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DESARROLLO DE MODELOS CELULARES PARA EL ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES PRIÓNICAS BASADOS EN EL USO DE CÉLULAS MESENQUIMALES OVINAS: OBTENCIÓN, ESTUDIO Y CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS MESENQUIMALES OVINAS Autor DIEGO RUBÉN MEDIANO MARTÍN-MAESTRO MÁSTER EN INICIACIÓN A LAS CIENCIAS VETERINARIAS Directoras INMACULADA MARTÍN BURRIEL ROSA MARIA BOLEA BAILO Facultad de Veterinaria 2012 Trabajo Fin de Máster 1 ÍNDICE 1. RESUMEN .................................................................................................................. 3 2. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 4 2.1 Enfermedades Priónicas ....................................................................................... 4 2.1.1 Agente causal: teoría de la proteína prión...................................................... 6 2.1.3 Expresión y funciones de PrPC ...................................................................... 8 2.1.4 Alteraciones de la función fisiológica y neurodegeneración ......................... 9 2.2 Scrapie .................................................................................................................. 11 2.2.1 Características clínicas del scrapie .............................................................. 12 2.2.2 Diagnóstico de scrapie ................................................................................. 13 2.2.3 Aislados priónicos asociados a la enfermedad de scrapie ........................... 16 2.2.4 Susceptibilidad genética a scrapie ............................................................... 18 2.2.4.1 Estructura del gen PRNP .................................................................... 18 2.2.4.2 Susceptibilidad a las formas clásicas de scrapie ................................ 19 2.2.4.3 Susceptibilidad a otras cepas priónicas ............................................. 20 2.3 Modelos celulares para el estudio de las enfermedades priónicas .................. 21 2.3.1. Líneas celulares murinas ............................................................................. 21 2.3.2. Cultivos neuronales primarios .................................................................... 22 2.3.3. Cultivos de células troncales neuronales .................................................... 23 2.3.4. Cultivos de células troncales mesenquimales ............................................. 24 2.4. Células Mesenquimales ..................................................................................... 25 2.4.1 Fuentes de obtención de MSC ..................................................................... 27 2.4.2 Caracterización ............................................................................................ 27 2.4.2.1 Capacidad de proliferación ................................................................ 28 2.4.2.2 Fenotipo .............................................................................................. 28 2.4.2.3 Potencial de diferenciación ................................................................ 29 Diferenciación adipogénica ................................................................... 30 Diferenciación osteogénica .................................................................... 31 Diferenciación condrogénica ................................................................. 31 2.4.3 Plasticidad de las MSC ................................................................................ 32 3 OBJETIVOS DEL ESTUDIO .................................................................................. 34 4 METODOLOGÍA ...................................................................................................... 35 4.1 Cultivo de MSC ................................................................................................... 35 4.1.1 Obtención de muestras y aislamiento de MSC ovinas ................................. 35 4.1.2 Expansión y criopreservación de MSC ........................................................ 37 4.1.3 Caracterización de las MSC ......................................................................... 37 4.1.3.1 Capacidad de proliferación ................................................................ 38 4.1.3.2 Expresión de marcadores de superficie .............................................. 38 4.1.3.3 Capacidad de diferenciación a linajes mesodérmicos ....................... 39 2 Diferenciación adipogénica ................................................................... 39 Diferenciación osteogénica .................................................................... 39 Diferenciación condrogénica ................................................................. 40 4.1.4 Capacidad de transdiferenciación neurogénica ............................................ 40 4.2 Análisis de la expresión génica .......................................................................... 41 4.2.1 Extracción de RNA y síntesis de DNA complementario ............................. 41 4.2.2 Reacción en cadena de la polimerasa........................................................... 42 4.2.2.1 Diseño y optimización de cebadores .................................................. 42 4.2.2.2 PCR convencional ............................................................................... 43 4.2.2.3 Secuenciación automática ................................................................... 45 4.2.2.4 RT-qPCR ..................................................................................................... 45 4.3 Análisis de expresión de PrPC mediante Dot Blotting ..................................... 46 4.4 Infección de las MSC .......................................................................................... 47 4.4.1 Inoculación con scrapie................................................................................ 47 4.4.2 Determinación de PrPSc medianteWestern Blotting .................................... 48 4.5 Herramientas bioinformáticas ........................................................................... 49 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................... 50 5.1 Aislamiento y diferenciación de MSC ............................................................... 50 5.1.1 Capacidad de proliferación .......................................................................... 51 5.1.2 Expresión de marcadores celulares de superficie mesenquimales ............... 52 5.1.3 Potencial adipogénico .................................................................................. 54 5.1.4 Potencial osteogénico .................................................................................. 55 5.1.5 Potencial condrogénico ................................................................................ 56 5.2 Diferenciación neurogénica ................................................................................ 60 5.3 Infección de MSC con aislado priónico de scrapie clásico .............................. 64 6 CONCLUSIONES ..................................................................................................... 68 7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 69 3 1. RESUMEN Las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) son enfermedades neurodegenerativas fatales para las cuales no existe tratamiento. En las últimas décadas se han desarrollado modelos celulares tanto para el estudio de los mecanismos moleculares de la enfermedad como para su posible aplicación en el diagnóstico precoz y para la evaluación de tratamientos in vitro. Sin embargo, existen muy pocos modelos celulares capaces de multiplicar la proteína prión patológica, la mayoría son derivados murinos que requieren la adaptación previa del aislado priónico en ratón antes de su multiplicación. El objetivo final del presente estudio consiste en desarrollar un modelo celular que permita estudiar el scrapie en células procedentes del hospedador natural de la enfermedad, el ovino. Para ello se han estudiado y caracterizado las células mesenquimales (MSC) ovinas obtenidas a partir de sangre periférica y médula ósea. Se ha elegido la sangre periférica como tejido de fácil acceso, y la médula ósea por considerarse el lugar de mayor concentración de MSC en animales adultos. En las TSE la proteína prión patológica se acumula principalmente en el Sistema Nervioso Central y es allí donde ejerce su acción patológica, por ello se ha analizado la plasticidad de las MSC ovinas para su diferenciación neurogénica. Por otra parte, se ha estudiado la susceptibilidad de estas células frente a la infección con el agente del scrapie. En este trabajo se describe por primera vez la posibilidad de aislar MSC a partir de sangre periférica de ovino. Las MSC ovinas de ambos orígenes expresan a nivel de transcritos marcadores de superficie característicos de células mesenquimales. Tal y como se ha descrito en otras especies, se ha observado gran variabilidad individual de las MSC ovinas, que parece afectar tanto a la capacidad de diferenciación como a la plasticidad de estas células. Ambos tipos de MSC expresan la proteína prión celular y son susceptibles a la infección con aislados priónicos de scrapie. Estas características indican la idoneidad de las MSC ovinas como modelo celular en el hospedador natural de la enfermedad de scrapie. 4 2. INTRODUCCIÓN En este primer apartado se expondrán distintos aspectos de las encefalopatías espongiformes transmisibles, principalmente el scrapie ovino y los modelos celulares desarrollados para el estudio de estas. Dentro de estos modelos se profundizará en la posible aplicación de las células madre en el desarrollo de los mismos, y por último se detallarán los tipos y características de las células madre mesenquimales. 2.1 Enfermedades Priónicas Las enfermedades priónicas o encefalopatías espongiformes transmisibles son un grupo de enfermedades neurodegenerativas fatales. Las enfermedades priónicas pueden presentarse de forma hereditaria, debidas a la mutación del gen que codifica la proteína prión (PRNP); adquiridas, cuando son el producto de una infección con el agente causal; y esporádicas, sin una causa aparente conocida. Todas ellas comparten la transformación de la estructura de la Proteína Prión Celular (PrPC) en Proteína Prión Patológica (PrPSc), que se caracteriza por un alto contenido en láminas β sin que se vea afectada la estructura primaria. La PrPSc se acumula principalmente en el cerebro de los individuos afectados en una forma insoluble a detergentes y resistente a proteasas [1]. Las TSE están relacionadas con un grupo de enfermedades denominadas «conformacionales» en la especie humana, como son la enfermedad de Alzheimer, la de Parkinson o la corea de Huntington, que surgen como consecuencia del plegamiento anómalo de una proteína específica. Este cambio de conformación causa la enfermedad, bien por la adquisición de una actividad tóxica o por la pérdida de función de la proteína normal [2]. Entre las TSE que afectan a la especie humana se incluyen la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), el kuru, o el Insomnio Familiar Fatal (IFF). Entre las enfermedades que afectan a los animales se encuadra la Encefalopatía Espongiforme Bovina (BSE). Patología que además de afectar al ganado bovino, ha dado lugar a una nueva patología humana, la nueva variante de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vCJD), considerada zoonosis [3]. También se describen dentro de este grupo la 5 enfermedad caquectizante de los ciervos y el scrapie ovino y caprino, considerado el scrapie como origen de la BSE [4]. El análisis histopatológico de los cerebros de los animales muertos por BSE reveló una gran similitud con los cerebros de los animales infectados con scrapie. Además, estudios epidemiológicos demostraron que el vehículo de infección de la BSE fueron las harinas de carne y hueso utilizadas en los piensos en granjas de rumiantes, sospechando que estos suplementos estaban contaminados con el agente causante de la enfermedad en ovino. Es probable que el reciclaje del material infectado provocara una contaminación masiva de estas harinas, dando lugar a una epidemia de BSE con un máximo de casos en 1992 en Reino Unido. Su extensión a otros países de Europa fue probablemente debida a la exportación de ganado infectado y de harinas contaminadas desde países con BSE, principalmente Reino Unido [5-7]. El origen de la vCJD se ha atribuido a la exposición a altas concentraciones de productos contaminados con BSE a finales de los años 80, que ha permitido al agente infeccioso atravesar la barrera de especies entre el ganado vacuno y el hombre. Al parecer, la similitud estructural de los priones de ambas especies podría haber facilitado la transmisión de la enfermedad a los humanos [8-11]. Todas las investigaciones neuropatológicas realizadas sobre cerebros de animales y humanos llevaron a concluir que los distintos procesos neurológicos poseían una base molecular muy similar. En todas las muestras analizadas se detectó una degeneración espongiforme característica, por lo que a este grupo de enfermedades se le denominó Encefalopatías Espongiformes Transmisibles [12]. Las TSE se caracterizan por un curso progresivo y fatal, mostrando las siguientes características: Poseen períodos de incubación largos y variables (de meses a años), dependientes del huésped, de la cepa del agente causal y de la vía de transmisión. Son causadas por un agente no convencional altamente resistente a procedimientos físicos y químicos que inactivan bacterias, virus o viroides, y es sensible a tratamientos que alteran las proteínas [13]. Tienen carácter transmisible de forma experimental o natural [14-16]. 6 No se ha observado una respuesta inflamatoria clásica mediada por antígeno detectable en el huésped [17, 18, revisado por 19]. Producen un cuadro lesional caracterizado por una vacuolización espongiforme localizada principalmente en el tronco del encéfalo, neuropilo de la sustancia gris y pericarion de las neuronas [20-22]. 2.1.1 Agente causal: teoría de la proteína prión Inicialmente, se asumió que el agente responsable de las TSE era un lentivirus [23, 24]. Sin embargo, a partir de los experimentos con radiación ultravioleta sobre suspensiones de extractos de cerebros infectados de ratón, Alper y colaboradores concluyeron que la replicación del agente causante de scrapie no dependía de un ácido nucleico [25, 26]. Con estos resultados, Griffith postuló la hipótesis de una naturaleza proteica [27], como habían sugerido también Pattison y Jones [28]. Posteriormente el equipo de Prusiner, tras varios años de experimentos biofísicos y bioquímicos, consiguió aislar una glicoproteína resistente a proteasas a partir de cerebros de hámster infectados. Esta proteína era la predominante de la partícula infecciosa y se acumulaba en cerebros afectados, a veces en forma de placas amiloides. Prusiner introdujo el término «prión» para distinguir al agente de otros patógenos como virus o viroides y lo definió como «pequeña partícula infecciosa proteica que es resistente a procesos de inactivación de ácidos nucleicos» [29, 30]. El agente del scrapie demostró resistencia a muchos tratamientos aplicados para degradar ácidos nucleicos, como son los grandes cambios de pH, nucleasas, fosfodiesterasas, hidroxilamina, radiaciones ultravioleta e ionizantes, hidrólisis con Zn(NO3)2 e inactivación fotoquímica con psoralenos. Aunque existen virus que son resistentes a algunos de estos compuestos o procesos, no se conoce ninguno que resista a todos ellos. El componente proteico aislado y purificado de los cerebros afectados tiene un peso molecular de 27-30 kDa y es totalmente resistente a la digestión con proteinasa K [29], por ello se le denominó PrP27-30 o PrPres. La determinación de algunos aminoácidos del extremo N-terminal de esta proteína permitió la clonación del cDNA (Ácido Desoxirribonucleico Complementario, complementary Deoxyribonucleic Acid) codificante. El gen de PrPres fue localizado en el genoma del propio huésped y se descubrió que este péptido era en realidad un fragmento de otra molécula mayor (de 33- 7 35 kDa) llamada PrPSc (de scrapie) [31, 32]. Además, el gen que codifica la proteína PrP (PRNP) se encontró en todas las especies susceptibles de contraer una TSE y se comprobó que la proteína se expresaba de forma fisiológica en muchos tejidos de organismos sanos, con niveles más elevados en el cerebro [31, 33]. La proteína presente en los animales sanos es proteasa-sensible y se le conoce como PrPsen o PrPC y su secuencia primaria es idéntica a la de PrPSc [34]. Las diferentes propiedades de la proteína normal y la patológica son debidas a las diferencias en la conformación tridimensional (Figura 1). Figura 1. Modelos de las conformaciones terciarias de la proteína prión celular (PrPC) y la proteína prión patológica (PrPSc). En verde están representadas las estructuras de hélice-α y en azul las de lámina-β [12]. Investigaciones más recientes constituyen un nuevo sustento a la hipótesis priónica, ya que por fin se demuestra la generación in vitro de partículas infecciosas. Como ejemplo, una proteína PrPC recombinante en ratón producida en Escherichia coli convertida en PrP infecciosa capaz de causar un fenotipo similar a la enfermedad priónica en ratones [35]. Además, Castilla y colaboradores consiguieron generar partículas PrPres in vitro mediante una técnica de amplificación cíclica (PMCA: protein misfolding cyclic amplification) y la inoculación de estas partículas en hámster provocaron una patología típica de scrapie e idéntica a la desencadenada por inoculación de material infeccioso de cerebro en los mismos animales [36]. Las hipótesis alternativas a la teoría de la proteína prión surgen como solución a algunos aspectos difíciles de explicar por la hipótesis priónica, como por ejemplo el 14 genotipo sensible o se ha producido de forma iatrogénica, mediante vacunaciones o medicamentos. El desarrollo de los signos es gradual, en la mayoría de casos aparecen de forma insidiosa y progresan durante unos meses. También se pueden desarrollar como un brote agudo y normalmente se trata en los rebaños en los que, por falta de seguimiento individual, no se ha informado de ningún caso previo. En esta situación los signos de la enfermedad se acentúan en situaciones estresantes, enfermedades concomitantes o en el manejo rutinario. Normalmente se aprecia ausencia de respuesta al tratamiento sintomático, que no es efectivo para paliar los síntomas clínicos previamente descritos. Diagnóstico histopatológico: Las principales alteraciones que se pueden apreciar en el SNC son: vacuolización neuronal y del neuropilo, degeneración neuronal y gliosis, generalmente localizándose zonas concretas del SNC, como son la médula oblongada, puente, mesencéfalo y tálamo [95, 96]. Cabe señalar que no todas las razas ovinas exhiben la misma intensidad lesional, además de que algunas ovejas afectadas pueden presentar únicamente vacuolización [97]. Si bien este método presenta ciertas restricciones, como en el caso de cerebros que han sido congelados, o presentan un alto grado de autolisis y requiere de confirmación por medios inmunohistoquímicos. Diagnóstico inmunohistoquímico: La técnica inmunohistoquímica es un procedimiento muy eficaz y sensible para la confirmación de scrapie. [98, 99] La primera técnica se desarrolló empleando modelos murinos y utilizó un anticuerpo específico anti PrPSc mostrando la detección de placas de amiloide [100], pero estas placas en la enfermedad de scrapie no son comunes. Se trata de un método que se puede emplear en tejidos extraneurales, tanto en animales clínicos como preclínicos, siendo muy relevante éste último caso, permitiendo detectar PrPSc en tonsilas [101] y tejido linfoide la membrana nictitante de animales preclínicos [102-104]. A pesar de que en la actualidad existen anticuerpos con capacidad de diferenciar PrPC de PrPSc, si se quiere detectar únicamente PrPSc el tejido se trata con proteinasas para asegurar la fiabilidad de la técnica. Detección de las Fibrillas Asociadas a Scrapie (SAF): Las SAF son estructuras específicas de la enfermedad de scrapie. Se trata de la forma fibrilar de la PrPSc y se detectó por primera vez mediante microscopía electrónica de transmisión en cerebros de ratones y hámster infectados experimentalmente [105]. Presenta la ventaja de que estas 15 fibrillas son altamente resistentes a proteasas y pueden ser detectadas en cerebros muy autolíticos [106]. Diagnóstico mediante Western Blotting: permite detectar la proteína patológica en función de su resistencia a proteasas, su peso molecular y su reacción frente a determinados anticuerpos. Se realiza mediante la aplicación de una electroforesis en gel de poliacrilamida [107] seguida de un Western Immunoblotting [108]. Estas técnicas permiten separar los constituyentes de la PrPSc en función del peso molecular de las diferentes formas (no glicosiladas, mono-glicosiladas y di-glicosiladas), y posteriormente ser incubados con un anticuerpo anti-PrP. Técnicas rápidas de diagnóstico: Surgieron como respuesta a la necesidad de técnicas rápidas y fiables para detectar a los animales enfermos por BSE a causa de la epidemia en Reino Unido y posteriormente en diferentes países europeos. Las técnicas aplicadas son el ELISA (Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) de quimioluminiscencia; el ELISA-sandwich, que emplea la desnaturalización y concentración de la muestra previa incubación con anticuerpo primario y secundario, y la técnica de Western Blotting tradicional modificada, permitiendo acortar tiempos y aumentar el número de muestras y usando el anticuerpo monoclonal 6H4. Se esta estudiando la capacidad de las técnicas de Western Blotting modificadas para la detección de animales preclínicos [109], especialmente a partir de muestras de tejido linfoide periférico en el ganado ovino y caprino [110]. Pruebas in vivo: emplean fluidos tejidos accesibles en los animales permiten detectar a los individuos enfermos antes de su sacrificio. Se ha estudiado la detección mediante la técnica de la inmunohistoquímica a partir de tejido linfoide, como se ha señalado anteriormente, empleando principalmente muestras de tonsilas, membrana nictitante y también placenta [111]. A partir de sangre se ha detectado mediante sonicación la transformación de PrPC en PrPSc debido a pequeñas cantidades de PrPSc presentes en la sangre de los animales afectados [112]. Empleando la orina se ha llegado a detectar PrPSc en animales presintomáticos mediante Western Blotting [113], sin embargo, estos resultados no han sido concluyentes, ya que el patrón de inmunodetección se altera cuando aparecen los signos clínicos y esta actualmente siendo objeto de estudio [114]. 16 2.2.3 Aislados priónicos asociados a la enfermedad de scrapie La identificación de los diferentes aislados priónicos asociados a la enfermedad de scrapie, que algunos autores denominan cepas, productores de una encefalopatía espongiforme ha sido, y sigue siendo, uno de los retos de la investigación de las enfermedades priónicas. Pattinson y colaboradores en 1961 fueron los primeros en observar que existían diferentes cepas productoras de la misma enfermedad, concretamente en la especie caprina observaron dos síndromes clínicos, uno que se denominó drowsy (somnoliento) y otro scratching (rascado vigoroso). Durante la década de los noventa, los estudios de tipificación estuvieron basados en las características de incubación, síntomas clínicos y perfiles lesionales que las cepas producían en ratones inoculados experimentalmente. Posteriormente, con los avances en biología molecular, se trató de diferenciar las cepas mediante sus diferencias en los patrones de glicosilación. Se han aislado más de 20 cepas productoras de scrapie en la especie ovina y caprina [116-118]. El mejor método para separar combinaciones de cepas y para aislar o seleccionar nuevas cepas mutantes consiste en realizar sucesivos pases en una especie diferente a la del aislamiento primario (especie barrera) [119, 120]. Algunos aislamientos son, en realidad, un conjunto de cepas, como por ejemplo el scrapie sheep brain pool (SSBP/1), del cual se han aislado las cepas 22A, 22C y 22L. Algunas cepas aisladas en la especie ovina no son transmisibles a ratones, como la cepa CH1641 [123], aunque la mayoría si lo son, dividiéndose en dos grupos en función de las propiedades del gen «sinc» del ratón receptor. El grupo de agentes ME7 exhiben un periodo de incubación corto cuando se hacen los pases en ratones s7, y un periodo largo cuando son ratones p7. La cepa 22A exhibe exactamente características contrarias, largo periodo en s7 y corto en p7 [124, 125]. Las diversas cepas productoras de scrapie son responsables de ciertas características específicas en cuanto al periodo de incubación, perfil lesional y presencia o depósito de PRPSc. Se han definido tres clases de estabilidad de cepas [126]: Cepas de clase 1 (ME7 y 22C) poseen características estables independientemente del genotipo del gen sinc del hospedador. 17 Las cepas de clases II (22A y 22F) son estables si el pase se realiza en ratones con el genotipo del gen sinc idéntico al del hospedador donde se aisló, pero cambian si se pasan en otros genotipos de ratón. La cepas de clase III (31A, 51C, 87A, 125A, 138A, 153A) muestran cambios constantemente, independientemente del genotipo del hospedador. Estas seis cepas se caracterizan por periodos de incubación parecidos, producción de numerosos depósitos amiloides [127] y vacuolización asimétrica. Podría tratarse de una única cepa de scrapie. También se pueden diferenciar las cepas mediante los patrones lesionales que producen, teniendo este método la ventaja de no depender de la dosis de inóculo utilizada, y que permite conocer qué cepa causó la muerte del animal en caso de competencia entre dos o más cepas [97, 131]. Se han llevado a cabo estudios de los patrones lesionales en el ganado ovino, estos métodos de identificación han descrito diferentes tipos de lesiones según la raza y edad del ovino afectado, la dosis y vía de inoculación y las cepas de scrapie. El empleo de animales ovinos de experimentación tiene limitaciones debido al tiempo requerido hasta que se pueden identificar los síntomas y se puede determinar la cepa. Las técnicas actuales se basan en los patrones revelados mediante inmunohistoquímica para los depósitos de la proteína prión [132, 133], llegándose a describir más de 12 patrones lesionales según el acúmulo y localización de proteína prión [134]. Los patrones de glicosilación pueden ser detectados mediante la técnica de Western Blotting, pero únicamente con los resultados de la glicosilación no es suficiente para identificar una cepa ya que diferentes cepas pueden poseer el mismo patrón de glicosilación, como ocurre con la cepa CH1641, la BSE y la vCJD [123]. En Noruega, en el año 1998, se describieron los primeros casos de lo que hoy se conoce como «scrapie atípico» o scrapie producido por la cepa Nor98. Esta forma de scrapie difiere del scrapie clásico tanto en el cuadro patológico como en el perfil genético. A diferencia de la forma clásica, apenas hay vacuolización en el obex, ni se encuentran depósitos de PrPSc en esta zona. En cambio, la mayoría de los animales afectados exhiben vacuolización y acúmulo de PrPSc en el cerebelo. Además, el patrón obtenido por Western Blotting también es diferente, ya que se observa una banda muy pequeña (12 kDa) que no aparece en los casos de scrapie clásico [135]. 18 El scrapie es la patología que parece dar origen a la aparición de la BSE [136, 137]. Como se ha comprobado en los últimos años, la BSE es una zoonosis que afecta a la especie humana [138] dando lugar a la aparición de la vCJD [139]. Recientes estudios demuestran que la BSE puede ser transmitida al ganado caprino y ovino [140], revelando que en modelos murinos la susceptibilidad a la infección por BSE es mayor en los inóculos que han sufrido pases por ovino frente a la BSE clásica [141]. Por ello es necesario un modelo que permita la diferenciación de cepas. 2.2.4 Susceptibilidad genética a scrapie La genética del individuo influye tanto en la susceptibilidad a las enfermedades priónicas naturales, como en el período de incubación de la enfermedad. Una de las primeras evidencias de la influencia genética en esta enfermedad fue descrita en 1964 por Dickinson y colaboradores [142]. Estos investigadores observaron distintos períodos de incubación en una línea de ratones infectados de forma experimental. Posteriormente se han observado distintas mutaciones en el gen que codifica la proteína prión que son las responsables de algunas diferencias observadas en el periodo de incubación y susceptibilidad de la enfermedad. 2.2.4.1 Estructura del gen PRNP El gen de la proteína prión se ha identificado en un gran número de especies de mamíferos, tanto domésticas como salvajes. Es un gen de copia única [31, 32] que se localiza en el cromosoma 20 humano (PRNP), en el 2 murino (Prnp) y en los cromosomas 13 ovino y bovino. Entre los mamíferos su secuencia se encuentra altamente conservada, por ejemplo el grado de similitud entre la especie bovina y ovina es del 94%. A su vez, estas especies muestran una similitud con el gen humano del 66,7% y del 65,4%, respectivamente. Además, el gen se ha descrito en especies no afectadas por las TSE como aves, reptiles, anfibios y peces [143-147]. En todas las especies estudiadas el gen PRNP codifica una proteína de aproximadamente 250 aminoácidos que sufre modificaciones post-traduccionales, hasta convertirse en la proteína madura de unos 210 aminoácidos [148]. 19 Las secuencias del gen PRNP ovino y caprino presentan también un alto grado de conservación genética. Tienen un tamaño de 20.000 pb y codifican proteínas PrP con un tamaño de 256 aminoácidos. Tras el procesamiento post-traduccional se obtiene la proteína madura de 210 aminoácidos, con un peso molecular de 33-35 kDa para la forma di-glicosilada [149]. La mayoría de polimorfismos descritos en ovino y caprino se localizan en la parte C-terminal de la proteína PrP, entre los codones 98 y 234 [revisado por 150]. A pesar de la gran similitud, las alteraciones aminoacídicas asociadas con cambios en la susceptibilidad a scrapie parecen ser distintas en las dos especies. Actualmente se acepta la idea de que ambos factores: un genotipo susceptible y la exposición a un agente infeccioso; son requeridos para el desarrollo de la enfermedad [revisado por 151]. 2.2.4.2 Susceptibilidad a las formas clásicas de scrapie Los primeros polimorfismos del gen PRNP ovino asociados con susceptibilidad en scrapie experimental y natural se identificaron a principios de los años 90. Tras la secuenciación y posterior comparación del gen de ovejas sanas y enfermas se detectó un polimorfismo en el codón 171, donde se podía encontrar arginina (R) o glutamina (Q) [152]. Más tarde se identificaron los polimorfismos en los codones 136 de alanina por valina (A→ V) y 154 de arginina por histidina (R→ H) [153]. Diversos ensayos revelaron una compleja relación entre los genotipos de PrP en los codones 136 y 171, la cepa del agente infeccioso, y la ruta de exposición [154]. Los alelos V136, R154, Q171 y H171 se asociaron a la susceptibilidad y los alelos A136, H154 y R171 se relacionaron con resistencia al padecimiento del scrapie ovino. De las doce posibles combinaciones de estas variantes alélicas, sólo cinco se detectan frecuentemente en la especie ovina: ARR (A136R154R171), ARQ, AHQ, ARH y VRQ. La forma ARR corresponde al genotipo más resistente y la VRQ se relaciona con el más sensible frente al scrapie. Considerando estos cinco haplotipos, puede encontrarse un total de 15 genotipos del gen PRNP ovino [155, 156]. La distribución de frecuencias haplotípicas del gen PRNP en ovino español muestra que el haplotipo más frecuente es el ARQ [157], siendo este haplotipo también el mayoritario en los animales diagnosticados con scrapie clásico [158]. Este haplotipo es también el más frecuente en las razas mediterráneas [159, 160]. 20 A pesar de la gran cantidad de estudios, se desconoce si las diferencias en la infección son una consecuencia de las diferencias genéticas entre razas o son debidas a la tendencia de las distintas cepas del agente por infectar determinadas poblaciones. Se ha observado que animales del mismo genotipo y raza, en el mismo rebaño, son susceptibles a algunas cepas de scrapie pero resistentes a otras [154, 162, 163]. Por tanto, a pesar de que el gen PRNP se puede considerar como un gen mayor que afecta a la susceptibilidad a scrapie, esta base genética no explica la gran variabilidad observada en los tiempos de incubación de los distintos individuos, o en la susceptibilidad, tanto en la especie humana como en ratón y oveja [164-167]. 2.2.4.3 Susceptibilidad a otras cepas priónicas En cuanto a las características genéticas que distinguen al scrapie atípico, se destaca la frecuencia elevada de genotipos con cierta resistencia a scrapie clásico, particularmente el haplotipo AHQ. Además suele aparecer asociado al alelo F (fenilalanina) en el codón 141, que normalmente codifica el aminoácido leucina (L) [168]. También es muy frecuente la asociación de las formas atípicas con genotipos resistentes ARR/ARR o de cierta resistencia como ARR/ARQ, además de los genotipos con AHQ (ARR/AHQ, AHQ/AHQ o AHQ/ARQ) [168-172]. Además de la asociación del genotipo ARR/ARR con la resistencia a la infección natural, también se ha descrito su relación con la resistencia a la inoculación oral con scrapie y BSE en muchas razas ovinas [154, 155, 163, 173-175]. No obstante, han aparecido algunos casos de scrapie clásico portando este genotipo resistente [156, 176]. Además, recientemente se ha demostrado la sensibilidad de animales ARR/ARR a la exposición oral e intracerebral del agente de BSE [177, 178]. Todos estos casos que no se corresponden con los análisis iniciales de genotipado en animales enfermos ponen en duda la relevancia de los programas europeos de selección genética frente a scrapie, ya que todos ellos seleccionan genotipos que son susceptibles al scrapie atípico y pueden serlo también al scrapie clásico [revisado por 151]. 21 2.3 Modelos celulares para el estudio de enfermedades priónicas Tal y como se ha ido describiendo en los apartados anteriores, aunque en los últimos años el avance en las investigaciones en enfermedades priónicas ha sido muy importante, todavía existen muchas incógnitas con respecto a los mecanismos de replicación del prión o de toxicidad celular, la susceptibilidad genética de los individuos en función de su genotipo para PRNP a padecer la enfermedad dependiendo de las cepas de priones o la naturaleza misma de estas cepas. El estudio de estos aspectos conlleva la utilización de modelos animales, generalmente murinos, que requieren una inversión importante en tiempo y dinero, con el agravante de utilizar especies que no son las susceptibles de forma natural a estas enfermedades. Cuando se utilizan especies susceptibles el tiempo requerido y la inversión es todavía mayor. Por ello se hace necesario el desarrollo de modelos celulares que nos permitan estudiar estos parámetros in vitro. Además, estos modelos se pueden utilizar tanto para el estudio de aspectos básicos de la enfermedad [179] como para testar posibles tratamientos [180] o diagnosticar las distintas cepas de scrapie [181]. A pesar de que recientemente se han generado distintos métodos que permiten amplificar o multiplicar el prión in vitro sin necesidad de utilizar cultivos celulares, como la PMCA [36, 112], estos métodos libres de células no permiten analizar el efecto de la infección del prión en la célula, ni son muchas veces viables en laboratorios de diagnóstico. En 1970 se consiguió la infección de cultivos neuronales por el agente de scrapie [182]. Sin embargo, desde entonces, sólo unas pocas líneas celulares han podido ser infectadas por priones y mostrar acumulación de PrPres y/o infectividad, la mayoría de las líneas celulares utilizadas son de origen murino. A continuación se describen los distintos modelos celulares empleados hasta el momento. 2.3.1. Líneas celulares murinas Los primeros estudios se centraron en líneas de origen neuronal como son las líneas celulares de neuroblastoma [183, 184] o células de Shwann [185] o la línea derivada de cerebro de ratón SMB [186]. Estas líneas celulares muestran infección persistente [183, 187] y se han empleado para estudiar los mecanismos de generación y 22 tráfico de la PrPSc [181, 188], y evaluar el potencial terapéutico de diferentes agentes [189, 190]. Los modelos celulares murinos presentan varios problemas que Solassol y colaboradores [191] resumen en: Limitada susceptibilidad a ciertas cepas de prión debido a la barrera de especie. Únicamente algunas células del cultivo se infectan. Es necesario un nivel adecuado de PrP para que exista infección. La propagación de priones induce cambios muy sutiles en el fenotipo de los cultivos infectados. Existen modelos en los que se ha conseguido propagar el prión a pesar de la barrera de especie existente entre el cultivo y el inóculo. Estas líneas celulares generalmente son también de origen murino y propagan únicamente las cepas priónicas que han sido adaptadas experimentalmente a la infección en roedores [191]. Las dificultades encontradas en los modelos murinos se han intentado subsanar creando líneas celulares que expresen una PrP homóloga a la del inóculo [192]. La creación de ratones transgénicos que expresan la PrP ovina, bovina o humana ha facilitado la creación de líneas celulares portadoras de PrP homólogas al inóculo [193, 194]. Sin embargo, la creación de animales transgénicos es un método caro, laborioso y de larga duración. Además, en especies como la ovina, en la que las variantes genéticas tienen mucha influencia en la susceptibilidad de los individuos a las distintas cepas de scrapie [135, 195], esta metodología supondría la construcción de tantos ratones como haplotipos descritos para el gen PRNP ovino. 2.3.2. Cultivos neuronales primarios La obtención de células para este tipo de cultivos se realiza a partir de muestras de SNC de animales y requiere el sacrificio de los mismos. La infección de estos cultivos obtenidos a partir de neuronas de embriones o ratones y ratas neonatos han demostrado ser un modelo de gran valor para el estudio de la patogénesis de virus neurotrópicos, en particular para distinguir las lesiones causadas por el agente infeccioso o por la respuesta del huésped [196]. 23 A diferencia de las líneas celulares murinas donde no se detecta un efecto citopatológico ligado a la propagación del agente infeccioso de las TSE a pesar de la infección persistente [185], en células neuronales infectadas se ha podido observar como la infección tanto de neuronas como de astrocitos condujo a una pérdida neuronal progresiva tras la propagación activa del prion [197]. También ha permitido demostrar que los cultivos neuronales son más sensibles al estrés oxidativo [198], posiblemente ligado a la modificación de las funciones fisiológicas de la PrPC. Sin embargo, estos modelos están desarrollados en la especie murina y requieren de una adaptación previa del prión por ratón o de la creación de animales transgénicos que expresen la proteína prion celular de la especie origen del prion que sea el objeto de estudio [197], con las posibles variaciones sobre el agente original que ello conlleva. En especies naturalmente susceptibles a la enfermedad, como es la especie humana, este tipo de cultivos son de difícil aplicación ya que requieren el uso de muestras de SNC. 2.3.3. Cultivos de células troncales neuronales Más recientemente, Milhavet y colaboradores [199] propusieron el uso de células troncales neuronales (NSC) para la propagación in vitro del prión. Estas células pueden diferenciarse a distintos tipos celulares del SNC [200, 201] y pueden multiplicar la proteína prión a partir de muy poca dosis de homogeneizado de cerebro infectado. Si se utilizan células troncales de la misma especie afectada se podría eliminar el problema de especie. Las NSC en cultivo forman neuroesferas que también han podido ser infectadas con priones [202], y presentan una serie de ventajas como modelos celulares para la propagación del prión [203]: constituyen un cultivo no transformado que se autorrenueva, se puede obtener de cerebro fetal de ratones normales o transgénicos con secuencias de PrPC de distintos genotipos o especies; y las neuroesferas diferenciadas son más similares a los tipos celulares presentes en el cerebro que las líneas tumorales. A pesar de lo prometedor de estas líneas, existen muy pocos trabajos que muestren el aislamiento de progenitores neuronales de especies de interés en los estudios sobre priones como son los rumiantes [204] o la especie humana. Estas células se obtienen a partir de embriones, con los problemas éticos que ello supone. Las células troncales también están presentes en el SNC adulto [205], principalmente en el hipocampo y la zona ventricular [206], pero también se ha descrito la presencia de estas células en la 30 Se ha visto que las MSC ovinas poseen gran variabilidad en su potencial de diferenciación en las diferentes líneas celulares durante la condrogénesis [243] y en la expresión de marcadores neuronales [245]. Diferenciación adipogénica Para que las MSC entren en diferenciación adipogénica, se emplean normalmente inductores relacionados con ligandos de receptores de hormonas asociados con la adipogénesis, como son la dexametasona (ligando del receptor de glucocorticoides) o el factor de transcripción de receptores activados de proliferación de los peroxisomas (PPAR ) Estos inductores producen en las células alteraciones en la transcripción génica que conllevan un aumento de la expresión de factores de transcripción como PPAR o el C/EBPα (proteína ligante a CCAAT). Estos factores de transcripción desencadenan a su vez la activación de genes relacionados con la adipogénesis como aP2 (proteína de unión específica a ácidos grasos), LPL (lipoprotein lipasa), GLUT4 (transportador de glucosa tipo 4), perilipina (PLIN1), adiponectina (ADIPOQ) y adipsina (CFD) entre otros. Los genes de los factores de transcripción mencionados junto con LPL se consideran marcadores de diferenciación temprana ya que se regulan positivamente durante las primeras etapas, mientras que el resto son marcadores de diferenciación tardíos [246]. La activación y expresión de estos genes provoca un cambio morfológico en las células que podemos apreciar al microscopio: la célula madre mesenquimal cambia su forma típica de fibroblasto por una más redondeada, que acumula paulatinamente gotas lipídicas. Estas gotas lipídicas aumentan su tamaño a medida que acumulan más grasa. En ovino se ha descrito la diferenciación a este linaje celular a partir de MSC obtenidas de médula ósea [243] y sangre de cordón umbilical [247]. 31 Diferenciación osteogénica La osteogénesis y la adipogénesis son procesos íntimamente relacionados ya que si se produce uno de ellos, se mantiene inhibido el otro debido a la implicación de PPAR [248]. Los reactivos añadidos a los medios para inducir la osteogénesis son sustancias que promueven la mineralización y modulan las actividades osteoblásticas [249]. El ascorbato, por ejemplo, aumenta la expresión de la fosfatasa alcalina (marcador intermedio de diferenciación) y de la osteocalcina (OC o BGLAP). Además, el ascorbato está relacionado con la conversión de residuos de prolina en hidroxiprolina en las moléculas de colágeno [250]. Al poner en contacto a las MSC con los inductores de diferenciación osteogénica se producen una serie de cambios genéticos y una remodelación de la matriz extracelular. El marcador de osteogénesis es el factor de transcripción Runx-2 (marcador temprano de diferenciación) que promueve la expresión de genes como la BGLAP, osteopontina (SPP1) y la síntesis de colágeno tipo I (COL1A1). El cambio apreciable mediante un microscopio óptico, se observa la formación de nódulos en los que se produce un depósito de hidroxiapatita. Las MSC ovinas obtenidas de tejido adiposo y médula ósea presentan esta capacidad de diferenciación a tejido óseo [234]. De hecho, el ovino es un animal modelo ampliamente utilizado para el estudio de la aplicación de terapia celular en el tratamiento de lesiones del aparato locomotor [251-253] Diferenciación condrogénica La diferenciación condrogénica de las MSC se induce mediante moléculas como el factor de crecimiento transformante beta 3 (TGF-β3) y la proteína morfogenética del hueso 2 (BMP2), cuando éstas se encuentran en cultivo en pellet ya que un entorno tridimensional junto con una situación de hipoxia favorecen esta diferenciación [254]. También se ha descrito la diferenciación condrogénica en cultivos en monocapa [247]. Durante la diferenciación se produce un aumento de la expresión de los factores de transcripción de la familia Sox (el desencadenante principal es Sox9) y Scleraxis y además de genes como el agrecano, el colágeno tipo II (COL2A1) y el COMP (proteína oligomérica de la matriz del cartílago). Estos genes constituirán las principales proteínas 32 de la matriz extracelular del cartílago [255]. Para observar la diferenciación a nivel microscópico es necesario realizar la tinción de los glucosaminoglicanos presentes en él [256]. Se ha descrito en ovino que TGF-β3 induce la diferenciación condrogénica [243], además se ha utilizado la inoculación de MSC prediferenciadas a condrocito como tratamiento en modelos ovinos de lesiones articulares [252]. 2.4.3 Plasticidad de las MSC Las MSC colaboran en procesos de regeneración axonal [257], expresando marcadores neuronales y presentando un efecto antiinflamatorio [258]. Además de estos efectos sobre lesiones en el SNC que parecen indicar cierta capacidad de diferenciación hacia líneas neuronales, las MSC también se han podido diferenciar a elementos neuronales in vitro [259-262]. De hecho, la plasticidad de las células troncales es más extensa de lo que se creía en un principio. La capacidad de diferenciación de las MSC adultas a células del SNC las convierte en modelos celulares candidatos al estudio de las enfermedades priónicas, con la ventaja añadida de la facilidad de obtención de las MSC a partir de médula ósea o sangre periférica de individuos adultos, evitando la necesidad de tener que recurrir al asilamiento de células troncales neuronales a partir de tejidos embrionarios. Para la diferenciación in vitro se han empleado medios enriquecidos con mercaptoethanol, alfa-MEM o ácido retinoico y medios con dimetilsulfóxido (DMSO) junto a beta-hidroxianisol (BHA). Estos factores inducen cambios en las MSC y se vuelven inmunorreactivas al Antígeno Nuclear Neuronal (NEUN), la Enolasa Específica de Neurona (NSE), Nestina (NES) y la Proteína ácida Fibrilar (GFAP). Además de estos marcadores, estudiando sus capacidades electrofísicas se ha visto que expresan dos rectificadores tardíos de canales de K+ (eag1 y eag2), los cuales son fundamentales para restaurar el potencial negativo requerido por la neurona para ejercer su actividad [263]. También se observan cambios morfológicos en los cultivos diferenciados como la retracción del citoplasma, cuerpos celulares esféricos, protrusiones celulares y una detención de la proliferación. Las células se muestran al microscopio con elongaciones ordenadas en dos o tres polos y con formaciones ramificadas en sus extremos [258]. 33 Hasta el momento, no existen referencias en las que se haya estudiado la capacidad de las MSC ovinas a diferenciarse hacia células neuronales. Este es uno de los objetivos que nos hemos planteado en el Trabajo Fin de Máster. Tal y como hemos señalado, esta propiedad hace más atractivas a las MSC para el estudio de enfermedades priónicas ya que podrían establecerse modelos para el análisis de la toxicidad de la proteína prión. 34 3 OBJETIVOS DEL ESTUDIO El objetivo final del presente trabajo es estudiar el potencial de las MSC ovinas extraídas de médula ósea y sangre periférica para el desarrollo de modelos in vitro para el estudio de scrapie y otras enfermedades priónicas. Para el logro de esta meta nos planteamos los siguientes objetivos parciales: Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales ovinas procedentes de médula ósea y sangre periférica. Determinar el potencial de diferenciación a células del sistema nervioso central de las células mesenquimales ovinas de ambos orígenes. Evaluar la expresión de la proteína prión celular, tanto en células diferenciadas como indiferenciadas. Analizar la susceptibilidad de las células mesenquimales ovinas a la infección por aislados priónicos de scrapie clásico y la capacidad de mantenimiento de dicha infección. 35 4 METODOLOGÍA En este apartado se detallan los materiales y métodos empleados para el Trabajo de Fin de Máster. Se hará una descripción de cada uno de ellos a la vez que se indicará con qué objetivo concreto fueron realizados. 4.1 Cultivo de MSC Para el desarrollo de este trabajo se llevaron a cabo técnicas de cultivo celular. El manejo de las células se realizó en condiciones de esterilidad haciendo uso de una cabina de flujo laminar y en laboratorio de bioseguridad P3 del Centro de Investigación de Encefalopatías y Enfermedades Transmisibles Emergentes si era necesario por las características de las células o los inóculos utilizados así lo requirieron. A continuación se explican brevemente los diferentes pasos requeridos para el cultivo celular. 4.1.1 Obtención de muestras y aislamiento de MSC ovinas Se obtuvieron muestras a partir de ovinos procedentes del rebaño experimental del centro citado, cuyos animales proceden de rebaños regionales afectados por la enfermedad de scrapie. Los animales específicos y las muestras biológicas a partir de las que se aislaron las MSC y la metodología utilizada para el procesado de las mismas se describen a continuación Animales: Durante la realización de este trabajo se han obtenido muestras biológicas de un total de 11 ovejas. Todas ellas eran hembras con edades comprendidas entre 1 y 6 años, de raza Rasa Aragonesa y distintos genotipos para el gen PRNP. El uso y toma de muestras de estos animales fue aprobado por la comisión ética de la Universidad de Zaragoza (PI38/10). Se obtuvo médula ósea de 5 animales y la sangre periférica se extrajo de 6 animales. Aspirados de médula ósea de cabeza humeral: Las intervenciones se realizaron bajo neuroleptoanalgesia (sedación profunda con xilacina intravenosa y anestesia local en la zona de punción). Para minimizar el sufrimiento y estrés innecesario de los animales, los procedimientos se realizaron en las instalaciones en donde los 36 animales se encuentran estabulados habitualmente. Cuando la neuroleptoanalgesia surtió efecto, el animal se colocó encima de una mesa móvil en decúbito lateral, en la que se preparó asépticamente la zona de la punción. El lugar escogido para la extracción de médula ósea fue la cabeza humeral, siendo el lugar de entrada el lado cráneo-lateral del húmero proximal, distal al tubérculo mayor. Se utilizó una aguja de 13G Jamshidi (Care Fusion), por lo que no fue necesaria incisión previa ni sutura posterior. La aguja se introdujo con el estilete montado mediante presión y movimientos de rotación, siguiendo un ligero ángulo caudo-dorsal para introducir la aguja en la medular de la cabeza del húmero. Tras retirar el estilete se conectó una aguja de 10 ml precargada con heparina y se realizó la aspiración. En ningún caso fue necesario revertir la sedación con atipamezol intravenoso. El aspirado de 15 ml de médula ósea se homogeneizó y las células mononucleares se aislaron por gradiente de centrifugación, utilizando Lymphoprep (Atom), a 1800 r.p.m. sin aceleración ni deceleración. Las células fueron lavadas dos veces con Tampón Fosfato Salino (PBS) (Gibco). Para el contaje de células mononucleadas se eliminaron los glóbulos rojos utilizando Red Blood Cell Lysis Buffer (SIGMA) y fueron sembradas a una densidad de 2.000.000 de células mononucleadas/cm2. Obtención de sangre procedente de vena yugular: De un modo similar, los procedimientos también se realizaron en las instalaciones en donde los animales se encuentran estabulados habitualmente para minimizar el sufrimiento y estrés de los animales. En este caso no fue necesaria la anestesia ni sedación, ya que la extracción de sangre es un procedimiento rutinario, y más allá de la punción el procedimiento no es doloroso. El lugar escogido fue la vena yugular, se obtuvieron unos 25 ml de sangre periférica por animal, depositando la muestra sobre tubos heparinizados (Becton Dickinson). La sangre fue diluida en un volumen 1:1 de PBS y posteriormente las células mononucleares se aislaron por gradiente de centrifugación en Lymphoprep (Atom), a 1800 r.p.m. sin aceleración ni deceleración. Las células fueron lavadas con PBS dos veces y sembradas a una densidad de 2.000.000 de células mononucleadas/cm2. 37 Las células de ambos orígenes se mantuvieron en medio de crecimiento, compuesto por DMEM bajo en glucosa (Sigma-Aldrich) suplementado con 1% de L- glutamina (Sigma-Aldrich), 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma-Aldrich) y según su origen, se suplementó con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (Gibco) (células procedentes de médula ósea), y con un 20% de FBS (células obtenidas a partir de sangre periférica). Después de la extracción, a las 24, 48 y 72 horas, las células se lavaron con PBS y el medio se cambió para eliminar las células no adherentes. Las MSC se mantuvieron en condiciones de 37ºC, 5% de CO2 y 20% de O2 para todos los procesos realizados. 4.1.2 Expansión y criopreservación de MSC Para la realización de los experimentos que componen la presente memoria fue necesario trabajar con un número elevado de células, objetivo que se consiguió a través de la expansión de MSC en varios pases. Las MSC de ambos orígenes se cultivaron realizando cambios de medio dos veces por semana, hasta alcanzar aproximadamente un 80% de confluencia. Posteriormente, las células se separaron de la superficie de la placa de cultivo por tratamiento con 0,25% tripsina/EDTA (Sigma-Aldrich) y se contaron empleando la cámara de Neubauer. En este punto, una fracción de células fue resembrada a una densidad de 5.000 MSC/cm2, que constituyó un nuevo pase, mientras que el resto de las células fueron criopreservadas para la realización de experimentos posteriores. El medio de congelación en el que las células fueron resuspendidas estaba compuesto por un 90% de FBS y 10% de DMSO. Las células se expandieron hasta pase 3 para las células obtenidas a partir de medula ósea, y hasta pase 2 para las células obtenidas a partir de sangre periférica. Posteriormente todas las células fueron congeladas utilizando el medio de congelación anteriormente descrito y mantenidas a -150ºC. 4.1.3 Caracterización de las MSC Antes de estudiar su posible aplicación como modelos celulares para el estudio de scrapie, fue necesario comprobar que las células aisladas eran MSC. Para ello se 38 caracterizaron mediante el análisis de su capacidad de proliferación y expresión de los marcadores de superficie e inducción de las MSC hacia los linajes mesodérmicos utilizando diferentes condiciones de cultivo en función de los requerimientos específicos de cada una de ellas. La caracterización en cuanto a potencial de diferenciación ha sido más exhaustiva para las MSC derivadas de sangre periférica ya que este trabajo es el primero que describe el aislamiento de este tipo de células. Así en las PB-MSC se ha analizado la cinética de diferenciaciones mediante marcadores moleculares mientras que en BM-MSC sólo se han estudiado en el punto final. 4.1.3.1 Capacidad de proliferación La capacidad de proliferación se evaluó estimando los parámetros del doblaje celular (CD) y del tiempo de doblaje (DT). Para ello se contaron las células tras el aislamiento (pase 0) hasta el pase en que se congelaron todas. Los valores de CD y DT fueron calculados empleando las fórmulas: Siendo CD el doblaje celular, Ni el número inicial de células, Nf el número final de células en los cultivos, DT el tiempo de doblaje y CT el tiempo de cultivo en días. 4.1.3.2 Expresión de marcadores de superficie El estudio basado en la Reacción en Cadena de la Polimerasa Cuantitativa o en Tiempo Real (RT-qPCR) se ha usado para cuantificar los niveles de expresión del ácido ribonucleico mensajero (mRNA) para seis genes de antígenos de superficie (véase apartado 4.2). Se han analizado los marcadores mesenquimales CD29, CD73, CD90 y CD105 y los marcadores hematopoyéticos CD34 y CD45. 39 4.1.3.3 Capacidad de diferenciación a linajes mesodérmicos Diferenciación adipogénica Las células mesenquimales provenientes de sangre periférica (PB-MSC) y las células mesenquimales provenientes de médula ósea (BM-MSC) se sembraron a una densidad de 5.000 MSC/cm2 en placas de 24 pocillos y se mantuvieron durante 14 días. Las células control mantenidas en medio de crecimiento y las tratadas con medio adipogénico fueron sembradas por cuadruplicado (sendos duplicados para el medio de crecimiento y el medio de diferenciación). El medio de diferenciación estaba compuesto por medio de crecimiento suplementado con 1 μM de dexametasona, 500 μM de IBMX, 200 μM de indometacina y 15% de suero de conejo [256] y fue renovado dos veces por semana. Los lípidos intracelulares formados en el interior de las MSC diferenciadas fueron visualizados a los días 7 y 14 tras su fijación con formalina al 10% (Sigma-Aldrich) durante 15 minutos y su tinción con oil red O 0,3% (Sigma-Aldrich), que tiñe de rojo los ácidos grasos. En los días 7 y 14 se estudió la expresión de marcadores adipogénicos PPAR , esteaoril-CoenzimaA desaturasa (SCD), e interleuquina 6 (IL-6) mediante RT-qPCR (véase apartado 4.2) en las PB-MSC. Estos marcadores se analizaron el último día de cultivo en las BM-MSC. Diferenciación osteogénica Las células se sembraron a una densidad de 20.000 MSC/cm2 en placas de 24 pocillos y se cultivaron durante 21 días, según protocolos empleados para otras especies [264]. Las células control tratadas con medio de crecimiento y tratadas con medio de diferenciación osteogénica fueron sembradas por cuadruplicado (sendos duplicados para el medio de crecimiento y el medio de diferenciación). El medio de inducción estaba formado por medio de crecimiento suplementado con 10 nM de dexametasona, 10 mM de β-glicerofosfato y 100 M de ascorbato-2-fosfato y fue renovado dos veces por semana. Para la valoración de la osteogénesis, las células se fijaron con etanol al 70% frío los días 7, 14 y 21 de la diferenciación y se incubaron durante 10 minutos con Alizarín Red 2% (Sigma–Aldrich) y pH 4,6. Esta molécula presenta afinidad por el calcio depositado en la matriz extracelular generada por las células diferenciadas. Además se estudió la expresión de los marcadores osteogénicos 46 hibridación de cada cebador (58-60ºC). Al finalizar la amplificación se realizó el protocolo para obtener la curva de disociación e identificar la presencia de bandas de amplificación no específicas o la presencia de altos niveles de dímeros. Cuando se cuantifica la expresión de un gen se utilizan genes normalizadores, los cuales son genes constitutivos (housekeeping genes), para disminuir el error entre muestras generado por pasos previos a la cuantificación, como diferencias en la síntesis de cDNA o errores de pipeteo. Los genes normalizadores empleados en el estudio fueron Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa (G6PDH) e Hipoxantina-Guanina Fosforribosiltransferasa (HPRT). El factor de normalización al que referir la expresión de los genes de interés en cada muestra se calculó como la media geométrica de las dos medidas de expresión de G6PDH y HPRT. Finalmente se empleó la prueba estadística t de Student para analizar las diferencias entre los cultivos control y los sometidos a diferenciación, considerándose estadísticamente significativos los resultados cuya p < 0.05. 4.3 Análisis de expresión de PrPC mediante Dot Blotting La técnica de Dot Blotting se utilizó para comprobar la expresión de PrPC en los cultivos celulares de MSC previamente a la infección. Se utilizaron los reactivos del kit Prionics® -Check Western (Prionics). Alícuotas de 106 células, mantenidas a -80ºC en tubos de 1,5 ml, fueron homogeneizadas en 500 l de tampón de homogenización Prionics® -Check Western (Prionics). A continuación las muestras se centrifugaron a 10.000 g durante 10 minutos a 4ºC y se midió la concentración de proteína total en el sobrenadante mediante el método del ácido Bicinconónico BCA (Sigma Aldrich). Posteriormente, el extracto celular se centrifugó a 10.000 g durante 60 minutos a 4ºC para precipitar las proteínas, se eliminó el sobrenadante y el precipitado se diluyó en agua ultrapura para obtener una concentración final de 25 g/ l. Se depositó un total de 50 g muestra sobre una membrana de 0,2 m Immun-Blot® PVDF (Bio-Rad) y, una vez adsorbida la muestra, la membrana se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) en tampón de bloqueo formado por leche desnatada en polvo resuspendida al 5% en TBST (Tampón Salino Tris con Tween 20 al 0.05 %). Las membranas se incubaron durante 1 hora a RT con el anticuerpo monoclonal de ratón 47 anti-PrP IgG1 6H4 (Prionics) diluido 1:5000 en tampón de bloqueo. Tras realizar tres lavados con TBST se incubó 1 hora a RT en el anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Prionics) diluido 1:5000 en tampón de bloqueo. El revelado se realizó mediante el revelador CDP-Star® (Tropix) y las imágenes de quimioluminiscencia se obtuvieron mediante el revelador digital cuantificador Versa-Doc™ Imaging System Modelo 4000 (Bio-Rad). 4.4 Infección de las MSC En este apartado se describe la metodología utilizada para la infección de las BM-MSC y las PB-MSC con extractos priónicos y la detección de la PrPSc en cultivos celulares. 4.4.1 Inoculación con scrapie Para probar la capacidad de infección de las MSC por aislados priónicos se utilizaron inóculos del cerebro de animales sanos, como control negativo, y de animales enfermos. Las muestras obtenidas post-mortem se homogenizaron y diluyeron en una solución de suero salino fisiológico (Braun) en una proporción 1:10 (g/ml). Para evitar posibles contaminaciones en los cultivos, las muestras se sometieron a un tratamiento antibiótico con Sulfato de Estreptomicina (100 g/ml) junto a Bencilpenicilina (100 g/ml). Además se sometió a la muestra a un tratamiento térmico a 70ºC durante 10 minutos. Antes de proceder a la inoculación se testaron las muestras mediante cultivo en agar sangre (5% sangre ovina) durante 48 horas a 37ºC y se confirmó el crecimiento negativo. Las MSC fueron sembradas a una densidad de 5.000 cels/cm2, se mantuvieron 24 h en cultivo para permitir su adhesión a la placa, y se añadió el inóculo al medio de cultivo en una proporción 1:4. Se dejó en contacto con las MSC durante 72 horas antes de renovar el medio. Posteriormente el medio se renovó dos veces por semana. El cultivo se mantuvo hasta pase 7, en cada pase las células se mantenían hasta alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia, posteriormente, las células se separaron de la superficie de la placa de cultivo por tratamiento con 0,25% tripsina/EDTA (Sigma- 48 Aldrich) y se contaron mediante la cámara de Neubauer. En este punto, una fracción de células fue resembrada a una densidad de 5.000 MSC/cm2, que constituyó un nuevo pase, y el resto de las células fueron criopreservadas para la realización de experimentos posteriores. El medio de congelación en el que las células fueron resuspendidas estaba formado por un 90% de FBS y 10% de DMSO. 4.4.2 Determinación de PrPSc medianteWestern Blotting El Western Blotting se utilizó para confirmar la presencia de PrPSc en los cultivos de MSC. Las muestras de 106 células se encontraban mantenidas a -80ºC en tubos de 1,5 ml. La extracción de proteínas se realizó mediante la homogeneización de las muestras en 500 l de tampón de homogenización Prionics® -Check Western (Prionics). Las muestras se centrifugaron a 10.000 g durante 10 minutos a 4ºC y se midió la concentración de proteína total en el sobrenadante mediante el método del ácido Bicinconónico BCA (Sigma Aldrich). Las muestras se diluyeron en el tampón de Prionics® -Check Western (Prionics) hasta una concentración de 1mg/ml. Aproximadamente 800 µg de proteína se sometieron a una digestión a 37ºC durante 30 minutos con 35 µl de proteinasa K 1µg/µl (Prionics). Tras la digestión se centrifugó a 10.000 g durante 50 minutos a 4ºC y se desechó el sobrenadante. Se resuspendió el precipitado en 100 µl de gel de carga β-mercaptoetanol (Prionics) y se calentó a 100ºC durante 10 minutos. El marcador de talla y control de transferencia utilizado fue el Kaleidoscope Prestained Standards (Bio-Rad) siguiendo las instrucciones del fabricante. La electroforesis se realizó con el gel Criterion™ XT al 12% Bis-Tris (Bio-Rad) cargando 10 µl de muestra. La migración se realizó sobre una membrana de transferencia de 0,45 m Immobilon–P (Millipore Corporation). La membrana fue bloqueada con PVDF Blocking Buffer Concentrate 5x (Prionics) a concentración de trabajo 1x, durante media hora a RT. El anticuerpo primario empleado fue el monoclonal de ratón P4 (Biopharm) 1:2500 en TBST incubando toda la noche a 4ºC en agitación. El anticuerpo secundario empleado fue el anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Prionics) diluido 1:5000 en TBST e incubado 1 hora a RT. Por último se empleó el revelador CDP-Star® (Tropix). Las imágenes de quimioluminiscencia se obtuvieron con el lector Versa-Doc™ Imaging System Modelo 4000 (Bio-Rad). 49 4.5 Herramientas bioinformáticas En el desarrollo de este trabajo se han utilizado diversos programas y bases de datos para la búsqueda de secuencias génicas específicas de oveja, diseño de cebadores para su uso en PCR, análisis de las amplificaciones. A continuación se detallan los programas y bases de datos utilizados en el presente Trabajo Fin de Máster. Búsqueda y recuperación de datos en sistemas integrados de búsqueda y bases de datos: ENTREZ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Alineamiento y búsqueda de secuencias: BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Diseño de cebadores: Primer Express Software 2.0 (Applied Biosystems). Visualización de secuencias y alineamiento: BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Análisis de productos amplificados de RT-qPCR: StepOne™ software (Applied Biosystems). 50 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN A continuación se exponen los resultados obtenidos durante la realización del Trabajo Fin de Máster y su discusión. 5.1 Aislamiento y caracterización de MSC Desde los primeros días de cultivo de las células mononucleadas obtenidas tanto de sangre periférica como de médula ósea se observaron células con morfología de fibroblasto adheridas al plástico (Figura 3). La obtención de MSC a partir de médula ósea de ovino ya se ha descrito [232, 233, 253], sin embargo, esta es la primera vez que se describe un método para el aislamiento de MSC a partir de sangre periférica de oveja. Debido a la novedad, hemos realizado un análisis de caracterización más exhaustivo en las PB-MSC analizando la cinética de las diferenciaciones hacia linajes mesodérmicos. Para las BM-MSC sólo se ha comprobado la diferenciación en el punto final del proceso. A pesar de que el volumen obtenido de sangre fue similar para todos los animales, el número de células nucleadas obtenidas fue variable. El rango de células mononucleadas obtenidas a partir de sangre periférica varió desde 0,594 106 hasta 1,9 106 células mononucleadas/ml, con una media de 1,35 106 ± 682646 células/ml. Tras el proceso de aislamiento, se obtuvo una media de 281400 ± 178051 células adherentes por animal, obteniéndose entre 2700 y 9300 células adherentes por cada 106 células mononucleadas (media de 5850 ± 2700). En otras especies domésticas se ha observado que la cantidad de MSC en sangre periférica es baja [265], lo cual parece suceder también en ovino, ya que se observaron pocas colonias durante los cultivos de PB-MSC. En el caso de la obtención de células a partir de médula ósea es más difícil partir de un volumen similar para todos los animales y la cantidad de células nucleadas obtenidas varió mucho entre individuos. Así, tras normalizar los datos frente al volumen de médula obtenido, el número de células aisladas tras los gradientes de centrifugación varió desde 0,16 106 hasta 2,73 106 células nucleadas/ml, con una media de 1,178 106 ± 1,18 106 células/ml. Tras el aislamiento quedó una media de 326462 ± 302288 células 51 por individuo, variando entre 116859 y 12195 células aisladas por cada 106 células mononucleadas de médula ósea, siendo la media de 57103 ± 50115. Las células se expandieron durante dos o tres pases para obtener una cantidad suficiente para llevar a cabo los ensayos de diferenciación en las tres líneas potenciales, adipocitos, condrocitos y osteoblastos, y caracterización mediante el análisis de la expresión de marcadores celulares de superficie. En estos pases se evaluó también la capacidad de proliferación de las células obtenidas. Figura 3. Se muestran células procedentes de médula ósea con morfología de fibroblasto y adheridas al plástico después de 3 días (A) y 7 días (B) del aislamiento. 5.1.1 Capacidad de proliferación La capacidad de proliferación de las células obtenidas a partir de sangre periférica se midió durante los dos pases en que se expandieron las células antes de su criopreservación. Se necesitó una media de 12,6 días para el primer pase, reduciéndose a 7,33 días durante el segundo pase. Los valores obtenidos para CD y DT en los dos pases se especifican en la Tabla 3. La gran variabilidad individual en cuanto a la cantidad de MSC aisladas se ha descrito en el aislamiento de MSC de sangre periférica de otras especies, como la equina [266]. Sin embargo, los tiempos de doblaje observados en ovino son superiores a los descritos para el caballo. Estas diferencias podrían deberse a que en equino se utiliza 52 un medio con una concentración de FBS (30%) superior a la empleada en este trabajo, o también a la adición de dexametasona al medio de cultivo, la cual ha demostrado ser beneficiosa para la expansión de las MSC [267]. Las células obtenidas de médula ósea se expandieron hasta pase 3, y la capacidad de proliferación fue medida durante estos pases. La media de tiempo requerida para los tres pases fue de 7 días. Los datos de proliferación se muestran en la Tabla 3. La variabilidad detectada en este estudio se corresponde con la observada por otros autores en el análisis de MSC ovinas obtenidas a partir de la médula ósea [239]. Tabla 3. Datos obtenidos para la proliferación de BM-MSC y PB-MSC PASE BM-MSC PB-MSC 1 CD 2,96 ± 1,21 2,29 ± 0,887 DT (días) 2,62 ± 0,82 5,99 ± 1,86 2 CD 1,36 ± 0,29 1,84 ± 0,975 DT (días) 5,32± 1,11 4,88 ± 2,68 3 CD 2,50 ± 0,23 DT (días) 2,82 ± 0,27 5.1.2 Expresión de marcadores celulares de superficie mesenquimales Para iniciar la caracterización de las BM-MSC y PB-MSC se ha analizado la expresión de los transcritos de seis marcadores específicos para células mesenquimales y hematopoyéticas mediante RT-qPCR. La utilización de estas técnicas basadas en la expresión génica son útiles a la hora de identificar estas moléculas descritas como marcadores de MSC [268, 269], principalmente en especies para las que no se dispone de anticuerpos comerciales con reactividad frente a sus epítopos. Así, se ha descrito una buena correlación entre los marcadores de expresión génica y el inmunofenotipo detectado por citometría de flujo en MSC equinas [224]. 53 La falta de un fenotipo inmune bien definido para las MSC en sangre periférica dificulta su estudio. Además, muchas de los marcadores celulares utilizados en el análisis por citometría de flujo de MSC humanas no han sido probadas en ovino [233]. La expresión de los marcadores CD29, CD73, CD90 y CD105 es positiva en MSC humanas, y la expresión de CD34 y CD45 es negativa. En nuestro trabajo, tanto las BM-MSC como las PB-MSC ovinas analizadas expresaron CD29, CD73, CD90 y mostraron lecturas negativas para el marcador hematopoyético CD45. Además se observó una débil expresión de CD105 en ambos tipos celulares, siempre tras más de 32 ciclos de amplificación. La única diferencia observada entre ambas fuentes de MSC se corresponde con la expresión de CD34. Así, en las BM-MSC no se amplificó este marcador, mientras que 5 de los 6 cultivos de PB-MSC mostraron expresión de CD34. Nuestros resultados concuerdan con los descritos por otros autores en la especie ovina. Utilizando citometría de flujo se ha demostrado la presencia de CD29 y CD105 en MSC ovinas obtenidas a partir de médula ósea [233, 243]. A partir de tejido adiposo se han obtenido marcajes positivos frente a CD90 [238], así como señales débiles para el marcador CD-105. En concordancia con la especie humana [270], las MSC ovinas obtenidas a partir de médula ósea [243] y de tejido adiposo [238] han demostrado ser negativas para la expresión de CD45. En este trabajo también se han obtenido resultados negativos para este marcador. En nuestro análisis CD34 se amplificó en 5 de los 6 cultivos de PB-MSC, mostrando heterogeneidad individual. A pesar de que se describe como un marcador hematopoyético y que, por tanto, debería estar ausente en las MSC, este marcador fue detectado a bajos niveles mediante RT-qPCR en MSC humanas aisladas de sangre periférica [271] y en MSC equinas obtenidas de tejido adiposo [272]. A pesar de que la citometría de flujo es necesaria para corroborar el inmunofenotipo de las células aisladas, el perfil de expresión génica sugiere que tanto las células obtenidas a partir de médula ósea como las de sangre periférica cumplen las características adecuadas en cuanto a expresión de marcadores de superficie para ser consideradas MSC. 54 5.1.3 Potencial adipogénico En los cultivos mantenidos en condiciones de adipogénesis se observaron por microscopio óptico gotas lipídicas, sin embargo, el tamaño de las gotas fue variable dependiendo del animal del que procedían las células. Para confirmar la naturaleza lipídica de las gotas, los cultivos se tiñeron con oil red O (Figuras 4 y 5 para las BMMSC y PB-MSC respectivamente). La expresión de marcadores adipogénicos se analizó en los días 7 y 14 para las PB-MSC tras la inducción de la diferenciación. La expresión de PPAR , SCD e IL6 se muestran en la Figura 7. Como la capacidad adipogénica de las BM-MSC ovinas ya ha sido caracterizada por otros autores [232, 233] en este trabajo se analizan los marcadores de diferenciación adipogénica únicamente el último día de diferenciación para así confirmar la diferenciación observada previamente mediante las tinciones. Sin embargo, tanto los cultivos mantenidos en medio de crecimiento como los cultivos mantenidos en medio adipogénico presentaron un alto índice de mortalidad celular, impidiendo la medición de sus niveles de expresión mediante RT-qPCR. No obstante, los acúmulos de gotas lipídicas se observaron mediante tinción específica (Figura 4). En los cultivos de PB-MSC se observó un aumento en la expresión de PPAR y SCD de 7.3 y 20.8 veces respectivamente, pero debido a la gran variabilidad entre animales, los resultados no han sido estadísticamente significativos. Por el contrario, se detectó un descenso significativo en la expresión de IL6 a las 2 semanas de cultivo (Figura 7). La diferenciación adipogénica mostró una gran variabilidad en cuanto a las gotas lipídicas observadas mediante tinción. Las variaciones en cuanto a la expresión génica concuerdan con la función conocida de estos marcadores y corroboran la diferenciación adipogénica observada mediante las técnicas de tinción. Así, PPAR es considerado como el principal regulador de la adipogénesis [273, 274] y se encuentra sobreexpresado en condiciones de adipogénesis [275]. La SCD únicamente se expresa en adipocitos, y cataliza la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados, desempeñando un papel fundamental en la adipogénesis [276]. Por último, la IL6 es la encargada de mantener el estado indiferenciado y proliferativo de las MSC que derivan de médula ósea [277] y su expresión disminuye durante la diferenciación a los diferentes linajes celulares [278]. 55 5.1.4 Potencial osteogénico La capacidad de las células para diferenciarse a osteoblastos se demostró para las dos fuentes de MSC ovinas del estudio. Se utilizó la tinción de Alizarín Red y las agregaciones observadas con aspecto nodular aparecieron teñidas de rojo (Figuras 4 y 5 para las BM-MSC y PB-MSC respectivamente), al menos tras 21 días de cultivo, indicando que estas células se mineralizan en un estado muy tardío. La débil tinción observada en algunos de los cultivos puede ser debida a que el periodo necesario para la mineralización de las MSC ovinas descrito por otros autores varía de 21 días [243] a 5 semanas [233]. La expresión de marcadores de osteogénesis en las BM-MSC se analizó únicamente el último día de cultivo (21 días) y no mostró cambios significativos para ninguno de los dos marcadores analizados (Figura 6). Tanto COL1A1 como BGLAP se mantuvieron en niveles similares a los controles tras tres semanas en cultivo, mostrando una gran desviación estándar. El análisis de la expresión de marcadores en las PB-MSC positivas a la tinción con Alizarín Red (dos cultivos) no mostró cambios significativos en los niveles de COL1A1 en las primeras 2 semanas de cultivo. Asimismo, después de 3 semanas la expresión de este marcador se redujo. Por el contrario, la expresión del marcador BGLAP aumentó durante el periodo de cultivo (Figura 7). A pesar de que COL1A1 está considerado como un marcador temprano de osteogénesis [279], no se han observado cambios estadísticamente significativos en los últimos días de cultivo en ninguno de los dos tipos celulares, incluso se advirtió un descenso en la expresión del mismo. De acuerdo con nuestros resultados, la bibliografía describe un ascenso poco marcado de la expresión del mRNA de COL1A1 tras la diferenciación osteogénica en la especie humana [280], porcina [281] y equina [264]. Igualmente se ha descrito el descenso de este marcador en las MSC humanas obtenidas a partir de sangre periférica [282]. En consecuencia, no parece ser un marcador apropiado para comprobar la diferenciación de las MSC en muchas especies, y particularmente de las MSC ovinas. Sin embargo BGLAP se mostró sobreexpresado durante la diferenciación para PB-MSC, coincidiendo con la tinción positiva a Alizarín Red. Estos datos parecen estar en concordancia con que BGLAP sea un marcador tardío de los osteoblastos y aparezca junto a la mineralización de la matriz celular [283]. 62 Por tanto, las BM-MSC y PB-MSC parecen conservar la capacidad de transdiferenciación, asimismo, la presencia de PRNP se ha demostrado en ambos tipos celulares previa a la diferenciación, y se ha observado su sobreexpresión durante la diferenciación neuronal. La sobreexpresión de PRNP podría estar involucrada con los cambios morfológicos, ya que la PrPC parece ser necesaria para la neuritogénesis [287]. Esta capacidad de expresión de PRNP convierte a ambos tipos celulares en excelentes candidatos para el desarrollo de modelos celulares de enfermedades priónicas. Figura 9. Diferenciación neurogénica de BM-MSC. Imágenes de microscopía por contraste de fases de las BM-MSC ovinas cultivadas en medio neurogénico durante 3 días. Las células control (A) muestran una morfología fibroblástica mientras que las células diferenciadas (B) muestran características compatibles con neuronas: cuerpos brillantes, extensiones multipolares y finales en ramificación (C: más aumentos). Se muestran los niveles de expresión evaluados por RT-PCR de marcadores neuronales para los diferentes días en cultivo relativos a los niveles mostrados por los cultivos en medio de crecimiento (valores marcados como 1, línea horizontal). Los datos se muestran como medias ± los errores estándar. Las diferencias estadísticamente significativas entre los cultivos diferenciados y control se han determinado mediante la prueba t de Student. (*P<0.05) 63 Figura 10. Diferenciación neurogénica de PM-MSC. Imágenes de microscopía por contraste de fases de las PM-MSC ovinas cultivadas en medio neurogénico durante 3 días. Las células control (A) muestran una morfología fibroblástica mientras que las células diferenciadas (B) muestran características compatibles con neuronas: cuerpos brillantes, extensiones multipolares y finales en ramificación (C: más aumentos). Se muestran los niveles de expresión evaluados por RT-PCR de marcadores neuronales para los diferentes días en cultivo relativos a los niveles mostrados por los cultivos en medio de crecimiento (valores marcados como 1, línea horizontal). Los datos se muestran como medias ± los errores estándar. Las diferencias estadísticamente significativas entre los cultivos diferenciados y control se han determinado mediante la prueba t de Student. (*P<0.05) 64 5.3 Infección de MSC con aislado priónico de scrapie clásico Una vez que la expresión de PRNP fue confirmada a nivel de transcritos, antes de realizar la infección de las células, confirmamos que esta expresión se veía reflejada a nivel proteico. La especificidad de los anticuerpos utilizados para la determinación de la PrP ovina es muy alta y ha sido validada en múltiples laboratorios de diagnóstico, en consecuencia se planteó la evaluación de la expresión de PrPC mediante Dot Blotting (Figura 11), ya que supone una prueba más rápida y sencilla en su realización, y que permite seleccionar las muestras para su posterior estudio mediante Western Blotting. Se han obtenido resultados positivos para 3 de 4 animales en los que se analizaron muestras tanto de BM-MSC como de PB-MSC. Este resultado parece indicar que, al igual que ocurre a nivel de transcritos, los niveles de expresión de PrPC pueden ser variables dependiendo del animal. La técnica de Dot Blotting permite cuantificar la expresión de PrPC en los diversos cultivos. En consecuencia, se utilizará para evaluar los niveles de expresión de las MSC ovinas de nuestro banco con el fin de determinar aquellos cultivos que presenten una mayor expresión de la proteína. Además se utilizará para confirmar a nivel proteico la sobreexpresión de PrPC en los cultivos de MSC ovinas en condiciones neurogénicas. Los ensayos de inoculación se están poniendo a punto en un reducido número de muestras para evitar el gasto de extractos positivos, debido al valor de este material biológico. Tras la inoculación sobre los cultivos la presencia de PrPSc fue detectada mediante digestión con proteinasa K de los extractos proteicos y posterior realización de Western Blotting. Esta técnica permite identificar la proteína PrP resistente a proteasas, confirmando así la infección del cultivo. Tras la incubación de 72 h de las células con los extractos de cerebro infectado por priones se detectó una gran muerte celular, probablemente debido a una pobre oxigenación de las células producida por el exceso de inóculo. En consecuencia, actualmente se están poniendo a punto nuevos protocolos de infección en los cuales la mortalidad se ha eliminado, pero todavía no tenemos resultados de la infección. A pesar de la mortalidad, las células que sobrevivieron mantuvieron su capacidad de proliferación y se expandieron hasta el pase 3. En este pase se evidenciaron importantes niveles de PrPSc, tanto en un cultivo de PB-MSC como en otro de BM-MSC (Figura 12). El cultivo de PB-MSC infectado mostró mayor intensidad de 65 PrPSc por lo que se evaluó la capacidad del mismo para propagar la infección en pases posteriores. Así, se expandió hasta 10 pases posinfección y se evaluó la presencia de PrPSc en los pases 5, 7 y 10. En contra de lo publicado por otros autores en la especie murina [210], la presencia de PrPSc se evidenció sólo hasta el pase 3 posinfección (Figura 13). El cultivo infectado presentaba una gran capacidad de proliferación que creemos estaría impidiendo la transmisión de la infectividad de unas células a otras, ya que no están en contacto el tiempo suficiente. Únicamente las células que se infectaron en un primer momento y las derivadas de ellas presentarían la infección, por lo que ésta se diluiría en los sucesivos pases [180]. Con el fin de evitar esta pérdida de infectividad y de favorecer la infección de las células, se están valorando distintas condiciones de cultivo con menor porcentaje de suero para ralentizar el crecimiento celular. La infección de células diferenciadas podría favorecer la replicación del prión ya que en principio expresarían mayores niveles de proteína prión y siendo menor su capacidad proliferativa. Por otra parte, la infección con aislados de scrapie podría estar produciendo cierta toxicidad en el cultivo. En los estudios realizados en la especie murina no se observó toxicidad [210], pero en este estudio trabajamos con una especie naturalmente susceptible a la enfermedad. Se necesitan estudios de viabilidad celular para analizar esta posible toxicidad y confirmar o rechazar esta hipótesis. Las investigaciones realizadas en el presente trabajo abren nuevas vías de estudio, como es el análisis de la sensibilidad de estas células a la infección en función de su genotipo para PRNP, que en caso de resultar distinta podría permitir la tipificación de distintas cepas de scrapie (clásico y atípico) o de BSE. También permitiría el estudio de la toxicidad de la infección con prión en MSC, con y sin diferenciación a células neuronales. Si se consiguiera multiplicar la infectividad, estos cultivos podrían servir como método de diagnóstico para amplificar la señal de tejidos levemente infectados. Finalmente, el estudio de las MSC procedentes de animales en distintas fases de la enfermedad contribuiría al conocimiento de la patogenia de estas enfermedades. 66 Figura 11. Dot Blotting de expresión de PrP en BM-MSC (BM) y PB-MSC (PB). La imagen muestra la expresión de PrP en muestras de cuatro animales (A (Negativo), B, C y D) para muestras de PB-MSC y de BM-MSC, la prueba se ha realizado por duplicado (segunda línea). Figura 12. Western Blotting de expresión de PrPSc en muestras de PB-MSC (PB) y BMMSC (BM). La imagen muestra resultados positivos (bandas de 27-30 kDa tras la digestión de las muestras con proteinasa K) en pase 3 tras la infección (PB1 (+), PB2 (+) y BM1 (+)). 67 Figura 13. Western Blotting de expresión de PrPSc en muestras de PB-MSC. La imagen muestra resultados positivos (bandas de 27-30 kDa tras la digestión de las muestras con proteinasa K) en pase 3 (P3) tras la infección. La detección es negativa para las mismas muestras tras 5 pases (p5), 7 pases (P7) y 10 pases (P10) postinfección. 68 6 CONCLUSIONES 1. En el presente estudio se describe por primera vez el aislamiento de células mesenquimales a partir de sangre periférica de ovino. Estas células presentan marcadores de superficie mesenquimales y conservan su capacidad para diferenciarse a osteoblastos, adipocitos y condrocitos. 2. La gran variabilidad individual, manifestada en la heterogeneidad de los resultados obtenidos en la diferenciación a linajes mesodérmicos de las PB-MSC y BM-MSC ovinas pone de manifiesto la necesidad de realizar más estudios para optimizar las condiciones de cultivo y confirmar la idoneidad de estas células para estudios en los que la diferenciación a estos linajes sea imprescindible. 3. Las células mesenquimales ovinas de ambos orígenes muestran capacidad para transdiferenciarse a células de origen neurogénico, expresando además el gen PRNP y la proteína prión celular. Estas características ofrecen grandes posibilidades para el desarrollo de modelos in vitro para el estudio de las enfermedades neurodegenerativas en ovino, modelo ideal de hospedador natural para las enfermedades priónicas. 4. El presente trabajo demuestra por primera vez la infección de MSC con priones en un hospedador natural de las enfermedades priónicas. La presencia de PrPSc se mantiene a niveles detectables hasta el tercer pase postinfección. Futuros trabajos clarificarán si la pérdida de infectividad se debe a la excesiva división de las MSC en cultivo o a una posible toxicidad del prión. 69 7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Safar J, Roller PP, Gajdusek DC, Gibbs CJ, Jr.: Conformational transitions, dissociation, and unfolding of scrapie amyloid (prion) protein. J Biol Chem 1993, 268(27):20276-20284. 2. Soto C: Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci 2003, 4(1):49-60. 3. 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