agua dentro de la incubadora. Los huevos se disponían sobre regletas de madera con una marca en su parte superior, destinada a mantener localizable la parte donde encontraremos el embrión en la mayoría de casos según la regla de von Baer (Von Baer, 1828). - El segundo día de incubación se procedía a la apertura de una ventana en la parte superior del huevo por la que se podía observar y manipular el embrión. Esta ventana era cubierta con cinta adhesiva transparente antes de retornar el huevo a la incubadora, para evitar la deshidratación del embrión. - En el tercer día de incubación se retiraba el celo para obtener información gráfica sobre el desarrollo embrionario. Como consecuencia de la manipulación y del transporte se apreció un desfase de unas 6 horas entre el desarrollo observado y el descrito en los libros. Así, en los libros, a las 72 horas de incubación se obtienen embriones de 35 somitos en el estadio 18. Sin embargo, los que se iban obteniendo durante la investigación estaban alrededor de los estadios 14, 15, 16 o 17. Este desfase puede considerarse normal y asignable a un tiempo de activación preciso tras la latencia en que quedan sometidos los embriones por la falta de continuidad entre la puesta y el comienzo de la incubación. - En algunos lotes de huevos se prolongó la incubación un día más, y así disponer de información comparativa sobre etapas posteriores a las que focalizaron la experimentación. página 14 MATERIAL y MÉTODOS Material Gráfico Para la obtención de todas las fotografías y vídeos se ha usado un microscopio digital (Reflecta DigiMicroscope USB de 200 aumentos y resolución de 2 megapíxeles) capaz de almacenar las filmaciones en un ordenador (Acer Extensa 5620Z) a través de un puerto USB. Otros procedimientos como: microscopía de fluorescencia y laser doppler (ver Figuras 1, 2 y 3), se mostraron inadecuados a nuestro objetivo. Bien por alterar la morfología normal de los vasos embrionarios; bien por carecer de sensibilidad para detectar el flujo vascular en estos estadios embrionarios tempranos. Figura 1: embrión fotografiado con la camara del laser doppler. página 15 MATERIAL y MÉTODOS Las imágenes obtenidas mediante el microscopio USB se clasificaron según el estadio embrionario, tal y como se referencian por Hamburger y Hamilton (Hamburger and Hamilton, 1915), determinado a partir de la morfología del embrión y de sus vasos corioalantoideos, así como en los intraembrionarios, especialmente en el número de arcos aórticos ya que debido a la resolución de las imágenes determinar el número de somitos no era posible, por quedar enmascarados bajo otras estructuras embrionarias. Figuras 2 y 3: imágenes obtenidas aplicando el laser doppler. En ninguna de ellas se aprecia el flujo sanguíneo. En la imagen de la izquierda los artefactos que se aprecian están producidos por los latidos del corazón del embrión. página 16 MATERIAL y MÉTODOS Codificación de los vasos Para esta fase del trabajo, y muy especialmente para las que vendrán en años posteriores, es esencial identificar morfológica y semánticamente los vasos. En ausencia de una referencia normalizada para los vasos extraembrionarios hasta el nivel de ramificación que estudiamos, decidimos establecer un sistema que codificaba los vasos. Este sistema utiliza el siguiente código alfanumérico, mediante el que se pueden nombrar los vasos en un lenguaje interpretable por un autómata finito (ver Figuras 5 y 6). - Cada rama se identificó con una letra que hace referencia a su orientación con respecto a la de referencia (U, L, D o R) - Los números son enteros y hacen referencia tanto a la rama como al orden de ramificación. - Del embrión parten los vasos principales que identificamos como U1, L1, D1 y R1. - Cada uno de estos se consideró como una referencia independiente de los otros vasos principales. Y respecto a él se estableció una orientación para todas sus ramas. - Los números se colocaban en orden correlativo. Los más altos se adjudicaban a niveles de ramificación más alejados. En puntos donde emergían varios vasos, todos obtenían el mismo número y solo diferían en la letra que indicaba su orientación. página 17 MATERIAL y MÉTODOS Figura 5: fotografia obtenida con el microscopio USB. página 18 MATERIAL y MÉTODOS Bloqueo de los vasos Algunos vasos principales se bloquearon selectivamente para estudiar las posibles consecuencias vasculares derivadas de esta acción. La manipulación previa antes de la incubación se realizó de igual modo que en la primera experiencia. Los huevos se abrían aproximadamente a las 55 horas de incubación y se procedía a bloquear, o anular, ciertos vasos bien referenciados por nuestro sistema de codificación. Después se devolvían a la incubadora. Al día siguiente se procedía a bloquear los vasos de los embriones cuyo desarrollo había sido más lento y aquellos que no habían sido correctamente realizados el día anterior. Se continuaba con su incubación y al día siguiente se comprobaban los resultados obtenidos. El bloqueo de los vasos se comenzó a realizar cauterizándolos con una aguja al rojo. Sin embargo, este método implicaba una alta mortalidad de los embriones por lo que se decidió cambiar de técnica y bloquear los vasos mediante compresión de los mismos con unas pinzas el tiempo suficiente para conseguir anular la vascularización vehiculada por dicho vaso (ver Figuras 12, 13, 14, 15 y 16) Figura 12: embrión en estadio 15. página 25 MATERIAL y MÉTODOS Figura 13: bloqueo por compresión. Figura 14: venas vitelinas craneales derecha e izquierda bloqueadas. página 26 MATERIAL y MÉTODOS Figura 15: resultado del bloqueo. Figura 16: detalle de las venas vitelinas craneales inmediatamente después del bloqueo. página 27 MATERIAL y MÉTODOS MATERIAL y MÉTODOS página 28 RESULTADOS RESULTADOS página 29 RESULTADOS página 30 RESULTADOS página 31 Material Gráfico Se obtuvieron 99 imágenes de embriones en distintos estadios embrionarios: - Once embriones en el estadio 14. - Veintinueve embriones en el estadio 15. - Veintiséis embriones en los estadios 16 y 17. - Siete embriones en el estadio 18. Cada una de estas imágenes se codificó según lo explicado en el apartado material y métodos. Las codificaciones recogidas para cada embrión servirán como base para futuros análisis morfométricos sustentados en la medida de la complejidad vascular según su entropía. Las imágenes obtenidas están recogidas en el CD que acompaña a este trabajo (Anexo I). Medida de la Densidad Vascular. Después de aplicar el procedimiento descrito en el apartado anterior, las densidades vasculares medidas en píxeles obtenidas fueron las que se detallan en la Tabla 1 para la el árbol vascular (D.V ÁRBOL VASCULAR), el embrión (D.V. EMBRIÓN) y la membrana corioalantoidea (D.V. MCA). Las imágenes a partir de las cuales se obtuvieron las distintas densidades vasculares están recogidas en el CD que acompaña a este trabajo (Anexo II). Tabla 1. EMBRIÓN D.V. ÁRBOL VASCULAR D.V. EMBRIÓN D.V. MCA D.V. CORREGIDA ESTADIO 1 118576 134791 118591 1.136603958 15 2 116174 147986 116272 1.272756984 15 3 395376 409395 395625 1.034805687 14 4 104421 137316 104405 1.315224367 15 5 231286 245907 231410 1.062646385 16 6 237095 243382 237229 1.025936964 14 7 185617 194524 186095 1.04529407 14 8 312611 326635 312854 1.044049301 15 9 174655 181391 174208 1.04123232 17 10 315331 325286 315336 1.031553644 15 11 209126 223457 208701 1.070704022 16 12 273804 280709 274420 1.022917426 16 13 268732 282420 268798 1.05067746 16 14 313446 330713 313553 1.05472759 16 15 306159 315768 306244 1.031099385 17 16 240809 257723 240670 1.070856359 17 17 193256 211094 193362 1.091703644 16 18 203558 211162 203632 1.036978471 16 19 193233 197024 193304 1.019244299 14 20 145435 165726 145206 1.141316475 16 21 244509 270834 244570 1.107388478 17 22 248895 254023 248963 1.020324305 15 23 172284 177568 172339 1.030341362 14 24 239912 247113 239995 1.029658951 15 25 313161 325283 313072 1.039003807 16 26 258128 265243 258036 1.027930211 17 27 218161 229240 218227 1.050465799 16 28 224684 233145 224811 1.03707114 17 29 203029 220303 203116 1.084616672 16 30 182539 188334 182511 1.031904926 14 31 305978 312190 305717 1.021173176 15 32 336248 347917 336278 1.034611244 16 33 219736 229921 218841 1.050630366 15 página 32 RESULTADOS 34 275261 280643 275362 1,019178391 16 35 278146 284637 278151 1,02331827 16 36 282980 297203 283121 1,049738451 17 37 305780 324788 305808 1,062065087 17 38 344543 353286 344132 1,026600258 16 39 315598 331359 315215 1,051215837 17 40 389090 397809 389183 1,02216438 17 41 277911 286577 278124 1,030392918 14 42 296190 306995 296232 1,036333009 17 43 323706 337011 324154 1,039663246 16 44 263303 269544 263458 1,023100456 15 45 268298 278292 268383 1,036921116 16 46 269992 280822 270079 1,03977725 17 47 138621 146033 138715 1,05275565 15 48 163676 172245 163714 1,052109166 15 49 233062 244229 233105 1,047720984 17 50 188241 195836 188440 1,039248567 17 51 269075 284796 269346 1,057361164 16 52 292301 302660 292363 1,035219915 17 53 137662 144532 137797 1,048876245 15 54 325443 338552 325537 1,039980094 15 55 299595 309169 299708 1,031567392 16 56 377672 395498 377591 1,047424329 16 57 313471 330201 314192 1,050952921 15 58 108121 128738 108164 1,190211161 17 59 375340 397679 375261 1,059739754 14 60 342365 351390 342447 1,02611499 14 61 270860 279640 270734 1,032895757 15 62 302890 317353 303076 1,047106996 15 63 230172 236971 230336 1,028805745 15 64 357001 367182 357058 1,028353937 15 65 112834 133885 112912 1,185746422 17 66 339686 352761 339824 1,038069707 16 67 168469 180804 168374 1,07382375 14 68 360916 373598 362138 1,031645395 16 69 318115 327156 317867 1,029222914 15 página 33 RESULTADOS Aunque todos los embriones fueron fotografiados a la misma escala, para corregir las diferencias en el desarrollo embrionario de cada embrión se ha relativizado la densidad vascular de la membrana corioalantoidea al tamaño del embrión valorado en función de su densidad vascular. Este valor se refleja en la columna D.V CORREGIDA. 70 291207 296487 291262 1,017939175 15 71 248050 254635 248328 1,025397861 16 72 167319 172632 167391 1,031309927 14 73 207031 212608 207134 1,026427337 15 74 179367 185744 179436 1,035154596 15 75 348025 355364 348125 1,020794255 15 76 330121 345184 330039 1,045888516 16 77 315741 323747 315501 1,026136209 15 78 290134 295255 290089 1,017808328 15 79 103226 120753 103257 1,169441297 16 80 271606 281167 272081 1,033394467 17 81 235311 241720 235375 1,026956984 16 82 286857 297708 286906 1,037649962 17 83 347297 368506 347338 1,060943519 18 84 341891 353667 342026 1,034035424 17 85 121867 131947 121950 1,08197622 17 86 119700 145878 119727 1,21842191 18 87 335922 348937 336085 1,038240326 15 88 249151 261050 249174 1,047661474 17 89 315847 322278 315425 1,021726242 15 90 371131 378964 371163 1,02101772 17 91 111268 128751 111298 1,15681324 15 92 294842 302845 294681 1,027704535 17 93 330858 343416 330889 1,037858617 18 94 253524 273615 253532 1,07921288 17 95 380385 387718 379962 1,020412568 18 96 100169 111068 100168 1,108817187 18 97 347841 380106 347919 1,092512912 18 98 285114 294139 284826 1,032697155 18 99 395832 406214 396538 1,024401192 17 página 34 RESULTADOS Correlación en el estadio 17 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). Tabla 5.1. ESTUDIO DE LA CORRELACIÓN EN EL ESTADIO 17 EMBRIÓN D.V. EMBRIÓN D.V. MCA D.V. CORREGIDA ESTADIO 9 181391 174208 1,04123232 17 15 315768 306244 1,031099385 17 16 257723 240670 1,070856359 17 21 270834 244570 1,107388478 17 26 265243 258036 1,027930211 17 28 233145 224811 1,03707114 17 36 297203 283121 1,049738451 17 37 324788 305808 1,062065087 17 39 331359 315215 1,051215837 17 40 397809 389183 1,02216438 17 42 306995 296232 1,036333009 17 46 280822 270079 1,03977725 17 49 244229 233105 1,047720984 17 50 195836 188440 1,039248567 17 52 302660 292363 1,035219915 17 58 128738 108164 1,190211161 17 65 133885 112912 1,185746422 17 80 281167 272081 1,033394467 17 82 297708 286906 1,037649962 17 84 353667 342026 1,034035424 17 85 131947 121950 1,08197622 17 88 261050 249174 1,047661474 17 90 378964 371163 1,02101772 17 92 302845 294681 1,027704535 17 94 273615 253532 1,07921288 17 99 406214 396538 1,024401192 17 página 41 RESULTADOS Tabla 5.2. El valor de la correlación de Pearson es de 0,998. Figura 20: correlación en el estadio 17. página 42 RESULTADOS Correlación en el estadio 18 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). Tabla 6.1. ESTUDIO DE LA CORRELACIÓN EN EL ESTADIO 18 EMBRIÓN D.V. EMBRIÓN D.V. MCA D.V. CORREGIDA ESTADIO 83 368506 347338 1,060943519 18 86 145878 119727 1,21842191 18 93 343416 330889 1,037858617 18 95 387718 379962 1,020412568 18 96 111068 100168 1,108817187 18 97 380106 347919 1,092512912 18 98 294139 284826 1,032697155 18 Figura 21: correlación en el estadio 18. página 43 RESULTADOS Tabla 6.2. El valor de la correlación de Pearson es de 0,997. página 44 RESULTADOS A continuación, se procedió a estudiar la posible correlación existente entre estadios. Para ello se utilizó la densidad vascular corregida (ver Tabla 7). Como el tamaño de cada muestra era diferente se optó por una prueba T para calcular la correlación (ver Tablas 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17). Tabla 7. ESTUDIO DE LA POSIBLE CORRELACIÓN EXISTENTE ENTRE ESTADIOS d.corregida e14 d.corregida e15 d.corregida e16 d.corregida e17 d.corregida e18 1,034805687 1,136603958 1,062646385 1,04123232 1,060943519 1,025936964 1,272756984 1,070704022 1,031099385 1,21842191 1,04529407 1,315224367 1,022917426 1,070856359 1,037858617 1,019244299 1,044049301 1,05067746 1,107388478 1,020412568 1,030341362 1,031553644 1,05472759 1,027930211 1,108817187 1,031904926 1,020324305 1,091703644 1,03707114 1,092512912 1,030392918 1,029658951 1,036978471 1,049738451 1,032697155 1,059739754 1,021173176 1,141316475 1,062065087 1,02611499 1,050630366 1,039003807 1,051215837 1,07382375 1,023100456 1,050465799 1,02216438 1,031309927 1,05275565 1,084616672 1,036333009 1,052109166 1,034611244 1,03977725 1,048876245 1,019178391 1,047720984 1,039980094 1,02331827 1,039248567 1,050952921 1,026600258 1,035219915 1,032895757 1,039663246 1,190211161 1,047106996 1,036921116 1,185746422 1,028805745 1,057361164 1,033394467 1,028353937 1,031567392 1,037649962 1,029222914 1,047424329 1,034035424 1,017939175 1,038069707 1,08197622 1,026427337 1,031645395 1,047661474 1,035154596 1,025397861 1,02101772 1,020794255 1,045888516 1,027704535 1,026136209 1,169441297 1,07921288 1,017808328 1,026956984 1,024401192 1,038240326 1,021726242 1,15681324 página 45 RESULTADOS Tabla 8: Estudio de la correlación entre el estadio 14 y el 15 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. bilateral, su valor es de 0,327. Tabla 9: Estudio de la correlación entre el estadio 14 y el 16. El p-valor se encuentra el la casilla sig. bilateral, su valor es de 0,189. página 46 RESULTADOS Tabla 10: Estudio de la correlación entre el estadio 14 y el 17 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. bilateral, su valor es de 0,172. Tabla 11: Estudio de la correlación entre el estadio 14 y el 18 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. bilateral, su valor es de 0,138. página 47 RESULTADOS Tabla 12: Estudio de la correlación entre el estadio 15 y el 16 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. bilateral, su valor es de 0,661. Tabla 13: Estudio de la correlación entre el estadio 15 y el 17 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. bilateral, su valor es de 0,856. página 48 RESULTADOS Tabla 14: Estudio de la correlación entre el estadio 15 y el 18 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. bilateral, su valor es de 0,462. Tabla 15: Estudio de la correlación entre el estadio 16 y el 17 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. bilateral, su valor es de 0,724. página 49 RESULTADOS Tabla 16: Estudio de la correlación entre el estadio 16 y el 18 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. bilateral, su valor es de 0,127. Tabla 17: Estudio de la correlación entre el estadio 17 y el 18 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. bilateral, su valor es de 0,237 página 50 RESULTADOS Tablas 24: Test de Kolmogorov-Smirnov entre el estadio 15 y el 18 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. asintót. (bilateral), su valor es de 0,169; 0,169 y 0,240. página 57 RESULTADOS Tablas 25: Test de Kolmogorov-Smirnov entre el estadio 16 y el 17 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. asintót. (bilateral), su valor es de 0,918; 0,918 y 0,995 página 58 RESULTADOS Tablas 26: Test de Kolmogorov-Smirnov entre el estadio 16 y el 18 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. asintót. (bilateral), su valor es de 0,503; 0,406 y 0,503. página 59 RESULTADOS Tablas 27: Test de Kolmogorov-Smirnov entre el estadio 17 y el 18 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915). El p-valor se encuentra el la casilla sig. asintót. (bilateral), su valor es de 0,291; 0,291 y 0,652. página 60 RESULTADOS Filmación del desarrollo. Al término de la incubación se obtuvieron 1652 fotografías con las que se montó una película en la que se puede apreciar el desarrollo embrionario. Las imágenes obtenidas están recogidas en el CD que acompaña a este trabajo (Anexo III). La película también puede encontrarse en el CD (Video I) Bloqueo de los vasos. La inferencia de conclusiones basada solo en los resultados de los estadios normales, es meramente especulativa. Ello cambia cuando se introducen datos experimentales procedentes de la alteración controlada del desarrollo normal, que dado el objetivo del trabajo, se centro en el bloqueo de ciertos vasos. De los 70 bloqueos realizados en embriones han sobrevivido 34 con bloqueos en las venas vitelinas craneales derecha e izquierda, en la arteria umbilical, en los vasos vitelinos izquierdos y en los vasos vitelinos derechos. En algunos casos los vasos bloqueados desaparecían y los cercanos crecían hacia el espacio dejado por ellos. En otros casos se producía una reorganización de los vasos bloqueados. En total de los 34 embriones: - 12 sufrieron una revascularización de la zona a través de vasos de nueva formación. - 4 tuvieron asociada a esa revascularización un crecimiento de los vasos más cercanos. - En 6 embriones, el vaso bloqueado desapareció y su vascularización fue suplida por los que estaban cerca. - En 2 casos, el bloqueo desapareció pero la zona se revascularizó con vasos de nueva formación y con ramas de los cercanos. - En 8 embriones aparentemente no tuvo efecto la anulación del vaso. El trayecto del mismo se veía modificado pero no se apreciaba la formación de nuevos vasos o un mayor crecimiento de los existentes hacia esa zona. Las imágenes obtenidas están recogidas en el CD que acompaña a este trabajo (Anexo IV). página 61 RESULTADOS RESULTADOS página 62 DISCUSIÓN página 63 DISCUSIÓN DISCUSIÓN página 64 DISCUSIÓN página 65 La membrana corioalantoidea es una membrana fina que posee una extensa red vascular. Los métodos que se suelen usar para detectar alteraciones en ella suelen estar limitados a tecnicas in vitro (DeFouw et al., 1989; Strick et al., 1991; Nguyen, Shing, Folkman 1994) Existen otros métodos como la tecnica DSA para el análisis in vivo (Siamblis et al., 1996; Nikiforidis et al., 1999) En este trabajo se han obtenido y analizado densitométricamente 99 imágenes del desarrollo vascular normal de la membrana corioalantoidea, entre los estadios, 14 y 18 de Hamburger y Hamilton (Hamburger y Hamilton, 1915); así como de 34 embriones donde se alteró experimentalmente y de forma controlada el normal desarrollo vascular de la membrana corioalantoidea. La técnica que se ha utilizado para medir las densidades vasculares en este trabajo tiene como principal ventaja la no introducción de sustancias extrañas que puedan afectar el desarrollo embrionario normal, así como una agresividad muy limitada ya que no necesita cateterizaciones del embrión ni medios de contraste como ocurre en el DSA. Cuando estos medios de contraste no difunden a través de la totalidad del sistema vascular las partes distales de los vasos de la membrana corioalantoidea y especialmente los vasos pequeños no se visualizan (Nikiforidis et al., 1999) Por otro lado, en la técnica usada en este trabajo solo se debe aplicar un filtro para preparar la imagen y dejar al descubierto los píxeles que ocupan las distintas densidades vasculares frente a otras técnicas de procesado de imagen que incorporan sustancias extrañas al embrión. (Nikiforidis et al., 1999). Las medidas que se han obtenido después de aplicar el tratamiento de las imágenes han sido la densidad total del árbol vascular, la densidad vascular del embrión y la densidad vascular de la membrana corioalantoidea. Al comparar los datos obtenidos para la densidad vascular del embrión y para la densidad vascular de la membrana corioalantoidea dentro de cada estadio investigado se ha obtenido una correlación muy alta entre ellos (ver Tabla 28), lo que confirma la uniformidad en las características morfológicas medidas en los embriones usados para cada estadio. Ello también dará consistencia a las inferencias estadísticas procedentes de las comparaciones entre estadios embrionarios distintos. Tabla 28: datos extraídos de las tablas 2.2, 3.2, 4.2, 5.2 y 6.2. Para comparar estadios se ha elegido una prueba T ya que las muestras tenían distinto tamaño. Esta prueba se realizó con las densidades vasculares corregidas. Observando que los valores de significación para la prueba de Levene son mayores que 0,05 (ver Tabla 29) asumimos que las varianzas de las densidades corregidas de los distintos estadios son iguales. Sin embargo, el valor para la comparación entre el estadio 14 y el 18 indica que no podemos asumir que sus varianzas sean iguales. Fijándonos en el p-valor que nos aporta la prueba T, tanto si se asumen varianzas iguales como si no se asume este supuesto, (ver Tabla 29), observamos que los datos obtenidos son mayores que nuestro nivel de significación (0,05) por lo que no se rechaza la hipótesis nula que presumía una igualdad entre las medias. Esto confirma que existe una correlación entre los diferentes estadios. Tabla 29: datos extraídos de las tablas 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 y 17. página 66 DISCUSIÓN BIBLIOGRAFÍA página 73 BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA página 74 BIBLIOGRAFÍA página 75 Balinsky BI. Introducción a la Embriología. Barcelona: Ed. Omega. 1983. pp. 307, 308, 313. 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