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Trabajo Fin de Máster Relaciones entre el clima, la vegetación y la prevalencia de Borrelia burgdorferi s.l. en garrapatas en Europa: apuntes para la aproximación a un modelo de riesgo Tamara Latapia Buisán Director: Agustín Estrada Peña Facultad de Veterinaria 2012 P á g i n a | 2 ÍNDICE I. Introducción……………………………………………………….4 II. Revisión Bibliográfica ……………………………………………7 II. 1.- Historia de la enfermedad de Lyme………………….....8 II. 2.- Agente causal de la enfermedad de Lyme…………….11 II.2.1.- Especies y genospecies II.2.2.- Epidemiología II.2.3.- Hospedadores II. 3.- Vector…………………………………………………......14 II.3.1.- Ciclo vital II. 4.- Diagnóstico de B. burgdorferi s.l en Ixodes ricinus.......18 II.4.1.- Aislamiento de Borrelia en Ixodes ricinus II.4.2.- Identificación de genospecies de Borrelia mediante PCR y RFLP II. 5.- Diagnóstico de B. burgdorferi en humanos……………19 II.5.1- Diagnóstico directo II.5.1.1.- Cultivo II.5.1.2.- Visualización II.5.2.- Diagnóstico indirecto II.5.2.1.- Métodos de diagnóstico II.5.3.- Técnicas de amplificación genética II. 6.- Situación actual de la Borreliosis de Lyme…………….21 III.- Objetivos………………………………………………………..24 IV.- Material y métodos……………………………………………26 IV. 1.- Colección de datos……………………………………...27 IV. 1.2.- Método de detección de B. burgdorferi P á g i n a | 3 IV. 2.- Establecimiento de la relación entre factores abióticos y prevalencia de infección en garrapatas……...30 IV. 2.1.- Clasificación de los niveles de prevalencia IV. 2.2.- Obtención de los factores abióticos IV. 2.3.- Análisis estadístico IV. 2.3.1.- Análisis de riesgo V.- Resultados y discusión………………………………………35 V.1.- Distribución de los valores de cada variable abiótica en función de los niveles de prevalencia de Borrelia spp. en garrapatas……………………………..36 V.2.- Asociación entre la distribución de los valores de las variables abióticas estudiadas y la prevalencia de Borrelia spp. en garrapatas ………………44 V.3.- Diseño del análisis de riesgo cualitativo de infección por Borrelia spp. en garrapatas en función de los valores de las variables abióticas estudiadas ………………………………………...46 VI.- Resumen……………………………………………………….52 VII.- Conclusiones……………………………………………….....54 VIII.- Referencias bibliográficas ………………………………….56 P á g i n a | 4 I.- INTRODUCCIÓN P á g i n a | 5 I.- INTRODUCCIÓN La enfermedad de Lyme (LB), también conocida como borreliosis de Lyme (BL), es una zoonósis infecciosa causada por la bacteria Borrelia burgdorferi y transmitida por garrapatas del genero Ixodes. La bacteria se mantiene en un ciclo de transmisión horizontal entre su vector, las garrapatas del complejo Ixodes ricinus y los vertebrados (9). La enfermedad de Lyme se distribuye en una amplia área geográfica en regiones templadas del hemisferio norte del mundo (3). El estudio de la distribución y características de esta enfermedad ha avanzado rápidamente en EEUU, ya que en el Neártico solamente existe Borrelia burgdorferi como agente causal. Ello ha permitido hacer una definición de caso de vigilancia de BL para la información nacional de la enfermedad de Lyme (3). No ocurre lo mismo en Europa donde existen al menos 6 especies patógenas de Borrelia. Por ello, el espectro de la enfermedad es muy amplio, no hay una definición clara de BL y por tanto no puede haber una monitorización permanente de la enfermedad (11). Por ello no existen estadísticas validas acerca de la prevalencia en la especie humana en el continente Europeo. Por otro lado, el cálculo del riesgo para la especie humana a partir de las propias series de casos es un concepto erróneo. Además la prevalencia de la infección en la propia garrapata, diversos detalles relativos al reservorio, el patógeno, el hábitat y el clima, intervienen los factores sociológicos que condicionan el contacto de los grupos de riesgo con las garrapatas, infectadas o no. En este estudio, hemos pretendido asociar las tasas de prevalencia del agente patógeno en las garrapatas en todo el entorno geográfico del Paleártico occidental, con una serie de factores ambientales y climáticos, que permitieran establecer una P á g i n a | 6 definición de riesgo objetiva. Este estudio se basa en imágenes de satélite y en un meta-análisis de la información publicada, para construir tal sistema de previsión de riesgo. P á g i n a | 7 II.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA P á g i n a | 8 II.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA II.1.- HISTORIA DE LA ENFERMEDAD A partir de 1883, comenzaron a aparecer en Europa registros de enfermedad de Lyme. En Breslau, Alemania, un médico llamado Alfred Buchwald descubrió una condición conocida hoy como la acrodermatítis atrófica crónica (ACA), que se describe como la decoloración o la degeneración de la piel que ocurren comúnmente en las manos y los pies (34). En la reunión de 1909 de la Sociedad Sueca de Dermatología, Arvid Afzelius presentó su investigación sobre un fenómeno descrito como expansión en forma de anillo de las lesiones de la piel y el patrón de erupción que se había observado desde hace años; 12 años más tarde, publicó el manuscrito de su obra, especulando que esta condición provenía de la picadura de una garrapata del genero Ixodes (34). Durante la primera parte del siglo XX, se produjeron más asociaciones sobre los signos y síntomas de la enfermedad de Lyme. Los casos médicos que se utilizaron en la investigación incluyen la relación entre el eritema migrans (EM), erupción cutánea y problemas neurológicos en el año 1922, la aparición de síntomas psiquiátricos en pacientes con erupción de EM en 1930, la aparición de la EM y la ACA en los pacientes con nódulo benigno o rubor en 1934 y la participación de las enfermedades del corazón en pacientes con síntomas de EM y artritis (34). En 1976 la enfermedad de Lyme fue descrita como una entidad separada debido a la agrupación geográfica de niños afectados, quienes presentaban artritis reumatoide, vivían en zonas rurales y el comienzo de los P á g i n a | 9 síntomas era en verano. La presentación de los casos dentro de las mismas familias en diferentes años sugirió que el proceso era transmitido por un artrópodo. Además, algunos de los pacientes iniciales notaron una lesión expansiva roja en la piel, pensando que era por la picadura de un insecto, antes del comienzo de la artritis. La lesión era mas comparable con el eritema migrans (EM), el cual fue descrito por primera vez en Europa a principios del siglo XX y en EEUU a mitad del siglo XX. En Europa, las lesiones de piel habían sido asociadas con la picadura de Ixodes ricinus y con posteriores anormalidades neurológicas pero no con artritis (34). Durante el verano de 1976, veinticuatro pacientes fueron identificados con EM y días más tarde el 75% de ellos desarrollaron artritis, confirmando así el enlace entre las lesiones de piel y la artritis. Por otra parte algunos de los pacientes desarrollaron cuadros neurológicos y anormalidades cardiacas, las cuales demostraban que la enfermedad de Lyme era un complejo multisistémico (34). En el verano de 1977, más estudios epidemiológicos de pacientes de Lyme (Connecticut), con EM, implicaron a garrapatas Ixodes scapularis, un miembro del complejo I. ricinus, como vector de la enfermedad de Lyme (34). En este mismo año, un médico llamado Allen Steere y su equipo lograron describir y proporcionar una explicación de los fenómenos, lo cual fue inicialmente mal diagnosticado como la artritis reumatoide, llamando a la condición “artritis de Lyme" (34). En 1979, se habían identificado 512 casos de enfermedad de Lyme en los EEUU a lo largo de la costa noroeste y al norte de California. Las localizaciones a lo largo de la costa noroeste estaban correlacionadas con la distribución de I.scapularis y las del norte de California con la de I.pacificus. P á g i n a | 16 generalmente sobre pequeños mamíferos silvestres y aves, y posteriormente caen al suelo donde mudan a la fase de ninfa. Estas son un poco más grandes, unos 2 mm, con cuatro pares de patas, sin abertura genital entre el segundo par de patas en la porción ventral de su cuerpo y por lo general se alimentan durante varios días sobre pequeños animales silvestres, animales domésticos o en el hombre. Cuando están repletas caen al suelo y mudan a la fase de adulto (machos o hembras) y estas en condiciones ambientales adecuadas vuelven a picar a un hospedador, preferentemente grandes animales o incluso al hombre. Los adultos se alimentarán de sangre de mamíferos y humanos hasta que en la siguiente primavera realicen la puesta de huevos e inicien el ciclo biológico de nuevo (34). La larva raramente se encuentra infectada, por lo que es evidente que la transmisión transovárica no existe. Sin embargo, este estadio tiene un papel importante al mantener la circulación de la bacteria en la naturaleza al alimentarse de hospedadores reservorios, como roedores (5, 23). Como sólo se alimentan una vez en cada estadio, la infección normalmente la adquiere uno de ellos (por ejemplo la larva), que se alimenta sobre un hospedador reservorio de la espiroqueta y la transmite al próximo (por ejemplo la ninfa). Esto se conoce como transmisión transestadial. El momento de actividad de la garrapata está determinado principalmente por la latencia (diapausa), este mecanismo consiste en el acondicionamiento fisiológico de las garrapatas por señales ambientales relacionadas con las condiciones ambientales futuras que permiten a las garrapatas evitar la búsqueda de hospedadores, en fases desfavorables del año. Este comportamiento impide que una parte de las garrapatas que mudan en verano, se alimenten en otoño, estas quedan en diapausa, impidiendo a las garrapatas repletas que sigan adelante con su desarrollo durante los meses de P á g i n a | 17 invierno. La inducción de la diapausa se determina fundamentalmente por el fotoperiodo, la temperatura también puede tener una influencia modificadora y una variedad de factores, incluyendo la genética de población de garrapatas local (12). P á g i n a | 18 II.4.- DIAGNÓSTICO DE B.burdorferi s.l EN IXODES RICINUS II.4.1.- Aislamiento de Borrelia en Ixodes ricinus El aislamiento de Borrelia se realiza según diferentes estudios en medio BSK. Las garrapatas son empapadas en etanol al 70% e individualmente se aplastan con fórceps esterilizados en tubos que contienen modificado medio BSK-II. Después de 7 a 14 días de incubación a 34ºC se seleccionan los medios de cultivo positivos mediante microscopio de campo oscuro. (28). II.4.2.- Identificación de genoespecies de Borrelia mediante la reacción en la cadena de la polimerasa (PCR) y polimorfismo de restricción de fragmentos de ADN (RFLP) Para la extracción de ADN, según diferentes estudios se coge 1,5 ul de muestras positivas, se lavan por centrifugación y lavado doble con 1 ml de PBSMgCl2 (28). El sedimento se suspende en 50 ul de tampón, con MgCl2, dNTP, cebador y Taq polimerasa y se extrae el ADN después de la incubación de los diferentes ciclos durante un total de 10-15 min de acuerdo a Gern et al. (2010)(14, 28). PCR y fragmentos de restricción polimórficos (RFLP) se utilizan para identificar especies de Borrelia (14, 28). Para RFLP y PCR positiva, los productos se digieren con la endonucleasa de restricción Msel y luego son separados por electroforesis en un gel de acrilamida al 16% durante 1 h 30 min a 120 V. El ADN digerido se tiñe con bromuro de etídio (18, 28) y se visualiza bajo luz UV (18). P á g i n a | 19 II.5.- DIAGNÓSTICO DE B. burgdorferi EN HUMANOS El diagnóstico clínico es difícil, ya que un elevado número de enfermos no recuerdan el antecedente de la picadura de garrapata, y hasta en un 50 % de los afectados tampoco aparece la lesión cutánea característica, el eritema migrans. Las fases posteriores de la enfermedad se caracterizan por la inespecificidad de los signos y síntomas. Por lo que es necesaria la realización de pruebas de laboratorio que confirmen la existencia de infección (29). II.5.1.- Diagnóstico directo Se basa, en la visualización del microrganismo o su aislamiento, a partir de sangre, muestras cutáneas del eritema, líquido cefalorraquídeo (LCR), sinovial o incluso orina (4). II.5.1.1.- Cultivo El medio más utilizado es el BSK-H (4, 32). El cultivo es el procedimiento ideal para confirmar el diagnóstico etiológico, sobre todo en la fase inicial de la enfermedad, pero su complejidad y lentitud de crecimiento hacen que no se haga de forma habitual (4). II.5.1.2.- Visualización B. burgdorferi se observa difícilmente en tejidos, LCR o muestras de sinovia. Se realiza con preparaciones no teñidas, en fondo oscuro y teñidas, pudiendo ser fluorescentes o no fluorescentes (4). II.5.2.- Diagnóstico indirecto II.5.2.1.- Métodos de diagnóstico Los métodos más utilizados son la immunofluorescencia indirecta (IFI), el ELISA indirecto o de captura y el Western-Blot o Immunoblot (2, 4). P á g i n a | 20 Inmunofluorescencia indirecta. No es tan reproducible como el ELISA (29) y es difícil de estandarizar. Es rentable en estadios tardíos de la enfermedad, cuando hay eritema migrans. No se ha establecido la dilución óptima, con lo que la interpretación es difícil (2, 4). ELISA. Puede ser de tipo indirecto o de captura IgM. Tiene la ventaja de su automatización, que permite procesar un gran volumen de muestras, así como mejor estandarización. El ELISA de captura IgM ha demostrado ser más sensible (31). Western-blot. Se utiliza para la confirmación de las pruebas de IFI y ELISA (2, 4). Su interpretación debe de hacerse de forma cuidadosa y estricta, bien de forma cualitativa (29), cuantitativa (32), o una combinación de ambos. Antes de aplicar las pruebas serológicas, se debe excluir cualquier otra causa etiológica (27). II.5.3.- Técnicas de amplificación genética La detección directa de secuencias de ADN específicas mediante PCR puede ser una técnica prometedora que complemente las pruebas serológicas, aunque no está exenta de problemas (2). Resumiendo, la PCR es una técnica sensible y específica, pero tiene el inconveniente de no haber encontrado la diana idónea, bien por falta de expresión o por variabilidad en la secuencia (2). No sustituye a la evaluación clínica ni a la serología, aunque si completa el diagnóstico cuando se obtiene un resultado positivo. Un resultado negativo no excluye la existencia de enfermedad (4). P á g i n a | 21 II.6.- SITUACIÓN ACTUAL DE LA BORRELIOSIS DE LYME. Algunos estudios han señalado la influencia del ciclo de vida de la garrapata sobre la distribución de B. burgdorferi sensu stricto en los Estados Unidos como consecuencia de los diferentes patrones climáticos que afectan a la fenología de la garrapata (13). El hecho de que exista un rango determinado de temperatura, al menos en Estados Unidos, se ha interpretado como el control de la sincronía de la actividad de las diferentes etapas de garrapatas por la amplitud térmica anual y la persistencia del agente patógeno en el reservorio primario (13). La abundancia de Borrelia en las garrapatas está determinada no sólo por el clima sino también por el período de incubación de espiroquetas en las garrapatas, lo que equivale a la duración del desarrollo de larva a ninfa (30). Por lo tanto, los patrones de abundancia y genotipo de la distribución de las poblaciones de B. burgdorferi sensu lato están conformadas sustancialmente por las señales ambientales que actúan sobre las poblaciones de garrapatas, mientras que otros factores adicionales se introducen en el sistema por la dinámica de la población de hospedadores y la respuesta inmune del hospedador tanto a las bacterias como a las garrapatas (6). Las condiciones meteorológicas como temperatura y precipitación, afectan al microclima de las garrapatas, el cual influye en la supervivencia y actividad de estas, así como en la abundancia de hospedadores y en la dinámica entre vector y hospedador (25). Estudios anteriores clasificaron diferentes categorías de vegetación que, fueron relacionadas con la presencia de Borreliosis de Lyme y se demostró que las diferentes categorías de vegetación eran relevantes para la P á g i n a | 22 supervivencia de las garrapatas y de los hospedadores reservorios (16). Así pues se demostró que la vegetación estaba estrechamente relacionada con la humedad del microclima que afecta a la supervivencia de las garrapatas (sobre todo en los estados no parásitos) y que ejercía influencia en la abundancia de garrapatas junto con la abundancia de especies hospedadoras, las cuales determinan también la abundancia de las garrapatas (10,16). Por otra parte, el cambio climático puede ejercer diferentes efectos en la supervivencia y desarrollo de garrapatas, así como cambios en la abundancia de garrapatas y la transmisión de patógenos (25), como también ocasionan impactos en la composición de plantas y especies animales que forman parte de un hábitat, y en el inicio y duración de los periodos de actividad estacional de las garrapatas. Por ello, la variabilidad interanual de la temperatura junto con la tendencia de la amplitud térmica influyen en la actividad de la garrapata. Por ejemplo, no están activas por debajo de 6ºC, impiden su actividad. La temperatura superior a 6ºC inicia su actividad y la ausencia de grandes amplitudes térmicas favorece su supervivencia así como la de sus hospedadores (8, 20). La prevalencia de la Borreliosis de Lyme varía considerablemente en diferentes países europeos, con variaciones en las escalas espaciales y temporales de la enfermedad (5). La distribución de las especies de B. burgdorferi sensu lato, la prevalencia de garrapatas infectadas y la naturaleza de los hábitats en focos de Borreliosis de Lyme, muestran diferencias dentro de Europa, que parecen ser relevantes para la prevalencia de Borreliosis de Lyme. (16). Este problema es particularmente importante a la luz de la tendencia reciente del clima, a como esas variaciones climáticas pueden hacer oscilar las P á g i n a | 23 poblaciones de garrapatas, y al hecho de que se trata de una enfermedad que afecta a la especie humana, para la que puede existir una prevención sencilla si conocemos la influencia real del clima sobre la prevalencia de las espiroquetas en las garrapatas (25, 26). Los estudios previos sobre el tema se han centrado en áreas geográficas relativas a las grandes divisiones administrativas, en Europa. Estos estudios no pueden desentrañar las relaciones entre los rasgos abióticos y los patrones de prevalencia del patógeno en la garrapata vectora. Estas características abióticas son críticas y deben ser identificadas antes de llevar a cabo cualquier estudio de impacto potencial de las tendencias del clima en los procesos de transmisión de la Borreliosis de Lyme (9). A continuación, describimos un meta-análisis de la prevalencia y la distribución de genoespecies de B. burgdorferi sensu lato en garrapatas I. ricinus en la región Paleártica occidental, basado en una revisión sistemática de la literatura. Este análisis se restringe explícitamente a la zona de distribución de I. ricinus, aunque la bacteria puede ser transmitida por Ixodes persulcatus al este de la zona objetivo. P á g i n a | 24 III.- OBJETIVOS P á g i n a | 25 III.- OBJETIVOS  Determinación, mediante un meta-análisis, de la prevalencia de infección por B.burdorferi sensu lato en garrapatas ninfas del genero Ixodes ricinus, para Europa en el periodo comprendido entre los años 2000 a 2011.  Clasificación de los diferentes países y áreas geográficas de Europa en cuatro niveles de prevalencia obtenidas (baja, moderada, alta y muy alta) que se identificaran a niveles de riesgo para la salud pública.  Identificación de las principales variables abióticas del hábitat que influyen en la abundancia y supervivencia de las poblaciones de garrapatas en estudio.  Estudio de la relación entre los niveles de prevalencia definidos y las variables abióticas como elementos de riesgo de infección por Borrelia (asociación estadística).  Elaboración de un análisis de riesgo cualitativo de infección por Borrelia, niveles de riesgo (inapreciable, posible, moderado y elevado), en función de los factores de riesgo abióticos identificados y la distribución en niveles de prevalencia. P á g i n a | 32 IV.2.3.- Análisis estadístico El análisis estadístico se ha realizado para conocer la asociación de diferentes niveles de prevalencia de Borrelia en garrapatas con unas determinadas variables del hábitat. Para llevar a cabo todos los cálculos de la distribución de prevalencias, y asociación con los factores abióticos estudiados, se realizaron diferentes análisis de tipo estadístico utilizando el programa informático EPI INFO 2007 a partir de las bases de datos organizadas en el programa EXCEL. Las pruebas utilizadas han sido: distribución anual de la temperatura T80 valor del percentil 80 de la distribución anual de la temperatura Tacc Temperaturas acumuladas Tacc_6 Temperaturas acumuladas por encima de 6ºC (que es la temperatura de activación de las garrapatas) Tacc_12 Temperaturas acumuladas por encima de 12ºC (que es la temperatura de inicio de actividad de las garrapatas) W20NDVI semana del año en la que se aprecia el percentil 20 de NDVI W80NDVI semana del año en la que se aprecia el percentil 80 de NDVI W20T semana del año en la que se aprecia el percentil 20 de T W80T semana del año en la que se aprecia el percentil 80 de T P á g i n a | 33  Distribución de la media, mediana y cuartiles (25 y 75) para cada nivel de infección en garrapatas (prevalencia muy alta, alta, media o baja).  Coeficiente de correlación del valor del factor de riesgo con la prevalencia de infección en garrapatas o bien la significación estadística mediante ANOVA para la prevalencia de infección baja, media, alta y muy alta con los valores de cada factor. Fueron consideradas significativas aquellas distribuciones cuyos valores de p son menores o iguales a 0,05. Los factores que estaban significativamente relacionados con la prevalencia, son los que nos interesan para nuestro análisis de riesgo, por tanto fue para ellos para los que fueron establecidos los niveles de riesgo. IV.2.3.1.- Análisis de riesgo El análisis de riesgo desarrollado fue de tipo cualitativo basado en los modelos diseñados por la OIE y AFSSA (1,7). Los riesgos se estimaron mediante el estudio de la relación de los diferentes factores abióticos identificados como factores de riesgo potenciales con los niveles de prevalencia de infección en garrapatas, de forma que se analizó la correspondencia entre los cuatro niveles de prevalencia establecidos y los valores obtenidos para los factores abióticos mencionados. A partir de esa relación se establecieron los cuatro niveles de riesgo correspondientes (inapreciable, posible, moderado y elevado) para cada variable de acuerdo con los estándares de la OIE para el análisis de riesgos en movimientos de población y que se identificaban como los niveles de riesgo de infección en función de las características de los factores abióticos de un área geográfica. P á g i n a | 34 Los niveles de riesgo fueron establecidos para cada factor estudiado a partir de la distribución de los valores de esos factores y su relación con los niveles de prevalencia, definiendo esos riesgos dentro de los rangos (cuartiles 25 y 75) de variabilidad de cada factor abiótico en los diferentes niveles de prevalencia y ajustándolos, posteriormente, de forma observacional. P á g i n a | 35 V.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN P á g i n a | 36 V.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN V.1.- Distribución de los valores de cada variable abiótica en función de los niveles de prevalencia de Borrelia spp en garrapatas Los valores de cada una de las variables abióticas se indican en las tablas según los niveles de prevalencia establecidos. (Tablas II, III, IV, V y VI). Tabla II, media de la distribución de las VARIABLES ABIÓTICAS para diferentes niveles de prevalencia de Borrelia spp. en ninfas de Ixodes ricinus. Los datos de temperaturas se expresan en grados Kelvin (los originales en las imágenes de MODIS) y los datos de NDVI (vegetación) son cantidades sin unidad (varia en un rango entre 0 y 1). PREVALENCIA BAJA PREVALENCIA MODERADA PREVALENCIA ALTA PREVALENCIA MUY ALTA T 280,55 281,86 281,7 281,92 T1 266,65 268,17 267,88 268,92 T2 276,63 277,81 277,7 278,26 T3 284,46 285,91 285,69 285,58 T4 295,84 297,1 296,94 295,83 Max NDVI 0,61 0,62 0,61 0,62 Mean NDVI 0,44 0,45 0,46 0,49 Min NDVI 0,27 0,29 0,32 0,33 PCT1 985,84 990,65 990,03 989,48 PCT2 4,66 6,48 5,55 8,56 PCT3 2,98 2,70 2,69 2,09 PNDVI 1 1,58 1,61 1,62 1,70 PNDVI 2 0,13 0,09 0,05 0,06 PNDVI 3 0,06 0,07 0,07 0,04 Amp NDVI 0,34 0,33 0,30 0,28 Amp T 24,73 23,72 23,91 21,4 Max_ndvi 0,61 0,62 0,61 0,62 Max_t 291,28 292,40 292,29 291,98 Min_ndvi 0,27 0,29 0,32 0,33 Min_t 266,54 268,68 268,38 270,58 NDVI20 0,34 0,35 0,38 0,4 NDVI80 0,54 0,55 0,55 0,57 T20 271,50 273,42 273,16 274,86 P á g i n a | 37 T80 286,33 287,65 287,51 287,7 Tacc 8134,99 8742,49 8645,84 8711,52 Tacc_6 198,30 212,69 210,32 212,1 Tacc_12 127,73 137,85 141,91 144,9 W20ndvi 12,795 12,08 11,36 11,8 W20t 10,62 11,19 11,41 13,6 W80t 17,37 16,81 17,18 16,5 W80ndvi 14,99 14 13 16,1 Wt2080 24,01 24 23,41 21,9 Wndvi2080 24,23 25,92 27,64 24,1 El análisis de estos datos ha puesto de manifiesto que la temperatura mínima absoluta anual (T1) y la media de las máximas (T3) tienen diferentes valores para los cuatro niveles de prevalencia establecidos; el menor mínimo absoluto se asocia a prevalencia baja y el mayor mínimo absoluto a prevalencia muy alta. La menor media máxima se asocia a prevalencias bajas. El valor más bajo de la media absoluta anual (T) coincide con prevalencias bajas y el valor más alto con prevalencias muy altas. La temperatura media mínima (T2) y la temperatura máxima absoluta anual (T4) no están bien correlacionadas con los niveles de prevalencia establecidos. La reducción mediante un análisis de componentes principales (ACP) de las variables mensuales de temperatura proporcionó un mejor conjunto de descriptores de las tasas de prevalencia clasificadas. Los valores del primer eje principal están correlacionados directamente con la temperatura media, y los valores más bajos de este eje se asocian a prevalencias bajas. El segundo eje está inversamente relacionado con la amplitud de la temperatura. Los resultados indican que hay una menor variabilidad estacional para valores de prevalencia altos y una mayor variabilidad asociada a una prevalencia baja. El tercer eje está inversamente relacionado con las temperaturas mínimas del invierno. Las zonas con prevalencia baja tienden a estar relacionadas con P á g i n a | 38 zonas de menor temperatura invernal, mientras que el resto de los cuartiles tenía correlativamente valores más altos para este eje. Las variables derivadas de las características de la vegetación no son descriptores adecuados de los rangos de prevalencia de Borrelia si se usaban por separado. Sin embargo, y aunque estos valores no sean significativos, la prevalencia de Borrelia en garrapatas aumenta siguiendo el marcador del NDVI. Las amplitudes medias de temperatura y de NDVI muestran valores mayores en zonas en la que la prevalencia es menor, y disminuyen en zonas con mayor prevalencia. En resumen, en áreas en las que la temperatura media anual se mantiene por encima de unos márgenes, en las que los inviernos no son extremos, y en las que no existe una gran variabilidad anual, cabe esperar una mayor prevalencia de Borrelia en las garrapatas, muy probablemente por la mayor abundancia de estas. La implicación del NDVI en estos resultados se debe a la presencia de un mayor contenido de agua en el suelo, que también aumenta la supervivencia de las garrapatas. P á g i n a | 39 Tabla III, valores de las VARIABLES ABIÓTICAS para el nivel de prevalencia baja VARIABLES MEDIA CUARTIL 1 MEDIANA CUARTIL 3 T 280,55 279,97 280,56 281,3 T1 266,65 265,18 266,54 266,99 T2 276,63 276 276,6 277,44 T3 284,46 283,45 284,68 285,47 T4 295,84 295,18 296,05 297,19 Max NDVI 0,61 0,59 0,61 0,64 Mean NDVI 0,44 0,43 0,44 0,47 Min NDVI 0,27 0,23 0,26 0,31 PCT1 985,84 982,18 986,75 989,46 PCT2 4,66 1,65 4,32 6,53 PCT3 2,98 2,77 3,53 4,1 PNDVI 1 1,58 1,51 1,58 1,68 PNDVI 2 0,13 0,10 0,16 0,19 PNDVI 3 0,06 0,02 0,08 0,11 Amp NDVI 0,34 0,3 0,36 0,38 Amp T 24,73 23,18 25,48 26,14 Max_ndvi 0,61 0,59 0,61 0,64 Max_t 291,28 290,65 291,88 292,25 Min_ndvi 0,27 0,23 0,26 0,31 Min_t 266,54 264,84 265,98 267,07 NDVI20 0,34 0,31 0,33 0,38 NDVI80 0,54 0,53 0,54 0,57 T20 271,49 270,17 271,16 272,31 T80 286,33 285,6 286,47 286,92 Tacc 8134,99 7854,09 8064,97 8356,39 Tacc_6 198,3 192,5 196 206,5 Tacc_12 127,73 129,5 133 143,5 W20ndvi 12,8 11 13 14,5 W20t 10,62 9 9 12 W80t 17,37 16 18 18,5 W80ndvi 14,99 12,5 14 17,5 Wt2080 24,014 24 25 25,5 Wndvi2080 24,22 22 24 27,5 P á g i n a | 40 Tabla IV, valores de las VARIABLES ABIÓTICAS para el nivel de prevalencia moderada VARIABLES MEDIA CUARTIL 1 MEDIANA CUARTIL 3 T 281,86 280,32 281,4 282,99 T1 268,17 266,48 267,045 269,25 T2 277,81 276,78 277,39 278,26 T3 285,91 283,98 285,38 287,95 T4 297,1 295,04 296,01 300,15 Max NDVI 0,62 0,56 0,63 0,67 Mean NDVI 0,45 0,43 0,46 0,49 Min NDVI 0,29 0,20 0,30 0,34 PCT1 990,65 982,14 989,03 998,1 PCT2 6,49 0,45 6,43 9,79 PCT3 2,7 2,09 3,23 4,11 PNDVI 1 1,61 1,53 1,65 1,73 PNDVI 2 0,086 0,02 0,08 0,2 PNDVI 3 0,07 0,02 0,06 0,12 Amp NDVI 0,33 0,24 0,34 0,29 Amp T 23,72 20,49 23,86 27,67 Max_ndvi 0,62 0,56 0,63 0,67 Max_t 292,4 291,23 292,2 294,61 Min_ndvi 0,29 0,20 0,30 0,34 Min_t 268,68 265,46 266,91 272,06 NDVI20 0,35 0,3 0,37 0,39 NDVI80 0,55 0,51 0,56 0,6 T20 273,42 271,07 271,98 276,02 T80 287,66 285,94 287,55 289,05 Tacc 8742,49 8027,06 8356,79 9236,19 Tacc_6 212,69 196 203 255,5 Tacc_12 137,85 129,5 140 178,5 W20ndvi 12,08 11,5 12,5 13 W20t 11,19 9,5 10 15 W80t 16,81 16 17 18 W80ndvi 14 11 14 16,5 Wt2080 24 22,5 24,5 26 Wndvi2080 25,92 23,5 25,5 30 P á g i n a | 41 Tabla V, valores de las VARIABLES ABIÓTICAS para el nivel de prevalencia alta VARIABLES MEDIA CUARTIL 1 MEDIANA CUARTIL 3 T 281,7 280,86 281,58 282,74 T1 267,88 265,77 268,12 269,34 T2 277,7 276,84 277,85 278,27 T3 285,69 284,23 285,67 286,97 T4 296,94 295,07 296,89 299,26 Max NDVI 0,61 0,57 0,62 0,67 Mean NDVI 0,47 0,41 0,48 0,52 Min NDVI 0,32 0,24 0,31 0,39 PCT1 990,03 985,08 990,08 994,65 PCT2 5,55 1,01 5,25 9,08 PCT3 2,69 1,94 2,72 3,54 PNDVI 1 1,62 1,46 1,67 1,82 PNDVI 2 0,05 -0,02 0,07 0,14 PNDVI 3 0,07 0,02 0,08 0,13 Amp NDVI 0,3 0,28 0,31 0,35 Amp T 23,91 21,78 24,07 27,49 Max_ndvi 0,61 0,57 0,62 0,67 Max_t 292,29 291,11 292,22 294,3 Min_ndvi 0,32 0,24 0,31 0,39 Min_t 268,38 265,28 268,53 270,98 NDVI20 0,38 0,3 0,37 0,44 NDVI80 0,55 0,51 0,56 0,59 T20 273,16 271,05 273,33 274,91 T80 287,51 286,21 287,54 288,77 Tacc 8645,84 8273,88 8353,81 9196,42 Tacc_6 210,32 210 203 224 Tacc_12 141,91 136,5 140 164,5 W20ndvi 11,36 11 11 12,5 W20t 11,41 9,5 12 14 W80t 17,18 16,5 17 18 W80ndvi 13 10,5 13 15,5 Wt2080 23,41 22 23,5 25,5 Wndvi2080 27,64 23,5 28,5 31,5 P á g i n a | 48 medias se mueve en ese rango y PCA2 [8,31-10,67] que indica la menor amplitud térmica produce el mayor riesgo. Los estudios que se han publicado hasta la fecha, acerca de la prevalencia de Borrelia en garrapatas tienen un enfoque extremadamente regional, que no permite ver el conjunto de los datos y de la distribución de la variable a estudiar. Así, se ha indicado que la zona geográfica con mayor prevalencia de Borrelia era el centro y este de Europa (16). El mapa de clasificación de Europa debe ser considerada como la mejor explicación de la influencia de las variables abióticas en la prevalencia de garrapatas infectadas, pero no debe identificarse este hecho con un mapa del riesgo para la especie humana (9), ya que este dependerá finalmente de la posibilidad de contacto entre el hombre y la garrapata. No obstante, la prevalencia de infección de Borrelia spp. en garrapatas si que es considerado un elemento más de riesgo para la enfermedad de Lyme (32), pero dependiendo de las tasas de contacto de las garrapatas infectadas y los seres humanos, con otros factores, en parte si representa un elemento de información sobre la evolución de las tasas de incidencia de la enfermedad en Europa. P á g i n a | 49 Figura 2: Distribución del riesgo de la infección por B. burgdorferi s.l. en garrapatas I. ricinus según los factores climáticos analizados. La figura muestra una descripción del impacto de los factores abióticos sobre la prevalencia esperada de la infección en las garrapatas vectoras. P á g i n a | 50 Los patrones de distribución de B. burgdorferi sensu lato mostraron una clara relación con gradientes de temperatura y características de la vegetación. Estos gradientes son poderosos agentes impulsores de la abundancia de garrapatas, la estacionalidad, y el predominio de los diferentes hospedadores de espiroquetas, dando lugar a comunidades altamente variables de hospedadores en la región objetivo según Dizij A., Kurtenbach K. y Gatewood A. G., et al. en estudios anteriores (6,13, 25). El cambio climático global que induce temperaturas mínimas más altas y primaveras más tempranas pueden afectar también a aspectos de la fenología de las garrapatas, como la densidad de su distribución local, las tasas de supervivencia y su propagación hacia zonas de mayor altitud y en latitudes más al norte. Una mayor abundancia de garrapatas propiciada por factores climáticos y por el aumento concomitante en la densidad de vertebrados salvajes y domésticos, junto con la expansión de hábitat adecuados para los huéspedes reservorio resulta, según estudios realizados, en una mayor circulación de Borrelia burgdorferi y como consecuencia en una mayor incidencia de la enfermedad de Lyme (33). Esta última parte fue demostrada según Halos et. al, en un estudio sobre la prevalencia B. burgdorferi sensu lato, donde aparecía más infección por Borrelia spp. en las garrapatas de bosque que en las garrapatas de pastos, lo cual demuestra que los reservorios principales, roedores y aves, son más abundantes en los bosques que en los pastizales; así mismo se encontró mayor infección de Borrelia spp. en garrapatas de pastos con alto porcentaje de arbustos o pastizales rodeados de bosque, donde son abundantes los reservorios (18). Estudios teóricos indican que interacciones complejas entre factores como cambios genéticos en el patógeno, el vector o el huésped, la tasa de P á g i n a | 51 supervivencia y la abundancia de las garrapatas o la mayor exposición de los seres humanos a las picaduras debido a un aumento de actividad al aire libre inciden en las fluctuaciones espacio-temporales de la abundancia de las diferentes genoespecies de Borrelia burgdorferi y de la enfermedad de Lyme. (33). El carácter estacional de la actividad de las garrapatas determina la estacionalidad de la LB. La mayoría de los casos se manifiestan a mediados o finales de verano y esta es en función de la aparición de las garrapatas en la vegetación, la presencia de personas en ese hábitat y el tiempo de incubación de la enfermedad (12). Por lo tanto, B. burgdorferi sensu lato puede ser considerado como un grupo de diferentes poblaciones ecológicas, o ecotípos, cuya distribución y abundancia son moldeadas por fuerzas climáticas, que también impulsan la dinámica de las garrapatas vectoras, junto con la especie de hospedador y su abundancia. Factores abióticos, tales como la temperatura, déficit de saturación de la atmósfera y horas de luz, afectan en el comportamiento de la fenología de las garrapatas, proporcionando la variabilidad en el ciclo de vida de acuerdo al área de distribución geográfica de la garrapata. Aunque la estructura de las comunidades de hospedadores determina la estructura de la población de los genotipos B. burgdorferi sensu lato en Europa, el clima tiene un impacto definitivo en la distribución de las diferentes cepas de I. ricinus, y por tanto en la modulación de la prevalencia de B. burgdorferi sensu lato. P á g i n a | 52 VI.- RESUMEN P á g i n a | 53 VI.- RESUMEN La distribución de la media y cuartiles (25-75) de los valores de las variables abióticas para los cuatro niveles de prevalencia ya demostraba la asociación de los valores de algunas de las variables con los niveles de prevalencia, como por ejemplo las mayores prevalencias se asociaban con la temperatura media mas alta, así como a prevalencias bajas se observaban las temperaturas máximas y mínimas más bajas, junto con mayores amplitudes de temperatura. Tras confirmar que variables estaban estadísticamente relacionadas con los niveles de prevalencia, se estableció el análisis de riesgo cualitativo de infección en garrapatas, definiendo los valores de cada variable que determinaban los cuatro niveles de riesgo, según la distribución de esos valores dentro de los rangos (cuartiles 25 y 75) en los diferentes niveles de prevalencia. Se obtuvo el mayor riesgo de infección en garrapatas con temperaturas medias y mínimas anuales más altas, con la mayor temperatura media máxima dentro de la temperatura de actividad de la garrapata y en lugares con menores amplitudes. Por tanto se demuestra la asociación de que garrapatas de una zona tengan mayor o menor riesgo de infección por Borrelia spp. está determinado por factores abióticos que influyen tanto en el ciclo de la garrapata como en el mantenimiento de hospedadores reservorios, que permiten la circulación de la infección. P á g i n a | 54 VII.- CONCLUSIONES P á g i n a | 55 VII.- CONCLUSIONES  Algunos factores climáticos como la temperatura media anual, la amplitud térmica y el déficit de saturación de agua en el aire son indicadores de la mayor o menor prevalencia de B.b.s.l. en las garrapatas I. ricinus. de la región Paleártica de una zona.  Los gradientes de temperatura y vegetación modulan la abundancia de garrapatas, su estacionalidad y el predominio de hospedadores reservorios, por tanto modulan el contacto entre reservorio-garrapata y por consiguiente condicionan la prevalencia de infección por Borrelia en garrapatas I.ricinus.  Los factores que promueven una actividad de las garrapatas sostenida en el tiempo, estable, sin amplias variaciones ni mortalidad de las mismas, provocan un aumento del riesgo de infección por las mismas. Sin embargo, las temperaturas extremas, la amplia variabilidad térmica y un alto déficit de saturación de agua marcan una baja abundancia de garrapatas y por tanto bajas tasas de contacto entre garrapatas y reservorios.  Estos resultados no deben evaluarse como una aproximación directa al riesgo de la enfermedad en la especie humana, sino como la interpretación del impacto del clima en los componentes de la transmisión de la enfermedad. Otros factores de tipo social condicionan la diferente incidencia de la enfermedad. P á g i n a | 56 VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA). 2009. Une métode qualitative d’estimation du risque en santé animale. Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA), Bialec-Nancy, France. 2. Assous MV. Méthodes du diagnostic biologique au cours des différentes manifestations de la borréliose de Lyme. Médecine et maladies infectieuses. 2007; 37:487–495. France. 3. 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