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Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Trabajo Fin de Máster para optar al título de Máster en Biología Molecular y Celular Ángela Fernández Otal Licenciada en Bioquímica RESUMEN Las infecciones bacterianas son cada vez más difíciles de tratar puesto que los microbios que las causan presentan resistencia a los antibióticos convencionales. El desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos pasa por la identificación de nuevas dianas antibacterianas. En este contexto, una forma de abordar el problema consiste en la búsqueda de compuestos que actúen sobre funciones genéticas del patógeno que sean esenciales para producir la enfermedad in vivo. Es el caso de los genes necesarios para causar virulencia o los implicados en la viabilidad del mismo. La disminución en la concentración de hierro, micronutriente esencial para la mayoría de los seres vivos por el que compiten hospedador y patógeno durante la infección, es una señal que desencadena la expresión de genes de virulencia en el patógeno. En el control de la expresión de muchos de ellos participan homólogos de la proteína Fur (Ferric uptake regulator). Este regulador transcripcional modula la homeostasis del hierro y es esencial para la virulencia de muchos patógenos, convirtiéndolo en un candidato muy interesante como diana terapéutica para la identificación de antibióticos alternativos a los actuales. Los resultados que se presentan en este proyecto máster se enmarcan dentro de una línea de trabajo del grupo de investigación donde se ha desarrollado, encaminada a valorar la idoneidad de Fur como diana terapéutica frente a microorganismos patógenos. Se basa en la búsqueda de compuestos bioactivos que modifiquen la actividad de Fur de patógenos mediante cribado de librerías de compuestos químicos, análisis de la interacción Fur-DNA en presencia de compuestos seleccionados, in vitro, y confirmación de su eficacia in vivo. En particular, el objetivo del trabajo que se desarrolla a continuación es la selección de moduladores de la actividad de Fur de entre un conjunto de compuestos derivados de ferroceno y estudio de su actividad antimicrobiana. Se han fijado como tareas el clonaje, sobrexpresión, purificación y caracterización bioquímica de las proteínas Fur de Listeria monocytogenes EGD-e y Helicobacter pylori 26695 y la identificación de derivados de ferroceno que modulan la actividad de ambas proteínas en ensayos de retardo de movilidad electroforética (EMSA), así como la evaluación de la acción antimicrobiana de los mismos in vivo. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Índice 1 ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS 3 ÍNDICE DE TABLAS 5 ABREVIATURAS 6 A. INTRODUCCIÓN 9 I. PROBLEMÁTICA ACTUAL DE LA RESISTENCIA BACTERIANA 9 II. NUEVAS ESTRATEGIAS PARA EL DESARROLLO DE ANTIMICROBIANOS 10 III. LA PROTEÍNA FUR 10 a. Estructura de Fur 11 b. Modo de acción de Fur 13 c. Genes regulados por Fur en patógenos 14 d. ¿Cómo se regula Fur? 15 IV. LOS FERROCENOS 16 B. OBJETIVOS 17 C. MATERIALES Y MÉTODOS 18 I. MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO 18 II. CLONAJE DEL GEN fur EN EL PLÁSMIDO DE SOBREEXPRESIÓN 19 a. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 19 b. Extracción del plásmido de E. coli a pequeña escala (miniprep) y cuantificación del DNA 20 c. Digestión doble enzimática de DNA y ligación 20 d. Preparación de células termocompetentes 20 e. Transformación mediante choque térmico 21 f. Secuenciación 21 III. SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LOS HOMÓLOGOS DE FUR 22 a. Sobreexpresión de las proteínas 22 b. Obtención del extracto crudo 23 c. Cromatografía de afinidad a metales (IMAC) 23 d. Precipitación con ácido tricloroacético (TCA) 24 e. Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 24 f. Concentración y diálisis de las proteínas 25 g. Cuantificación de las proteínas por espectroscopía 25 IV. TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS FUR 26 a. Estudio de la presencia de metal mediante electroforesis 26 b. Determinación del número de cisteínas libres 26 c. Detección de la actividad disulfuro reductasa 26 d. Estudio de la interacción proteína-DNA (EMSA) 27 e. Estudio de la interacción con el grupo hemo 28 V. ENSAYOS IN VIVO DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA 29 a. Cálculo de la unidades formadoras de colonias (CFU/ml) 29 b. Test de difusión en disco: Método Kirby-Bauer 29 c. Test de dilución en caldo: Determinación de la C.I.M. 30 “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Índice 2 D. RESULTADOS 31 I. CLONAJE 31 II. SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LOS HOMÓLOGOS DE FUR 32 a. Sobreexpresión de las proteínas 32 b. Purificación de las proteínas 33 c. Cuantificación de las proteínas 34 III. ANÁLISIS DE LA PRESENCIA DE METAL MEDIANTE ELECTROFORESIS 35 IV. DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE CISTEÍNAS LIBRES 36 V. DETECCIÓN DE LA ACTIVIDAD DISULFURO REDUCTASA 38 VI. ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN PROTEÍNA-DNA 39 a. Búsqueda de las condiciones óptimas de unión 39 b. Efecto de la presencia del quelante EDTA sobre la interacción 40 VII. ANÁLISIS DE LA INTERACCIÓN DE LOS HOMÓLOGOS FUR CON EL GRUPO HEMO 41 a. Detección de los complejos mediante espectroscopía diferencial 42 b. Estudio del efecto de la presencia del grupo en la interacción proteína-DNA 44 VIII. EFECTO DE COMPUESTOS DERIVADOS DE FERROCENO SOBRE LA INTERACCIÓN PROTEÍNA-DNA IN VITRO 45 IX. EFECTO DE COMPUESTOS DERIVADOS DE FERROCENO IN VIVO 46 a. Test de difusión en disco Kirby-Bauer 47 b. Determinación de la C.I.M. 49 E. DISCUSIÓN 51 I. OBTENCIÓN DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES LmFur Y HpFur 51 II. PRESENCIA DE METAL EN LOS HOMÓLOGOS PURIFICADOS 52 III. ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD DISULFURO REDUCTASA 54 IV. INTERACCIÓN DE LAS PROTEÍNAS CON EL GRUPO HEMO 54 V. EFECTO DE LOS COMPUESTOS DERIVADOS DE FERROCENO IN VITRO 55 VI. EFECTO DE LOS COMPUESTOS DERIVADOS DE FERROCENO IN VIVO 56 F. CONCLUSIONES 57 G. BIBLIOGRAFÍA 58 “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Índice 3 ÍNDICE DE FIGURAS A. INTRODUCCIÓN Figura 1.1. Dianas tradicionales de los actuales antibióticos. 9 Figura 1.2. Representación de la estructura cristalina del dímero Fur de P. aeruginosa. 11 Figura 1.3. Representación de la estructura cristalina del dímero Fur de H. pylori. 12 Figura 1.4. Mecanismo general de represión propuesto para Fur. 13 Figura 1.5. Representación esquemá tica de las secuencias consenso propuestas como “caja Fur”. 13 Figura 1.6. Actuación de Fur y RhyB en la regulación génica dependiente de hierro. 15 Figura 1.7. A. Estructura química del grupo hemo. B. Grupo ferroceno. 16 B. MATERIALES Y MÉTODOS Figura 3.1. Representación esquemática del sitio de clonaje múltiple del vector pET-28a(+). 19 Figura 3.2. Elementos de control en el sistema pET. 22 Figura 3.3. Esquema de la matriz de afi nidad “Chelating Sepharose Fast Flow”. 23 Figura 3.4. Fórmula química del quelante TPEN. 26 Figura 3.5. Reacción producida durante el ensayo de Ellman. 26 Figura 3.6. Reacción entre el ditiotreitol y la insulina. 27 Figura 3.7. Compuestos derivados de ferroceno empleados en este trabajo. 29 C. RESULTADOS Figura 4.1. Verificación de la presencia del gen clonado fur en los plásmidos pET-28a:fur Lm y pET-28a:fur Hp. 31 Figura 4.2. Análisis de la sobreexpresión de las proteínas recombinantes mediante geles de SDS-PAGE al 15% (tampón de carga con agentes reductores). 32 Figura 4.3. Purificación de LmFur. 33 Figura 4.4. SDS-PAGE al 15% del proceso total de purificación (tampón de carga con agentes reductores). 33 Figura 4.5. Espectro de absorción de las proteínas recombinantes purificadas. 34 “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Índice 4 Figura 4.6. Análisis de la presencia de metal mediante SDS-PAGE al 15%. 35 Figura 4.7. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las proteínas LmFur y HpFur. 37 Figura 4.8. Determinación del número de cisteínas libres presentes en la solución de proteína. 37 Figura 4.9. Detección de la actividad disulfuro reductasa. 38 Figura 4.10. EMSA en gel de poliacrilamida al 6% para comprobar la actividad de las proteínas purificadas. 39 Figura 4.11. EMSA en gel de poliacrilamida al 6% para comprobar el efecto del Mn(II) en la actividad de las proteínas. 40 Figura 4.12. EMSA en gel de poliacrilamida al 6% para comprobar el efecto de la presencia del quelante EDTA en la actividad de las proteínas. 41 Figura 4.13. Estudio por espectroscopía diferencial de la unión del grupo hemo a los homólogos de la proteína Fur. 43 Figura 4.14. Estudio mediante EMSA del efecto del grupo hemo en la actividad de los homólogos de Fur in vitro. 44 Figura 4.15. EMSA en gel de poliacrilamida al 6% para comprobar el efecto del conjunto de compuestos derivados del ferroceno sobre la unión de la proteína LmFur al DNA. 45 Figura 4.16. EMSA en gel de poliacrilamida al 6% para comprobar el efecto del conjunto de compuestos derivados del ferroceno sobre la unión de la proteína HpFur al DNA. 46 Figura 4.17. Cálculo de las unidades formadoras de colonias (CFU/ml) de S. aureus ATCC 29213. 47 Figura 4.18. Ensayo de susceptibilidad antimicrobiana mediante el test de difusión en disco Kirby-Bauer. 48 Figura 4.19. Determinación de la CIM del compuesto CLM-12 sobre S. aureus ATCC 29213. 49 Figura 4.20. Determinación de la CIM del antibiótico ampicilina sobre S. aureus ATCC 29213, realizado como control positivo. 50 D. DISCUSIÓN Figura 5.1. Modelo propuesto para la especies monomérica y dimérica presentes en la solución de proteína recombinante HpFur. 53 Figura 5.2. Alineamiento de los motivos CXXC. 54 “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Índice 5 ÍNDICE DE TABLAS B. MATERIALES Y MÉTODOS Tabla I. Microorganismos empleados. 18 Tabla II. Oligonucleótidos empleados en este trabajo. 20 Tabla III. Composición de los tampones utilizados en la purificación. 24 Tabla IV. Composición del gel SDS-PAGE al 15%. 25 Tabla V. Composición del gel para EMSA al 6% (2 geles). 27 C. RESULTADOS Tabla VI. Cuantificación de las proteínas purificadas. 34 “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Introducción 11 a. Estructura de Fur Las estructuras obtenidas por rayos X de homólogos de la familia Fur entre los que se encuentran una versión truncada de Fur de E. coli (Fur-(1-82)) (Pecqueur et al., 2006), Fur de Pseudomonas aeruginosa (Pohl et al., 2003), Vibrio cholerae (Sheikh & Taylor, 2009) y Helicobacter pylori (Dian et al., 2011), Nur de Streptomyces coleicolor (An et al., 2009), FurB/Zur de Mycobacterium tuberculosis (Lucarelli et al., 2007) o PerR de B. subtilis (Jacquamet et al., 2009), presentan características estructurales similares. Estas proteínas, de unos 150 aminoácidos y pesos moleculares que varían entre 15 y 17 kDa, muestran un plegamiento básico con dos dominios bien definidos: un dominio amino terminal de reconocimiento y unión al DNA ( 80 aa) y un dominio carboxilo terminal de dimerización ( 70 aa), conectados ambos por una “bisagra”. Además, en la secuencia de aminoácidos destaca un motivo rico en histidinas HHXHX2CX2C altamente conservado, y otro motivo CX2C menos conservado en el extremo carboxilo de la proteína, que son potenciales sitios de unión a metal. En Fur de P. aeruginosa, primera estructura cristalina obtenida para un homólogo de Fur, el dominio de unión a DNA está compuesto por cuatro hélices seguidas de una lámina  antiparalela de dos hebras, formando un motivo alado hélice-giro-hélice. El dominio de dimerización consiste en un dominio  en el que tres hebras  antiparalelas cubren una larga hélice Esta estructura presenta dos sitios de unión a metal: el sitio 1 en el domino de dimerización, responsable de la actividad de unión al DNA, donde el metal unido se conoce como metal regulador, y el sitio 2 localizado en la “bisagra” , donde se une el metal estructural que es necesario para el correcto plegamiento de la proteína. En esta estructura, ambos sitios están ocupados por un átomo de Zn(II), aunque el sitio 1 también puede estar coordinado a un átomo de Fe(II) (Figura 1.2) (Pohl et al., 2003). Figura 1.2. Representación de la estructura cristalina del dímero Fur de P. aeruginosa (resolución 1.8 Å). El dominio amino terminal de unión al DNA se presenta en azul, mientras que el domino carboxilo terminal de dimerización se representa en verde. Los átomos de Zn(II) presentes en la estructura se representan como esferas rojas. A. Vista perpendicular del eje binario cristalográfico. B. Vista sobre el eje binario. (Adaptado de (Pohl et al., 2003)). “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Introducción 12 Un modelo revisado basado en estudios de mutagénesis de varias proteínas Fur sugiere que realmente el sitio 2 descrito para Fur de P. aeruginosa, que es el localizado en la interfase entre ambos dominios, corresponde al metal regulador, donde se une un átomo de Fe(II). Su geometría suele conservarse en los distintos homólogos. Sin embargo, el sitio 1 podría ser un sitio de unión a metal de baja afinidad sin significado biológico (Lee & Helmann, 2007). Se ha observado que existe variación entre los distintos homólogos sobre el metal que presentan y su coordinación con la proteína, participando residuos de His, Cys, Asp o Glu. En homólogos de la proteína como FurB/Zur de M. tuberculosis (Lucarelli et al., 2007) y Fur de H. pylori (Dian et al., 2011) se han descrito tres sitios de unión a Zn(II). En estas estructuras, así como en la de PerR de B. subtilis (Jacquamet et al., 2009), el sitio de unión al metal estructural, localizado en el dominio de dimerización, presenta una geometría tetraédrica donde se encuentra coordinado a cuatro Cys implicadas en los dos motivos CXXC, no presentes en Fur de P. aeruginosa (Vitale et al., 2009). Este sitio se designa como S1 en Fur de H. pylori y es esencial para su dimerización. Un segundo sitio conocido como S2 corresponde al sitio de unión al metal regulador, homólogo al sitio 2 de P. aeruginosa, y es esencial para la actividad de unión al DNA de la proteína. El tercer sitio, S3, se localiza en el dominio de dimerización, y en un principio no es esencial para la unión al DNA pero sí parece tener relación con la fuerza con la que Fur se une al DNA. Este sitio presenta homología con el sitio 1 descrito en P. aeruginosa (Figura 1.3). Figura 1.3. Representación de la estructura cristalina del dímero Fur de H. pylori (resolución 1.9 Å). A. Dos vistas de la estructura dimérica de Fur, donde un monómero se representa en gris, y el otro monómero presenta el dominio de unión a DNA en verde, el dominio de dimerización en violeta, la bisagra que conecta ambos dominios en beige, y los átomos de Zn(II) se representan como esferas en azul (S1, sitio estructural), rojo (S2, sitio regulador) y amarillo (S3). B. Geometría de los tres sitios de unión a metal. (Adapatado de (Dian et al., 2011)). “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Introducción 13 b. Modo de acción de Fur Generalmente, Fur regula los niveles intracelulares de hierro de forma que cuando éste es suficiente, un átomo de Fe(II) se coordina con un monómero de Fur y la proteína dimeriza. En estas condiciones, Fur se une al DNA en los promotores de los genes que regula impidiendo la unión de la RNA polimerasa, y por consiguiente, la transcripción del gen. A pesar de actuar como represor de manera clásica, también se ha descrito que puede ejercer su función como activador de la transcripción. Además, puede unirse al DNA es su forma apo, tal y como se ha descrito para un número relativamente pequeño de bacterias, como H. pylori (Carpenter et al., 2009b) (Figura 1.4). Se ha establecido una secuencia consenso de DNA a la que se une la proteína, conocida como “caja Fur”. Inicialmente se trató de una secuencia palindrómica de 19 pb rica en A y T, formada por dos motivos orientados de forma inversa, en la que Fur se une como un único dímero (Griggs & Konisky, 1989). Pero un modelo revisado propuesto por Baichoo y col. establece que la unión de Fur al DNA se apoya en dos motivos 7-1-7 solapantes para la proteína, donde dos dímeros de Fur se unen a dos motivos 7-1-7 en lados opuestos de la doble hélice de DNA (Figura 1.5) (Baichoo & Helmann, 2002). Figura 1.5. Representación esquemática de las secuencias consenso propuestas como “caja Fur”. A. Secuencia de 19 pb propuesta inicialmente, donde Fur se une como un único dímero. B. La clásica “caja Fur” de 19 pb reconocida por dos dímeros de Fur interactuando cada uno con dos motivos 7-1-7 solapantes a lados opuestos de la doble hélice de DNA. C. Modelo de interacción de Fur de P. aeruginosa con el DNA basado en la caja Fur compuesta por dos motivos 7-17 solapantes. (Adaptado de (Baichoo & Helmann, 2002) y (Lee & Helmann, 2007)). Figura 1.4. Mecanismo general de represión propuesto para Fur. Cuando los niveles de Fe(II) aumentan en la célula bacteriana , el Fe(II) actúa como cofactor y se coordina a un monómero de Fur, que dimeriza. El dímero Fe-Fur reprime la transcripción al unirse al promotor del gen que regula, impidiendo la unión de la RNA polimerasa. (Adaptado de (Carpenter et al., 2009b)). “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Introducción 14 c. Genes regulados por Fur en patógenos Debido a la necesidad de hierro que presentan la mayoría de microorganismos, Fur desempeña un importante papel en los sistemas de captación y almacenamiento de hierro en patógenos, siendo por tanto esencial para la supervivencia del patógeno. Por ejemplo, en P. aeruginosa, Fur regula la producción del sideróforo pioverdina, que es una proteína de unión a hierro que la bacteria secreta para captarlo del ambiente (Prince et al., 1993). En Haemophilus ducreyi, la regulación de hgbA, gen que codifica una proteína de unión a hemoglobina, también está mediada por Fur, de forma que la bacteria es capaz de captar hierro del grupo hemo (Carson et al., 1996). En cuanto a los sistemas de almacenamiento de hierro, en Listeria monocytogenes y H. pylori, Fur regula los genes fri y pfr respectivamente. Ambos genes codifican una molécula procariótica tipo ferritina (Fiorini et al., 2008) y (Delany et al., 2001). Además, Fur no sólo está relacionada con el metabolismo del hierro, sino que también juega un papel importante en la expresión de factores de virulencia en diversos patógenos. Por ejemplo, en V. cholerae, Fur regula de manera negativa la producción de hemolisina y la expresión de irgA, un determinante de virulencia de la membrana externa, mientras en Neisseria gonorrhoeae, Fur interacciona con los promotores de los genes que codifican las proteínas de la membrana externa que le ayudan a adherirse y a invadir a la célula hospedadora (Carpenter et al., 2009b). A la vez, Fur interviene en la defensa contra el estrés oxidativo. Por ejemplo en M. tuberculosis, Fur regula la síntesis de catalasa, un enzima que ayuda a combatir los productos tóxicos derivados del oxígeno (Pym et al., 2001). Del mismo modo, en L. monocytogenes Fur regula la síntesis de Dps, proteína que protege a la bacteria contra las especies reactivas de oxígeno y es esencial para la virulencia de este patógeno y necesaria para el crecimiento bacteriano en los primeros estadíos de infección (Fiorini et al., 2008). En H. pylori, Fur regula en su forma apo, el gen sodB, que codifica una superóxido dismutasa (Carpenter et al., 2009a). Otro aspecto importante a destacar en el papel que desempeña Fur en patógenos, es su relación con la colonización. Se ha demostrado que mutantes de fur de diversos patógenos muestran una reducida capacidad de colonizar modelos animales de infección. Por ejemplo, un mutante deficiente en fur de H. pylori mostró un defecto en la colonización del estómago en un modelo murino, a pesar de no ser un gen esencial para dicho patógeno (Bury-Mone et al., 2004). Por otro lado, un mutante de fur de L. monocytogenes, presentó una significativa reducción en la virulencia de dicho patógeno (Rea et al., 2004). Lo que no está claro es si el defecto en la virulencia de dichos mutantes se debe a una desregulación de los sistemas de captación de hierro, por ser un micronutriente esencial, o si se debe directamente a la regulación que ejerce Fur sobre genes implicados en su virulencia. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Introducción 15 d. ¿Cómo se regula Fur? La proteína Fur está regulada a distintos niveles del flujo de información genética: Nivel transcripcional. Se ha demostrado que Fur se une a su propio promotor en respuesta a hierro (Delany et al., 2002). Nivel post-transcripcional. En la actualidad se acepta que la regulación positiva de Fur suele ser indirecta y se produce mediante la represión dependiente de Fur de un pequeño RNA antisentido regulador (small RNA). Este sRNA actúa a nivel post-transcripcional para reprimir la traducción de los genes diana ((Masse & Gottesman, 2002)). RhyB en E. coli es el sRNA regulado por Fur mejor caracterizado. Es un sRNA de 90 nucleótidos reprimido por Fur de manera dependiente de hierro (Masse et al., 2005). Cuando hay limitación de hierro, la expresión de RhyB deja de estar reprimida provocando una disminución de la expresión de los genes diana, que codifican para proteínas que utilizan y almacenan hierro. Como consecuencia, E. coli usa de forma más eficiente el hierro disponible para sus funciones esenciales (respuesta a la escasez de hierro) (Figura 1.6). Figura 1.6. Actuación de Fur y RhyB en la regulación génica dependiente de hierro. Cuando el hierro es bajo, aumenta la expresión de RhyB (sRNA). Como consecuencia se reprime la traducción de proteínas de almacenamiento de hierro y enzimas unidas a hierro no esenciales. Así se puede hacer un uso más eficiente del hierro disponible. (Adaptado de (Lee & Helmann, 2007)). Nivel post-traduccional. Estudios llevados a cabo en nuestro laboratorio indican que moléculas pequeñas son capaces de modular la actividad de Fur. En particular, se ha demostrado que FurA de Anabaena sp. PCC 7120 une hemo (Figura 1.7 A), en el rango de concentración micromolar, y que la presencia de este compuesto inhibe la unión de la proteína a promotores diana en función de la concentración del mismo (Hernandez et al., 2004). Además, nuestros datos indican que la cisteína 141, perteneciente a un motivo cisteína-prolina (CP) que forma parte de un motivo regulador de hemo (HRM, Heme Regulatory Motif), es uno de los ligandos axiales del Fe(III) en la molécula de hemo (Pellicer et al., 2012). “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Introducción 16 IV. FERROCENOS Los reguladores transcripcionales, como es el caso de Fur, tienen separados un dominio de unión al DNA y un dominio de activación transcripcional. En principio, pequeñas moléculas, ya sean metabolitos naturales como el hemo, mencionado anteriormente, o diseñadas de forma sintética podrían unirse a cualquiera de los dos dominios, controlando de manera selectiva la transcripción de genes y pudiendo tener un efecto biológico o terapéutico. Un tipo de moléculas orgánicas que han llamado la atención de los investigadores son los derivados de ferroceno. Spencer y col. han sintetizado un derivado del compuesto antitumoral SAHA con un grupo ferroceno es su estructura. SAHA actúa como inhibidor de histonas deacetilasas (HDACS), y el derivado de ferroceno fue capaz de interaccionar con las HDACS mostrando un potencial efecto antitumoral (Spencer et al., 2011). El ferroceno es un compuesto organometálico tipo sándwich cuya fórmula es (C5H5)2Fe. Su estructura se basa en una disposición centrada del metal entre dos aniones ciclopentadienilos enfrentados entre sí, los cuales dan gran estabilidad al compuesto (Figura 1.7 B). Fue sintetizado por Pauson y Kealy en 1951 (Chavain & Biot, 2010) y desde entonces ha despertado gran interés en la química organometálica, ya que numerosos análogos si rven como “andamiaje molecular”, cromóforo, marcador biológico, sitio redox activo, sitio catalítico, etc. La sustitución de grupos aromáticos por unidades de ferroceno, suele proporcionar al producto resultante una marcada actividad biológica carente en la molécula de partida (Damljanovic et al., 2009). Cabe destacar que ciertas moléculas químicas sintéticas que contienen un grupo ferroceno en su estructura presentan actividad antimicrobiana contra M. tuberculosis (Maguene et al., 2011) y (Mahajan et al., 2011), así como frente a diversos tipos de microorganismos (Damljanovic et al., 2009). Figura 1.7. A. Estructura química del grupo hemo. B. Grupo ferroceno. B. OBJETIVOS “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Objetivos 17 OBJETIVO GENERAL Selección de moduladores de la actividad de Fur de entre un conjunto de compuestos derivados de ferroceno y estudio de su actividad antimicrobiana. OBJETIVOS PARCIALES Clonar, sobreexpresar y purificar Fur de Listeria monocytogenes EGD-e y Helicobacter pylori 26695 como modelo de patógenos Gram-positivo y Gram-negativo, respectivamente. Realizar ensayos de caracterización bioquímica para evaluar su actividad biológica. Identificar moduladores de la actividad de ambas proteínas in vitro de entre un conjunto de compuestos derivados de ferroceno. Evaluar, in vivo, la acción antimicrobiana de los candidatos seleccionados. C. MATERIALES Y MÉTODOS “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Materiales y métodos 18 I. MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO En este trabajo se han empleado los microorganismos que se recogen en la tabla I en la que se especifica la casa comercial y el uso que se les ha dado. Tabla I. Microorganismos empleados. CEPA CASA COMERCIAL EMPLEO Escherichia coli TG1 STRATAGENE Test de susceptibilidad antimicrobiana Staphylococcus aureus ATCC 29213 ATCC Test de susceptibilidad antimicrobiana Escherichia coli DH5 INVITROGEN Mantenimiento de plásmidos Escherichia coli BL21 (DE3) NOVAGEN Sobreexpresión de proteínas Para el estudio de la sensibilidad antimicrobiana a un conjunto de compuestos derivados de ferroceno, se escogió E. coli TG1 como bacteria Gram-negativa y S. aureus ATCC29213 como bacteria Grampositiva. Los cultivos en medio sólido se llevaron a cabo en Mueller-Hinton agar (MH) (Panreac) esterilizado, preparado según las especificaciones del fabricante. Las placas Petri de 90 mm de diámetro con una profundidad de 4 mm de medio sólido, se incubaron en estufa a 37 °C durante 14-18 h. Para el resto de los experimentos llevados a cabo, los cultivos líquidos se realizaron en agitación a 37 °C en medio de cultivo Luria-Bertani (LB) esterilizado, cuya composición era 10 g/l NaCl, 10 g/l triptona y 5 g/l extracto de levadura. Esta solución se suplementó con agar al 1,5% para el medio LB sólido. La selección bacteriana, tanto en medio de cultivo LB sólido o líquido se realizó añadiendo el antibiótico kanamicina a una concentración final de 50 g/ml (LBK). “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Materiales y métodos 25 Tabla IV. Composición del gel SDS-PAGE al 15%. REACTIVO GEL SEPARADOR 15% GEL CONCENTRADOR 5% H2O 0.71 ml 1.4 ml Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 2.24 ml --- Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 --- 0.25 ml Acrilamida : Bisacrilamida 30% 3 ml 0.33 ml SDS 10% 30 l 10 l PSA 10% 20 l 10 l TEMED 10 l 10 l Para visualizar las proteínas, se tiñó el gel de poliacrilamida durante 20 min con una disolución colorante compuesta por 10% ácido acético, 45% metanol, 45% agua y 0.25% (p/v) Coomasie Blue R- 250. El colorante azul de Coomasie presenta una sensibilidad de 0.2-0.5 g de proteína y se une de forma no covalente a residuos básicos y aromáticos de la proteína. Para eliminar el exceso de colorante al gel, se realizaron varios lavados con una disolución decolorante cuya composición es 10% ácido acético, 25% metanol y 65% agua. f. Concentración y diálisis de las proteínas. Las fracciones de proteína más puras se concentraron utilizando tubos “Amicon® Ultra” (Millipore) con un tamaño de poro de 10K. Este s istema impide que moléculas con un peso molecular superior a 10 kDa atraviesen la membrana del dispositivo, de forma que se concentran sobre la misma. Previo a su utilización, se equilibró la membrana con tampón A, centrifugándolo a 4000 rpm durante 10 min y 4 °C. Posteriormente se cargó la proteína y se fue concentrando con ciclos de centrifugación a 4000 rpm y 4 °C, hasta que el volumen inicial se redujo hasta 2 ml aproximadamente. A continuación las soluciones proteicas se dializaron para retirar el imidazol de la disolución y dejarlas en las condiciones deseadas. La membrana de diálisis se introdujo en un recipiente con un volumen al menos 100 veces mayor de tampón de diálisis (Tabla III). Se mantuvo al menos 3 h a 4 °C y en agitación, y tras ello se renovó el tampón. Después de 3 cambios, se cuantificaron y alicuotearon las dos proteínas y se conservaron a -20 °C hasta su utilización. g. Cuantificación de las proteínas por espectroscopía. Todos los espectros realizados en este trabajo se registraron a 25 °C usando el espectrofotómetro Cary 100 Bio. Para conocer la concentración de proteína obtenida tras la purificación se cuantificó por espectroscopía de absorción molecular en el UV, aplicando la ley de Beer-Lambert: Abs = - log (I/I0) =  l C. Así se relaciona la concentración de una sustancia, C (M), con su absorción, donde  es el coeficiente de extinción molar (M-1 · cm-1) y l representa el paso óptico (1 cm). Las proteínas presentan un máximo de absorción a 280 nm debido a la absorción de los residuos aromáticos, especialmente triptófanos. La concentración se calculó conociendo el  teórico de las proteínas recombinantes purificadas, obtenido mediante el servidor ExPASy (http://au.expasy.org). Los valores utilizados en este trabajo son 280 nm = 10220 M-1 cm-1 para LmFur y 280 nm = 11835 M-1 cm-1 para HpFur. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Materiales y métodos 26 IV. TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS FUR a. Estudio de la presencia de metal mediante electroforesis. Se aplicó la técnica SDS-PAGE para analizar el efecto de la presencia de Zn(II) en la movilidad electroforética de las proteínas. Para ello se utilizó un quelante específico de Zn(II), N,N,N′,N′-Tetrakis(2- pyridylmethyl)ethylenediamine, TPEN (SIGMA) (Figura 3.4). En un volumen final de reacción de 15 l, se trató una muestra 50 M de LmFur o 30 M HpFur con TPEN a una concentración final 5 mM, durante 20 min a temperatura ambiente. La finalidad era quitar todo el Zn(II) presente en la proteína. A continuación, estas alícuotas se incubaron durante 20 min con ZnCl2 1 mM, para conseguir revertir dicho efecto. Tras desnaturalizar las proteínas mediante hervido durante 5 min en tampón de carga, las muestras se analizaron por electroforesis al 15 % mediante el procedimiento habitual. Cuando fue necesario se usó el tampón de carga sin agentes reductores cuya composición era: 50 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol y 0.02% azul de bromofenol. b. Determinación del número de cisteínas libres. La determinación de los grupos tiol en estado reducido de una proteína, se puede realizar mediante el método espectrofotométrico desarrollado por (Ellman, 1959). El procedimiento está basado en la reacción que se produce entre los grupos tiol (-SH) presentes en las cisteínas reducidas, con el reactivo 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid), DTNB (SIGMA) (Figura 3.5). En la reacción se libera como subproducto NTB (5-tio-2-nitrobenzoato), cuya absorción a 412 nm se sigue con el tiempo por ser un producto coloreado. Dado que se conoce el coeficiente de extinción molar del compuesto generado ( 412 nm = 13600 M-1 cm-1), es posible establecer una relación molar entre el DTNB que ha reaccionado y la concentración de proteína empleada, ya que la estequiometría de la reacción es 1:1. Esta relación permite calcular el número promedio de tioles en estado reducido que presenta la proteína mediante la siguiente relación:  Abs 412 nm = n –SH · [Proteína] · 13600 Para el ensayo se incubaron, en un volumen final de 700 l, 10 l de LmFur o 50 L de HpFur en tampón fosfato de sodio 100 mM pH 7, con 7 l del reactivo DTNB recién preparado y en oscuridad a una concentración de 4 mg/ml en dicho tampón. El blanco se hizo antes de añadir la proteína, y tras su adición en la cubeta de muestra, se añadió el mismo volumen de tampón en la cubeta de referencia. La reacción se siguió por el incremento de absorbancia a 412 nm con el tiempo hasta alcanzar un máximo en la señal. c. Detección de la actividad disulfuro-reductasa. Para el estudio de la actividad disulfuro reductasa se llevó a cabo el experimento propuesto por (Holmgren, 1979). Cuando una proteína presenta dicha Figura 3.4. Fórmula química del quelante TPEN (SIGMA). Figura 3.5. Reacción producida durante el ensayo de Ellman. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Materiales y métodos 27 actividad es capaz de catalizar la reacción entre el DTT y la insulina. La insulina está formada por dos cadenas,  y , unidas por un puente disulfuro. Al reducirse, la cadena  libre precipita, y la reacción se puede seguir por espectrofotometría a 650 nm ya que la precipitación provoca un aumento de la turbidez (Figura 3.6). El ensayo se llevó a cabo en un volumen final de 700 l, donde la mezcla de reacción contenía 0.13 mM insulina (SIGMA), 0.33 mM ditiotreitol, DTT (SIGMA) y 10 M de la proteína de interés, todo en el tampón 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl y 2 mM EDTA. El blanco se hizo con el tampón, la insulina y la proteína, y a continuación, se añadió DTT a la cubeta de muestra y el mismo volumen de agua a la cubeta de referencia, comenzando la reacción. Se registró el cambio de absorbancia a 650 nm durante 80 min. Como controles positivos se utilizaron DsbA (10 M) y DsbC (5 M) de E. coli, y como control negativo, la reacción de la insulina con el DTT sin proteína que actúe como catalizador. En el cálculo de la actividad disulfuro reductasa, dada como DO 650 nm · 10-3/min2, se tomó la variación de absorbancia en un minuto, dividiendo este valor por el minuto en que comienza a precipitar la insulina (Martinez- Galisteo et al., 1993). d. Estudio de la interacción proteína-DNA: Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Para estudiar la actividad de las proteínas recombinantes se hicieron ensayos de retardo en gel (EMSA). Esta técnica permite detectar si una proteína se une a un determinado DNA ya que el complejo que se forma provoca una disminución en la movilidad electroforética del DNA con respecto al DNA libre. El ensayo se hace en presencia de un DNA competidor, para asegurar que la interacción es específica. Los fragmentos de DNA empleados en el ensayo se amplificaron por la técnica de la PCR (apartado C.II.a), con los oligonucleótidos descritos en la tabla II, y su cuantificación se hizo por espectroscopía de absorción UV (apartado C.II.b). Para LmFur se empleó como DNA específico el promotor del gen fhuC (pfhuC, 311 pb) y para HpFur, el promotor del gen feoB (pfeoB, 358 pb). En ambos casos se utilizó un fragmento de DNA inespecífico de Anabaena sp. PCC 7120 perteneciente al promotor del gen nifJ (pnifJ, 234 pb). Tabla V. Composición del gel para EMSA al 6% (2 geles). REACTIVO VOLUMEN H20 milliQ 4.86 ml Acrilamida : Bisacrilamida 30% 2.06 ml Tampón de electroforesis 5x LmFur: 20 mM Tris-acetato pH 8, 0.1 mM DTT HpFur: 25 mM Tris-HCl pH 8, 190 mM Glicina 1.86 ml Glicerol 50% 1.40 ml PSA 10% 50 l TEMED 30 l En el ensayo se utilizaron geles de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes al 6% cuya composición se detalla en la tabla V. En cada ocasión, se prepararon en el momento y se precorrieron a Figura 3.6. Reacción entre el ditiotreitol y la insulina. (Adaptado de (Holmgren, 1979)). “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Materiales y métodos 28 60 V y 4 °C durante 45 min para eliminar posibles trazas de poliacrilamida y PSA presentes en el pocillo que puedan desestabilizar el complejo proteína-DNA. Las mezclas de reacción se prepararon en un volumen final de 20 l. Las proteínas LmFur y HpFur se incubaron con 50-100 ng de DNA específico y 50-100 ng de DNA inespecífico, usando un tampón de unión específico para LmFur (20 mM Tris-Acetato pH 8, 1 mM MgCl2, 50 mM KCl, 5% glicerol, 0.05 mg/ml BSA) y para HpFur (20 mM Tris-HCl pH 8, 75 mM KCl, 1 mM DTT, 5% glicerol, 0.05 mg/ml BSA). Con el tampón de unión se busca simular las condiciones que se producen en el interior celular: pH fisiológico, fuerza iónica moderada y elevada concentración proteica. Se probaron distintas condiciones, por lo que cuando fue necesario, se añadió a la mezcla de reacción:  MnCl2 1 mM. El Mn(II) actúa como metal regulador estabilizando la unión proteína-DNA.  EDTA 1 mM, quelante de iones divalentes.  Grupo hemo preparado según el apartado C.IV.e, a distintas concentraciones (proteína/hemo 1:5, 1:8 y 1:14).  Conjunto de compuestos ensayados. Los compuestos derivados de ferroceno se disolvieron en DMSO al 2%, y se probaron distintas concentraciones (proteína/compuesto 1:1, 1:5, 1:10 y 1:20) (Figura 3.7). Las proteínas se añadieron siempre en último lugar, y la mezcla de reacción se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. Por último, se añadieron 3 l del tampón de carga compuesto por 20 mM Tris- HCl pH 8, 50 mM KCl, 50% glicerol, 0.0025% (p/v) azul de bromofenol. Tras aplicar las muestras, la electroforesis transcurrió durante 2h 30 min a 90 V y 4 °C en el tampón de electroforesis inidcado en la tabla V. A continuación se tiñeron los geles durante 30 min a temperatura ambiente con una disolución compuesta por el revelador de ácidos nucleicos Vistra GreenTM (Amersham Biosciences) a una concentración de 1 g/ml disuelto en el tampón de electroforesis. e. Estudio de la interacción con el grupo hemo. Se preparó una disolución de hemo, en el momento del ensayo, usando como reactivo hemina (SIGMA). Para ello se disolvió una pequeña cantidad del mismo en 2 ml de una disolución 0.1 N NaOH : Etanol en proporción 9:1 (v/v), preparada en recipientes de cristal y protegida de la luz en todo momento. Después de agitar vigorosamente para conseguir la máxima disolución del reactivo, se filtró con una membrana de 0.20 m para eliminar posibles trazas de producto sin disolver. La concentración de esta disolución de hemo se calculó por espectrofotometría diluyendo 50 l de la misma en 950 l de NaOH 0.1 N usando el coeficiente de extinción molar en medio básico del hemo (385 nm = 58.44 mM-1 cm-1). A partir de ésta se prepararon 50 ml de una disolución 2 M de hemo en 50 mM Tris-HCl pH 8. El ensayo se llevó a cabo partiendo de 800 l de la disolución 2 M de hemo, a la que se hicieron pequeñas adiciones de las soluciones proteicas LmFur y HpFur (de 2 a 40 l), permitiendo así la formación del complejo proteína-hemo. Después de añadir el mismo volumen de tampón a la cubeta de referencia, y de proteína a la cubeta de muestra, se registró el espectro diferencial entre 300 y 600 nm, de forma que el máximo de absorción se desplazó de 385 nm (grupo hemo libre) a 414 nm (grupo hemo interaccionando con la proteína objeto de estudio). Una vez formado el complejo proteína-hemo en condiciones de saturación, se redujo añadiendo ditionito sódico (SIGMA) 5 mM disuelto en agua, y el mismo volumen de agua a la cubeta de referencia, volviendo a registrar el espectro diferencial. Los datos experimentales fueron ajustados a una ecuación teórica de estequiometria 1:1 usando el programa KaleidaGraph 2.1 de Albebeck. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Materiales y métodos 29 V. ENSAYOS IN VIVO DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA a. Cálculo de las unidades formadoras de colonias (CFU/ml). A partir de un cultivo crecido durante 14-18 h, se hizo un inóculo al 1% en medio LB, y se incubó hasta alcanzar una D.O. a 600 nm de 0.6. A continuación, se hicieron diluciones seriadas del mismo, con PBS estéril. Por último, se sembraron 20 l de cada dilución en placas de LB, por triplicado, y se incubaron a 37 °C durante 16-24 horas. Para el cálculo de las CFU/ml se eligieron aquellas placas en las que había entre 10-20 colonias. b. Test de difusión en disco: Método Kirby-Bauer. El test de difusión en disco se realizó de acuerdo al protocolo CLIS (Clinical and Laboratory Standards Institute). El objetivo fue determinar la sensibilidad o resistencia de diversas cepas frente a varios compuestos derivados de ferroceno (Figura 3.7), estudiando así la posible actividad antimicrobiana de dichos compuestos. Estos compuestos han sido proporcionados por la Dra. Concepción López Martínez, del Dpto. de Química Inorgánica (Universidad de Barcelona) y el Dr. Asensio González del Dpto. de Química Orgánica (Institut de Biomedicina, Barcelona). Figura 3.7. Compuestos derivados de ferroceno empleados en este trabajo. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Materiales y métodos 30 Para ello, en placas de MH agar se sembraron en césped 200 l de cultivo en fase exponencial de E. coli TG1 a una concentración de 3 x 108 CFU/ml y de S. aureus ATCC 29213 a 2 x 108 CFU/ml. Sobre las placas se colocaron discos de papel de filtro (WhatmanTM) estériles de 6 mm de diámetro. Los discos se impregnaron con 20 l de disoluciones de distinta concentración de los compuestos disueltos en DMSO, consiguiendo una concentración final de 20, 50, 100, 200 y 250 g/disco. Como control positivo se utilizó el antibiótico ampicilina a una concentración de 10 g/disco, y como control negativo se utilizó DMSO, por ser el solvente que se empleó para disolver los distintos compuestos. Las placas se incubaron 18-24 h a 37 °C, tras lo cual se observó el halo producido por la difusión del compuesto que inhibía el crecimiento de la bacteria. c. Test de dilución en caldo: Determinación de la C.I.M. Para la determinación cuantitativa de la susceptibilidad a los compuestos ensayados, se calculó la concentración inhibitoria mínima (C.I.M.) mediante el test de dilución en caldo. El experimento se realizó únicamente para el compuesto derivado de ferroceno CLM-12 y con la cepa de S. aureus ATCC 29213. Para ello, se preparó una disolución stock del compuesto CLM-12 en DMSO a una concentración de 500 g/ml. A partir de esta disolución stock, se hicieron diluciones seriadas del compuesto en medio LB líquido de 125 g/ml hasta 0.9 g/ml del compuesto, en un volumen final de medio de 2 ml. Los medios se prepararon en tubos falcon de 15 ml y en condiciones de esterilidad. Como control de crecimiento de la cepa ensayada, se preparó un tubo que no contenía compuesto CLM-12. Además, se preparó otro tubo en el que no se inocularon bacterias, para comprobar la esterilidad tanto de la solución del compuesto, como del medio LB. Una vez preparados los tubos, se inocularon con 100 l de un cultivo de S. aureus ATCC 29213 de D.O. a 600 nm de 0.6. A continuación, los tubos se incubaron a 37 °C durante 18-24 h con agitación suave. Como control positivo se realizó el mismo experimento utilizando el antibiótico ampicilina. La solución stock de la que se partió para preparar las diluciones dobles seriadas fue de 1 mg/ml, y se probaron concentraciones de 50 g/ml a 0.78 g/ml de antibiótico. Se siguió el procedimiento descrito anteriormente. D. RESULTADOS “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 31 I. CLONAJE Uno de los objetivos de este trabajo fue crear los plásmidos de sobreexpresión pET-28a:fur Lm y pET- 28a:fur Hp, para obtener con una cola de histidinas en el amino terminal las proteínas recombinantes LmFur y HpFur respectivamente, y así purificarlas mediante una columna de afinidad a metal (IMAC). Tras realizar el clonaje mediante los pasos descritos en el apartado de MATERIALES Y MÉTODOS, se procedió a verificar que los plásmidos contenían el gen de interés. Esto se comprobó mediante una digestión enzimática doble del plásmido, usando las enzimas de restricción NdeI y HindIII empleadas en el clonaje, y mediante una PCR utilizando como molde el plásmido generado. En ambos plásmidos se demostró la presencia del gen de interés (Figura 4.1). Por último, se secuenciaron para comprobar que el gen clonado no presentaba ninguna mutación, dando como resultado la secuencia correcta correspondiente a cada gen fur. Figura 4.1. Verificación de la presencia del gen clonado fur en los plásmidos pET-28a:fur Lm y pET- 28a:fur Hp. A. Gel de agarosa al 1.5%, carril 1: marcadores de peso molecular, carril 2: control negativo de la PCR, carril 3: control positivo (PCR sobre DNA genómico, lmo1953), carril 4: producto de PCR utilizando el plásmido pET-28a:fur Lm como DNA molde. B. Gel de agarosa al 1.5%, carril 1: marcadores de peso molecular, carril 2: control positivo (PCR sobre DNA genómico, lmo1953), carril 3: plásmido pET- 28a:fur Lm digerido con las enzimas de restricción NdeI y HindIII durante 2 h a 37 °C. C. Gel de agarosa al 1.2%, carril 1: marcadores de peso molecular, carril 2: control negativo de la PCR, carril 3: producto de PCR utilizando el plásmido pET-28a:fur Hp como DNA molde. D. Gel de agarosa al 1.2%, carril 1: marcadores de peso molecular, carril 2: control positivo (PCR sobre DNA genómico, hp1027), carril 3: plásmido pET-28a:fur Hp digerido con las enzimas de restricción NdeI y HindIII durante 2 h a 37 °C. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 32 II. SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LOS HOMÓLOGOS DE FUR a. Sobreexpresión de las proteínas Para la sobreexpresión de LmFur y HpFur se siguieron los protocolos detallados en (Ledala et al., 2007) y (Delany et al., 2001), respectivamente. En ambos casos se adaptó la sobreexpresión de ambos homólogos de Fur, utilizando en este trabajo células de E. coli BL21(DE3) y los plásmidos pET-28a:fur Lm y pET-28a:fur Hp. Se introdujeron los vectores en células competentes de E. coli BL21 (DE3) mediante transformación por choque térmico. Los transformantes se crecieron hasta fase exponencial, momento en el que se indujeron con IPTG 1 mM durante 3 h a 37 °C. Tras ello se analizó la expresión proteica mediante SDSPAGE al 15%. Las muestras se sometieron a lisis celular mediante hervido en tampón de carga en presencia de SDS. Se tomó una alícuota de cada cultivo sin inducir con IPTG como control. Ambas proteínas mostraron un nivel de sobreexpresión similar (Figura 4.2). Una vez elegido el cultivo que mayor nivel de sobreexpresión de la proteína mostró, se procedió a su crecimiento a gran escala para la obtención de la biomasa. Para el caso de LmFur se empleó el cultivo analizado en el carril 7 y para HpFur, el cultivo analizado en el carril 5. Figura 4.2. Análisis de la sobreexpresión de las proteínas recombinantes mediante geles de SDS-PAGE al 15% (tampón de carga con agentes reductores). A. Proteína LmFur. Se cargaron lisados celulares de cuatro colonias distintas, resultantes de la transformación de E. coli BL21(DE3) con el plásmido pET- 28a:fur Lm. Carril 1: marcadores de peso molecular, carriles 2-5: cuatro colonias analizadas (control sin inducir), carriles 6-9: las mismas cuatro colonias inducidas con IPTG 1 mM 3 h a 37 °C. La banda gruesa que aparece en los carriles 6-9 corresponde a la proteína LmFur con cola de hisitidinas con un peso molecular de 19,3 kDa. B. Proteína HpFur. Se cargaron lisados celulares de cuatro colonias distintas, resultantes de la transformación de E. coli BL21(DE3) con el plásmido pET-28a:fur Hp. Carril 1: marcadores de peso molecular, carriles 2,4,6,8: cuatro colonias a analizar sin inducir, carriles 3,5,7,9: las mismas cuatro colonias inducidas con IPTG 1 mM 3 h a 37 °C. La banda gruesa que aparece en los carriles 3,5,7,9 corresponde a la proteína HpFur con cola de histidinas con un peso molecular de 19,8 kDa. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 33 b. Purificación de las proteínas La purificación de ambas proteínas se basó en los protocolos descritos en (Fiorini et al., 2008) y en (Delany et al., 2001) para LmFur y HpFur, respectivamente. En ambos casos se utilizó una cromatografía de afinidad a metales (IMAC) aprovechando la interacción entre el Ni(II), coordinado a la matriz, y la cola de histidinas de las proteínas recombinantes. En la purificación de las dos proteínas, se observó la presencia de una banda con color adherida a la matriz, una vez pasado el extracto crudo. Esta banda comenzó a desplazarse al eluir con gradiente de imidazol, indicando por tanto la presencia de la proteína (Figura 4.3). Las fracciones más ricas y puras de proteína presentaban un ligero color rojo/violeta, pero éste se perdió quedando la solución de proteína resultante totalmente incolora. Figura 4.3. Purificación de LmFur. A. Columna cromatográfica IMAC con Ni(II). B. Columna tras haber cargado el extracto crudo, donde se observa la presencia de una banda con color en la parte superior, indicada con una flecha. C. Columna en el momento de la elución con gradiente de imidazol, donde se observa el desplazamiento de la banda coloreada. Lo mismo ocurrió con HpFur. Las fracciones eluidas de la columna se sometieron a SDS-PAGE al 15% para comprobar en cuales de ellas se encontraba la proteína así como su pureza (Figura 4.4). Figura 4.4. SDS-PAGE al 15% del proceso total de purificación (tampón de carga con agentes reductores). A. Proteína LmFur. Carril 1: marcadores de peso molecular, carril 2: lisado celular tras el proceso de sonicación, carril 3: extracto crudo, carril 4: material no fijado tras cargar el extracto crudo, carril 5-6: lavados, carril 7: fracción al comienzo de la elución con gradiente de imidazol, carril 8: fracción a mitad del gradiente de imidazol, carril 9: proteína LmFur tras la purificación. B. Proteína HpFur. Carril 1: marcadores de peso molecular, carril 2: lisado de células sin inducir, carril 3: lisado de celulas tras inducir con IPTG 1 mM, carril 4: material no fijado tras cargar el extracto crudo, carril 5: lavado, carril 6- 8: fracciones alternas de la elución con gradiente de imidazol, carril 9: proteína HpFur obtenida tras la purificación. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 40 Figura 4.11. EMSA en gel de poliacrilamida al 6% para comprobar el efecto del Mn(II) en la actividad de las proteínas. A. Se incubaron distintas concentraciones de LmFur en el tampón de unión correspondiente con 100 ng de DNA pfhuC y 100 ng de DNA inespecífico (pnifJ), y con 1 mM MnCl2. Carril 1: control negativo sin proteína, carril 2: 250 nM de LmFur, carril 3: 500 nM de LmFur, carril 4: 700 nM de LmFur. B. Se incubaron distintas concentraciones de HpFur en el tampón de unión correspondiente con 80 ng de DNA pfeoB y 80 ng de DNA inespecífico (pnifJ), y 1 mM MnCl2. Carril 1: control negativo sin proteína, carril 2: 200 nM de HpFur, carril 3: 400 nM de HpFur, carril 4: 500 nM de HpFur. Tal como se muestra en la figura 4.10 ambas proteínas mostraron actividad de unión al DNA. La titulación para LmFur mostró que a una concentración de proteína 700 nM se consigue acomplejar todo el DNA (Figura 4.10 A. carril 8). En cambio para HpFur, esto sucedió con una concentración 600 nM de proteína (Figura 4.10 B. carril 7). En la figura 4.11 se muestra como la adición de Mn(II) a la mezcla de reacción, mejoró en ambos casos la interacción proteína-DNA. Para LmFur, las mejores condiciones para la interacción proteína-DNA son 500 nM de LmFur y 1 mM de MnCl2 (Figura 4.11 A. carril 3). Para HpFur las mejores condiciones de unión se consiguen también con 500 nM de HpFur y 1 mM de MnCl2 (Figura 4.11 B. carril 4). b. Efecto de la presencia del quelante EDTA en la interacción proteína- DNA Tal y como se hace referencia en (Lee & Helmann, 2007), las proteínas LmFur y HpFur necesitan el metal correpresor para su actividad in vivo. Pero para ambas se ha descrito que in vitro, son capaces de unirse a promotores específicos, aún sin haber metal en el medio (Ledala et al., 2007). Para eliminar posibles trazas de metal presentes en la mezcla de reacción, se añadió EDTA 1 mM, que es un quelante de metales divalentes. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 41 Figura 4.12. EMSA en gel de poliacrilamida al 6% para comprobar el efecto de la presencia del quelante EDTA en la actividad de las proteínas. A. Se incubó LmFur en el tampón de unión correspondiente que contenía 1 mM EDTA con 100 ng de DNA pfhuC y 100 ng de DNA inespecífico (pnifJ). Carril 1: control negativo sin proteína, carriles 2-8: cantidades crecientes de proteína LmFur (100, 200, 300, 400, 500, 600 y 700 nM) B. Se incubó HpFur en el tampón de unión correspondiente que contenía 1 mM EDTA con 80 ng de DNA pfeoB y 80 ng de DNA inespecífico (pnifJ). Carril 1: control negativo sin proteína, carriles 2-8: cantidades crecientes de proteína HpFur (100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 y 1000 nM). Según se observa en la figura 4.12, el efecto del EDTA no inhibe por completo la actividad de las proteínas, observándose la formación del complejo proteína-DNA, a concentraciones superiores a 200 nM para LmFur (Figura 4.12 A. carril 3) y 100 nM para HpFur (Figura 4.12 B. carril 2). Estas proteínas necesitan la presencia del metal correpresor in vivo, pero no es estrictamente necesario para su actividad in vitro, aunque en presencia de él sí se mejora su actividad. VII. ANÁLISIS DE LA INTERACCIÓN DE LOS HOMÓLOGOS FUR CON EL GRUPO HEMO En nuestro grupo se ha demostrado que la proteína FurA de la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120 es capaz de unirse fuertemente al grupo hemo, lo cual afecta a su capacidad de interacción con el DNA (Hernandez et al., 2004). En este trabajo se ha analizado si las dos proteínas Fur de los patógenos L. monocytogenes y H. pylori son capaces de unirse al grupo hemo y cómo afecta a la actividad de la proteína la presencia de este compuesto. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 42 a. Detección de los complejos mediante espectroscopía diferencial El espectro del grupo hemo libre presenta un máximo de absorción a 385 nm. Cuando el grupo hemo se encuentra interaccionando con una proteína, su espectro cambia y el máximo de absorción se desplaza a 414 nm. De esta forma, se puede seguir por espectroscopía diferencial el cambio que se produce en el espectro de absorción en el UV-Visible del grupo hemo, al ir añadiendo cantidades crecientes de proteína a una solución de este compuesto. Para estudiar si las proteínas formaban un complejo con el grupo hemo, se realizó una titulación de proteína (de 2 a 40 l) sobre una disolución 2 M de hemo en Tris-HCl 50 mM pH 8. Al registrar los espectros diferenciales, se observó la aparición de un pico a 414 nm (máximo del grupo hemo interaccionando con una proteína), lo que fue indicativo de la formación del complejo proteína-hemo (Figura 4.13 A y B). La titulación se realizó hasta alcanzar la condición de saturación. Así se pudo estudiar la cantidad de grupo hemo capaz de interaccionar con las proteínas LmFur o HpFur, y por tanto la constante de disociación (Kd) del complejo formado Fur-hemo para ambas proteínas. Para ello, se dibujó la curva de saturación representando la variación de absorbancia producida como consecuencia de la formación de dicho complejo (Abs414 nm – Abs385 nm) frente a la concentración de proteína añadida. Los datos se ajustaron a una ecuación teórica utilizando el programa KaleidaGraph 2.1 de Albebeck, asumiendo una estequiometría 1:1 para ambas proteínas (Recuadro figura 4.13 A y B). La formación del complejo para ambas proteínas quedó demostrada, pero a pesar de realizar el experimento por triplicado, no se pudo obtener un valor numérico para la Kd fiable como consecuencia de la naturaleza de las proteínas. Aún así la constante de disociación mostró un valor en el rango de concentración M. La reducción con ditionito sódico 5 mM del complejo proteína-hemo provocó un cambio en el espectro. El máximo de absorción se desplazó de 414 nm (espectro del hemo interaccionando con la proteína) a 426 nm y aparecieron dos nuevas bandas,  (558 nm) y  (529 nm), características del complejo reducido. Esto indicó que realmente existe una interacción entre el grupo hemo y la proteína objeto de estudio, ya que el espectro del hemo cambia cuando cambia su entorno, como cuando se encuentra unido a una proteína (Figura 4.13 C y D). “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 43 Figura 4.13. Estudio por espectroscopía diferencial de la unión del grupo hemo a los homólogos de la proteína Fur. A. Espectro diferencial de la formación del complejo LmFur-hemo por adición de cantidades crecientes de LmFur a una disolución de hemo 2 M en Tris-HCl 50 mM pH 8. Recuadro: Curva de saturación del grupo hemo con LmFur, que corresponde a un complejo de estequiometría 1:1. B. Espectro diferencial de la formación del complejo HpFur-hemo por adición de cantidades crecientes de HpFur a una disolución de hemo 2 M en Tris-HCl 50 mM pH 8. Recuadro: Curva de saturación del grupo hemo con HpFur, que corresponde a un complejo de estequiometría 1:1. C. Reducción del complejo LmFur-hemo. Línea azul: espectro diferencial del complejo LmFur-hemo en condiciones de saturación, línea roja: espectro diferencial tras reducir el complejo al añadir ditionito sódico 5 mM. D. Reducción del complejo HpFur-hemo. Línea azul: espectro diferencial del complejo HpFur-hemo en condiciones de saturación, línea roja: espectro diferencial tras reducir el complejo al añadir ditionito sódico 5 mM. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 44 b. Estudio del efecto de la presencia de hemo en la actividad de las proteínas En base al complejo que se forma entre las proteínas objeto de estudio y el grupo hemo, se quiso estudiar el efecto de esta unión en la actividad de la proteína in vitro. Para ello se realizó un ensayo de retardo en gel (EMSA) en el que se incubaron las proteínas LmFur o HpFur con cantidades crecientes de hemo. El estudio se realizó en las mejores condiciones para la actividad de ambas proteínas, siendo 500 nM de proteína y 1 mM MnCl2. Figura 4.14. Estudio mediante EMSA del efecto del grupo hemo en la actividad de los homólogos de Fur in vitro. A. EMSA en gel de poliacrilamida al 6% para LmFur. Se incubaron 500 nM de LmFur con 100 ng de DNA pfhuC y 100 ng de DNA inespecífico (pnifJ) en el tampón de unión correspondiente en presencia de 1 mM MnCl2. B. EMSA en gel de poliacrilamida al 6% para HpFur. Se incubaron 500 nM de HpFur con 100 ng de DNA pfeoB y 100 ng de DNA inespecífico (pnifJ) en el tampón de unión correspondiente en presencia de MnCl2 1 mM. En ambos casos: carril 1: DNA sin proteína (control negativo), carril 2: mezcla de reacción sin hemo (control positivo), carril 3-5: mezcla de reacción incubada con cantidades crecientes de hemo (a una relación proteína:hemo de 1:5, 1:8 y 1:14, respectivamente). En la figura 4.14 se observa que el grupo hemo no interfiere en la unión, y la proteína mantiene su actividad iincluso con una concentración 14 veces mayor de este compuesto. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 45 VIII. EFECTO DE COMPUESTOS DERIVADOS DE FERROCENO SOBRE LA INTERACCIÓN PROTEÍNA-DNA IN VITRO Tal como se describe en (Spencer et al., 2011), compuestos derivados de ferroceno tienen la capacidad de interaccionar con una proteína de unión al DNA. Por este motivo, y una vez fijadas las condiciones óptimas para la interacción proteína-DNA, se estudió el efecto de un conjunto de compuestos derivados de ferroceno (Figura 3.7) sobre la actividad in vitro de las proteínas recombinantes obtenidas. Como se muestra en la figura 4.15 A, el compuesto CLM-12 impide la unión de la proteína LmFur al DNA. Esto se observa a partir de una concentración equimolar de compuesto y proteína (carril 4). Fue necesario poner a punto el ensayo, puesto que la concentración de DMSO en la que estaban disueltos los compuestos (al 100%) afectaba a la estabilidad de la proteína. Para ello se redujo el DMSO hasta un 2% observando que a esta concentración la interacción proteína-DNA no se veía afectada (carril 3). El mismo efecto se obtuvo para el compuesto CLM-9. En la figura 4.15 B, se muestra cómo el resto de compuestos ensayados (CLM-3, CLM-4, CLM-10 Y CLM-11), no impedían la formación del complejo aún con una concentración proteína/compuesto 20 veces mayor. En la figura 4.16 B se muestra también como los compuestos CLM-12 y CLM-9 impiden la unión del DNA a la proteína HpFur (Figura 4.16 B), mientras el resto, no afectan a la formación del complejo (Figura 4.16 A). Figura 4.15. EMSA en gel de poliacrilamida al 6% para comprobar el efecto del conjunto de compuestos derivados del ferroceno sobre la unión de la proteína LmFur al DNA. Se incubó 500 nM de LmFur con MnCl2 1 mM en el tampón de unión correspondiente con 100 ng de DNA pfhuC y 100 ng de DNA inespecífico (pnifJ). A. Titulación del compuesto CLM-12. Carril 1: control negativo sin proteína, carril 2: control positivo (mejores condiciones de unión para la proteína), carril 3: mezcla de reacción incubada con DMSO al 2%, carril 4-7: mezcla de reacción incubada con cantidades crecientes del compuesto CLM-12 disuelto en DMSO al 2% (a una relación proteína:CLM-12 de 1:1, 1:5, 1:10 y 1:20, respectivamente). B. Tratamiento de la proteína LmFur con los compuestos CLM-3, CLM-4, CLM-10 Y CLM-11. Carril 1: control negativo sin proteína, carril 2: control positivo (mejores condiciones de unión para la proteína), carril 3: mezcla de reacción incubada con DMSO al 2%, carril 4-7: mezcla de reacción incubada con los compuestos CLM-3, CLM-4, CLM-10 Y CLM-11, respectivamente (a una concentración proteína/compuesto de 1:20). “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 46 Figura 4.16. EMSA en gel de poliacrilamida al 6% para comprobar el efecto del conjunto de compuestos derivados del ferroceno sobre la unión de la proteína HpFur al DNA. Se incubó 500 nM de HpFur con MnCl2 1 mM en el tampón de unión correspondiente con 100 ng de DNA pfeoB y 100 ng de DNA inespecífico (pnifJ), y con los compuestos ensayados a una concentración proteína/compuesto de 1:20. A. Carril 1: control negativo sin proteína, carril 2: control positivo (mejores condiciones de unión para la proteína), carril 3: mezcla de reacción incubada con DMSO al 2%, carril 4-7: mezcla de reacción incubada con los compuestos CLM-3, CLM-4, CLM-10, CLM-11. B. Carril 1-2: mezcla de reacción incubada con los compuestos CLM-9 y CLM-12, respectivamente. IX. EFECTO DE COMPUESTOS DERIVADOS DE FERROCENO IN VIVO En base al resultado obtenido en el ensayo de retardo en gel (EMSA) donde el compuesto CLM-9 y CLM- 12 impedían la unión entre el DNA y la proteína Fur, a continuación se estudió si ambos compuestos presentaban actividad antimicrobiana. Además, se analizó la posible actividad antimicrobiana de todo el conjunto de compuestos, a pesar de no impedir la formación del complejo proteína-DNA. Para los ensayos de susceptibilidad antimicrobiana, primero fue necesario calcular el número de unidades formadoras de colonias por ml (CFU/ml), para adecuar la concentración de células al ensayo. Según el estándar NCCLS (National Committe for Clinical Laboratory Standars), dichos ensayos requieren una concentración de células que corresponde al estándar 0.5 McFarland, lo que equivale a una suspensión bacteriana que contiene entre 1 · 108 y 3 · 108 CFU/ml de E. coli. El cálculo de las CFU/ml dio como resultado un valor para E. coli TG1 de 3 · 108 CFU/ml, y para S. aureus ATCC 29213 de 2 · 108 CFU/ml (Figura 4.17). “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 47 Figura 4.17. Cálculo de las unidades formadoras de colonias (CFU/ml) de S. aureus ATCC 29213. Se hicieron diluciones seriadas de un cultivo de S. aureus ATCC 29213 de D.O. a 600 nm de 0.6, sembrándose 20 l de cada dilución en LB. Tras incubar las placas a 37 °C durante 14-18 h, se produjo el conteo de las colonias en aquellas diluciones donde aparecieron entre 10 y 20 unidades. Se repitió el mismo procedimiento para E. coli TG1. a. Test de difusión en disco Kirby-Bauer: Para estudiar la posible actividad antimicrobiana in vivo de los compuestos ensayados, se llevó a cabo el test de difusión en disco Kirby-Bauer, según el CLSI (Clinical Laboratory Institute Standards). La presencia o ausencia de crecimiento microbiano alrededor del disco impregnado con una solución del compuesto a ensayar, es una medida indirecta de la habilidad de dicho compuesto para inhibir al microorganismo. En el experimento, se estudió la susceptibilidad de S. aureus ATCC 29213 y E. coli TG1 a los derivados de ferroceno ensayados, usando como control positivo el antibiótico ampicilina. El solvente utilizado para disolver los compuestos fue DMSO, por lo que también se evaluó el efecto de éste sobre el crecimiento de las bacterias. Se probaron distintas concentraciones, utilizando como máxima la concentración de 250 g/disco, que era 25 veces mayor que la concentración del control positivo (ampicilina 10 g/disco). Según “Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests” del año 2006 del CLSI, una cepa de S. aureus es sensible a ampicilina cuando produce un halo de inhibición ≥ 20 mm, y para E. coli cuando el halo de inhibición es ≥ 17 mm. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 48 Figura 4.18. Ensayo de susceptibilidad antimicrobiana mediante el test de difusión en disco Kirby- Bauer. Se sembraron en césped en placas de MH, 200 l de un cultivo de E. coli TG1 de 3 · 108 CFU/ml o S. aureus ATCC 29213 de 2 · 108 CFU/ml. Tras dejar secar los cultivos, se colocaron discos estériles de papel WhatmanTM impregnados con disoluciones estériles de los compuestos a ensayar, y las placas se incubaron a 37 °C durante 14-18 h. A. Placa de E. coli TG1 con DMSO al 100% como control negativo (C-) y antibiótico ampicilina a una concentración de 10 g/disco como control positivo (C+). B y C. Placa de E. coli TG1 con 20, 50, 100, 200 y 250 g/disco del compuesto CLM-9 y CLM-12 respectivamente, disueltos en DMSO al 100%. D. Placa de S. aureus ATCC 29213 con los compuestos CLM-3, CLM-9, CLM-10 y CLM- 12 a una concentración de 250 g/disco, disueltos en DMSO al 100%, antibiótico ampicilina a una concentración de 10 g/disco (C+) y DMSO al 100% (C-). El ensayo realizado (Figura 4.18) mostró que los compuestos CLM-9 y CLM-12 presentaban una ligera actividad antimicrobiana, descartada por el efecto del DMSO, tal como y como se demostró con el control negativo. Se observó mayor efecto de inhibición del crecimiento con la mayor concentración probada (250 g/disco). Esto se observó tanto para E. coli TG1 como para S. aureus ATCC 29213. También cabe destacar que el compuesto CLM-3 mostró un ligero halo de inhibición en S. aureus ATCC 29213, y ninguno en E. coli TG1. El antibiótico ampicilina, utilizado como control positivo, produjo un halo de inhibición en ambas cepas de 25 mm de diámetro, demostrando la sensibilidad de las cepas al antibiótico. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Resultados 49 b. Determinación de la C.I.M. (Concentración Inhibitoria Mínima) Una vez realizado el test de difusión en disco, se determinó cuantitativamente la CIM del compuesto CLM-12 sobre S. aureus ATCC 29213, por ser uno de los compuestos que mejor resultado había dado en el test Kirby-Bauer. La CIM es la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de su incubación. Para ello, se inoculó S. aureus ATCC 29213 en diluciones dobles seriadas del compuesto objeto de estudio preparadas en medio LB. A continuación, se incubaron a 37 °C durante 18-24 h. Finalmente se observó si se produjo o no crecimiento del microorganismo por aumento de la turbidez del medio. Figura 4.19. Determinación de la CIM del compuesto CLM-12 sobre S. aureus ATCC 29213. Se inoculó 100 l de un cultivo de S. aureus ATCC 29213 de D.O. a 600 nm de 0.6, en 2 ml de medio LB con diluciones dobles seriadas del compuesto CLM-12 (125 a 0.9 g/ml). Los tubos se incubaron a 37 °C durante 18-24 h. El tubo “0” se empleó como control de crecimiento de la cepa, y el tubo “C2” se utilizó como control de esterilidad del medio LB con el compuesto a la mayor concentración empleada. A. Vista de los tubos antes de la incubación. B. Vista de los tubos tras la incubación. Tal como se muestra en la figura 4.19, se observó crecimiento a todas las concentraciones probadas (de 125 g/ml a 0.9 g/ml) del compuesto CLM-12, por lo que la CIM > 125 g/ml. No se probó una concentración mayor del compuesto ya que 125 g/ml se consideró una concentración suficientemente elevada según los estándares propuestos por el CLSI. “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Discusión 55 unión inhibe la capacidad de la proteína para interaccionar con el DNA (Hernandez et al., 2004). La caracterización del sitio de unión del grupo hemo en la proteína FurA sugiere que esta proteína pueda funcionar como un sensor de hemo en la célula (Pellicer et al., 2012). En este trabajo se ha analizado la capacidad de los homólogos LmFur y HpFur de interaccionar con el grupo hemo, siguiendo la metodología descrita por (Hernandez et al., 2004). Los resultados que se obtienen confirman la interacción específica de ambas proteínas recombinantes con la molécula de hemo, como sugiere la curva de saturación obtenida en la titulación para ambas proteínas. Aunque no se ha podido obtener un valor numérico fiable para la constante de disociación, los datos sugieren que la interacción es ligeramente más fuerte que en el caso del homólogo FurA de Anabaena sp. PCC 7120 (Kd = 0.4 M) (Hernandez et al., 2004). La presencia de hemo en solución no afecta a la capacidad de ambos homólogos de unirse al DNA. Este resultado es opuesto al observado para FurA de Anabaena sp. PCC 7120 (Hernandez et al., 2004). Se propone que posiblemente esta diferencia en el comportamiento se deba a que el sitio de unión a hemo se localiza en una posición distinta en el caso de FurA respecto a los homólogos purificados en este trabajo. Para FurA se ha determinado que la cisteína de un motivo CP presente en su secuencia, es uno de los ligandos axiales del Fe(III) del grupo hemo (Pellicer et al., 2012) y que las características físico-químicas de la unión de hemo a FurA son las típicas de un sensor de hemo (Shimizu, 2011). Los homólogos LmFur y HpFur carecen de este motivo, sin embargo, poseen varios residuos de histidina que posiblemente sean los implicados en la unión del grupo hemo, como se propuso para el homólogo Fur de E. coli (Smith et al., 1996). Es posible que las diferencias observadas estén relacionadas con la naturaleza de los microorganismos, puesto que Anabaena sp. PCC 7120 es una cianobacteria fotosintética diazotrófica, y tanto L. monocytogenes como H. pylori son organismos heterótrofos. V. EFECTO DE LOS COMPUESTOS DERIVADOS DE FERROCENO IN VITRO Como se ha mencionado en la introducción, la identificación de moduladores que afecten a la actividad de reguladores transcripcionales implicados, por ejemplo en la síntesis de factores de virulencia, se perfila como una estrategia en la búsqueda de nuevos antimicrobianos. Ciertos derivados de ferroceno poseen capacidad antimicrobiana, como lo demuestra el gran número de artículos recogidos en la bibliografía. Además, pueden interaccionar con proteínas de unión a DNA modulando su actividad (Spencer et al., 2011). A través de una colaboración entre la Dra. Mª Luisa Peleato, perteneciente al grupo donde se ha llevado a cabo este trabajo, y los Drs. Concepción López Martínez, del Dpto. de Química Inorgánica (Universidad de Barcelona) y Asensio González del Dpto. de Química Orgánica (Institut de Biomedicina, Barcelona), se disponía de una serie de compuestos derivados de ferroceno con un anillo de pirazol y diversos sustituyentes (Figura 3.7). Mediante ensayos de retardo de la movilidad electroforética (EMSA), se ha comprobado que dos de ellos inhiben la unión de ambas proteínas al DNA, por lo que se perfilan como “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Discusión 56 moduladores de su actividad. Es posible que estos derivados de ferroceno interaccionen con algún aminoácido esencial de la proteína implicado en la unión al DNA, o bien que impidan que la proteína adquiera la conformación activa, perdiendo por tanto su capacidad de represor transcripcional. Sin embargo, teniendo en cuenta que ambas proteínas tienen solo un 20% de homología de secuencia (Figura 4.7), es posible que el compuesto reconozca determinada conformación y no un aminoácido en particular. VI. EFECTO DE LOS COMPUESTOS DERIVADOS DE FERROCENO IN VIVO El hecho de que dos de los compuestos analizados afectaran a la actividad de los homólogos in vitro, llevó a probar su posible actividad antimicrobiana in vivo. En el estudio se analizaron todos los compuestos disponibles, y se comprobó que aunque ninguno de ellos impedía el crecimiento, como cabría esperar con un antibiótico convencional, los dos compuestos que afectaban a la actividad de Fur en ensayos de EMSA eran los que ligeramente inhibían el crecimiento bacteriano. Teniendo en cuenta que para considerar que un compuesto posee actividad antimicrobiana debe inhibir el crecimiento de la bacteria en el rango de concentración en que lo hacen los actuales antibióticos, y que ambos compuestos producían su efecto a una concentración 25 veces superior al control positivo, no parecen buenos candidatos. Ahora bien, su estructura y comportamiento químico indican que son moléculas hidrofóbicas, característica que puede dificultar su acceso al interior de la célula. Una posible actuación para potenciar su actividad antimicrobiana, sería introducir algún sustituyente polar, como es el caso de grupos amino en su estructura, puesto que derivados de ferroceno similares que poseen dichos grupos muestran una marcada actividad antimicrobiana (Damljanovic et al., 2009). En cualquier caso, un ensayo de susceptibilidad como el realizado en este trabajo, no permitiría vincular la acción antimicrobiana a Fur. F. CONCLUSIONES “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Conclusiones 57 Los resultados obtenidos a partir del trabajo expuesto en esta memoria demuestran que: Es posible sobreexpresar en E. coli las proteínas recombinantes LmFur y HpFur, y purificarlas mediante una cromatografía de afinidad a Ni (IMAC), consiguiendo un grado de pureza que permite su caracterización bioquímica. Las proteínas recombinantes obtenidas son activas en ensayos de unión al DNA in vitro. Aunque el Mn(II) no es necesario para su actividad, su presencia mejora la interacción. Ambos homólogos se obtienen como una mezcla heterogénea de proteína. Para LmFur se obtiene únicamente el monómero tanto en forma apocomo holoproteina (Zn-LmFur). Para HpFur se obtiene una mezcla de monómero junto con diversas especies oligoméricas. Las proteínas recombinantes LmFur y HpFur no posean actividad disulfuro reductasa in vitro. Las proteínas se unen a hemo en el rango de concentración M, y su interacción no impide la unión de la proteína al DNA. Del conjunto de derivados de ferroceno analizados en este estudio, dos de ellos, CLM-9 y CLM- 12, impiden la unión de ambas proteínas Fur al DNA presentando ambos una ligera actividad antimicrobiana. G. BIBLIOGRAFÍA “ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS” Bibliografía 58 Alanis, A. J. (2005). Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Arch Med Res 36, 697- 705. An, Y. J., Ahn, B. E., Han, A. R., Kim, H. 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