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“Estudio preliminar sobre la presencia y características fenotípicas de resistencia a los antibióticos de las cepas de Staphylococcus aureus aisladas en una población de équidos y en las personas relacionadas con ellos” Salvador Oliver Ferrando Memoria Proyecto Fin de Máster Directora: Mª Carmen Simón Valencia Máster de Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias Curso 2011-2012 1 Agradecimientos A Mª Carmen Simón, por darme la oportunidad de trabajar en este proyecto tan interesante y por su gran ayuda en la elaboración de este trabajo. A Jesús, Carmelo y Marta por su inestimable colaboración en las tareas de laboratorio. Y por último, a mis compañeros del hospital, por su participación en la recogida de muestras de este experimento. 2 ÍNDICE 1. RESUMEN................................................................................................................ 5 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Staphylococcus aureus. Características intrínsecas ........................................... 6 2.1.1. Importancia Clínica .................................................................................. 7 2.1.2. Factores de Virulencia de S. aureus ........................................................ 8 2.1.3. Resistencia a los antibióticos de S. aureus.............................................. 10 2.1.4. Base bioquímica del desarrollo de la resistencia a los antibióticos.......... 11 2.1.4.a. La resistencia a los antibióticos ß-lactámicos ........................... 11 2.1.4.b. La resistencia a los Macrólidos, Lincosamidas, StreptograminaB y Ketólidos........................................................ 13 2.1.4.c. La resistencia a los Glicopéptidos. .............................................. 13 2.1.4.d. La resistencia a los Antibióticos Esteroidales: Ác. Fusídico ...... 14 2.1.4.e. La resistencia a las Tetraciclinas. ................................................ 14 2.1.4.f. La resistencia a los Aminoglicósidos........................................... 15 2.1.4.g. La resistencia a las Fluoroquinolonas ......................................... 15 2.2. Importancia de los SARM en la especie humana .............................................. 16 2.3. Modos de adquisición de la infección por SARM: HA-MRSA/ HCA-MRSA/ CA-MRSA/ LA-MRSA ......................................... 18 2.4. El estado de portador de S. aureus. .................................................................. 19 2.5. Implicaciones zoonóticas................................................................................... 20 2.6. Infección/ colonización con SARM en caballos ............................................... 22 2.6.1. Infección por S. aureus y SARM. ........................................................... 22 2.6.2. Los factores de riesgo para la colonización y la infección con SARM en caballos ............................................................................... 25 2.6.3. Riesgo de transmisión de SARM por contacto entre personas y caballos .................................................................................................... 26 3 3. OBJETIVOS ............................................................................................................. 28 4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1. Aislamiento e identificación de S. aureus. ....................................................... 29 4.1.1. Individuos participantes en el estudio...................................................... 29 4.1.1.a. Personas ...................................................................................... 29 4.1.1.b. Équidos ....................................................................................... 29 4.1.2. Recogida de muestras .............................................................................. 29 4.1.3. Aislamiento de S. aureus a partir de las muestras recogidas. .................. 30 4.1.3.a. Aislamiento de S. aureus a partir de muestras de Lesión. .......... 30 4.1.3.b. Aislamiento de S. aureus a partir de muestras de Fosas nasales y Espacios interdigitales .................................................. 30 4.1.4. Identificación de las cepas de S. aureus. ................................................. 31 4.1.5. Resumen de la Identificación de S. aureus ............................................. 33 4.2. Fenotipo de resistencia a los antibióticos. ......................................................... 34 4.2.1. Detección de cepas Meticilin-Resistentes de S. aureus (SARM/MRSA) .......................................................................................... 34 4.2.2. Test de Sensibilidad a otros antibióticos de importancia clínica ............. 34 4.2.3. Mínima Dosis Inhibitoria ......................................................................... 35 4.3. Análisis observacional ...................................................................................... 37 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. Cepas de S. aureus aisladas .............................................................................. 38 5.2. Frecuencia de aislamientos de S. aureus en la población de équidos y personas del estudio ........................................................................................... 39 5.3. Razas de los équidos del estudio de los que se aisló S. aureus ........................ 42 5.4. Género de las personas y équidos del estudio en los que se aisló S. aureus .... 43 5.5. Edad de las personas y équidos del estudio y relación con las cepas de S. aureus aisladas de ellos ............................................................................. 44 4 5.6. Hipótesis sobre el posible origen de las cepas de S. aureus aisladas en este estudio .................................................................................................... 45 5.7. Fenotipo de resistencia de las cepas de S. aureus aisladas................................ 48 5.7.1. Fenotipo de resistencia de la cepa C1 ..................................................... 48 5.7.2. Resistencia a β-lactámicos del resto de cepas aisladas ............................ 51 5.7.3. Inducción de la resistencia a la Clindamicina por medio de la Eritromicina ................................................................................................. 51 5.7.4. Resistencia a Glicopéptidos ..................................................................... 52 5.7.5. Resistencia al Ácido Fusídico .................................................................. 52 5.7.6. Resistencia a las Tetraciclinas .................................................................. 52 5.7.7. Resistencia a Aminoglicósidos................................................................. 53 5.7.8. Resistencia a Fluoroquinolonas................................................................ 53 5.7.9. Patrón fenotípico de resistencia a los antibióticos de las cepas aisladas ....................................................................................................... 53 6. RECOMENDACIONES DERIVADAS DEL ESTUDIO ..................................... 55 7. CONCLUSIONES .................................................................................................... 57 8. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 58 ANEXO .......................................................................................................................... 73 5 1. RESUMEN La infección por Staphylococcus aureus, y en particular si se trata de cepas resistentes a la Meticilina, puede ser un riesgo para la salud humana y para los animales domésticos, incluidos los équidos. Diversos estudios observan que la transmisión de estas cepas puede ocurrir en todos los sentidos entre estas especies, y se hace necesario determinar la presencia de cepas resistentes a Meticilina en ambientes animales y humanos, con la finalidad de aplicar medidas de control de su difusión. En este estudio se ha pretendido detectar la presencia y las características fenotípicas de resistencia a los antibióticos de las cepas de Staphylococcus aureus aisladas en 35 équidos y 35 personas relacionadas con ellos. Paralelamente, se investigó la presencia de Staphylococcus del grupo intermedius que también han adquirido importancia en Salud Pública y Veterinaria. Se recogieron datos de las características de las personas participantes en el estudio (edad, presencia de animales en el hogar, tratamiento antibiótico recibido, contacto con ambientes hospitalarios, etc.) y de los équidos con los que estaban relacionadas (edad, raza, tratamientos recibidos, alojamiento, contacto con otros animales, procedencia hospitalaria o comunitaria, etc.). Mediante hisopos estériles se recogieron muestras, de fosas nasales y lesiones (en équidos enfermos) y de fosas nasales y espacios interdigitales en el caso de las personas. Tras el cultivo de las muestras en el laboratorio, se aislaron e identificaron 12 cepas de S. aureus (7 en caballos y 5 en personas) y ninguna del grupo S. intermedius. La mayoría de las cepas estaban relacionadas con el ámbito hospitalario y se aislaron a partir de fosas nasales. La determinación de la resistencia a los antibióticos, se realizó mediante el método de difusión en disco de Kirby-Bauer, frente a un grupo de antibióticos de importancia clínica en Medicina Humana y Animal. La resistencia a βlactámicos y Glicopéptidos se ha corroborado mediante la prueba de la Mínima Dosis Inhibitoria. De este modo, se detectó la presencia de una cepa resistente a la Meticilina (SARM), a partir de la supuración de la incisión realizada en la cirugía (laringoplastia) de un caballo, de la que se sospecha un origen humano (“Humanosis”). En estudios posteriores se determinará el origen y el patrón genético de las cepas de S. aureus aisladas. 6 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Staphylococcus aureus. Características intrínsecas Staphylococcus aureus fue descubierto en 1880 por el cirujano Sir Alexander Ogston en Aberdeen (Escocia), que sistemáticamente observaba al microscopio las preparaciones de pus de la supuración y los abscesos de la herida postoperatoria y vió unos agrupamientos de bacterias en formas de racimo de uvas, que los llamó “Staphylococcus” por la expresión griega “staphyle” (racimo de uvas). Rosenbach, en 1884, lo aisló a partir de abscesos y lo llamó “aureus” por el color amarillo-anaranjado o dorado de sus colonias. Posteriormente, S. aureus ha demostrado ser uno de los principales agentes patógenos humanos, capaz de producir una amplia gama de infecciones leves en la piel, así como graves procesos que pueden conducir a la muerte. Es la especie más patógena de las más de 30 especies que forman parte del género Staphylococcus. Su patogenicidad se puede expresar a pesar de que el Sistema Inmune del individuo infectado funcione normalmente o sus defensas locales se encuentren intactas (van Belkum and Melles, 2005). Los Estafilococos son bacterias Gram positivas de forma redondeada (“Cocos”) de aproximadamente 1,5 m de diámetro. Crecen bien en medios sintéticos en aerobiosis a 35-37ºC dando lugar a colonias de 1 a 3 mm de diámetro, generalmente blancas o ligeramente coloreadas. Hay cierta discrepancia en cuanto al número de especies y subespecies que forman parte de este género, indicando de 30 a 44, según los autores. Las características morfológicas son similares entre Staphyloccocus y Microccocus, que se diferencian fenotípicamente por la pigmentación de las colonias, la oxidación de la glucosa, la producción de ácido a partir del glicerol y los test de sensibilidad a la lysostatina y lisozima. Además es posible diferenciarlos por el porcentaje de Guanina y Citosina de su ADN, que en los estafilococos es baja (30 al 39%) y en los micrococos es alta (68 al 74%). Las técnicas de biología molecular han demostrado las diferencias entre los ADNs y el ARN ribosomal 16S de estos dos géneros. Los Staphyloccocus desde el punto de vista genómico se han agrupado en cinco grupos: S. intermedius, S. saprophyticus, S. simulans, S. sciuri, S. hyicus, que contienen especies típicas humanas y de los animales. Todavía sin agrupar quedan 8 especies, entre las que se encuentran S. aureus, y nuevas especies descubiertas recientemente y que no están bien definidas (van Belkum et al., 2009; Bes et al., 2002). 7 2.1.1. Importancia Clínica Dentro de las especies de interés médico humano, S. aureus es la más importante, pero también se consideran S. epidermidis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S saprophyticus y S. warneri. Otras especies emergentes son S. lugdunensis, S. scheiferi y S. caprae o S. intermedius. En las especies animales S. aureus también juega un papel importante en la patología, tanto en animales de abasto como en los de compañía. Sin embargo, hay numerosas especies que afectan a los animales y cabe destacar el papel de S. pseudointermedius, que forma parte de las subespecies del grupo S. intermedius. S. intermedius se describió en 1976 basado en el contenido G+C y en test fenotípicos (Weese and van Duijkeren, 2010) y se ha encontrado en numerosas especies animales domésticas y salvajes. En el año 2005 se diferenciaron las especies e integrantes del grupo basándose en el análisis de la secuencia de rARN del 16S (Devriese et al., 2005). Actualmente, se agrupan como S.intermedius, S. pseudintermedius y S. delphini basados en el análisis de la secuencia nucleotídica de los genes sodA y hsp60 (Sasaki et al., 2007). El aislamiento de S. pseudointermedius en perros es tan frecuente que se recomienda que todos los S. intermedius sean considerados S. (pseudo)intermedius, aunque esto solo puede determinarse por sus características genéticas (Devriese et al., 2009) ya que las pruebas bioquímicas no se consideran fiables para diferenciarlos. Al igual que S. aureus, se considera agente oportunista, ya que reside habitualmente en la piel y mucosas de los animales y puede ocasionar cuadros dérmicos variados (pioderma, otitis externa, infección de heridas, abscesos, e infección de otras cavidades) (Morris et al., 2006). La prevalencia de esta infección es muy variable entre las especies y la localización geográfica. Se ha demostrado su carácter zoonósico (Hanselman et al., 2007), sobre todos en heridas infectadas, aunque también se ha asociado con bacteriemia, neumonía, infección ótica, úlceras varicosas en la pierna y abscesos cerebrales (Weese and van Duijkeren, 2010), además existen cepas resistentes a la Meticilina cuya prevalencia está aumentando (van Duijkeren et al., 2008). En équidos parece ser poco aislado, mientras que S. aureus si que es frecuente en ellos (Vengust et al., 2006; Weese and van Duijkeren, 2010). Staphylococcus aureus produce una amplia gama de enfermedades graves y de importancia económica en medicina humana y veterinaria (Leonard and Markey, 2008; Safdar and Bradley, 2008). La bacteria coloniza la piel y las mucosas y a partir de ahí puede invadir múltiples órganos. La sintomatología es muy variada. Las infecciones supurativas superficiales cutáneomucosas tales como las foliculitis, forúnculos, impétigo, sinusitis y otitis son las más frecuentes. Estas infecciones se pueden complicar por su difusión hemática o por la extensión regional de la infección siendo responsable de septicemia, pleuroneumonía, endocarditis aguda, afección osteo-articular (osteomielitis) o urinaria, que son las complicaciones nosocomiales más importantes en hospitales, tanto desde el punto de 8 vista sanitario como económico. Además, puede dar lugar a infecciones no supurativas, de origen toxínico (toxemia estafilocócica), debidas a la difusión de toxinas a partir del foco de infección o a la ingestión de un alimento contaminado que las contenga, estas son el síndrome cutáneo estafilocócico, el shock tóxico estafilocócico (SST) (Morgan, 2008) y las intoxicaciones alimentarias. En ganadería S.aureus es una causa importante de mastitis e infección de tejidos blandos (SSTI) y en menor medida, de infecciones del aparato locomotor. En las infecciones del área de incisión quirúrgica (SSI) S. aureus se aísla cada vez más y se ha informado en animales de compañía y caballos (Hermans et al., 2008). 2.1.2. Factores de Virulencia de S. aureus Existen varios factores que explican la frecuencia y gravedad de las infecciones por S. aureus como son su carácter ubicuitario, la multirresistencia de determinadas cepas a los antibióticos, sobretodo en el medio hospitalario, así como una disminución de las defensas inmunes de los pacientes afectados. La patogenicidad de S. aureus se debe, principalmente a los factores de virulencia, ya que tras la invasión, es capaz de secretar factores de adherencia, toxinas y enzimas (Vincenot et al., 2008). Al igual que otras bacterias (Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Clostridium perfringens o Bacillus cereus), S. aureus secreta numerosas toxinas que tienen por objeto deteriorar o neutralizar la respuesta inmune del hospedador infectado. Por otro lado, la degeneración celular que provocan ciertas toxinas puede proporcionarle una base apropiada para su multiplicación. Los determinantes genéticos, ya sean localizados en cromosomas de los bacteriófagos estabilizados, en plásmidos o en secuencias de inserción, parece que se expresan de forma complementaria y organizada y están destinadas a disminuir las defensas del infectado, a menudo, ya debilitado previamente. La bacteria neutraliza la función y la génesis de la respuesta inmune humoral, la respuesta citotóxica y el quimiotactismo de las células polimorfonucleares y desvía la respuesta inflamatoria. S. aureus es frecuentemente, una bacteria comensal, esto se debe a un sutil equilibrio entre las defensas del hospedador “inmunocompetente” y la capacidad de la bacteria de expresar sus factores de virulencia en función de las condiciones del entorno que determinarán el éxito o la erradicación de la infección (Krishna and Miller, 2011; McCaig et al., 2006). La colonización por S. aureus sucede a partir del microrganismo que se encuentra como comensal en la superficie de la piel y/o mucosas, sin producir signos ni síntomas de infección. La colonización requiere que S aureus se adhiera a la superficie (Krishna and Miller, 2011) y esto lo puede hacer mediante la Proteína A de unión a la fibronectina (FnbpA), 15 resistencia en S. aureus, es la protección ribosomal por las proteínas Tet(M) o Tet(O) “factor-like” de elongación, ésta confiere resistencia a la inhibición de la síntesis de proteínas, promoviendo la liberación del antibiótico desde su sitio inhibitorio en el ribosoma. El otro mecanismo proporciona dicha resistencia por eflujo activo a las proteínas TetK o TetL, codificadas por los genes móviles Tet (Levy et al., 1999). Ambos mecanismos pueden ser inducidos por bajas concentraciones de Tetraciclina (Trzcinski et al., 2000; Connell et al., 2003). 2.1.4.f. La resistencia a los Aminoglicósidos Estos antibióticos de amplio espectro (McCallum et al., 2010), aumentan el ratio de error de la síntesis de proteínas en el ribosoma, provocando errores en la lectura y/o dificultando el paso de translocación. El resultado es la alteración de la pared de la bacteria por la incorporación de proteínas defectuosas. En una segunda fase, esto favorecerá el aumento de la entrada del antibiótico en la bacteria (Vakulenko and Mobasthery, 2003). Todos los Aminoglicósidos se unen selectivamente a la subunidad ribosomal 30S, pero las interacciones de cada uno de ellos es diferente. La resistencia a estos antibióticos ocurre, principalmente, por modificación enzimática por O- fosforilación, N-acetilacción u O-nucleotidilación, catalizadas por fosfotransferasas, acetiltransferasas o nucleotidiltransferasas, conocidas como Enzimas modificadoras de Aminoglicósidos (siglas en inglés AME). Están codificadas por diferentes genes localizados en transposones u otros elementos móviles, lo que favorece su amplia diseminación entre las bacterias Gram positivas y negativas. 2.1.4.g. La resistencia a las Fluoroquinolonas Las Fluoroquinolonas tienen como “blanco”, en S. aureus, a la topoisomerasa IV (grlA, grlB) que es una enzima esencial necesaria para la decatenación o interunión de cromosomas. Además una girasa relacionada (gyrA, gyrB) altera el ADN dificultando la replicación (McCallun et al., 2010). En bajas concentraciones las Fluoroquinolonas son mutagénicas y aumentan el ratio de mutación bacteriana que actúa en el sistema de reparación SOS del ADN. Es importante el hecho de que concentraciones subinhibidoras de Fluoroquinolonas aumentan la resistencia a β-lactámicos (Tattevin et al., 2009). El principal modo de resistencia a Fluoroquinolonas son las mutaciones del grlAB y gyrB. El segundo modo de resistencia es el aumento del eflujo del antibiótico por la familia Nor de bombas de eflujo de diferentes medicamentos. Algunos de estos, como el NorA no solo inducen resistencia a la Norfloxacina, sino que también la produce frente a β-lactámicos, Tetraciclinas, Cloranfenicol y otros compuestos químicos. Esto mismo puede ocurrir con otros miembros de la familia (Mesak et al., 2008). 16 2.2. Importancia de los SARM en la especie humana En la especie humana, los Staphylococcus aureus resistentes a la Meticilina (SARM) son uno de los patógenos nosocomiales más importantes. Se trata de un patógeno virulento, capaz por sí solo de aumentar la incidencia global de infección estafilocócica (Coia et al., 2006). Además, las infecciones invasoras por SARM se asocian con mayor mortalidad y coste económico que las causadas por S. aureus sensibles (Cosgrove et al., 2003; Cosgrove and Carmeli, 2003). Por todo ello, la vigilancia y el control de SARM debe ser una prioridad en todos los centros hospitalarios. La vigilancia epidemiológica es un componente crítico de cualquier programa de control de SARM. Los pasos clave son la recogida sistemática de la información, su análisis e interpretación y la difusión a quienes están al cuidado de los pacientes. Los casos nuevos se detectan a partir del laboratorio de Microbiología. Además, el laboratorio debe, en la medida de sus posibilidades, establecer un sistema para congelar los aislados de SARM que se consideren representativos para la eventual realización de estudios moleculares (Rodríguez-Baño et al., 2006). En España, los primeros brotes de SARM se comunicaron a finales de la década de 1980 (Pérez et al., 1998). Diversos estudios de prevalencia multicéntricos han mostrado aumentos en el porcentaje de resistencia a Meticilina en S. aureus a lo largo de la década de 1990 hasta alcanzar cifras superiores al 30% (Cuevas et al., 2004; Asensio et al., 2006). Los datos del European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) han mostrado cifras de entre el 23 y el 28% (Oteo et al., 2004). En las unidades de cuidados intensivos (UCI) el porcentaje de SARM entre 1997 y 2003 fue del 30,5% (Álvarez et al., 2006). En una encuesta en varios centros hospitalarios españoles, se obtuvo una incidencia media de 0,88 casos de infección/colonización por SARM por cada 100 ingresos (mediana de 0,45) (Rodríguez-Baño et al., 2006), y se han encontrado cifras indicativas de elevada transmisión (Wenzel et al., 1998) en más del 50% de hospitales. En cualquier caso, la situación en los distintos hospitales es heterogénea. El aumento progresivo en la frecuencia de infecciones por SARM a la que asistimos durante los años finales del siglo XX podría estar dando paso a una situación de estabilización en meseta, probablemente asociada al desarrollo de programas de control y a la sustitución de determinados clones anteriormente predominantes (como el denominado clon ibérico (Domínguez et al., 1994) por otros (Vindel et al., 2006). En el informe elaborado por el ECDC (European Centre for Diseases prevention and Control) en el 2010, que recoge la participación de la mayoría de países europeos que informan sobre la resistencia a los antimicrobianos de los SARM aislados de importancia en Salud Pública en centros hospitalarios, los países Nórdicos muestran la menor prevalencia (<1% a <5%), Centro-Europa tiene países con valores desde el 5% a 17 <25%, y los países del Sur muestran del 25 a <50%, entre los que España se encuentra en el límite inferior con un 25.3%, y Portugal supera el 50%. En Reino Unido se observó un importante aumento de infecciones por SARM que fueron del 2% a >40% entre 1990 y primeros años del 2000, con valores medios de bacteriemia entre 0,10 a 0,19 casos por cada 1000 camas ocupadas; y en Irlanda, la prevalencia de SARM por cada 100.000 habitantes, estaba comprendida entre el 11,4 a 14,0, según la zona geográfica (Norte, Sur), y las infecciones invasivas se encontraban entre el 5 al 10%. En otros países Europeos como los Escandinavos, Italia y España, también se ha observado el incremento de la bacteriemia por SARM entre 1999 y 2002 (Tiemersma et al., 2004: Coia et al., 2006). La bacteriemia con cepas SARM puede tener como consecuencia la endocarditis, y esto la diferencia de la infección con cepas SASM. Dentro de las neumonías de origen hospitalario y neumonías asociadas a ventilación, se ha encontrado que las cepas SARM son la causa en el 20-40% de ellas, principalmente en personas seniles y débiles sometidas a ventilación prolongada (Cosgrove et al., 2003; 14). En un estudio realizado en Detroit (USA) de evaluación de la morbilidad, mortalidad y costes atribuibles a bacteriemia por SARM, se encontraba que los casos de bacteriemia por cepas SARM aumentan la estancia en el hospital 1,5 veces (19,1 día vs. 14,2 días) y el coste de hospitalización 2 veces (21.577 $ vs. 11.668$), respecto a los producidos por cepas SASM. El retraso en acertar con el tratamiento adecuado que se atribuye a las cepas SARM, era un factor predictivo de la mortalidad. (Lodisea and McKinnon, 2005) La epidemiología de SARM está cambiando. Además de las sustituciones clonales comentadas, un porcentaje importante de casos ocurren ahora en pacientes no hospitalizados que han tenido un estrecho contacto previo con el sistema sanitario (Rodríguez-Baño, et al., 2004), lo que los diferencia de las infecciones estrictamente comunitarias causadas por nuevos clones de SARM (Naimi et al., 2003). Éstas ya han sido descritas en España (Broseta et al., 2006), y aunque son aún muy poco frecuentes, sus implicaciones clínicas y epidemiológicas obligan a establecer sistemas de detección adecuados. La mayoría de las infecciones por SARM de la Comunidad suelen ser localizadas en piel y tejidos blandos, sin embargo, se ha detectado que la fascitis necrotizante y la neumonía necrotizante a consecuencia de SARM de la Comunidad, pueden llegar a valores del 20 y 75% de mortalidad, respectivamente (Li et al., 2011) A pesar de que existen numerosas guías con recomendaciones para el control de SARM, una encuesta realizada en el año 2003 en 61 hospitales españoles mostró una importante heterogeneidad en la aplicación de medidas de control (Rodríguez-Baño et al., 2006). Unas medidas de control básicas serían: el cumplimiento de las normas elementales de higiene de manos, uso racional de guantes y uso de mascarillas ante riesgo de salpicaduras de líquidos biológicos en el cuidado de todos los pacientes. La higiene de manos es uno de los pilares fundamentales del control de la infección nosocomial y de los patógenos multirresistentes. La recomendación unánime y evidenciada es el frotado 18 de manos con soluciones alcohólicas ya que ofrecen, con respecto al lavado con jabones antisépticos, mayor eficacia en la reducción de la flora bacteriana transitoria, mayor facilidad para su cumplimiento y mejor tolerancia. Debe recordarse que cuando las manos están visiblemente sucias debe realizarse lavado de manos con un jabón antiséptico (Rodríguez-Baño et al., 2006) 2.3. Modos de adquisición de la infección por SARM: HA-MRSA/ HCA-MRSA/ CA-MRSA/ LA-MRSA Las infecciones hospitalarias de SARM (HA-MRSA, siglas en inglés) son de tipo nosocomial y se conocen desde hace décadas. Se considera como HA-MRSA cuando las infecciones causadas por estos microrganismos es probable que se adquirieran en el hospital y surgen por lo menos 48 horas después del ingreso de los pacientes, que además, tienen factores de riesgo particulares tales como la estancia prolongada en el hospital, la atención en unidades de cuidados intensivos (UCI), el tratamiento prolongado con antibióticos, las intervenciones quirúrgicas, y / o el estrecho contacto con personas SARM-positivas (EMEA, 2009; Stefani et al., 2012). En otros casos, la adquisición de la infección está relacionada con los cuidados sanitarios (HCA-MRSA). La bacteria se aisla en un paciente no ingresado o durante las primeras 48 h de ingreso si se cumple alguna de las siguientes condiciones en el último año: ha estado ingresado más de 48 h en un hospital o centro sociosanitario (como residencias y hogares de ancianos, centros que asisten a diálisis y/o centros para control de la diabetes), ha recibido atención domiciliaria especializada, diálisis o tratamiento en hospital de día, ha sido intervenido quirúrgicamente o se le ha realizado algún procedimiento invasivo (Rodríguez-Baño et al., 2006; Bartels et al., 2008). Otras infecciones por SARM se asocian a la Comunidad (CA-MRSA), se dan en pacientes no ingresados o en las primeras 48 h de ingreso, sin que se dé ninguna de las circunstancias anteriores. Los factores de riesgo de estas infecciones serían: contacto estrecho en la realización de deportes, escuelas, instalaciones militares, prisiones, etc. Hay una escasez de datos de calidad que investiguen la infección y/o tasas de portadores humanos en la Comunidad, pero esta parece variar considerablemente con la región geográfica (EFSA, 2009). Desde hace algunos años, se ha asociado también a la ganadería (LA-MRSA), se trata de la transmisión de SARM y se refiere principalmente a la expansión clonal de ciertas cepas que colonizan las distintas especies animales, incluyendo los caballos, que pueden causar infecciones en las personas. Además, los animales de compañía y los caballos pueden ser colonizados por mayor variedad de cepas, debido a su estrecho contacto con personas. Así, estas especies 19 pueden actuar como portadores de SARM procedentes de seres humanos (se le ha dado el nombre de "Humanosis") (Morgan, 2008). Durante el período 1970-2000, el SARM se ha aislado de los animales de forma esporádica, en particular en vacas, animales de compañía y caballos. Con la excepción de algunos aislamientos equinos, la naturaleza de estos casos sugiere un origen humano y no se ha informado de epidemias (Leonard and Markey, 2008). Hasta finales del siglo 20, tanto la comunidad científica como los responsables políticos pensaban que el SARM de la medicina humana no tenía nada que ver con la cría de animales, sino que se trataba de un problema basado únicamente en el uso de antimicrobianos en la medicina humana. La situación ha cambiado, con un aumento del número de informes de LA-MRSA en animales. Se ha aislado en casi todas las especies domésticas, perros, gatos, ganado ovino, cerdos y pollos, además de los bóvidos, en los que S. aureus es causa frecuente de mamitis. También se ha descrito la transmisión entre humanos y animales (Leonard and Markey, 2008). Se ha detectado hasta un 14% de los pacientes caninos y equinos infectados con SARM en hospitales veterinarios universitarios. Si bien el aislamiento de S. aureus en perros y gatos es menos frecuente que en équidos. A veces son linajes genotípicos específicos que circulan entre las especies animales, (Cuny et al., 2006; Voss et al., 2005), pero en muchas ocasiones están asociados a linajes genotípicos de origen humano (Weese, 2008). 2.4. El estado de portador de S. aureus Teóricamente, cualquier parte del cuerpo podría ser colonizada por S. aureus, sin embargo, la porción anterior de las fosas nasales suele ser el lugar más frecuente en el que se establece en un portador (Aly and Levit, 1987; Cole et al., 2001). Los mecanismos que permiten esto son multifactoriales y están relacionados con las toxinas bacterianas y las proteínas de su pared (Weidenmaier et al., 2004), también con factores ambientales y factores de susceptibilidad del hospedador (inmunosupresión, enfermedades pre-existentes…) (Bogaert et al., 2004). De todos modos, la importancia clínica del estado de portador en la faringe o en el periné no ha sido tan investigado. Los primeros datos de asociación entre el estado de portador nasal y la enfermedad se informó en 1931, en un estudio de factores predisponentes de la furunculosis. Además la administración de tratamiento antiestafilococos en esas localizaciones previene el desarrollo de episodios infecciosos (Perl et al., 2002). También se ha demostrado que la mayoría de las infecciones nosocomiales por S. aureus son de origen endógeno (las cepas nasales y las de la infección son idénticas) (Von Eiff et al., 2001). El estado de portador nasal aumenta en 3 veces el riesgo de desarrollar autoinfección nosocomial (Wertheim et al., 2004a). 20 Frecuentemente, la piel es colonizada por S. aureus en los portadores en fosas nasales, y la transmisión suele ocurrir a través de las manos. Se ha demostrado que la eliminación del estado de portador nasal mediante Mupirocina elimina el estado de portador en las manos (Reagan et al., 1991). En el personal del hospital y en pacientes externos se ha valorado aproximadamente un 6% y un 2% portadores nasales de SARM, respectivamente (Cesur and Cokca, 2004). El estado de portador de S. aureus en fosas nasales afecta a aproximadamente un 20% de la población y se ha identificado como factor de riesgo para el desarrollo de la patogénesis de las infecciones adquiridas en la Comunidad y nosocomiales (Kluytmans et al., 1997; Tiemersma et al., 2004; Travis et al., 1999; von Eiff et al., 2001). Los factores que determinan el ser portador o no son bien conocidos (apartado I.4 de la introducción). Wherteim et al. (2004b) estudiaban la importancia del estado de portador nasal de S. aureus y dedujeron que los portadores nasales persistentes parecían estar protegidos de una evolución hacia la bacteriemia en el curso de la enfermedad. La prevalencia de portadores de S. aureus es variable, Kluytmans et al. (1997) detectaron una prevalencia del 37,2%, y en personas sanas se encontraron tres patrones de portadores. Alrededor de un 20% eran portadores persistentes, un 60% eran intermitentes y otro 20% eran portadores ocasionales. Estos valores aumentaban considerablemente cuando se trataba de personas sometidas a tratamiento (hemodiálisis, drogadictos, etc.) o infectados por HIV (Kluytmans et al., 1997). Sin embargo en un estudio más reciente en EEUU (Graham et al., 2006), se halló un 31,6% de las personas colonizadas con S. aureus de los que un 0,88% eran SARM. La prevalencia de SARM entre los infectados con S. aureus en un estudio en el que intervenían 26 países Europeos desde 1999 a 2002 (Tiemersma et al., 2004) variaba desde <1% en países del Norte de Europa a >40% en países del Sur y Oeste Europeo. En Dinamarca disminuyó de un 15% en 1971 a un 0,2% en 1984, y en Países Bajos, mediante un programa de control (“Buscar y destruir”), quedaron valores de <1%, y solo un 0,03% de los pacientes sin riesgo admitidos en el hospital eran portadores nasales de SARM (Wertheim et al., 2004b). 2.5. Implicaciones zoonóticas Las personas en contacto directo con animales SARM-positivos tienen un mayor riesgo de llevar las mismas cepas de SARM que ellos. Esto se ha documentado en hospitales veterinarios de pequeños animales, y en hospitales y entornos de ganado equino (Morgan, 2008; Weese, 2008). Se han producido casos clínicos graves de LA-MRSA en los seres humanos, incluyendo un reciente brote en un hospital holandés (Declercq et al., 2008; Wulf et al., 2008a). Este fenómeno emergente representa un peligro que exige un enfoque de gestión bilateral, teniendo en cuenta a los animales y a los seres humanos como fuentes potenciales de SARM. 21 Los ganaderos de ganado porcino y bovino, son considerados un grupo de riesgo definido, que se detectan en la admisión en los hospitales. En un estudio (Wulf et al., 2008a) realizado con 1721 trabajadores de centros de salud en Holanda (4 Hospitales generales y un Hospital Universitario), un 4,4% manifestaban contacto directo o indirecto con cerdos y/o terneros y un 8,8% tenían contacto con otros animales de abasto, los que no tenían contacto con animales de abasto formaban el grupo control. SARM se encontró en fosas nasales y/o faringe en el 1,7% de los que contactaban con cerdos y/o terneros y un 0,17% en el grupo control, pero esas diferencias no eran estadísticamente significativas. No se encontraron portadores entre los que contactaban con otros animales de abasto. En otro estudio (Wulf et al., 2008b) doscientos setenta y dos asistentes a una conferencia internacional sobre salud en ganado porcino fueron analizados en fosas nasales y faringe en Holanda. Treinta y cuatro participantes de 9 países, portaban SARM. El uso de máscaras, guantes y batas no eran medidas protectoras frente al estado de portador. La mayoría de las cepas pertenecían al MLST398, típico porcino en cerdos, granjeros porcinos y veterinarios en Holanda. Deducen que la transmisión de SARM a partir de cerdos es un problema internacional, y consideran al cerdo un reservorio para la transmisión en la Comunidad. El riesgo ocupacional para la colonización por LA-MRSA a través del contacto con ganado porcino también se ha demostrado en Bélgica (Denis et al., 2008), Alemania (Meemken et al., 2008), Dinamarca (Wulf et al., 2008b) y España (Lozano et al., 2011). Cabe destacar que en dos de los estudios, y en contraste con las conclusiones extraídas de un estudio realizado en Canadá en las unidades de caballos (Anderson et al., 2008), las medidas de higiene actuales (por ejemplo, usar máscara en el manejo) no era suficiente protección para el portador de SARM (Denis et al., 2008; Wulf et al., 2008b). Los veterinarios parecen tener menor riesgo de SARM, como se ha demostrado en Dinamarca (Moodley et al., 2008). En los Países Bajos y en Dinamarca se ha detectado un aumento de las infecciones humanas con LA-MRSA después de la primera descripción en el 2004 (Voss et al., 2005; van Rijen et al., 2008; Lewis et al., 2008). Ha habido infecciones graves como una infección agresiva de tejidos blandos de una herida por mordedura de cerdo (Declercq et al., 2008) y endocarditis (Ekkelenkamp et al., 2006), y un brote en una sala quirúrgica de un hospital holandés (Wulf et al., 2008a). 22 2.6. Infección/ colonización con SARM en caballos 2.6.1. Infección por S. aureus y SARM Es muy probable que S. aureus colonice las mucosas y la piel de los animales de un modo similar a lo que ocurre en la especie humana (Weese and van Duijkeren, 2010; Bitterman et al., 2010). En un estudio (Van Eede et al., 2009) han detectado SARM en un 40% de los caballos sanos que residían en un hospital universitario un mínimo de 6 meses y que fueron separados entre ellos al menos durante 1 mes. La mayor proporción se encontró en fosas nasales, y en diferentes localizaciones de la piel en un 30%. Se analizaron diferentes localizaciones en la piel (lateral del cuello, cruz, grupa, periné, punto medio del carpo izquierdo, cara posterior del casco, flanco izquierdo y muslo izquierdo), en todas ellas se aisló SARM al menos una vez. Las fosas nasales fueron las muestras más frecuentemente infectadas, mientras que en la piel, el carpo fue el más frecuente (16,7%), seguido por la grupa (13,3%). La probabilidad de encontrar un resultado positivo en fosas nasales era de un 83,3%, pero si se combinaban fosas nasales y piel aumentaba a un 91,7%, aunque no ocurre si es la piel de la grupa, flanco o casco. En los caballos hospitalizados en salas de cirugía se aisló con mayor frecuencia (60%), seguido por los de las salas de medicina interna (55,6%). Los informes iniciales de la infección por SARM en los caballos solían ser infecciones esporádicas o pequeños brotes, principalmente asociados con los hospitales veterinarios, y se pensaba que los caballos eran infectados o colonizados directamente a partir de las personas. Posteriormente, ha habido informes sobre infecciones por SAMR a nivel internacional, tanto en relación con caballos en hospitales veterinarios como con su origen en la Comunidad. Las infecciones clínicas por SARM pueden ser esporádicas o en brotes, y suelen presentar una amplia variedad de cuadros con carácter oportunista. En un estudio realizado con 115 caballos en Canadá y EEUU entre 2000 y 2006 (Anderson et al., 2008) en el que el rango de edad de los animales infectados con SARM iba de cero (nacidos en el hospital) a 31 años, las infecciones con HA-MRSA representaban el 50.9% y las CA-MRSA el 49.1%. En los resultados de dicho estudio, las incisiones quirúrgicas representaban el lugar más común de las infecciones con SARM. La infección de la incisión quirúrgica se encontró asociada a HA-MRSA (58%), lo cual no era sorprendente ya que los animales hospitalizados es más probable que hayan sido sometidos a una cirugía que los caballos de la Comunidad; las infecciones del catéter i.v. también fueron frecuentes en caballos del hospital (16%). 23 Se detectó también alta frecuencia de infección de la incisión por CA-MRSA (17.9%), y se concluyó que esta infección debe ser considerada en la Comunidad tras procedimientos quirúrgicos de rutina. En los caballos con infecciones de CA-MRSA, las infecciones mas frecuentes fueron las de la piel y tejidos blandos (29%), las infecciones de las articulaciones fueron tan frecuentes como las infecciones de la incisión (17.9%) y las infecciones de los huesos y tendones representaron el 14%. Más de 2/3 (73%) de todas las infecciones con SARM de las articulaciones ocurrieron en caballos de edad madura. La artritis séptica es una gran preocupación debido a la posibilidad de consecuencias graves o potencialmente mortales incluso con tratamiento intensivo. Estas infecciones podrían haber sido de origen iatrogénico durante la realización de la artrocentesis o la inyección articular, pero en este estudio no se pudo concluir de forma objetiva. Una tercera parte (3/9) de los caballos con infección en el lugar del catéter i.v. fueron sometidos a eutanasia, sin embargo sólo uno de esos caballos tenía SARM en sangre. Se consideró que estos resultados podían ser consecuencia de que en los caballos en estados más graves es más probable que se emplee la vía i.v., además son menos capaces de responder a las infecciones, y esta era la razón por la que se asociaba a menor supervivencia (Anderson et al., 2008). También se ha informado de una variedad de infecciones que incluyen neumonía, metritis, onfaloflebitis, sinusitis, bacteriemia, infección por catéter intravenoso, osteomielitis, tenosinovitis, metritis y mastitis (Cuny et al., 2006; Middleton et al., 2005; Weese et al., 2005, Anderson et al., 2008). La gravedad de la infección puede ser muy variable, desde leves y superficiales a formas agresivas que ponen en riesgo la vida del animal. No hay evidencia de que las infecciones por SARM tengan una diferente presentación clínica que las infecciones por SASM (S. aureus Sensible a Meticilina), o de otro tipo oportunistas (Anderson et al., 2008). Se ha investigado la prevalencia de colonización por SARM en diferentes poblaciones de caballos, dando tasas de 0 a 10,9% en los caballos de la Comunidad y tras la admisión en hospitales veterinarios, y es probable que sea endémico en la población de caballos de muchas regiones. En las explotaciones equinas se han observado brotes que podrían llegar a tasas de colonización del 43% en algunas de ellas (Weese and Rousseau, 2005). Los conductos nasales parecen ser el lugar primario de la colonización, aunque no se ha hecho ninguna comparación objetiva de las diferentes localizaciones corporales. Si bien la mayoría de los caballos colonizados no desarrollan infecciones clínicas, el estar colonizado en el momento de la admisión en el hospital, sí se ha considerado un factor de riesgo para el desarrollo de posterior infección clínica por SARM en los caballos hospitalizados (Weese et al., 2006c). 24 La comparación de los informes de diferentes áreas geográficas puede ser obstaculizada por el uso de sistemas de tipado y nomenclaturas diferentes, ya que no hay un sistema estándar para hacerlo, y las pruebas de las que se dispone tienen ventajas y limitaciones. EL PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis), es el más usado por ser reproducible, estandarizado y altamente discriminatorio. Sin embargo, el análisis puede ser subjetivo, algunas cepas no son tipificables por este método, y es exigente técnicamente con las limitaciones. El Spa-typing, que analiza la secuencia de la región X del gen de la proteína A, es un método estandarizado, rápido y objetivo, que es susceptible de mayor rendimiento y está siendo más usado. El test de tipado de la Secuencia de multilocus (MLST) analiza la secuencia de los siete genes más importantes. Es estandarizado y objetivo, sin embargo, es menos discriminatorio que la PFGE o spa-typing, y es mejor para comparaciones temporales o geográficas más amplias. La agrupación de las secuencias relacionadas de los tipos (STs) en complejos clonales (CCs) puede ser útil para un análisis más amplio. Además, otros métodos como el tipado de la cassette cromosómica estafilocócica (SCCmectyping) y la detección de los genes de la Leucocidina Panton-Valentine (LPV), también se utilizan algunas veces como pruebas complementarias. Muchos de los informes iniciales de SARM en los caballos involucraban el clon ST8 clasificado por PFGE como Canadá SARM-5 o USA500 (Anderson and Weese, 2007; O'Mahony et al., 2005; Weese et al., 2005). Este es un clon negativo a la LPV, el cual posee SCCmecIV, que es un clon epidémico humano, sin embargo, sólo representa un pequeño porcentaje de infecciones humanas. El predominio de este clon en los caballos y el personal de caballos en algunas regiones, sugiere que este clon de origen humano se haya adaptado a caballos. Cepas relacionadas, incluyendo ST8 y ST254, también se han identificado en los caballos (Cuny et al., 2006; Moodley et al., 2008), lo que sugiere que las cepas relacionadas con el complejos clonal 8 podrían haberse adaptado al caballo. Existen varios informes de la colonización e infección con secuencia de tipo ST398 en los caballos en Europa (Van den Eede et al., 2009; Witte et al., 2007; Lozano et al., 2011) y Canadá (Tokateloff et al., 2009), incluyendo un estudio que identificó la colonización con SARM ST398 en el 10,9% de los caballos admitidos en un Hospital universitario belga (Van den Eede et al., 2009). Teniendo en cuenta la prevalencia de ST398 en animales de abasto, es razonable sospechar que el ST398 haya pasado al caballo de forma directa o indirecta de animales destinados al consumo. No se sabe si este es un problema emergente en caballos. Al igual que en el perro y el gato, la colonización de caballos suele ser transitoria en la mayoría de los casos, con descolonización natural si se previene la reinfección (Weese and Rousseau, 2005). El primer informe sobre el aislamiento de SARM en caballos fue publicado en 1996, pero ya en Japón se había aislado en 13 yeguas con mastitis entre 1989 y 1991. La 31 4.1.4. Identificación de las cepas de S. aureus Las colonias de las muestras crecidas en medio sólidos son identificadas por su morfología (Imagen 1) y por la presencia de hemólisis (Imagen 2), siguiendo las recomendaciones estándar de aislamiento (Bes and Brun, 2002; Pottumarthy et al., 2004; Durdik et al., 2010). En el caso de las muestras crecidas en BHI, se comprueba con la tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivos característicos. Tanto las colonias típicas crecidas en Agar Sangre como los crecimientos en BHI-10% NaCl son subcultivados en Medio Manitol Salino (Manitol Salt Agar; OXOID, ref.: CM0085), en el cual se comprobará la fermentación del manitol típica de S. aureus por la coloración amarilla que adquiere el medio inicialmente rojizo (Imágenes 3 y 4). A las colonias características crecidas en medio sólido (ya sea en Agar Sangre o en Manitol salino), se les realiza las pruebas de la Catalasa (debe ser positiva en estafilococos) y la Citocromo-Oxidasa (debe ser negativa en estafilococos). Las colonias que cumplen con estas condiciones son sometidas a la prueba de la Coagulasa (debe ser positiva en S. aureus y S. intermedius). Imagen 3: colonias de S. aureus crecidas en Agar Manitol Salino en el que se observa su brillo y pigmentación amarillenta Imagen 2: β-hemolisis observada en las colonias de S. aureus crecidas en Agar Sangre de cordero Imagen 4: comparación entre dos cepas de Staphylococcus, el de la izquierda es S .aureus con reacción positiva y el de la derecha un Staphylococcus spp, con reacción negativa Imagen 1: colonias de S. aureus de 1-3 mm, brillantes, ligeramente convexas, aunque aún no han desarrollado la pigmentación amarilla, crecidas en Agar Sangre de Cordero 32 La prueba de la -galactosidasa, es usada para diferenciar S. aureus (negativa), del grupo S. intermedius (positiva) (Bes and Brun, 2002; Pottumarthy et al., 2004; Durdik et al., 2010). La aglutinación al látex (Imagen 5) para la detección factor aglutinante, la proteína A y polisacáridos capsulares de la superficie de S. aureus, permite confirmar esta bacteria. (Pastorex Staph-Plus; BIORAD. Rf: 56356). Cuando se encuentra discordancia en los resultados de estas pruebas, se pasa a realizar pruebas complementarias como la producción de acetoína (Voges-Proskauer), asimilación de carbohidratos en caldo y/o la tira API-Staph (Imagen 6) (Biomerieux, Ref. 20500 API STAPH) (Bes and Brun, 2002; Chanchaithong and Prapasarakul, 2011; Ishii et al., 2006). Imagen 5: Kit Pastorex Staph-Plus para la detección de la aglutinación al látex Imagen 6: Tira API-Staph utilizada para la identificación de una cepa de S. aureus 33 4.1.5. RESUMEN de la identificación de S. aureus Muestra Lesión (animal): Agar Sangre: o Incubación 18-24 h a 35-37ºC: colonias 1-3 mm, brillantes, ligeramente convexas, generalmente con desarrollo de pigmento amarillo en S. aureus y blanco en S. intermedius. o Tinción Gram (cocos G+). o Hemolisis (β-hemolisis en S. aureus, a veces no se observa). Muestras de fosas nasales (animales y personas), y espacios interdigitales: BHI + 10%NaCl: o Incubación 18-24 h a 35º/37ºC: turbidez del medio. o Tinción Gram (cocos G+). Colonias en Agar Sangre/ Asa de BHI: Agar Manitol Salino: o Incubación 18-24 h/35-37ºC: Coloración amarilla del medio (el 80% de los S. aureus presenta esta coloración). Todas las colonias: Catalasa (+) Oxidasa (-) Coagulasa (+) Prueba de la -galactosidasa: diferencia S. intermedius (+ ) de S. aureus (-) Pastorex Staph Plus: S. aureus (+) Cepas dudosas: otras pruebas bioquímicas (producción de acetoína (Voges-Proskauer), asimilación de carbohidratos en caldo y/o API-Staph). 34 4.2. Fenotipo de resistencia a los antibióticos 4.2.1. Detección de cepas Meticilin-Resistentes de S. aureus (SARM/ MRSA) Siguiendo las recomendaciones de la EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System; www.earss.rivm.nl), y el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institut) (CLSI, 2012), en algunos casos, la demostración de la resistencia a la Meticilina se puede demostrar al enfrentar la cepa con discos de Oxacilina y/o Cefoxitina por el método de difusión en disco (método de difusión de Kirby-Bauer). Se utiliza Agar Müller Hinton (Scharlau, Rf: 01.136) que es inoculado con una suspensión de la cepa ajustada al valor 0,5 en la escala de Mac-Farland. Los discos de Cefoxitina de 30 g. y Oxacilina de 1 g, son depositados en la superficie del cultivo confluyente. Los resultados son interpretados tras 18-24 h de cultivo a 33- 35-37ºC con los diámetros recomendados por el CLSI (2012): Tabla 1: tamaño de los halos del antibiograma para diferenciar las cepas de S. aureus Resistentes (R), Intermedias (I) y Sensibles (S), a Oxacilina y Cefoxitina. Difusión en disco S I R Oxacilina 1 g ≥ 13 11-12 ≤10 Cefoxitina 30 g ≥ 22 - ≤21 4.2.2. Test de sensibilidad a otros antibióticos de importancia Clínica Además de la sensibilidad a la Meticilina, todas las cepas son evaluadas (método de difusión de Kirby-Bauer) frente a otros antibióticos de importancia clínica en Medicina Humana y Animal: Ácido Fusídico, Ciprofloxacina, Clindamicina, Cloranfenicol, Eritromicina, Estreptomicina, Gentamicina, Lincomicina, Mupirocina, Penicilina, Teicoplanina, Tetraciclina, Tobramicina, Trimethoprim-Sulfametoxazol y Vancomicina; interpretados con los criterios propuestos por el CLSI y la Societé Française de Microbiology (Imagen 7). 35 4.2.3. Mínima Dosis Inhibitoria Algunas de las resistencias a antibióticos observadas por el test de difusión en disco, es necesario corroborarlas con métodos complementarios (CLSI-2012). Este es el caso de la Penicilina, Oxacilina y Vancomicina, que hacen referencia a la detección de la resistencia a la Meticilina, y en consecuencia la demostración de existencia de cepas SARM o SASM (ORSA / OSSA), y a la Vancomicina, que hace referencia a cepas VISA o VRSA. El método laboratorial más usado es el de la demostración de la Mínima Dosis Inhibitoria (minimum inhibitory concentration, MIC, siglas en inglés), que clásicamente se realizaba mediante diluciones seriadas de los antibióticos y que actualmente es sustituida por tiras que contienen las dosis diluidas de antibióticos impregnadas en pequeñas muescas de una tira de material plastificado. La MIC de una bacteria se define como la mínima cantidad de un antibiótico que es capaz de inhibir su crecimiento en un determinado tiempo, dependiendo de la bacteria que se trate. Los métodos de demostración de la MIC por medio de tiras, han sido convalidados por el método clásico de diluciones seriadas en tubo y el CLSI admite su uso en sustitución del método clásico. En este trabajo se han utilizado las tiras “Oxoid M.I.C.EvaluatorTM (M.I.C.E.TM), que han sido evaluadas por diferentes laboratorios independientes y se han convalidado y admitido por la “British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC)” (Dr. David Livermore, Director Antibiotic Resistance Monitoring and Reference Laboratory, Colindale, UK). Las tiras contienen el antibiótico estabilizado en un polímero y cubre 15 diluciones en base 2, con un rango entre 256 μg/ml – 0.015 μg/ml (hay otras diluciones para situaciones específicas). Imagen 7: Antibiograma realizado a 4 cepas de S. aureus por el método de difusión en disco frente a la Teicoplanina 36 La tira se coloca sobre el agar ya inoculado con la dosis bacteriana que conviene según la bacteria en estudio. En el caso de S. aureus, se utiliza el mismo método que en las pruebas de difusión en disco, es decir, un cultivo confluyente a partir de una dilución de la bacteria equivalente a 0,5 en la escala de McFarland (CLSI). Posteriormente son incubadas a 35 ± 2ºC durante 18 a 24 horas (Imagen 8). La interpretación (siguiendo las recomendaciones provistas por la empresa OXOID), se realiza a simple vista con un foco de luz indirecta sobre fondo negro (cuando se utiliza como base Agar Müller Hinton), en el caso de observar doble halo o crecimiento de colonias individuales en el espacio inhibido se aplican las directrices de la casa productora: - Cuando se trata de un antibiótico bacteriostático, si el borde del halo de inhibición es irregular (no liso), se lee como el 80% de inhibición. - Cuando se trata de un antibiótico bactericida, con el borde del halo de inhibición liso, lectura se hace en el punto en el que contacta con la tira. - Cuando el halo es muy estrecho, se lee el punto más bajo en el que toca la tira. - Cuando existe un punto de contacto en un lado de la tira, y otro diferente en el lado contrario, se lee el punto de valor más alto. La tira tiene áreas blancas en las que se observa la dilución del antibiótico intercaladas con áreas negras de dimensiones similares. Si el inicio de la inhibición tiene lugar en la zona blanca, esa es la dilución que inhibe el crecimiento. En el caso de que el punto de inhibición coincida con la zona negra, se debe interpretar como una dilución intermedia entre el valor superior e inferior. La interpretación clínica (con el fin de poner en marcha un tratamiento antibiótico, que no es el objeto de este estudio), puede tener una lectura superior que la interpretación técnica. En la Tabla 2, se indican los valores que acepta el CLSI (2012), para interpretar la sensibilidad y resistencia de S. aureus frente a la Penicilina, Oxacilina y Vancomicina. Imagen 8: MIC frente a Vancomicina y Oxacilina de una cepa de S. aureus 37 Tabla 2: Recomendaciones del CLSI (2012), en la interpretación de la MIC para S. aureus. MIC S MIC I MIC R Penicilina ≤0,12 - ≥0,25 Oxacilina ≤2 - ≥4 Vancomicina ≤2 4-8 ≥16 MIC: minimum inhibitory concentration; I: Intermedio; R: Resistencia; S: Sensibilidad 4.3. Análisis observacional de los datos recopilados y los resultados obtenidos Los datos que entran en el estudio han sido recogidos mediante una ficha expresamente elaborada para ello, tanto para los animales como para las personas muestreadas (Anexo). Estos datos fueron introducidos en la base de datos del programa informático Excel . A partir de la información recopilada se ha realizado un análisis estadístico de tipo descriptivo en el que se determina la distribución de frecuencias para el caso de variables discontinuas (proporciones). Para la realización de estas determinaciones se utilizó el programa informático Epi Info 2000 (www//cdc.gob). 38 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. Cepas de S. aureus aisladas En el total de individuos (équidos y personas) que han intervenido en el estudio (Tabla 3), se han aislado 12 cepas de S. aureus y no se ha aislado ninguna cepa del grupo S. intermedius. El grupo Staphylococcus intermedius, se considera habitual en las especies animales y forma parte de la microflora normal de la piel y mucosas de perros, gatos caballos, cabras, visones, zorros, mapaches, palomas, periquitos... (Weese and van Duijkeren, 2010). Sin embargo, los datos que se conocen parecen indicar que en los équidos y las personas es una especie bacteriana menos aislada, de modo que no resulta extraño que en los 35 caballos estudiados no se haya producido ningún aislamiento, al igual que se ha observado en estudios realizados por otros autores (Vengust et al., 2006; Rusher et al., 2009). Tampoco es extraño no encontrarlo en las personas, ya que en algunos estudios realizados, la prevalencia encontrada es inferior al 0,1%, y generalmente, la colonización o infección está relacionada con la convivencia estrecha con perros y gatos infectados principalmente (en este caso suele ser infección por S. pseudointermedius, aunque solo se diferencian tras el análisis genético) (Mahoudeau et al., 1997). También se han dado casos en los que el origen era desconocido, o bien eran personas infectadas en una clínica veterinaria. En cualquier caso, se considera que es potencialmente zoonósico y puede causar infecciones en piel y mucosas en la especie humana, (Weese and van Duijkeren, 2010). Tabla 3: Número de individuos del estudio y muestras recogidas de ellos Équidos Personas Total Individuos muestreados 35 (34 caballos+1 Burro) 35 70 Fosas nasales (F) 35 35 70 Lesión (L) 8 0 8 Espacios interdigitales (i) 0 35 35 TOTAL de muestras 43 70 113 Se han aislado 12 cepas de S. aureus (Tabla 4): 7 cepas de 7 équidos diferentes (C1, C17, C20, C26, C29, C80 y C124); y 5 de 4 personas diferentes (C56, C97, C107, C108, C113). 39 De las 7 cepas de équidos, 6 cepas fueron aisladas de fosas nasales: C17, C20, C26, C29, C80 y C124; y una cepa del líquido supurado a través de la incisión tras 3 días de una intervención quirúrgica de la laringe (cepa C1). La cepas C80 y C124 proceden de équidos de la Comunidad, las cinco restantes están relacionadas con ámbitos Hospitalarios. Se aislaron 5 cepas de S. aureus de 4 Personas: 2 fueron aisladas de 1 persona (C107 de fosas nasales y C108 de espacios interdigitales), las 3 restantes son de fosas nasales de otras 3 personas (C56, C97 y C113) (Tabla 4). Las cepas C97 y C113, proceden de personas de la Comunidad y el resto son de personas relacionadas con el ámbito Hospitalario. Tabla 4: Distribución de las cepas de S. aureus según el tipo de muestra y especie de la que se aislaron. Origen muestra Personas Équidos Fosas Nasales (F) C56, C97, C113, C107 C17, C20, C26, C29, C80, C124 Lesión (L) C1 Espacios interdigitales (i) C108 TOTAL 5 cepas de 4 personas 7 cepas de 7 équidos 5.2. Frecuencia de aislamientos de S. aureus en la población de équidos y personas del estudio En ninguno de los casos analizados se han aislado paralelamente cepas de S. aureus en el équido y en la persona relacionada con ellos. Del total de individuos estudiados (Tabla 5) se aislaron 12 cepas de S. aureus (17,14%). Se han aislado una mayor proporción de cepas en los équidos (20,00%) que en las personas relacionadas con estos animales (14,29%), la proporción respecto a las muestras de fosas nasales aisladas de ellos también es superior en équidos (17,14% frente a 11,43%). Solo de una de las muestras de espacios interdigitales humanas (2,86%) se aisló S. aureus. Únicamente se aisló una cepa de S. aureus a partir de las 8 muestras de lesiones de équidos en las que se sospechaba la infección por este agente (12,50%). 40 Tabla 5: Frecuencias de las cepas de S. aureus aisladas en relación a los individuos y muestras realizadas Équidos Personas Total Cepas S. aureus 7 5 12 Según nº de individuos 7/35 (20,00%) 5/35 (14,29%)* 4/35 (11,43%) 12/70 (17,14%)* 11/70 (15,71) Individuos de la Comunidad 2/15 (13,33%) 2/15 (13,33%) 4/15 (26,66%) Individuos de ámbito hospitalario 5/20 (25%) 3/20 (15,00%)* 2/20 (10,00%) 8/20 (40,00%) * 7/20 (35,00%) Según nº de muestras 7/43 (16,28%) 5/70 (7,14%) 12/113 (10,61%)* 11/113 (9,73%) Según tipo de muestra: Fosas nasales 6/35 (17,14%) 4/35 (11,43%) 10/70 (14,29%) Lesión 1/8 (12,50%) 0/0 1/8 (12,50%) Espacios interdigitales 0/0 (0,00%) 1/35 (2,86%) 1/35 (2,86%) (*) dos de las cepas aisladas proceden de la misma persona y muy probablemente, son la misma cepa dado que fenotípicamente son idénticas, esa es la razón de la presentación de los dos valores de frecuencia La prevalencia de S. aureus aislada en caballos en su conjunto (20,00%), sin considerar si tenían relación directa o no con el ámbito hospitalario, o si se trataba de cepas SARM o SASM es difícil de valorar, ya que la mayoría de los autores hacen referencia a la presencia de SARM (será comentada posteriormente). Sin embargo, en un reciente trabajo realizado en estudiantes de medicina en Taiwan (Chen et al., 2012), se encontró un 19,3% de portadores nasales de S. aureus, de los que 16,8% se consideraron procedentes de la Comunidad (no habían entrado en contacto con la clínica) y 21,9% eran de origen Hospitalario (contactaban con la clínica), de los que un 2,2% eran cepas SARM y estas eran cepas de origen en la Comunidad. Los valores encontrados por nosotros en personas de la Comunidad (13,33%) y relacionados con ambiente hospitalario (10 a 15%), son ligeramente inferiores. La baja proporción de SARM que encontraron Chen et al. (2012) respecto al total de cepas de S. aureus aisladas (2,2%), también podría ser la razón por la que en nuestro estudio ninguna de las 4 cepas de S. aureus aisladas de las personas fuera SARM. 47 curso impartido en el Hospital. Los estudios genéticos que se lleven a cabo posteriormente, determinarán ante qué línea genética de SARM nos encontramos y permitirá confirmar esta sospecha. De todos modos, se sabe que hay líneas genéticas de SARM que pueden circular entre varias especies animales y humanos (Cuny et al., 2008; O'Mahony et al., 2005; Seguin et al., 1999; Weese et al., 2005). Las cepas C17, C20 y C26, proceden de caballos adquiridos para realización de prácticas con estudiantes de veterinaria. En el momento de la recolección de las muestras el tiempo de permanencia en el HCV-UZ era de un mes aproximadamente. Estos tres caballos se adquirieron a un tratante de caballos de Logroño, lugar en el que entran y salen continuamente caballos de muy diversa procedencia, situación que favorece el contagio entre los caballos. Las 3 cepas son fenotípicamente diferentes, lo que podría indicar diferentes orígenes en cada una de ellas. Wesse and Lefebvre (2007), encontraban que los équidos que habían presentado colonización por SARM en épocas anteriores tenían más probabilidades de seguir colonizados o reinfectarse. Si se considera el tiempo transcurrido desde que fueron comprados e integrados en su lugar actual de residencia y salvando las diferencias, puesto que la mayoría de los artículos se refieren específicamente a cepas SARM (Wesse and Lefebvre, 2007), estas tres cepas podían proceder de su actual ubicación (las personas que contactan con ellos son los estudiantes de veterinaria, además del personal de mantenimiento y limpieza, visitantes y veterinarios), pero no se puede descartar la posibilidad de que ya vinieran colonizados por S. aureus. La cepa C29 se aisló de un burro a partir de fosas nasales. Procede del Centro de Cría Caballar de las Fuerzas Armadas de Zaragoza en donde residía desde hacía 2 años, y había entrado en el HCV-UZ para tratar un nódulo en el pabellón auricular con una secreción maloliente. Fue muestreado de fosas nasales y del fluido excretado cuando ya llevaba 12 días en el Hospital y tras haber sido tratado con Penicilina y Gentamicina, sin embargo S. aureus solo se aisló de fosas nasales. Con estos antecedentes, es muy probable que este burro ya viniera colonizado por S. aureus y que esta cepa podría estar en esa colectividad equina. Sin embargo, no es posible descartar que fuera colonizado por una cepa de las personas que manejan la colectividad, aunque la persona de la que se hizo el muestreo no estaba colonizada por ninguna cepa de S. aureus, o que se hubiera colonizado en el HCV-UZ. Las cepas C80 y C124 no tienen relación directa con el ámbito del HCV-UZ dado que fueron recogidas in situ, en el lugar de residencia habitual de esos caballos. La C80 es de una yegua que vive en paddock junto a otros caballos en una yeguada de Muel (Zaragoza), por lo que el origen de la cepa es muy probable que se encuentre en la propia yeguada, sin descartar la posibilidad de que el personal u otras personas que frecuenten la yeguada, hayan podido ser la fuente de esta cepa. Aunque su dueño no estaba colonizado por S. aureus en el momento del estudio a pesar de estar relacionado con ambientes médicos y veterinarios. La cepa C124 procede de un caballo 48 perteneciente a una persona particular en Chimillas (Huesca) y vive en box individual. Como se relaciona con un perro y las personas de la casa, el origen de la cepa, podría ser humano, aunque no se puede descartar totalmente un origen animal. (Cuny et al., 2008; O'Mahony et al., 2005; Seguin et al., 1999; Weese et al., 2005; Morgan, 2008). La cepa C56 se aisló de fosas nasales de un veterinario interno del HCV-UZ, pero no del caballo relacionado con él. En su residencia hay otros animales de compañía (gato, rata y periquito), y el gato, sobre todo, también podría ser la fuente de S. aureus. Algunos estudios sobre la prevalencia de infección o colonización con SARM en gatos, dan valores de prevalencia entre el 0 y 4% (Weese and Duijkeren, 2010). Sin embargo, en un amplio estudio realizado por Loeffler et al. (2010) encontraban que un 12,3% de los veterinarios y un 7,5% de los dueños de animales infectados por SARM, también portaban este agente en fosas nasales, la mayoría de esas cepas, eran genéticamente, de origen HA-MRSA. Las cepas C107 y C108 aisladas de origen humano proceden de 1 persona relacionadas con el Hospital Veterinario, y con ambientes hospitalarios humanos (laboratorio de diagnóstico humano), y siguiendo los criterios de diferentes autores y el EMEA, estas cepas, muy probablemente, tienen origen hospitalario humano, (Bartels et al., 20008; EMEA, 2009; Stefani et al., 2012). La cepa C97 es de una persona de Calamocha (Teruel), propietaria de un caballo que contacta diariamente con otros caballos. Sin embargo, el caballo que fue muestreado a la par que él, no portaba S. aureus en fosas nasales. La cepa C113 procede de una persona que tiene su caballo en un club hípico de Zaragoza, y el contacto con otros caballos es diario, al igual que en el anterior, no se ha detectado S. aureus en su caballo, ni tiene relación con ambientes médicos o veterinarios ni ha padecido procesos relacionados con esta infección. En consecuencia, las cepas C97 y C113, podrían tener su origen en la Comunidad, ya que no hay relación directa o indirecta con ambientes hospitalarios médicos o veterinarios, y ninguna de estas personas se relaciona con animales de abasto, que también es considerado una fuente importante de S. aureus o SARM. (Bartels et al., 2008; EMEA, 2009; Stefani et al., 2012). 5.7. Fenotipo de Resistencia de las cepas de S. aureus aisladas 5.7.1. Fenotipo de resistencia de la cepa C1 Únicamente la cepa C1 aislada del líquido exudado de la herida postquirúrgica de un caballo de 6 años, de Pura Raza Española, muestra un fenotipo propio de una cepa SARM y además muestra un patrón de multirresistencia (MDR) respecto al resto de antibióticos, ya que la resistencia se ha observado frente a Penicilina, Oxacilina, Cefoxitina, Tetraciclina, Gentamicina, Estreptomicina, Tobramicina y Lincomicina, 49 pero no a la Vancomicina, Clindamicina, Cloranfenicol, Trimethoprim- Sulfamethoxazol, Mupirocina y Ciprofloxacina. Ha mostrado resistencia Intermedia al Ácido Fusídico, Eritromicina y Teicoplanina. Esta multiresistencia es característica de las cepas SARM (Appelbaum, 2007). Esta cepa no es resistente a Vancomicina por el método de difusión en disco (dd), sin embargo muestra resistencia Intermedia a Teicoplanina. Al realizar la MIC de la Penicilina, Oxacilina y Vancomicina, se confirmó la resistencia a la Penicilina y Oxacilina (patrón establecido por el CLSI, 2012), y la sensibilidad a la Vancomicina. Según los criterios establecidos por el CLSI (2012), los S. aureus resistentes a la Oxacilina también lo son para el resto de los antimicrobianos -lactámicos, con la excepción de las nuevas Cefalosporinas que tienen actividad anti-SARM. Además, por la resistencia mostrada a la Cefoxitina, se puede deducir que no solo produce la β-lactamasa, sino que además posee el gen mecA, característico de la resistencia a la Oxacilina (Hartman and Tomasz, 1984). En consecuencia, la cepa C1 es, fenotípicamente, una cepa SARM, que según los criterios del CLSI, se debería referir como ORSA. Todas las cepas de las personas y équidos de este estudio, de las que se aisló S. aureus en fosas nasales, eran SASM. Se ha comprobado, en personas ingresadas en hospitales, que la colonización de fosas nasales con cepas SASM tienen menos probabilidad de dar lugar a infecciones posteriores con esas cepas en otras localizaciones (Ellis et al., 2004; Werthein et al., 2005; Davis et al., 2004; Seybold et al., 2011), sin embargo Weese et al. (2006c) opinan que las cepas SARM y SASM equinas y humanas, tienen la misma capacidad de provocar infección. La Vancomicina (Glicopéptido), es la alternativa para el tratamiento de los casos clínicos en los que actúa una cepa SARM. Actualmente, es muy raro que haya cepas resistentes a la Vancomicina, aunque ya se han descrito algunos aislados con esta característica, pero los casos de resistencia Intermedia son igualmente importantes y deben confirmarse en un segundo laboratorio (McCallum et al., 2010; Honda et al., 2011). La cepa C1, SARM, mostraba resistencia Intermedia a la Teicoplanina (Glicopéptido), siendo sensible a la Vancomicina, sin embargo, el CLSI, indica que los resultados del test de difusión en disco de la Teicoplanina no se pueden considerar seguros ya que no se han re-evaluado a la par que los de la Vancomicina, por lo que se desconoce la capacidad de este test para diferenciar bien las cepas Sensibles, Resistentes e Intermedias (CLSI, 2012). Por otro lado, según Tenover (2010), las cepas que muestran resistencia a Teicoplanina, y no muestran resistencia a la Vancomicina por el test de difusión en disco, podrían tener resistencia heterogénea a los Glicopéptidos (hGISA), que en ocasiones se han asociado con fallos clínicos al tratamiento con Vancomicina, por eso recomiendan confirmar la resistencia a la Vancomicina realizando el MIC. 50 Otro antibiótico de interés en el control de la diseminación de las cepas SARM, en las poblaciones animales y humanas, es la Mupirocina (Ácido pseudomónico), que se viene usando para eliminar la colonización en fosas nasales (Reagan et al., 1991), y esta cepa es sensible a la Mupirocina. Tabla 8: Fenotipo de resistencia expresado por las 12 cepas de S. aureus aisladas en los équidos y las personas que participaron en el estudio Cepas Resistencia Intermedia Sensible Equinas C1 P, OX, FOX, TE, GM, TOB, S, LIN E, TEI, FUS CIP, VA, CLIN, C, SxT, MUP C17 P, LIN, FUS E, TEI OX, FOX, VA, TE, CLIN, C, GM, TOB, S, CIP, SxT, MUP C20 P E, S, SxT, FUS, TEI OX, FOX, VA, TE, CLIN, C, GM, TOB, LIN, CIP, MUP C26 LIN S, TEI P, OX, FOX, VA, TE, E, CLIN, C, GM, TOB, CIP, SxT, FUS, MUP C29 P, LIN E, S, TEI OX, FOX, VA, TE, CLIN, C, GM, TOB, CIP, SXT, FUS, MUP C80 P, S, LIN OX, FOX, VA, TE, E, CLIN, C, GM, TOB, CIP, SxT, FUS, MUP, TEI C124 S, LIN E, CLIN, CIP, SxT, TEI P, OX, FOX, VA, TE, C, GM, TOB, FUS, MUP Humana C56 P, TE, SxT LIN OX, FOX, VA, E, CLIN, C, GM, TOB, S, CIP, FUS, MUP, TEI C97 P TE, E, S, CIP OX, FOX, VA, CLIN, C, GM, TOB, LIN, SxT, FUS, MUP, TEI C107 S, LIN, FUS E, TEI P, OX, FOX, VA, TE, CLIN, C, GM, TOB, CIP, SxT, MUP, C108 S, LIN, FUS E, TEI P, OX, FOX, VA, TE, CLIN, C, GM, TOB, CIP, SxT, MUP, TEI 51 C113 S, LIN TE, E, CIP, TEI OX, FOX, VA, CLIN, C, GM, TOB, SXT, MUP C: Cloranfenicol; CIP: Ciprofloxacina; CLIN; Clindamicina; E: Eritromicina; FOX: Cefoxitina; FUS: Ácido Fusídico; GM: Gentamicina; LIN: Lincomicina; MUP: Mupirocina; OX: Oxacilina; P: Penicilina; S: Estreptomicina; SxT: Trimethoprimsulfametoxazol; TE: Tetraciclina; TEI: Teicoplanina; TOB: Tobramicina; VA: Vancomicina 5.7.2. Resistencia a β-lactámicos del resto de cepas aisladas Aparte de la cepa C1 ya comentada, 6 cepas más (C17, C20, C26 y C29, equinas, y C56 y C97 humanas) eran resistentes a la Penicilina por el test de difusión en disco y ninguna de ellas era resistente a Oxacilina y Cefoxitina. Según estos resultados, son productoras de β-lactamasa, pero deberían ser sensibles a las Penicilinas penicilinasaestables, a las combinaciones con inhibidores de la β-lactamasa, a los Cefenos antiestafilococos y a los Carbapenen (Smith and Jarvis, 1999; McCallum et al., 2010; CLSI, 2012). La ausencia de resistencia a la Oxacilina y a la Cefoxitina indicaría que carecen del gen mecA, dato que se confirmará en posteriores análisis genéticos. En el conjunto de las cepas de S. aureus aisladas, la frecuencia de cepas resistentes a la Penicilina, representa un 58,33% de los aislados. Teniendo en cuenta que se han detectado zonas geográficas con hasta un 90% de resistencia a Penicilina, podríamos decir que en la población estudiada la resistencia a este antibiótico no es muy elevada. 5.7.3. Inducción de la resistencia a la Clindamicina por medio de la Eritromicina Un efecto interesante a detectar en S. aureus, es la inducción de resistencia a la Clindamicina por medio de la Eritromicina. Nueve de las 12 cepas de S. aureus aisladas (C1, C17, C20, C29, C124 de équidos y C97, C107, C108 y C113 de las personas), mostraban resistencia Intermedia a la Eritromicina y eran sensibles a la Clindamicina, excepto la cepa C124 que presentaba resistencia Intermedia, lo que sugiere que podrían portar los genes de resistencia ermA, ermB o ermC (MacCallum et al., 2010). En la cepa C124 es posible que se hubiera producido inducción, aunque la línea de crecimiento era tenue y se consideró “dudosa”, en el resto no hubo inducción de la resistencia a la Clindamicina. Con estas características, esas cepas también podrían portar el gen msrA, (Matsuoka et al., 1998), que codifica la producción de una bomba de flujo que expulsa la Eritromicina fuera de la célula. Estos datos se conocerán en un estudio genético posterior. 52 5.7.4. Resistencia a Glicopéptidos Las cepas C17, C20, C26, C29 y C124 de origen equino, y las C107, C108 y C113, de origen humano, también mostraban resistencia Intermedia a la Teicoplanina, siendo sensibles a la Vancomicina, por lo que al igual que en la cerpa C1, estos resultados deben ser considerados dudosos (CLSI, 2012). 5.7.5. Resistencia al Ácido Fusidico Las cepas C17, (origen equino), C107 y C108 (de la misma persona) eran resistentes al Ácido Fusídico (antibiótico esteroidal), y las cepas C1 (cepa SARM), C20 (también de origen equino), mostraban resistencia Intermedia a este antibiótico. Este antibiótico es de gran utilidad para tratar S. aureus y en particular los SARM, en casos de infección de la piel y tejidos blandos en la especie humana. La detección de resistencia podría estar asociada a la presencia del gen fusA, y las cepas con resistencia Intermedia, podrían portar los genes fusB y fusC (Wang et al., 2012). Las prevalencias de resistencia al Ac. Fusídico es variable aunque todavía bajo, en general, en EEUU se daban valores del 0,3% de los S. aureus, mientras que en Canadá y Australia eran más elevados (7%). En nuestro estudio, son 3 cepas las que muestran resistencia, aunque las C107 y C108 son, muy probablemente la misma, por lo que consideramos una posible prevalencia del 16,67%, que podríamos calificar de elevada. Además otras 2 cepas muestran resistencia Intermedia, lo que añade otro 16,67% más. En Europa se cree que la expansión de la resistencia al Ác. Fusídico se debe a una expansión clonal de la cepa epidémica “European FA-resistant impétigo” (Castanheira et al., 2010). En estudios posteriores se comprobará la existencia de estos genes en las cepas aisladas. 5.7.6. Resistencia a las Tetraciclinas La Resistencia a la Tetracicilina se ha observado en 2 cepas (C1 SARM de origen equino; y C56 de origen humano). Otras dos cepas han presentado resistencia Intermedia (C97 y C113, ambas de origen humano). Las Tetraciclinas son inhibidores de la fase de elongación de la síntesis de proteínas (McCallum et al., 2010). El principal mecanismo de resistencia en S. aureus, es la protección ribosomal por las proteínas Tet(M) o Tet(O) “factor-like” de elongación (Connell et al., 2003) y el eflujo activo por el TetK o TetL, codificados por los genes móviles Tet (Levy et al., 1999). Ambos mecanismos pueden haber sido inducidos por bajas concentraciones de Tetraciclina (Trzcinski et al., 2000). 53 5.7.7. Resistencia a Aminoglicósidos La Resistencia a los Aminoglicósidos se ha evaluado con Gentamicina, Tobramicina y Estreptomicina, la única cepa que ha mostrado resistencia a los tres antibióticos (Tabla 8) ha sido la cepa C1, SARM, de origen equino. Sin embargo, el resto de las cepas eran sensibles a Gentamicina y Tobramicina, mientras que las cepas C80, C124 (origen equino) y las C107, C108 y C113 (origen humano), eran resistentes a Estreptomicina, y las cepas C20, C26, y C29 (de origen equino), y la cepa C97 (origen humano), mostraban resistencia Intermedia. Todos los Aminoglicósidos se unen a la subunidad ribosomal 30S, pero las interacciones de cada uno de ellos es diferente, lo que explicaría el hecho de haber encontrado sensibilidad a la Gentamicina y Tobramicina, pero no a la Estreptomicina en algunas de las cepas del estudio, además los genes que lo codifican se encuentran en transposones y elementos móviles que favorece la diseminación de estos genes entre las bacterias. El estudio genético podría detectar los genes que porta la cepa C1, SARM, en relación con las resistencias encontradas a la Estreptomicina en el resto de las cepas (Vakulenko and Mobasthery, 2003; McCallum et al. 2010). 5.7.8. Resistencia a Fluoroquinolonas La resistencia a las Fluoroquinolonas la hemos valorado con la Ciprofloxacina, y se puede decir que, en general, la sensibilidad a este antibiótico ha sido elevada, ya que solo las cepa C124 (origen equino), C97 y C113 (origen humano) han mostrado resistencia Intermedia a este antibiótico. La resistencia puede deberse a la mutación de los genes grlAB y gyrB, que controlan la enzima topoisomerasa y la replicación del ADN bacteriano, pero también por el aumento del eflujo del antibiótico por la familia NOR de bombas de eflujo, que a su vez, se sabe que pueden favorecer la resistencia a βlactámicos, Tetraciclinas, Cloranfenicol y otros compuestos químicos (Mesak et al., 2008; Tattevin et al. 2009; McCallun et al., 2010). La cepa C1, SARM, no ha mostrado resistencia a Ciprofloxacina, por lo que la resistencia a β-lactámicos y el resto de antibióticos, debería ser independiente de los sistemas de eflujo de antibióticos. 5.7.9. Patrón fenotípico de resistencia a los antibióticos de las cepas aisladas Finalmente, vemos que entre las 12 cepas de S. aureus aisladas, 10 muestran un patrón fenotípico de resistencia diferente al de las demás, sin embargo, las cepas C107 y C108 aisladas de fosas nasales y espacios interdigitales respectivamente, de la misma persona, muestran un fenotipo de resistencia idéntico. Ambas han mostrado resistencia a Estreptomicina, Lincomicina y Ácido Fusídico, y resistencia Intermedia a Eritromicina y Teicoplanina, sin embargo no muestran resistencia a ninguno de los β-lactámicos. Estas cepas pertenecen a un alumno en prácticas en el HCV-UZ que se relaciona habitualmente con los caballos de dicho hospital, también tiene contacto con perros y 54 además en su familia hay relación con ambientes médicos. Este alumno había recibido tratamiento antibiótico en los últimos 6 meses. El hecho de encontrar estas cepas iguales en fosas nasales y espacios interdigitales, concuerda con lo ya constatado en numerosas ocasiones respecto al papel de las manos como vectores de una cepa que coloniza las fosas nasales (Cesur and Cocka, 2004; Cole et al., 2001; Reagan et al., 1991; Weidenmaier et al., 2004; Rodríguez-Baño et al., 2008; WHO Guidelines, 2009; Gagne et al., 2010; Skov et al., 2012). Es probable que la cepa sea procedente de la Comunidad, puesto que es una cepa poco resistente y se ha observado, en el caso de cepas CA-MRSA, que son menos resistentes que las cepas HA-MRSA. La relación con el ambiente veterinario de forma continuada, también hace pensar en su origen animal, si bien la posibilidad de que tenga relación con el HCV-UZ es poco probable puesto que no se ha aislado en los caballos del estudio ni en el resto del personal relacionado con estos caballos. No es posible saber con una sola muestra, si la presencia de S. aureus en las manos de esta persona es momentánea e intermitente, o bien ha colonizado los espacios interdigitales. Razón por la que en posteriores estudios de estas cepas, se le sugerirá la posibilidad de controlar la presencia de S. aureus en ambas localizaciones de forma periódica. Como indican Krishna y Miller (2011), para que la piel sea colonizada se necesita que concurran una serie de factores que alteren el pH y la temperatura, que la flora normal de la piel esté ausente o alterada, y que los queratinocitos no excreten las sustancias bactericidas y bacteriostáticas que protegen la piel, entre otros. Estos autores también indican que esta capacidad de colonizar es igual en las cepas SARM y en las SASM. En un importante estudio realizado en EEUU encontraron que las infecciones de la piel por S. aureus afectaban a 11,6 millones de pacientes externos y en las salas de visita de emergencias, y cerca de 500.000 en las admisiones anuales (McCaig et al., 2006). Esta infección representa una amenaza a la Salud Pública dado al gran número de infecciones que podría provocar y la amplia diseminación de cepas resistentes como las SARM. En EEUU se calcula que un 30% de la población está colonizado en piel y/o mucosas con S. aureus. 55 6. RECOMENDACIONES DERIVADAS DE ESTE ESTUDIO La alta prevalencia de aislamientos de S. aureus en el Hospital Veterinario de caballos de la UZ, y la presencia de una cepa SARM en uno de ellos, pone de manifiesto la necesidad de mejorar las medidas preventivas. A pesar de que no hay medidas específicas que aseguren la desaparición completa de su presencia, se han hecho algunas adaptaciones de las medidas empleadas en Hospitales humanos que han sido recomendadas tanto para animales de compañía como para caballos. Resumen de medidas recomendadas para controlar la infección y colonización con SARM en animales (Leonard y Markey, 2008) I) Prevenir la introducción de la infección: Realizar cultivo a partir del foco de infección y/o fosas nasales en el momento de la admisión, y mantenerlos aislados hasta que se sepa que el resultado es negativo. Esto no siempre es posible en todas las clínicas, aunque puede ser una medida útil en hospitales de referencia. II) Prevenir la transmisión Animal-Humano y Humano-Animal: Higiene de las manos (lavado correcto, desinfectantes de base alcohólica, cubrir heridas y lesiones de la piel, usar guantes desechables, máscaras, protección ocular, delantales desechables cuando se va a contactar con heridas, fluidos corporales u otros materiales contaminantes). Los detalles pueden encontrarse en diferentes artículos desarrollados para hospitales humanos (Rodríguez-Baño et al., 2006). Estricta asepsia en la cirugía. Sondear la presencia de SARM en el personal de la Clínica (si se han detectado agrupamientos de infección en los animales, y colaboración con la profesión médica). III) Prevención de la transmisión Animal a Animal: Aislamiento de los casos sospechosos de estar infectados por SARM. Controlar la entrada a esa sala y siempre que sea posible, hospitalizarlos en áreas de aislamiento. Se puede intentar la eliminación del estado de portador, pero hay pocos datos de su eficacia. IV) Prevenir la Transmisión Indirecta: Limpieza y Desinfección estándar: 56 o En todas las superficies que tocan las manos (manillas de las puertas, estetoscopios, pizarras, lápices…) o En las salas de consulta/aislamiento o cualquier otro lugar en los que los animales infectados han estado. Especial cuidado con termómetros, collares u otros equipos de manejo, en casos de animales sospechosos o positivos. 63 Hanselman B.A., Kruth S., Weese J.S. Methicillin-resistant staphylococcal colonization in dogs entering a veterinary teaching hospital. Veterinary Microbiology. 2007; 126: 277–281. Hardy K.J., Oppenheim B.A., Gossain S., Gao F., Hawkey P.M. A study of the relationship between environmental contamination with methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and patients acquisition of MRSA. Infection Control and Hospital Epidemiology. 2006; 27: 127-32. Hartman B.J., Tomasz A. Low-affinity penicillin-binding protein associated with beta-lactam resistance in Staphylococcus aureus. 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