Repositorio Institucional de Documentos

1 Universidad de Zaragoza Facultad de Veterinaria Departamento de Patología animal Área de Sanidad animal Parasitología y Enfermedades parasitarias Pequeños estróngilos en el valle Medio del río Ebro. Manejo y detección de resistencias al tiabendazol. Eva Goñi Álvarez de Eulate Zaragoza, Septiembre de 2012 Trabajo de fin de Máster de Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias. 2 Agradecimientos Quiero agradecer a mi tutora del trabajo fin de Máster, María Jesús Gracia Salinas, por la ayuda y disponibilidad prestada en todo momento. A Francisco Vázquez Bringas y Antonio Romero Lasheras, veterinarios especialistas en équidos y especialmente a Arantza Vitoria Moraiz por asesorar y prestar ayuda en la visita a las explotaciones equinas y cumplimentación de encuestas. A los propietarios de las explotaciones visitadas por permitirme el acceso a las mismas y proporcionarme información sobre las encuestas. A los residentes del área de grandes animales del Hospital Clínico Veterinario de Zaragoza, especialmente a Almudena Arenas Álvarez por la ayuda en el manejo de los animales y recogida de muestras. A Carlos Calvete, veterinario e investigador en el Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria (CITA) de Montañana, por su disposición y enseñanza de las técnicas in Vitro. Gracias del mismo modo a Ana Guillén y Rebeca Calavia, trabajadoras también del CITA. Y por último, al profesorado y becarios de Parasitología por el apoyo ofrecido en todo este tiempo. 3 Resumen Los pequeños estróngilos constituyen, en la actualidad, los parásitos más emergentes y patogénos de los équidos, pudiendo ocasionar tanto efectos clínicos como subclínicos. El control de estos parásitos recae sobre todo en la utilización de antihelmínticos y aunque existen productos eficaces, los équidos no adquieren una inmunidad completa, por lo que es necesario seguir tratándolos con antiparasitarios a lo largo de su vida. Uno de los problemas que puede ocasionar la utilización de antihelmínticos es el desarrollo de cepas de nematodos resistentes. La resistencias a los antihelmínticos por parte de los nematodos gastrointestinales, cada día cobra más importancia. Muchos son los casos descritos en otras especies, sobretodo en rumiantes, pero en la especie equina, todavía hay mucho por investigar. Así pues, en países como Reino Unido, Italia, Alemania o Francia, hay artículos publicados donde se pone de manifiesto la existencia de resistencias a los antiparasitarios y sus consecuencias en la ganadería equina. Sin embargo, en España, los estudios realizados son escasos y algunos centran el problema en provincias como Cantabria, Álava o Palencia. La resistencia a los antihelmínticos conlleva la pérdida o disminución de su eficacia frente a los parásitos a los que van dirigidos. Por ello es importante detectar las resistencias en su fase inicial para poder cambiar de estrategia de control y preservar el bienestar de nuestros animales. Nuestro estudio tiene como objetivo identificar aspectos de manejo que pueden favorecer el desarrollo de resistencias. También pretende conocer la prevalencia, niveles de parasitación y los géneros más comunes de pequeños estróngilos que parasitan a los équidos en la zona media del Valle del río Ebro. Asimismo, también se realizaron pruebas in Vitro con el fin de detectar la posible presencia de cepas de pequeños estróngilos resistentes al tiabendazol. Los resultados del estudio nos indican que el manejo, en general, es correcto. Sin embargo, hábitos como desparasitar de forma no selectiva o utilizar dosis estandarizadas sin realizar el pesaje de los animales, son aspectos que pueden favorecer el desarrollo de resistencias. La prevalencia de parasitación por pequeños estróngilos en la zona de estudio fue del 34,04%. Los niveles de parasitación eran bajos, inferiores a 100 huevos por gramo de heces y las parasitaciones más elevadas, en 4 términos generales, se presentaban en los animales más jóvenes. En el 100% de los casos, el género implicado era Cyathostomun. La utilización del test in Vitro de inhibición de la eclosión nos permitió detectar que sólo el 5.55% de los animales muestreados portaban parásitos resistentes al tiabendazol. En general, y a la vista de los resultados obtenidos en este trabajo, podemos considerar que, en la actualidad, los pequeños estróngilos no representan una amenaza seria para los caballos en la zona media del Valle del Ebro. 5 ÍNDICE: 1. Introducción __________________________________ 6 1.1 Nematodos gastrointestinales: pequeños estróngilos ............................. 6 1.1.2 Ciclo biológico .............................................................................. 7 1.1.3 Síntomas y lesiones en caballos............................................... 10 1.1.4 Diagnóstico ................................................................................... 11 1.1.5 Tratamiento ................................................................................. 13 1.2 Resistencia a antihelmínticos y métodos de detección ........................... 15 1.3 Control de los pequeños estróngilos con el fin de reducir el riesgo de desarrollo de resistencias a los antihelmínticos ............................................... 22 2. Objetivos del trabajo __________________________ 25 3. Material y métodos ___________________________ 26 3.1 Aspectos de manejo que pueden determinar la aparición de cepas de pequeños estróngilos resistentes a antihelmínticos ........................................ 26 3.2. Parasitación por pequeños estróngilos en équidos en el Valle Medio del río Ebro ...................................................................................................................... 27 3.2.1. Coprología Cualitativa ................................................................ 28 3.2.2. Coprología Cuantitativa ............................................................. 28 3.2.3. Identificación de géneros. Coprocultivo ............................... 29 3.3. Situación de Resistencias a antihelmínticos en la especie equina....... 31 4. Resultados __________________________________ 34 5. Discusión ___________________________________ 41 6. Conclusiones _________________________________ 49 7. Bibliografía _________________________________ 50 6 1. Introducción: 1.1 Nematodos gastrointestinales: pequeños estróngilos. Los caballos de cualquier parte del mundo, están expuestos a una gran variedad de parásitos. Entre éstos, los nematodos digestivos, son los más frecuentes y la razón por la que se requiere el establecimiento de medidas preventivas en caballos durante todo el año (Fayet, 2005). Además, suponen la mayor amenaza en la industria equina, ya que cuando las cargas parasitarias son elevadas, pueden comprometer su salud y bienestar (Matthews, 2011). Los nematodos, se clasifican dentro del Reino Animalia , Subreino Metazoa, Phyllum Nemathelminthes, Clase Nematoda (Johnstone, 1998). Se trata de vermes no segmentados con simetría bilateral y cavidad corporal (Figura 1). El aparato digestivo consta de boca y ano sin pared muscular definida. No tienen aparato circulatorio ni respiratorio. Presentan sexos separados y un sistema reproductor relativamente sencillo (Johnstone, 1998). Figura 1: Corte longitudinal de nematodo hembra. En los nematodos, dentro del Orden Strongylida , se ubican los grandes y los pequeños estróngilos . Éstos forman parte a su vez, de la Superfamilia Strongyloidea (Dwight et al., 2004; Johnstone, 1998), Familia Strongylidae , Subfamilia Cyanthostominae (Dwight et al., 2004), de ahí que también sean 7 conocidos los pequeños estróngilos con el sobrenombre de ciatostomas (Corning, 2009) . Dentro de esta subfamilia, se distinguen varios géneros, tales como: Cyathostomum, Cylicostephanus, Cylicocyclus, Cylicodontophorus, Poteriostomum y Gyalocephalus (Johstone, 1998). Incluyen aproximadamente 50 especies de distribución cosmopolita, las cuales se localizan en el intestino grueso, principalmente en el ciego y colon de caballos y asnos. Mientras hace unas pocas décadas, los grandes estróngilos, eran considerados como la máxima preocupación epidemiológica y clínica, debido a los efectos fatales que ocasionan con sus migraciones a través de los vasos sanguíneos, hoy en día, esta situación ha cambiado desde que en la década de 1960 llegaran antiparasitarios altamente eficaces (Herd, 1990). Actualmente, los pequeños estróngilos, en lo que se refiere a la ganadería equina, son considerados como los parásitos más emergentes y patógenos, pudiendo ocasionar tanto efectos clínicos como subclínicos (Corning, 2009) . Asimismo, la falta de eficacia que se lleva observando a lo largo de los últimos años en Europa, Oceanía y América (Kaplan 2002; Kaplan 2004; Wolstenholme et al., 2004), debido a la resistencia que han desarrollado a los tratamientos antihelmínticos, complica el control de estos parásitos. En el caballo no provocan la activación de la respuesta inmune, de modo que estos animales no adquieren una inmunidad completa, por lo que es necesario seguir tratándolos con antiparasitarios a lo largo de su vida. 1.1.2 Ciclo biológico: Estos nematodos tienen un ciclo directo (Stratford et al., 2011; Matthews, 2011). El periodo de prepatencia oscila de 2 meses y medio a 4 meses (Matthews, 2011; Dwight et al., 2004). Los estadíos adultos de los pequeños estróngilos miden de 5 a 10 mm y se localizan en la superficie de la mucosa intestinal. Depositan grandes cantidades de huevos, que el caballo eliminará a través de las heces. Estos huevos miden entorno a 90-70 µm (Kassai, 2002). 8 Los animales parasitados defecan en los prados donde pastan. A través de estas heces se vehiculan millones de huevos de nematodos, en cuyo interior se desarrollarán las larvas L1, siempre que se reúnan unas condiciones ambientales favorables. Así, la humedad óptima para que se produzca la eclosión es del 80% y una temperatura entorno a 22-26ºC (Johnstone, 2002). Las larvas L1 eclosionan de los huevos accediendo al pasto, donde mudan a L2 (provista de una cutícula que la protege de la desecación, al mismo tiempo que impide la alimentación) y a L3 tempranas, que es la forma infectante para los équidos (Figura 2). Figura 2: Ciclo biológico de pequeños estróngilos. La tasa de desarrollo de L1 a L3 es directamente proporcional a la temperatura: con clima templado, los huevos pueden eclosionar y evolucionar a L3 infectante en un corto periodo de tiempo, como 3 días (Corning, 2009) . Las larvas que han mudado hasta el estadío de L3 (Figura 3) mantienen la cutícula del estadío anterior. Ésta les impide alimentarse pero a su vez, les permite sobrevivir incluso a condiciones de congelación, pudiendo perdurar en el pasto durante largos periodos de tiempo. De esta manera, en los pastos podemos encontrarnos tanto larvas L3 de la estación previa, como las que corresponden a las que han eclosionado recientemente de los huevos (Matthews et al., 2004). Estas L3 tempranas son ingeridas junto con la vegetación cuando los 9 animales prensan el alimento. En el interior del caballo, pierden la vaina y llegan hasta las criptas de Lieberkuhn del intestino delgado. Figura 3: Larva en estadío L3. Provista de vaina, cola larga y con forma de látigo y ocho células intestinales. Forma infectante para los équidos. Una vez en el intestino delgado, puede suceder dos cosas: que las L3 vayan mudando hasta la forma adulta y pongan huevos fértiles, en el lumen del intestino grueso en un rápido ciclo vital de unas 5-6 semanas, o que las larvas L3 lleguen a la mucosa del ciego y colon y formen quistes ( larvas en hipobiosis o inactivas) que suele coincidir con la llegada del otoño (Jasko y Roth, 1984; Church et al., 1986). La estación durante la cual ocurre la hipobiosis depende del clima. Así en climas templados, el cúmulo de larvas tiene lugar durante la temporada de pastoreo, la larva se enquistará durante los meses más frescos del año y podría emerger en masa cuando el tiempo más calienta en primavera. Esta sincronización se da a la inversa en climas tropicales, donde la sincronización de la inhibición se da en periodos de estrés propiciados por los meses de verano, con emergencia de larvas en otoño. Los estadíos larvales se protegen enquistándose. Además más del 90% de los ciatostomas enquistados, pueden quedar inhibidos en su estadío L3 temprana y permanecer dentro de la pared intestinal, como pequeños nódulos, durante largos periodos que pueden ir desde los 4 meses a los 2 años (Corning, 2009) . Durante este periodo de enquistamiento, los ciatostomas se hacen resistentes a muchos de los fármacos antihelmínticos actualmente disponibles, incluida la ivermectina oral a 0,2 o 1,0 mg/kg y moxidectina a 0,3 o 0,4 mg/kg (Xiao et al., 1994). 16 Stear et al., 1995; Calvete et al, 2012). Así como en otras especies se dispone de más información sobre el tema de las resistencias a lo antiparasitarios, no ocurre lo mismo con la especie equina (Meana et al, 2000). Prácticamente no hay ningún estudio en nuestro país en équidos. Hasta el momento se han publicado la presencia de ciatostóminos resistentes en dos yeguadas en Cantabria y Álava y sospecha de una tercera en Palencia. La razón de estas resistencias parece ser el tratamiento rutinario y frecuente con mebendazol (Rojo Vázquez y Meana Mañes, 2008). En caballos, a partir de finales de los años ochenta, se ha descrito resistencias principalmente de ciatostomas a Benzimidazoles como consecuencia del uso irracional de antiparasitarios (Kaplan, 2004; Lind et al., 2007; Traversa et al., 2007; Traversa et al., 2009; Witherle et al., 2004: Fayet, 2005). Así, en relación con lo anterior, son varios los estudios realizados en otros países como Italia (Traversa et al, 2007), Suecia (Lind et al., 2007), Reino Unido, EEUU, Dinamarca, Alemania, República Checa, Polonia o Australia (Heidy A. Brady et al, 2009), que señalan la presencia de estas resistencias. Varias investigaciones han demostrado que cuando se ha desarrollado la resistencia a antihelmínticos en nematodos, ésta permanecerá durante muchos años frente al fármaco concreto, incluso con el cese del tratamiento. Sin embargo, no se conoce cuando ocurre el punto de “no retorno” (Jackson y Coop, 2000; Lind et al., 2007; Lyons et al., 2007). Podemos afirmar que hay resistencia cuando una población de parásitos ha adquirido genéticamente la capacidad de resistir a concentraciones de antiparasitarios habitualmente letales para los individuos de esa especie (OMS, 1957). Así pues, la resistencia supone la inefectividad de un fármaco o disminución de su actividad. El desarrollo de nuevas moléculas, supone un coste elevado y por tanto, las posibilidades de extensión de la farmacoterapia antiparasitaria, en cualquier caso son muy limitadas. Es un fenómeno evolutivo que resulta de una selección genética. De este modo, los individuos que se vuelven resistentes, es debido a una mutación en su genoma. Al principio, los individuos son poco numerosos y tras cada tratamiento sobrevive al fármaco utilizado, una pequeña proporción. Éstos son los únicos capaces de reproducirse y contaminan los pastos con sus huevos. De esta manera, aumentan los genes de resistencia en la población, hasta reemplazar a la población sensible. 17 Las resistencias, al tratarse de un fenómeno de base genética, convierten a los nematodos, resistentes en todos los estadíos de su vida: larvario y adultos. Para poder hacernos una idea de la transcendencia que esto tiene, señalaremos que gracias a esta capacidad de supervivencia que tienen las larvas de ciatostomas hipobióticas de la mucosa, a múltiples dosis de antihelmíntico, ante una nueva ingesta de pasto de los caballos a su regreso a los prados, se podría reanudar la excreción durante meses o incluso años, de huevos de ciatostomas fecales con las consecuencias que ello supone. Se han puesto en evidencia varios mecanismos de resistencia, entre ellos destacamos los descritos en los estróngilos: - Producción de esterasas que modifican la estructura del antiparasitario y favorecen su eliminación. - Modificación cuantitativa y cualitativa de los receptores de los antiparasitarios (mutación de la Beta-tubulina en los individuos resistentes a los bencimidazoles) (Fayet, 2005). Para que la resistencia a los antihelmínticos se produzca ha de cumplirse una serie de condiciones tales como: - Frecuencia de utilización: La aparición de resistencias está asociado a menudo con el empleo repetido de antiparasitarios o a errores de utilización. Cuanto mayor es la frecuencia de utilización de un antiparasitario, mayor es la presión de selección. Se ha señalado que 5/6 desparasitaciones/año generan resistencia en 2 años (Calvete et al, 2012). Además el uso continuo de un antihelmíntico de espectro restringido puede ocasionar, de forma gradual, el cúmulo de ciertas especies de parásitos (Fayet, 2005). - Fallos en la sincronización del tratamiento de los animales que pastan en los prados, puede producir contaminación de los mismos y así transmitir la infección. En todos los programas de prevención, los animales deben estar tratados sincronizadamente. La razón que justifica esto es que los animales jóvenes son más susceptibles de contraer una infección y la mezcla de animales de distintas edades en un mismo pasto, aumenta la posibilidad de la transmisión de parásitos, porque los animales jóvenes tienden a tener PRH postratamiento más cortos. En los caballos adultos se produce además, un alargamiento de los PRH en heces tras los tratamientos 18 con antihelmínticos (Herd y Gabel, 1990). - Subdosis o sobresosis: Dosis insuficientes de antiparasitarios es una razón obvia que explique un fallo en el control parasitario. Permiten la supervivencia de individuos heterocigotos que portan los alelos de resistencia. La sobredosis conlleva la selección de individuos muy resistentes (Fayet, 2005; Calvete et al, 2012). - Alternancia o asociación de moléculas: La alternancia demasiado rápida de moléculas antiparasitarias supone la coselección de los parásitos resistentes a los antihelmínticos. Sin embargo, las asociaciones de dos antiparasitarios de familias diferentes, retardan la aparición de resistencias (Fayet, 2005). Si un antihelmíntico ejerce presión de selección en las larvas de la mucosa, entonces sobrevivirán y salen hacia el lumen para completar el ciclo y deberían ser menos sensibles a la droga que sus antecesoras. Por otra parte, si un tratamiento antihelmíntico tiene una actividad excelente solo frente a las fases alojadas en el lumen y poca o nada de actividad frente a las fases de la mucosa, hay poca presión de selección para la resistencia a las drogas hacia ese producto. Las larvas de la mucosa que continúan desarrollándose y ocupan el lumen, deberán ser tan sensibles a la droga como sus antecesoras. La ivermectina es un ejemplo de fármaco que ejerce poca o nula presión de selección, en este caso sobre los ciatostomas enquistados. Su actividad se limita a las larvas en la mucosa (a dosis terapéuticas y a elevadas). Además del manejo de los pastos y el papel del veterinario, los factores que determinan la rápida aparición de resistencias en el campo son: - La frecuencia del gen para la resistencia en poblaciones sin tratar. Parece ser que están implicadas mutaciones en sitios del receptor donde los antihelmínticos actúan o diferentes enzimas o mecanismos que pueden afectar al metabolismo o transporte de los antihelmínticos. En caballos el 3% de los ciatostomas son resistentes y el 17% son heterocigotos (Pape et al., 2003). - Si la resistencia es dominante o recesiva. Todo indica que las resistencias se desarrollan mas rápido si los genes implicados, son dominantes (Coles et al., 2004). - La aptitud biológica de vermes resistentes comparados con los 19 susceptibles (Coles et al., 2005). El poder detectar las resistencias a los productos antiparasitarios es importante para poder llevar a cabo una apropiada administración de estrategias. El poder conocer hasta donde se extienden las resistencias, depende de la existencia de pruebas capaces de detectarlas y del diseño de tests estandarizados para resistencias que fueron elaborados por la asociación de parasitología veterinaria, WAAVP en 1992 (Coles et al., 1992). Los test son necesarios para así conocer el estatus de resistencia de las granjas y para la planificación del uso óptimo de los restantes antihelmínticos efectivos, especialmente para las lactonas macrocíclicas (Coles et al, 2006). La detección de la resistencia cuando está aún en un bajo nivel debería ser un objetivo clave en nuestras estrategias para el control de nematodos en un futuro (Coles et al, 2006). Hay test muy simples y eficaces que pueden ser usados en laboratorios de parasitología. Entre estos test destacan: Tests in Vivo como el de la reducción del recuento de huevos fecales (FECRT) y dos test in Vitro , como el de inhibición de la eclosión de huevos con Tiabendazol (EHT) y el test de inhibición de la migración larvaria (LMIT). Parece ser que hay una correlación entre los resultados que se obtienen de las pruebas EHT y FECRT (Witherle et al., 2004). Hay una gran necesidad de mejorar los métodos de detección de resistencia a antihelmínticos, particularmente para la detección de la resistencia a las lactonas macrocíclicas. En la actualidad, el mejor método de detección de resistencia recae en la prueba de la reducción del recuento de huevos fecales (FECRT) que puede ser usado en todos los grupos de antihelmínticos. Se trata de un método in Vivo recomendado para la detección de resistencias a antihelmínticos en animales infectados natural o experimentalmente y la dosis a suministrar debe ser la registrada en la etiqueta del producto. Además, puede ser usado en diferentes especies como rumiantes, caballos o cerdos, con todo tipo de antihelmínticos y con todas las especies de nematodos, cuyos huevos se eliminan a través de las heces. Sin embargo, este test es solo fiable si más del 25% de las larvas 20 son resistentes (Martin et al, 1989). El test proporciona una estimación de la eficacia del antihelmíntico por comparación del recuento de huevos de nematodos de los animales, antes y después del tratamiento (Figura 4). La diferencia del recuento de huevos entre las dos muestras recogidas (antes y después de cada tratamiento) depende del antiparasitario utilizado. Un grupo sin tratar infectado de forma natural proporciona una medida de los cambios del recuento de huevos durante la prueba. Figura 4: huevos de pequeños estróngilos al microscopio óptico a X10. Para llevarlo a cabo, se deben coger unos 5 g de heces del recto antes de proceder al tratamiento de desparasitación. El recuento de huevos se realiza con la técnica de Mc Master (Raynaud, 1970). En el caso concreto de los caballos, esta técnica es la más simple, sensible y fiable, especialmente en el caso de recuentos bajos (Presland et al., 2005). Posteriormente, se coge una segunda muestra de cada animal y se vuelve a contar los huevos. La diferencia en cuanto al tiempo que transcurre entre una muestra y otra, depende del tratamiento de desparasitación utilizado, de modo que si son Lactonas macrocíclicas, el tiempo transcurrido entre el recuento de una muestra y de la otra ha de ser 14-17días, si se trata de benzimidazoles 8-10 días y si es levamisol tan solo 3-7 días. En el caso de que hubiera resistencia a estos tratamientos, transcurrido esos días, seguirán apareciendo huevos en las heces. Evaluando el recuento de huevos totales obtenido con test críticos, investigaciones recientes han mostrado, que la reducción de los periodos de reaparición de huevos observada después del tratamiento con moxidectina e ivermectina parece ser debido al desarrollo de resistencias a lactonas 21 macrocíclicas de L4 en el lumen (Lyons et al., 2009, 2010). Para que una detección de resistencia a antihelmínticos sea fiable en un 99%, ha de haber menos de un 95% de eficacia del tratamiento antihelmíntico utilizado sobre los vermes. Por lo tanto, una reducción de más del 95% en la puesta de huevos indica que el antihelmíntico utilizado es bueno para ser utilizado en programas de control para mantener la productividad. Un test de eficacia controlada es el método más fiable, pero el gasto que supone, generalmente limita su uso. Sin embargo es el estándar de oro para la detección de resistencias a antihelmínticos. En el caso de los caballos, una reducción del recuento de huevos menor del 90% (no del 95%) es indicativo de resistencia a benzimidazoles. Además del test FECRT, tenemos otras pruebas in Vitro como el Test de inhibición de la eclosión de huevos (EHT) con tiabendazol (TBZ). Se trata de una técnica indicada para la detección de resistencia de nematodos a los Benzimidazoles y sales de Pirantel (Craven et al., 1999; Ihler and Bjorn, 1996; Konigova et al., 2003; von Samson-Himmelstjerna et al., 2009; Young et al., 1999). Se utiliza en nematodos que eclosionan poco después de la embrionación (eclosión rápida). Al igual que el test FECRT, el test in Vitro (EHT) es fiable si la proporción de larvas resistentes es mayor del 25% (Martin et al., 1989). Para la detección de la resistencia a Benzimidazoles se utiliza el TBZ, antihelmíntico que pertenece a dicha familia, que fue descubierto en 1961 y que marcó el inicio de los antihelmínticos de amplio espectro. Poco tiempo después, se probaría la existencia de cepas resistentes en algunas poblaciones de ciatostomas de la especie equina (Drudge et al., 1977; Drudge et al., 1979; Drudge et al., 1984). Lo que se pretende con su uso es comprobar si existe eclosión de los huevos de nematodos a distintas concentraciones de este fármaco. Las cepas resistentes al TBZ eclosionarán a concentraciones de TBZ superiores que las cepas no resistentes. Se utiliza TBZ por su solubilidad en agua, por ser activo contra los adultos y algunas formas inmaduras de nematodos, donde también inhibe la formación del embrión en los huevos y por ser un producto seguro. Debido a esto último, puede ser utilizado en animales de todas las edades, gestantes y debilitados (Dwight et al., 2004). 22 Su sensibilidad disminuye conforme avanza la edad de los huevos. Así pues, lo óptimo es utilizar huevos de menos de 3h tras la recolección de las heces o que hayan estado almacenados en condiciones de anaerobiosis y por lo tanto, que estén en el mismo estado de embrionación. La capacidad del TBZ para inhibir la embrionación y eclosión de los huevos de nematodos recolectados es usada para calcular la dosis letal 50 (LD50) del antihelmíntico. Esta dosis permitirá compararla con otras poblaciones las cuales se conocen como resistentes o no resistentes. En los protocolos de los test in Vitro para la detección de resistencias se utiliza la dosis discriminante de TBZ, que es aquella que mata al 99% de los huevos susceptibles de eclosionar. En el caso de los équidos, esta dosis es de 0,12 µg/ml. Una dosis superior a 0.1 µg/ml es indicativa de resistencia. Algunos autores contemplan la posibilidad de que esta dosis podría ser superior (0,185µg/ml.) (Coles, unpublished). El test de inhibición de la migración larvaria (LMIT), es otra prueba in Vitro, en la que las larvas L3, procedentes de coprocultivo, se les permite migrar en pocillos con la presencia de concentraciones crecientes de lactonas macrocíclicas, las cuales causan parálisis. Por lo tanto, es una prueba que prueba la sensibilidad de los ciatostomas a las lactonas macrocíclicas en el laboratorio (Stratford et al., 2011). Todos estos tests deberían ayudar a los veterinarios sobre qué antihelmínticos deberían usar. Es imprescindible conocer si los problemas clínicos en los animales son debidos a la ineficacia de un determinado antihelmíntico como consecuencia de un fenómeno de resistencia. Es interesante por tanto, detectar lo antes posible la aparición de estas resistencias, para poder así modificar las estrategias de control parasitario y para que la salud y bienestar de nuestros animales no se vean comprometidos. 1.3 Control de los pequeños estróngilos con el fin de reducir el desarrollo de resistencias a los antihelmínticos: Los objetivos de los programas de control deberían encaminar medidas para: - Reducir el número de larvas infectantes en los pastos. - Reducir la transmisión de las larvas entre los animales, 23 - Reducir el número de tratamientos antihelmínticos requeridos para lograr la reducción de los huevos como medio de retrasar o evitar resistencia a drogas por parte de la población de ciatostomas. - Programa de vigilancia: aplicación rutinaria de protocolos para valorar la eficacia de los tratamientos (Calvete et al, 2012; Corning, 2009). Una de las opciones de las que disponemos para controlar los niveles de parasitación de los pequeños estróngilos, como hemos visto, es llevar a cabo tratamientos farmacológicos que favorezcan su eliminación. Del mismo modo, aparte del tratamiento de animales enfermos, estos antihelmínticos son también utilizados para reducir la contaminación medioambiental de larvas a nivel de explotación. Uno de los riesgos que conlleva la utilización inadecuada de los fármacos antiparasitarios es la aparición prematura de resistencias a los mismos. En relación a la frecuencia de los tratamientos, un programa basado en dos desparasitaciones anuales no debería representar un riesgo de selección. Ésta se produce con más de seis desparasitaciones anuales y si todas son hechas con el mismo grupo antihelmíntico. En general, la frecuencia de estos tratamientos disminuye conforme avanza la edad de los caballos. Otra alternativa para el control de estos nematodos y ante una presión de selección excesiva, sería tratar solamente aquellos animales que estén por encima del umbral de hpg (Nielsen et al., 2006) con el objetivo de reducir la presión de selección de la resistencia a antihelmínticos en la población de vermes en la respectiva granja. Hay autores que también recomiendan realizar recuentos de huevos fecales y coprocultivo de larvas, al menos tres veces al año y al menos al 20% de los caballos de una ganadería (Dipietro et al, 1987) para determinar su estatus parasitario. Un aspecto interesante sería, combinar fármacos que pertenezcan a distintas familias como es el caso de fenbendazol y piperazina (PPZ) (FBZ/PPZ) (Lyons, Tolliver et al, 1992) o hacer una rotación de antihelmínticos de diferente clase con los que se desparasitan a lo largo del año. Se ha descrito dos modalidades: rotación lenta y rotación rápida. Con la rotación lenta anual se pretende retrasar la selección de la resistencia al antihelmíntico. Consiste en el uso de un único antihelmíntico durante un año, seguido de la administración de otro de diferente clase en el segundo y tercer año (Woods et al, 1998). Esta práctica no es fácil de llevar a cabo, porque en situaciones de campo, donde hay múltiples especies que deben ser controladas, es necesario usar más de una clase de droga (dos o tres, según estudios recientes) durante un año. Por su parte, la rotación rápida 24 plantea el uso o rotación de clases de antihelmínticos en periodos de tres a seis veces por año. Con ello se trata de minimizar la exposición a los parásitos a una determinada clase de antihelmíntico (Brady et al, 2009). Debido al planteamiento que defiende la rotación rápida de fármacos, como es utilizar varias veces el mismo antihelmíntico como el fenbendazol a lo largo del año, aunque sea de forma alterna con otros productos, se contradicen muchas teorías que afirman de que un antihelmíntico jamás debe ser utilizado una vez que la resistencia se ha establecido (Corning, 2009, Brady et al., 2009). Por otro lado, se puede disminuir los nematodos de los pastos con el uso de antihelmínticos. Para estos casos sería aconsejable usar un producto con una alta eficacia que reduzca eficazmente las cargas de larvas de los pastos y otro, administrado en caballos, que sea eficaz contra las larvas enquistadas. Además de esto, se pueden llevar a cabo otras pautas de manejo como el traslado de los animales desde pastos contaminados a zonas “limpias” libres de nematodos, la eliminación de las heces de los prados al menos una vez/semana seguido de la arada y resiembra de los mismos para eliminar las larvas de pequeños estróngilos, disminuyendo así las probabilidades de que huevos allí presentes, evolucionen y los caballos contacten con ellos (Mejer, 2006) y rotación anual de pastos con especies domésticas como el ganado vacuno y ovino, ya que no son parasitados por pequeños estróngilos y con el consumo de hierba, disminuyen las cargas parasitarias (Fritzen et al., 2010; Herd, 1986). También se recomienda evitar el hacinamiento de los animales, buena higiene de establos (Fritzen, 2005; Fritzen et al., 2010) y una serie de buenas prácticas sobre los caballos nuevos antes de su introducción a los prados (Brady et al, 2009). Con esta serie de medidas, se podría disminuir la frecuencia de los tratamientos antiparasitarios (Hinney et al., 2011). Este trabajo se puso en marcha ante la escasez de información a cerca de qué parásitos están presentes en caballos en la zona de Aragón y alrededores, cual es su prevalencia y el deseo de conocer cómo está la situación de la resistencia a los antihelmínticos en la ganadería equina. 25 2. Objetivos: El presente estudio pretende alcanzar los siguientes objetivos: 2.1 Conocer aspectos de manejo que pueden determinar la aparición de cepas resistentes. 2.2 Conocer la parasitación por pequeños estróngilos en équidos en el Valle Medio del río Ebro. 2.3. Detección de resistencia a los Benzimidazoles mediante pruebas in Vitro. 32 eliminaremos con la bomba de vacío el sobrenadante (dejando 5ml o 5000 µl) y nos quedamos con el sedimento. Figura 11: Centrifugación de la muestra. Posteriormente, calcularemos la concentración de huevos, de manera que haya al menos 150 huevos/ml. En algunos casos tendremos que añadir o eliminar agua con el fin de ajustar la concentración de huevos. Para realizar el ensayo se utilizaron placas 24 pocillos (Figura 12). En cada pocillo de la placa se añaden 100 µl de la muestra de huevos, 10 µl de tiabendazol a una concentración de 20µg/ml y 1890 µl de agua destilada. En los controles se sustituye el tiabendazol por 10µl de agua destilada. Para cada muestra se utilizaron tres réplicas control (sin antihelmíntico) y tres replicas con la dosis discriminante de 10µl de tiabendazol (Coles et al, 2006). Figura 12: Placa de 24 pocillos con tres réplicas control y tres réplicas con tiabendazol. 33 Una vez preparada la placa, la dejaremos en incubación en una estufa durante 48 horas a 23ºC. Transcurrido este periodo, podremos mirarla con la ayuda de un microscopio invertido (Figura 13) y comprobar la existencia o no de larvas que han eclosionado de los huevos en aquellos pocillos donde se añadió el tiabendazol. Para ello, se contabilizan las primeras 100 formas parásitas (huevos o larvas) y se calcula el porcentaje de cada una. Figura 13: Microscopio invertido. Para determinar si hay resistencia o no, se realiza el cálculo del ratio de eclosión (Hdd): M huevos eclosionados en los pocillos con antihelmíntico M huevos eclosionados en los pocillos control Si Hdd es a 0,5 hay resistencia; Si Hdd es < 0,5 no hay resistencia (Coles et al, 1992). Hdd= 34 4. Resultados: 4.1 Conocer aspectos de manejo que pueden determinar la aparición de cepas resistentes. Desde noviembre de 2011 hasta julio de 2012 se cumplimentaron un total de 21 encuestas. Las encuestas se realizaron en 21 yeguadas, picaderos o establos situados en 18 localidades del Valle Medio del río Ebro. Las explotaciones, comprendían desde un único animal hasta 100 animales; incluyendo tanto machos como hembras y con edades que oscilaban desde un mes de vida hasta 21 años. Los animales de las explotaciones estudiadas estaban constituidos mayoritariamente por Pura Raza Español y cruzados. También había animales Lusitanos, Pura Raza Árabe, Ponis, Silla Francés o Koninklijk Warmbloed Paardenstamboek Nederland (KWPN). El alojamiento se realizaba mayoritariamente en boxes, aunque también se alojaban en padoccks y en menor medida, en corraletas con acceso a prados. La alimentación consistía en la administración de 12-15kg/día de paja, pienso compuesto (1,5 kg) y suplemento de avena (1 kg) o alfalfa según el caso y agua a plena disposición. Excepcionalmente, algunos animales podían acceder a la alimentación en pradera. En el caso de las grandes yeguadas encuestadas, el pienso que se administraba dependía del estado fisiológico de las hembras, aportando uno de mayor valor energético para aquellas yeguas gestantes y para las que estaban en época de competición. En relación a los datos con respecto a pautas de desparasitación, prácticamente el 100% de los animales encuestados se desparasitan dos veces al año, principalmente en primavera y otoño, excepcionalmente la desparasitación se realiza tres veces al año. Los productos utilizados, están incluidos en tres familias: Benzimidazoles, (fenbendazol), Isoquinolonas (praziquantel) y Lactonas Macrocíclicas o macrólidos (ivermectina) (Dwight et al., 2004). El fenbendazol y praziquantel 35 se administran conjuntamente mientras que la ivermectina se utiliza sola y alternada con los anteriores cada 6 meses. Para calcular las dosis de los antihelmínticos no se lleva a cabo el pesaje del animal. La dosis de antiparasitario está estandarizada, de modo que en el caso del fenbendazol corresponden 40 ml para los caballos adultos, 20ml para los ponies y 10 ml para los potros. En el caso de la ivermectina, para un caballo adulto de 500kg, corresponde 1ml por cada 50 kg de PV. El praziquantel se administra a razón de 1,5 mg/kg. Las desparasitaciones se realizan en la mayoría de los casos a petición de los propietarios, en sábana e independientemente del tipo de parásitos, de la carga parasitaria o del riesgo previo de exposición a parásitos. En explotaciones con mayor censo de animales el riesgo de importación de parásitos (posible entrada de cepas resistentes) es elevado ya que es frecuente la entrada de nuevos animales, cuyo estatus parasitario es desconocido. Sin embargo, en las explotaciones pequeñas generalmente el trasiego de animales es menor por lo que la introducción de parásitos también se reduce. Señalar que algunas de las preguntas de los cuestionarios, por desconocimiento, no fueron respondidas en todas las yeguadas. 4.2 Conocer la parasitación por pequeños Estróngilos en équidos en el Valle Medio del río Ebro. En total se tomaron muestras de 94 animales, procedentes de 21 explotaciones localizadas en 18 localidades situadas en el Valle Medio del río Ebro. De los animales estudiados (Tabla 1), 44 (46,81%) son machos y 50 (53,19%) son hembras. Las edades de los animales estaban comprendidas entre un mes de vida y 21 años. En concreto, 78 animales son adultos (82,97%) y 16 son potros (17,02%). La prevalencia de parasitación por pequeños estróngilos (Tabla 2) era del 34,04% (32 animales positivos). De estos animales positivos, 15 son machos (34,09% con respecto al total de los machos) y 17 son hembras (34% del total de las hembras). 36 Por edades, de los animales positivos, 23 animales (71,87%) eran adultos y 9 animales (28,12%) eran potros. Localidad Nº animales ♂ ♀ Adultos Potros % ♂ % ♀ % adultos % potros Utebo 3 3 0 2 1 100,00% 0,00% 66,67% 33,33% Peñaflor 7 2 5 7 0 28,57% 71,43% 100,00% 0,00% Garrapinillos 3 0 3 2 1 0,00% 100,00% 66,67% 33,33% Parque del agua 4 1 3 3 1 25,00% 75,00% 75,00% 25,00% Logroño 11 6 5 9 2 54,55% 45,45% 81,82% 18,18% Malpica 9 0 9 8 1 0,00% 100,00% 88,89% 11,11% Quinto de Ebro 7 6 1 6 1 85,71% 14,29% 85,71% 14,29% Movera 1 1 0 1 0 100,00% 0,00% 100,00% 0,00% Belchite 1 1 0 1 0 100,00% 0,00% 100,00% 0,00% Mercazaragoza 10 3 7 10 0 30,00% 70,00% 100,00% 0,00% HCVZ 4 1 3 4 0 25,00% 75,00% 100,00% 0,00% Siétamo 1 0 1 1 0 0,00% 100,00% 100,00% 0,00% Alicante 1 1 0 1 0 100,00% 0,00% 100,00% 0,00% Muel 2 1 1 1 1 50,00% 50,00% 50,00% 50,00% San Mateo de Gállego 4 0 4 3 1 0,00% 100,00% 75,00% 25,00% Calamocha 2 0 2 1 1 0,00% 100,00% 50,00% 50,00% Calahorra 1 1 0 1 0 100,00% 0,00% 100,00% 0,00% María de Huerva 23 17 6 17 6 73,91% 26,09% 73,91% 26,09% Total 94 44 50 78 16 46,81% 53,19% 82,98% 17,02% Tabla 1: datos generales de las explotaciones 37 Tabla 2: Prevalencia de parasitación de las explotaciones Localidad Nº animales (-) (+) (+) adultos (+) potros % (+) total %(+) % (+) adultos % (+) potros Utebo 3 1 2 1 1 66,67% 50,00% 50,00% Peñaflor 7 3 4 4 0 57,14% 100,00% 0,00% Garrapinillos 3 3 0 0 0 0,00% 0,00% 0,00% Parque del agua 4 2 2 1 1 50,00% 50,00% 50,00% Logroño 11 6 5 3 2 45,45% 60,00% 40,00% Malpica 9 7 2 1 1 22,22% 50,00% 50,00% Quinto de Ebro 7 2 5 5 0 71,43% 100,00% 0,00% Movera 1 0 1 1 0 100,00% 100,00% 0,00% Belchite 1 1 0 0 0 0,00% 0,00% 0,00% Mercazaragoza 10 10 0 0 0 0,00% 0,00% 0,00% HCVZ 4 1 3 3 0 75,00% 100,00% 0,00% Siétamo 1 0 1 1 0 100,00% 100,00% 0,00% Alicante 1 1 0 0 0 0,00% 0,00% 0,00% Muel 2 2 0 0 0 0,00% 0,00% 0,00% San Mateo de Gállego 4 1 3 2 1 75,00% 66,67% 33,33% Calamocha 2 1 1 0 1 50,00% 0,00% 100,00% Calahorra 1 1 0 0 0 0,00% 0,00% 0,00% María de Huerva 23 20 3 1 2 13,04% 33,33% 66,67% Total 94 62 32 23 9 34,04% 71,88% 28,13% 38 En cuanto a la coprología cuantitativa, en ningún caso, se superaron los 100 huevos/g de heces, lo que determina que las cargas parasitarias de los animales eran bajas. En cuanto a los coprocultivos realizados, en el 100% de los casos, las larvas L3 corresponden al género Cyathostomun . Figura 14: vista parcial de larva L3 Figura 15: vistas completas de larva L3 de ciatostoma de ciatostoma y sus células intestinales 4.3. Detección de resistencia a los Benzimidazoles mediante pruebas in Vitro. Los resultados de las pruebas in Vitro se realizaron en 18 animales procedentes de tres explotaciones. El criterio de selección de estos animales era la elevada carga parasitaria que tenían con respecto a los demás que fueron analizados. El ratio de eclosión a la dosis discriminativa se situaba de 0 a 0.55 (Tabla 3). Sólo un animal presentó un valor superior a 0.5, lo que sugiere que el 5,55% de los animales presentaba un fenómeno de resistencia al tiabendazol. Esto lo podemos determinar partiendo de la premisa, de que aquellos animales cuyo ratio de eclosión (Hdd) es 0,5 son los resistentes (Coles et al, 1992). 39 Figura 16: larvas L1 que han eclosionado de los huevos tras la aplicación de tiabendazol en la prueba in Vitro para la detección de resistencias. 40 Tabla 3: Relación de Hdd de los 18 caballos con los que se que se ha realizado la prueba in Vitro de TBZ. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 caballo1 0,42 caballo 2 0,08 caballo 3 0,55 caballo 4 0,31 caballo 5 0,3 caballo 6 0 caballo 7 0,31 caballo 8 0,31 caballo 9 0,0026 caballo 10 0 Caballo 11 0 Caballo 12 0,007 Caballo13 0,118 Caballo 14 0,224 Caballo 15 0 Caballo 16 0,0156 Caballo 17 0,016 Caballo 18 0 41 5. Discusión: De las encuestas cumplimentadas podemos destacar una serie de aspectos, que a continuación desarrollaremos: En referencia a las explotaciones estudiadas en la zona media del Valle del río Ebro, destacar que se trata en la mayoría de los casos, de explotaciones de tamaño medio-pequeño, donde predomina la raza Pura Sangre Español y los animales cruzados. En cuanto a la edad de los animales, predominan los animales adultos. En referencia al alojamiento, podemos observar que la mayoría de los animales que forman parte del estudio se alojan en box. Sin embargo, debemos hacer una diferenciación entre aquellos animales que están en régimen intensivo y por tanto, pasan la mayor parte del tiempo en un box y que salen de él para dar paseos, hacer ejercicio y visitas al veterinario y aquellos animales que están en régimen extensivo, utilizando el box únicamente como cobijo para pasar una parte del día, como podría ser la noche. El primer grupo de animales no tiene mucho acceso a pastos y que por tanto, son caballos que comparten poco espacio con otros y el riesgo de que sean parasitados se ve disminuido. Podrían tratarse menos a menudo de lo que realmente se hace, pero sobre este hecho, en muchas ocasiones, es el propietario el que ejerce presión para que sus caballos sean desparasitados. El otro grupo restante, es un pequeño porcentaje de caballos que forma parte de nuestro estudio y que durante el invierno se aloja en boxes pero la mayor parte del día lo pasa en prados a los que accede al punto de la mañana y que cuando llega la noche se recoge en boxes. En verano incluso las noches, estos animales, las pueden pasar fuera a la intemperie. En estos casos de régimen extensivo, no es de extrañar, que el riesgo de que se parasiten sea mayor. La cercanía con los parásitos que se desarrollan en los pastos y el espacio a compartir con otros caballos se ven incrementados y por tanto, el contacto con otras heces, mediante las cuales se vehiculan larvas. De esta manera aumentan las posibilidades de contagio con pequeños estróngilos (Corning, 2009). En estas circunstancias el tratamiento antiparasitario está más justificado. También hay animales que se alojan en paddock o pequeñas corraletas, donde el contacto con el exterior es mayor que en el caso de los boxes. El 48 Debemos señalar la importancia que tiene modificar las pautas de manejos en cuanto a los tratamientos antiparasitarios, en la especie equina si queremos detectar las resistencias en las primeras fases de su desarrollo. Para ello deberemos hacer chequeos de forma periódica en las explotaciones de ganadería equina, para poder detectar fallos en la eficacia de los antihelmínticos y aplicar medidas de prevención, con el fin de retrasar la velocidad de aparición de este fenómeno de base genética. Muchos estudios están de acuerdo en que una detección temprana de las resistencias, es clave para llevar un control de la situación (Brady et al, 2009). Hasta la fecha, parece ser que las resistencias en nuestro país podrían estar controladas, pero viendo que están presentes en los países vecinos y que si seguimos favoreciendo los factores que aceleran su aparición, no sería de extrañar su asentamiento en los próximos años. 49 6. Conclusiones: 1. Los resultados del estudio nos indican que el manejo, en general, es correcto. Sin embargo, hábitos como desparasitar de forma no selectiva o utilizar dosis estandarizadas sin realizar el pesaje de los animales, son aspectos que pueden favorecer el desarrollo de resistencias. 2. La prevalencia de parasitación por pequeños estróngilos en la zona de estudio es del 34,04%. 3. Las cargas parasitarias que presentan los animales son bajas. 4. El género implicado en las parasitaciones es Cyathostomun . 5. La prevalencia de resistencia de los pequeños estróngilos al tiabendazol es del 5,5% de los animales objetos de estudio. 50 7. Bibliografía: Brady H. A, Nichols, W.T; Drug Resistance in equine Parasites: An Emerging Global Problem . Journal of Equine Veterinary Science. 2009; 29 (5): 285-295. Calvete C, Calavia R, Ferrer L.M, Ramos J.J, Lacasta D, Uriarte J; Management and environmental factors related to benzimidazole resistance in sheep nematodos in Northeast Spain . Veterinary Parasitology; 2011; 184 (2-4): 193-203. 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