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PROYECTO FIN DE MASTER EN INICIACIÓN A LA INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS AGRARIAS Y DEL MEDIO NATURAL Aplicación de técnicas de microscopía a la determinación de cambios anatómicos derivados del déficit de hierro en Medicago truncatula AUTORA: Dido Villarroya Lacarta TUTOR: Dr. Javier Abadía Bayona PONENTE: Dra. Mª Luisa Peleato Sánchez Zaragoza, 29 de Noviembre de 2012 Autorización presentación de tesis master D. JAVIER ABADÍA BAYONA, Profesor de Investigación del Consejo de Investigaciones Científicas (CSIC) AUTORIZA: La presentación de la siguiente memoria de Tesis Master, titulada, “APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA A LA DETERMINACIÓN DE CAMBIOS ANATÓMICOS DERIVADOS DEL DÉFICIT DE HIERRO EN Medicago truncatula” presentada por Dª. Dido Villarroya Lacarta para optar al grado Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Agrarias y del Medio Natural por la Universidad de Zaragoza, y certifica que ha sido realizada bajo mi dirección en la Estación Experimental de Aula Dei (CSIC). Y para que conste en a los efectos oportunos expido la presente autorización En Zaragoza a 29 de noviembre de 2012 Fdo. Javier Abadía Bayona Esta tesis master ha sido financiada por el proyecto de investigación AGL2010- 16515 del Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN) titulado ‘Metalómica vegetal: una aproximación a la homeostasis de metales en plantas mediante espectrometría de masas integrada’. Agradecimientos Mi agradecimiento al grupo de Fisiología de Estrés Abiótico en Plantas de la Estación Experimental sin cuyos medios este trabajo no habría sido posible, en especial a Ana y Juanjo por su ayuda de última hora y a mis compañeros de laboratorio por su colaboración desinteresada y su amistad. También agradecer a la Unidad de Recursos Forestales del CITA, Eustaquio, Domingo y J, su indispensable apoyo y sabiduría. Y, por supuesto, a mis padres por todo, a Carlos por estar siempre a mi lado, a mis amigos por los buenos momentos y a Borris por su mundo paralelo. Índice 1 Índice Resumen........................................................................................................................... 2 1. Introducción.............................................................................................................. 3 1.1 Concepto de esencialidad y el Hierro............................................................... 3 1.1.1 Papel del Fe en las plantas............................................................................ 3 1.1.2 El Fe en el suelo ........................................................................................... 3 1.1.3 Causas de la deficiencia de Fe...................................................................... 4 1.1.4 Absorción del Fe por la raíz ......................................................................... 5 1.1.5 Respuestas de las plantas ante la deficiencia de Fe...................................... 5 1.2 La microscopía como técnica resolutiva .......................................................... 8 1.2.1 Microscopio óptico....................................................................................... 9 1.2.2 Microscopio de fluorescencia..................................................................... 10 1.3 Medicago truncatula como planta modelo...................................................... 11 2. Objetivo.................................................................................................................. 14 3. Materiales y métodos.............................................................................................. 15 3.1 Condiciones de cultivo................................................................................... 15 3.2 Preparación de las muestras para microscopía............................................... 16 3.2.1 Inclusión en agar......................................................................................... 17 3.2.2 Inclusión en resina epoxi............................................................................ 17 3.2.3 Inclusión en parafina .................................................................................. 18 3.3 Tinción de las muestras.................................................................................. 20 3.3.1 Tinción de Johansen................................................................................... 20 3.3.2 Safranina..................................................................................................... 21 3.3.3 Floroglucinol .............................................................................................. 22 3.4 Toma de imágenes.......................................................................................... 22 4. Resultados............................................................................................................... 23 4.2 Estado de las planta en el momento del muestreo.......................................... 23 4.3 Estudio histológico......................................................................................... 25 5. Discusión................................................................................................................ 31 6. Adecuación de las técnicas de microscopía para la tinción de lignina en tejidos de M. truncatula.................................................................................................................. 33 7. Conclusiones........................................................................................................... 35 8. Bibliografía............................................................................................................. 36 Anexo I........................................................................................................................... 40 Resumen 2 Resumen El hierro (Fe) es un micronutriente esencial para la vida de las plantas y el cuarto elemento más abundante de la corteza terrestre. Sin embargo, la deficiencia de Fe es uno de los factores más limitantes de la producción agrícola, especialmente en suelos calizos. En condiciones de deficiencia de Fe, las plantas como Medicago truncatula desarrollan una serie de cambios adaptativos a nivel fisiológico, morfológico y metabólico. Estudios previos en esta especie mostraron que la deficiencia de Fe induce alteraciones en la abundancia de proteínas de la ruta de los fenilpropanoides de la cual deriva la lignina. En este trabajo se utilizaron distintas técnicas de microscopía, tanto óptica como de fluorescencia, para identificar posibles modificaciones en la lignificación en esta especie como respuesta a la deficiencia de Fe, con o sin la presencia de carbonato de calcio (CaCO 3 ) en el medio de cultivo. Cortes de raíz, tallo y peciolo se estudiaron mediante microscopía de autoflourescencia, y con las tinciones de safranina, floroglucinol y Johansen. La tinción con floroglucinol y la auto-fluorescencia, en general, resultaron adecuadas para evaluar los cambios en la lignificación. Los tejidos nuevos, como la raíz y el peciolo crecidos durante el periodo de deficiencia de Fe, mostraron una reducción de la lignificación. Por el contrario, cuando la deficiencia de Fe fue acompañada de CaCO 3 se observó un aumento de la lignificación del peciolo. Introducción 3 1. Introducción 1.1 Concepto de esencialidad y el Hierro En las plantas, además de dióxido de carbono (CO 2 ), oxígeno (O 2 ) y agua, son necesarios elementos minerales esenciales para un correcto desarrollo del ciclo vital (Barker y Pibeam, 2006). Estos elementos esenciales se clasifican en macronutrientes y micronutrientes en función de la cantidad requerida por la planta. Muchos de los micronutrientes pertenecen al grupo de los metales pesados como el hierro (Fe), el manganeso (Mn), el cobre (Cu), el cinc (Zn), el níquel (Ni) y el molibdeno (Mo) siendo imprescindibles para funciones vitales como, entre otras, la fotosíntesis y la respiración (Marschner, 1995). 1.1.1 Papel del Fe en las plantas El Fe es un micronutriente esencial para las plantas, ya que es un constituyente indispensable de un gran número de enzimas y agentes redox que intervienen en algunas de las principales funciones del metabolismo de los seres vivos. La gran versatilidad del Fe en sus funciones biológicas es debida al potencial del par redox Fe(III)/Fe(II), que varía dependiendo del ligando al que se encuentre unido, permitiendo así su uso en forma de grupos hemo o cluster Fe-S. Así, el Fe interviene en las síntesis de clorofila y es esencial para la fotosíntesis y el mantenimiento de la estructura del cloroplasto (Abadía y Abadía, 1993). Además, interviene en procesos como la respiración, la fijación de nitrógeno (Clark, 1983) y en la síntesis de DNA y hormonas (Briat y Lobréaux, 1997). Aproximadamente un 63% del hierro de la hoja está asociado a proteínas, y un 80% del total está localizado en los cloroplastos (Young y Terry, 1982). 1.1.2 El Fe en el suelo El Fe es el cuarto elemento más abundante de la corteza terrestre. Sin embargo, en suelos alcalinos y calcáreos se encuentra en forma de óxidos e hidróxidos de muy baja solubilidad, provocando una baja biodisponibilidad para las plantas. Los factores que causan la deficiencia de este elemento son, entre otros: un pH elevado, altas cantidades Introducción 4 de arcillas y carbonatos (Kashirad y Marschner, 1974), mucha humedad, salinidad y altas cantidades de fosfatos (Lindsay y Schwab, 1982). 1.1.3 Causas de la deficiencia de Fe La deficiencia de Fe está muy extendida, ya que afecta a una gran variedad de especies agrícolas como soja, cacahuete, judía, sorgo, arroz, cítricos, melocotonero, vid y tomate, y afecta a muchos países como España, Francia, Italia, Turquía, EE.UU., China, Japón, etc. En el área mediterránea afecta a un alto porcentaje de las plantaciones de especies frutales (Sanz et al., 1992; Tagliavini et al., 2000). Sólo en la cuenca del Ebro se estimó en más de 13 millones de euros por año el gasto que suponen los tratamientos correctores de esta deficiencia (Sanz et al., 1992). La falta de corrección de esta alteración en cultivos frutales afecta el crecimiento de los árboles, ya que la floración es más escasa y los frutos son menos numerosos y más pequeños, pudiéndose llegar en casos extremos a la muerte prematura del árbol. La deficiencia de Fe en la planta no sólo puede estar producida por factores que afecten a su disponibilidad si no también a su absorción radicular y a su movilidad dentro de la planta. Aunque la absorción a nivel radicular depende principalmente de las características del suelo (ver apartado 1.1.2.), otros factores pueden también afectar a la disponibilidad del Fe como la compactación y el encharcamiento del suelo (Chen y Barak, 1982; Chaney, 1984), las bajas temperaturas y los herbicidas (Chaney, 1984), debido a que pueden dificultar el desarrollo radicular. La deficiencia de Fe puede ser también causada por una baja movilidad del Fe en la planta, lo que se hace patente en estudios que muestran que el contenido de Fe en hojas cloróticas de plantas deficientes puede ser similar o incluso algo superior al de las hojas verdes no deficientes (Morales et al, 1998; Römheld, 2000), lo que podría indicar que el Fe se encuentra acumulado en unas formas no utilizables por la planta. Tanto la presencia de fosfatos como un elevado pH del apoplasto son factores que podrían provocar su precipitación en el exterior de las células impidiendo su utilización (Mengel y Geurtzen, 1986). Sin embargo, la razón de la existencia de éste fenómeno, conocido como la “paradoja de la clorosis férrica”, es aún desconocida (Tomasi et al., 2009; Jimenez et al., 2009). Introducción 5 1.1.4 Absorción del Fe por la raíz Las plantas se pueden clasificar en dos grandes grupos en función de su mecanismo de absorción del Fe por la raíz (Abadía et al., 2011): • La Estrategia I o reductora Las plantas de Estrategia I (dicotiledóneas y monocotiledóneas no gramíneas) reducen el Fe(III) a Fe(II) para su posterior absorción. Este mecanismo consta de al menos tres componentes principales: una reductasa férrica de membrana perteneciente a la familia FRO (Ferric Reductase Oxidase) (Robinson et al., 1999), un transportador específico de Fe(II) perteneciente a la familia ZIP (ZNT-IRT like protein) de transportadores de metales (AtIRT1, Eide et al., 1996; Fox y Guerinot, 1998) y una H + -ATPasa que disminuye el pH de la rizosfera (Santi y Schmidt, 2009). • La Estrategia II o quelante Las plantas de Estrategia II absorben el Fe en forma de quelato de Fe(III). A este grupo pertenecen las gramíneas, cuyas raíces sintetizan y excretan compuestos de bajo peso molecular que son péptidos de aminoácidos no proteogénicos, derivados del ácido mugineico, llamados fitosideróforos (PS). Éstos son excretados por transportadores específicos (HvTOM1, Transporter Of Mugineic acid family phytosiderophores 1, Nozoye et al., 2010) y debido a su alta afinidad por el Fe lo solubilizan de forma muy eficaz por quelación, produciendo complejos Fe(III)- fitosideróforo que son introducidos al interior de la raíz a través de transportadores específicos situados en la membrana plasmática (ZmYS1; Yellow Stripe). 1.1.5 Respuestas de las plantas ante la deficiencia de Fe Las plantas deficientes en Fe muestran diversos síntomas, siendo el más visual el amarilleamiento de las hojas jóvenes denominado clorosis férrica (Terry y Abadía, 1986), que se debe a un cambio en la composición pigmentaria de los cloroplastos de las hojas (Morales et al., 1990, 1994; Abadía y Abadía, 1993). En casos extremos, la hoja Introducción 12 lo largo del tratamiento desde un punto de vista fisiológico (Andaluz et al., 2009; Rodríguez-Celma, 2011). En base a los resultados obtenidos, M. truncatula parece ser una buena candidata para el desarrollo de este tipo de estudios y sirve como planta modelo de Estrategia I complementaria Arabidopsis thaliana, ya que M. truncatula acumula en raíz y exuda a la rizosfera flavinas en respuesta a la deficiencia de Fe, cosa que no hace A. thaliana. En esta línea, estudios del proteoma de esta especie, han mostrado que la deficiencia de Fe junto con la presencia de CaCO 3 , incrementaba la cantidad de algunas enzimas involucradas en la formación de la lignina, que se describe en la Figura 2 (Rodríguez- Celma et al., en preparación). Concretamente, cambian la abundancia relativa de la cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD) y la cafeoyl-CoA o metiltransferasa, lo que sugiere un posible cambio del perfil de la lignificación. La lignina es un polímero complejo, que forma parte de las paredes celulares junto a la celulosa (Jone et al. 2001), y está formada por la combinación de subunidades, en las que dependiendo del precursor se pueden distinguir tres tipos: H-lignina, S-lignina y G- lignina (Vogt, 2010). Todas estas subunidades son sintetizadas mediante la ruta del metabolismo secundario de los fenilpropanoides. Tienen algunas características importantes como son la impermeabilidad y también emiten fluorescencia cuando se excitan a determinadas longitudes de onda. Se requiere de un importante gasto energético para su formación y por tanto los cambios fisiológicos en la planta que afecten a su capacidad fotosintética pueden afectar tanto a la formación de las mismas como a su distribución. Por otro lado, la lignina es un constituyente del tejido de soporte, ya que da rigidez a las paredes celulares, lo que puede afectar a su crecimiento (Vogt, 2012). Introducción 13 Figura 2: Ruta de síntesis de la lignina, donde las enzimas son: PAL phenylalanine ammonialyase; TAL tyrosine ammonia-lyase; C4H cinnamate 4-hydroxylase; C3H 4-hydroxycinnamate 3-hydroxylase; COMT caffeic acid 3-O-methyltransferase; F5H ferulate 5-hydroxylase; 4CL 4- coumarate: CoA ligase; CCoA-3H coumaroyl-coenzyme A 3-hydroxylase; CCoA-OMT caffeoyl-coenzyme A O-methyltransferase; CCR cinnamoyl-CoA reductase; and CAD cinnamyl alcohol dehydrogenase (Spangenberg et al. 2000). En círculos se muestran las enzimas que aumentaron su abundancia relativa en respuesta a deficiencia de Fe en M. truncatula (Rodriguez- Celma et al. en preparación). Materiales y métodos 14 2. Objetivo En base a lo descrito anteriormente, y con el fin de corroborar algunos de los cambios observados en el proteoma de M. truncatula en respuesta a la deficiencia de Fe, el objetivo de este trabajo fue: “Evaluar de los cambios inducidos por la deficiencia de hierro en la lignificación de las paredes celulares en diferentes tejidos de Medicago trucatula, mediante la observación por la aplicación de técnicas de microscopía”. Materiales y métodos 15 3. Materiales y métodos 3.1 Condiciones de cultivo Plantas de Medicago truncatula cv. “Jemoalong" se cultivaron según las condiciones descritas por Rodríguez-Celma et al. (2011). Las semillas se escarificaron con un bisturí y se germinaron en un matraz erlenmeyer con agua destilada durante 24 h, en agitación y oscuridad. A continuación, se pasaron a sobres de germinación durante 3 días, manteniéndose también en oscuridad. Posteriormente, las plántulas se pre-cultivaron en hidroponía con solución nutritiva Hoagland al 50% (v/v), que contiene: 0.6 mM de K 2 SO 4 , 0.5 mM de Ca(NO 3 ) 2 , 1.0 mM de NH 4 NO 3 , 0.3 mM de KH 2 PO 4 , 0.2 mM de MgSO 4 y 25 µM de CaCl 2 , 25 µM H 3 BO 3 , 2 µM de MnSO 4 , 2 µM de ZnSO 4 , 0.5 µM de CuSO 4 , 0.5 µM de H 2 MoO 4 , 0.1 µM de NiSO 4 y 20 µM Fe(III)-EDTA. Las plantas permanecieron en contenedores de 10 L (Figura 3) y creciendo en cámaras de cultivo durante 12 d. Las condiciones de luz, humedad relativa y fotoperiodo fueron: 23ºC durante 16 h de luz y a 19ºC en 8 h de oscuridad. Transcurrido ese periodo, se iniciaron los tratamientos que fueron: i) deficiencia de Fe (0 µM Fe, pH 5,5) y ii) deficiencia de Fe en presencia de carbonato cálcico (0 µM Fe + 1 g L -1 CaCO 3 , pH 7,7). Además, otras plantas se crecieron en condiciones control (45 µM Fe(III)–EDTA y sin CaCO 3 ). Tras 6 días de tratamiento se tomaron muestras de tallo, raíz y peciolo. Este experimento se repitió 3 veces con 8 plantas por tratamiento. Figura 3. Plantas de Medicago truncatula en crecimiento en la cámara de cultivo en el momento de la aplicación de los tratamientos. Materiales y métodos 16 3.2 Preparación de las muestras para microscopía Tras la recolección , las muestras del tallo, peciolo y raíces laterales cultivadas en los distintos tratamientos, se cortaron con un bisturí bajo el agua para evitar su deshidratación. En total se hicieron 8 repeticiones de 8 plantas en cada uno de los tratamientos. Las partes que se tomaron de cada uno de los tejidos se muestran en la Figura 4. Figura 4. Partes muestreadas de raíz, tallo y peciolo de Medicago truncatula. Para seccionar el tallo evitando cortar parte de la raíz principal, las secciones fueron de aproximadamente 1 cm de longitud, tomándose de la parte basal de la planta, justo antes de las ramificaciones de los peciolos (Figura 4). En cuanto al peciolo, en todas las plantas se siguió el mismo patrón de muestreo, cogiendo aproximadamente 1-2 cm de la parte central de aquellos peciolos más adultos que mostraran síntomas de deficiencia (Figura 4). En cuanto a las raíces, en plantas ‘-Fe’ y ‘-Fe + CaCO 3 ’ se muestrearon tomando 1 cm de la parte subapical de los pelos radiculares que mostraban amarilleamiento (Figura 4). En las plantas control se tomaron de la parte subapical de las raíces secundarias. Materiales y métodos 17 3.2.1 Inclusión en agar Algunas muestras de cada tejido fueron incluidas en agar, preparado al 5% en estado semisólido a 48ºC para evitar el choque térmico de los tejidos, y disponiéndolas verticalmente para dejarlas bien posicionadas. Una vez incluidas en el agar, se dejaron enfriar en la cámara fría durante dos horas a 4ºC con el fin de solidificar el agar y dejarlo listo para el corte. Una vez frías las muestras se cortaron con el uso de un vibratomo (VT1000 S, Leica Microsystems GMBH; Figura 5) siguiendo las indicaciones de Ojeda-Barrios et al. (2011). Los cortes fueron de 60 µm. Figura 5. Vibratomo VT1000 Leica. (http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade- microtomes/details/product/leica-vt1000-s/). 3.2.2 Inclusión en resina epoxi Muestras de tallo, peciolo y raíz fueron incluidas en resina epoxi. Para ello, la preparación de la resina se hizo de la siguiente manera: Mezcla A (13 ml): 39% de Epoxi Embedding Medium + 61% de DDSA Mezcla B (15 ml): 53% de Epoxi Embedding Medium + 47% de NMA Una vez realizadas las mezclas A y B se mezclaron entre sí y a la solución final se le añadieron 16 gotas de DMP-30. La concentración final de DMP-30 fue 1.5–2.0% (v/v). Materiales y métodos 18 Para la inclusión en resina epoxi, las muestras fueron deshidratadas mediante una serie de acetona: 30% (v/v) 10 min, 60% (v/v) 10 min y 90% (v/v) 10 min. Después fueron sumergidas tres veces en acetona 100% durante 10 min, cambiando la solución cada vez. Tras la deshidratación, las muestras se sumergieron en una mezcla 1:1 (acetona:epoxi) durante 30 min. A continuación se trasladaron a una solución acetona:epoxi en proporción 1:2 dónde permanecieron otros 30 min. Posteriormente, se rellenaron las cavidades de un molde de silicona con resina al 100% donde se colocaron las muestras cuidando que quedaran dispuestas de manera adecuada para el corte. Estos moldes se mantuvieron 12 h a 40ºC y 24 h a 60ºC hasta la polimerización total de la resina. 3.2.3 Inclusión en parafina Parte de las muestras vegetales se incluyeron en parafina (Figura 6). Para este trabajo se utilizó una parafina (Tissue Embedding Medium, Paraplast Regular, Sigma) con un punto de fusión de 60ºC y se siguió el protocolo de Ruzin (1999). Para ello, las muestras fueron deshidratadas previamente mediante una serie de etanol: 30 % (v/v), 50 % (v/v), 70 % (v/v) y 100% (v/v) de 30 min cada una. Seguidamente, las muestras se sumergieron en xileno, sustancia intermediaria en términos de polaridad entre el alcohol y la parafina, y para ello se realizaron 3 cambios de 10 min cada uno. Tras los últimos 10 min el material se sumergió en moldes rellenos con parafina licuada, que se mantuvo durante 2 horas en la estufa a 60ºC y finalmente se enfriaron a 4ºC. Las muestras incluidas, tanto en resina como en parafina, se cortaron mediante un microtomo de deslizamiento (Microm HM 350 S; Figura 7) ya que la dureza del material así lo permitía. El grosor de corte decidido en función de la permisividad del material fue de 20 µm para la resina y de 30 µm para la parafina. Materiales y métodos 19 Figura 6. Inclusión en parafina de una muestra de tejido. (http://webs.uvigo.es/mmegias/6- tecnicas/3-parafina.php) Materiales y métodos 20 Figura 7. Microtomo de deslizamiento HM 350 S, Microm. (http://www.microm.de/microm%20homepage/html/hm_350_e_l.html) 3.3 Tinción de las muestras La tinción de los cortes incluidos en parafina fueron desparafinados y rehidratados según el protocolo de Ruzin (1999). Las muestras, adheridas en un portaobjetos, se sumergieron en xileno dos veces durante 10 minutos, tiempo suficiente para disolver la parafina del tejido y, a continuación, se siguió un proceso inverso a la deshidratación con una serie de alcohol de concentración decreciente: 100% (v/v) 2 min, 95% (v/v) 1 min, 70% (v/v) 1 min y 50% (v/v) 1 min. 3.3.1 Tinción de Johansen La tinción de Johansen (Johansen, 1940) utiliza el contraste entre la O safranina y el Fastgreen. Este protocolo difiere de otros protocolos de tinción que utilizan estos dos colorantes en la adición de ciertos reactivos a las soluciones de tinción y limpieza que ayudan a diferenciar mejor los tejidos. La O safranina se utiliza como colorante regresivo y requiere una decoloración con hidróxido de amonio y una diferenciación con ácido pícrico para, posteriormente, teñir con Fast-green, un colorante progresivo. En los tejidos teñidos con este método, la O safranina aparece de color rojo brillante en las paredes celulares lignificadas, suberificadas, o cutinizadas, mientras que Fast-green tiñe de color verde brillante la celulosa de las paredes celulares. Materiales y métodos 21 El procedimiento comenzó tiñendo con O safranina (1,0% p/v) durante 2 h y, a continuación, se lavaron las muestras con agua destilada hasta la total eliminación de los restos de safranina sobre el portaobjetos. Posteriormente, se hizo una diferenciación con solución de 95% etanol y 5% ácido pícrico durante 10 s para seguir con un lavado del mismo tiempo con una disolución de 95% etanol y 4 gotas de hidróxido de amonio por cada 100 ml de disolución. El hidróxido de amonio neutraliza la acción del el ácido pícrico. Se continuó con 10 s en 100% etanol y, se prosiguió tiñendo las muestras con Fast-green (0.05% p/v) durante 15 s. Transcurrido este tiempo, se aclararon, primero, utilizando la solución 2 (ver preparación más adelante) y, seguidamente, la solución 1 (ver preparación más adelante) 10 ó 15 s con cada una de ellas. Utilizando una mezcla de xileno y unas gotas de etanol se aseguró la total eliminación de restos de agua que pudieran quedar, y se terminó con dos lavados con xileno. Las soluciones 1 y 2 se prepararon siguiendo las proporciones indicadas a continuación: Solución 1: Methyl salicilato (2 vol) + EtOH (100%) (1 vol) + Xileno (1 vol) Solución 2: Solución 1 (2 vol) + EtOH (1 vol) + Xileno (1 vol) Una vez terminado el proceso, se colocó una gota del adhesivo DPX en el cubreobjetos y se tomaron las fotografías en campo claro utilizando el microscopio indicado en el apartado 3.4. 3.3.2 Safranina La safranina tiñe de rojo intenso las paredes celulares lignificadas y las cutículas. Para realizar esta tinción se tomo como referencia el protocolo de Johansen. En primer lugar los cortes, ya colocados sobre el portaobjetos, se tiñeron con O safranina (1.0% p/v) durante 2 horas y, a continuación, se hizo un lavado con agua destilada. Seguidamente, se diferenció mediante una solución de 95% etanol (v/v) y 5% ácido pícrico (v/v) 10-15 s. La actividad del ácido se neutralizó utilizando una solución de 95% etanol (v/v) con 4 gotas de hidróxido de amonio por cada 100 ml de disolución durante 10-15 s, y se siguió con un aclarado del mismo tiempo con etanol al 100%. Se continuó la deshidratación de las muestras con una mezcla de xileno y unas gotas de etanol, y se finalizó con dos cambios de xileno de 10 s cada uno y colocando el cubreobjetos sobre el corte utilizando DPX como adhesivo. Resultados 28 Figura 9. Cortes de tallo de Medicago truncatula observados a 10X. Imágenes de autofluorescencia (A-C) y de tinción con floroglucinol (D-F) de las plantas con tratamientos: control (A y D), deficiente en Fe (B y E) y deficiente en Fe con CaCO 3 en el medio (C y F). X: xilema; F: Floema; C: córtex; Ep: epidermis. Los cortes se realizaron con el vibratomo a 60 µm. Resultados 29 Histología del peciolo La Figura 10 muestra cortes transversales de peciolo muestreados según se indica en la Figura 4 para las plantas control (A y D) y deficientes en Fe tratadas sin (B y E) o con CaCO 3 (C y F). Los paneles A-C muestran imágenes de auto-fluorescencia y los paneles D-F muestran la tinción con floroglucinol. Los peciolos de las plantas control mostraron auto-fluorescencia de color azul intenso principalmente localizada en los vasos xilemáticos y en el esclerénquima, indicándonos las zonas de deposición de la lignina ( Figura 10 , A). Aunque la tinción con floroglucinol ( Figura 10 , D) dio positivo en las mismas zonas que la imagen de auto-fluorescencia, el xilema mostró una tinción mayor (coloración Burdeos intensa) que el esclerénquima ( Figura 10 , D). La deficiencia de Fe causa cambios en la auto-fluorescencia azul ( Figura 10 , A versus B y C) y en la tinción con floroglucinol ( Figura 10 , D versus E y F) de los peciolos nuevos ya crecidos éstas condiciones. Sin embargo, este efecto de la deficiencia sobre la lignificación del peciolo estuvo afectado por la presencia de CaCO 3 en el medio especialmente en la zona del esclerénquima. Así, los peciolos de las plantas deficientes en Fe y no tratadas con CaCO 3 ( Figura 10 , B), mostraron una auto-fluorescencia azul menos intensa tanto en el xilema como en las células del esclerénquima cuando se comparan con las plantas control. La tinción con floroglucinol confirma la acusada disminución de la lignificación del esclerénquima presentada por esta plantas (‘-Fe - CaCO 3 ’), ya que no dio positivo para esta zona del tejido ( Figura 10 , E). Por el contrario, el xilema de estas plantas mostró una intensa tinción con floroglucinol que no difiere de las plantas control ( Figura 10 , E versus D). La presencia de CaCO 3 en el medio intensificó la disminución de la auto-fluorescencia azul de los vasos xilemáticos producida por la deficiencia de Fe, de manera que la parte más interna de este tejido no presenta auto-fluorescencia azul y aparece de una coloración verdosa ( Figura 10 , C). Sin embargo, dado que la tinción con floroglucinol fue fuertemente positiva en toda esta zona ( Figura 10 , F), lo que indica la presencia de lignina, se puede inferir un cambio de composición de la lignina que afecta a la proporción de los grupos fluoróforos responsables de la auto-fluorescencia azul. En cuanto a la auto-fluorescencia azul de la zona del esclerénquima, la presencia de CaCO 3 en el medio ( Figura 10 , C) causa un efecto contrario al observado en las plantas deficientes en Fe que no fueron tratadas CaCO 3 ( Figura 10 , B), ya que los peciolos de las plantas ‘-Fe + CaCO 3 ’ mostraron una intensa auto-fluorescencia azul que fue incluso mayor que la de las plantas control Resultados 30 ( Figura 10 , A). Esto fue completamente confirmado por la tinción con floroglucinol que fue la más intensa de las obtenidas para esta zona ( Figura 10 , F versus D y E). Figura 10. Cortes de peciolo de Medicago truncatula observados a 20X. Imágenes de autofluorescencia (A-C) y de tinción con floroglucinol (D-F) de las plantas con tratamientos: control (A y D), deficiente en Fe (B y E) y deficiente en Fe con CaCO 3 en el medio (C y F). X: xilema; F: Floema; Es: Esclerénquima; Ep: epidermis. Los cortes se realizaron con el vibratomo a 60 µm. Discusión 31 5. Discusión El estado de desarrollo de las plantas de Medicago truncatula concuerdan con lo descrito anteriormente en estudios de deficiencia de Fe en esta especie (Andaluz et al. 2009; Rodríguez-Celma et al. 2011a, 2011b, y Rodríguez-Celma et al. en preparación) dónde se describe el efecto de la deficiencia de este elemento sobre enzimas claves en la adquisición de Fe por la raíz (Andaluz et al. 2009; Rodríguez-Celma et al. 2011a) así como sobre el proteoma de raíz, tallo y peciolo (Rodríguez-Celma et al. 2011b y Rodríguez-Celma et al. en preparación). En todos estos estudios, la deficiencia de Fe causó una severa clorosis en las zonas más jóvenes de la parte aérea, además de una alteración de la morfología de la raíz. Los resultados presentados en este trabajo señalan que la deficiencia de Fe también afecta a la lignificación de raíces secundarias y peciolos jóvenes. Los haces vasculares, concretamente el xilema, además del esclerénquima y la banda de Caspari fueron los tejidos más afectados. Además, la presencia de CaCO 3 en el medio cambió el patrón de deposición de la lignina en plantas deficientes en Fe. Así, una menor lignificación en plantas deficientes en Fe no tratadas con CaCO 3 , fue observada a nivel de partes jóvenes tanto de raíz como de peciolo, quedando excluido de estos cambios el tallo, ya que se formó durante el periodo en el cual la planta no estaba deficiente en Fe. Sin embargo, cuando la deficiencia de Fe es acompañada de CaCO 3 , el efecto sobre la lignina se reduce al peciolo encontrándose un aumento de lignina tanto en el xilema como en el esclerénquima. Este hecho está de acuerdo con el incremento de aproximadamente 5 veces de dos proteínas (CAD y CCoA-OMT) directamente involucradas en la formación de lignina (ver Figura 1) observado en peciolos jóvenes de Medicago truncatula exclusivamente cuando se crecen en deficiencia de Fe con aporte de CaCO 3 (Rodríguez- Celma et al., 201x). La disminución de lignina en plantas con clorosis férrica y, por tanto, con una baja actividad fotosintética, concuerda con el hecho de que un estado óptimo de fotosíntesis es crucial para el funcionamiento de la ruta de biosíntesis de los fenilpropanoides, de la cual procede la formación de lignina (Vogt, 2010). Sin embargo, esto contrasta con el incremento de la lignificación observado en las plantas ‘-Fe + CaCO 3 ’. Este aumento de lignina y su localización en tejidos adyacentes a los haces vasculares, podría deberse a un mecanismo de protección frente al posible efecto tóxico de altas concentraciones de Discusión 32 Ca, ya que este mecanismo ha sido descrito para elementos tóxicos como el Cd en Arabidopsis y Brassicas (Lux et al. 2011; Redjala et al. 2011; Nasser et al. 2012). Estos estudios proponen un incremento de la lignificación de los tejidos adyacentes a los vasos, para restringir el paso y distribución de estos elementos a las distintas partes de los órganos a nivel tisular. Cabe destacar que el incremento de la lignificación, especialmente del xilema, fue acompañado de cambios en la auto-fluorescencia que sugieren cambios en la composición de la lignina. Así, una deficiencia energética como la que ocurre en las plantas cloróticas podría aumentar la formación de la lignina tipo H en detrimento de la lignina de tipo G y S, ya que éstas últimas requieren más gasto energético para la planta (Chapple et al., 1992). Esto tendría efectos en la autofluorescencia observada, ya que recientemente se ha descrito que la lignina tipo G autofluoresce en un azul más intenso mientras que la lignina tipo H lo hace cercano al verde (Djkonovic et al. 2012). Nuestros resultados nos llevan a proponer que la autofluorescencia verdosa observada en el xilema de peciolo de plantas deficientes en Fe tratadas con CaCO 3 , podría ser debida a la deposición preferencial en este tejido de lignina tipo H. Mejoras técnicas 33 6. Adecuación de las técnicas de microscopía para la tinción de lignina en tejidos de M. truncatula Al comienzo de este estudio se planteó el uso de auto-fluorescencia y las tinciones de safranina, floroglucinol y Johansen con el objetivo de evaluar cuales eran las más adecuadas para estudiar las posibles variaciones en la lignificación inducidas por la deficiencia de Fe en Medicago trucatula. Las imágenes tomadas mediante safranina y Johansen (Imágenes 12 y 14 del Anexo I), no resultaron adecuadas por los siguientes motivos: • En esta especie, la tinción con safranina no fue específica para la lignina ya que tiñó toda la pared celular. Esto no permitió diferenciar la celulosa de la lignina y, por lo tanto, no se apreciaron diferencias entre tratamientos (Figura 13 del Anexo I). • La tinción de Johansen permitió una buena visualización de los tejidos lignificados (Figura 15 del Anexo I). Sin embargo, esta técnica se podría mejorar para Medicago truncatula mediante una optimización de la fase de lavado con el fin de mantener la diferenciación entre los colorantes (Figura 15, E y F). Por otro lado, la auto-fluorescencia y la tinción con floroglucinol, aunque dieron buenos resultados (Figuras 8-10), son susceptibles a cambios para incrementar su eficiencia resolutiva. A continuación, presentaremos algunas de las propuestas para la mejora de estas técnicas: • Las imágenes de auto-fluorescencia de raíz mostraron interferencias derivadas de la presencia de flavinas que también fluorescen (Figura 8, B y C). Una posible solución a estas interferencias sería el tratamiento de los cortes con un compuesto de contraste como puede ser el Azul de Toluidina, disminuyendo la señal de autofluorescencia emitida por los tejidos. Posteriormente, debería ser teñido con un colorante exaltador como el Fluorol Yellow en el caso del estudio de la lignina. • La calidad de las imágenes de la tinción con floroglucinol podría mejorarse mediante una disminución en el grosor de los cortes y para ello se propone el uso de fijadores (p. ejemplo, paraformaldehído) junto a un cambio de inclusión a parafina. Esta mejora proporcionaría un endurecimiento de los tejidos y una Mejoras técnicas 34 matriz que mantiene su estructura en el momento del corte, pudiéndose realizar cortes más finos sin un desgarramiento y/o rotura de las distintas capas de células. Mejoras técnicas 35 7. Conclusiones 1. La tinción con floroglucinol y la auto-fluorescencia resultan generalmente adecuadas para evaluar los cambios en la lignificación inducidos por deficiencia de Fe en plantas de Medicago truncatula. 2. La deficiencia de Fe induce una menor lignificación de las zonas en crecimiento como raíces secundarias y peciolos en Medicago truncatula. 3. La deficiencia de Fe en presencia de CaCO 3 produce un incremento en la lignificación de las paredes celulares tanto a nivel del xilema como del esclerénquima en peciolos jóvenes de Medicago truncatula. Bibliografía 36 8. Bibliografía Abadía, J., y Abadía, A. (1993). Iron and plant pigments. In Iron chelation in plants and soil microorganisms L.L. Barton, y B.C. Hemming, eds. (San Diego: Academic), pp. 327- 343. Abadía, J., Vázquez, S., Rellán-Álvarez, R., El-Jendoubi, H., Abadía, A., Álvarez- Fernández, A., y López-Millán, A.F. (2011). Towards a knowledge-based correction of iron chlorosis. Plant Physiol Biochem 49, 471-482. Aitken, Y. (1955). Flower initiation in pasture legumes. III. Flower initiation in Medicago tribuloides Desr. and other annual medics. Aust J Agric Res 6, 258-264. Alcántara, E., de la Guardia, M.D. y Romera, F. J. (1991). Plasmmalemma redox activity and H+ extrusion in roots of Fe-deficient cucumber plants. Plant Physiol 96, 1034-1037. Andaluz, S., Rodríguez-Celma, J., Abadía, A., Abadía, J., y López-Millán, A.F. (2009). Time course induction of several key enzymes in Medicago truncatula roots in response to Fe deficiency. Plant Physiol Biochem 47, 1082-1088. Barker, V.A. y Pibeam, D.J. (2006). Plant Nutrition 6ª edition. Barker A. y Pibeam D.J.(eds). 3- 18 Bell, P.F., Chaney, R.L. y Angle, J.S. (1988). Staining localization of ferric reduction on roots. J Plant Nutr 11, 1237-1252. Briat, J.F. y Lobréaux, S. (1997). Iron transport and storage in plants. Trends in Plant Science 2, 187-193. Cesco, S., Neumann, G., Tomasi, N., Pinton, R. y Weisskopf, L. (2010). Release of plantborne flavonoids into the rhizosphere and their role in plant nutrition, Plant Soil 329, 1-25 Chaney, R.L. (1984). Diagnostic practices to identify iron deficiency in higher plants. J Plant Nutr 7, 47-67. Chapple, C. C. S., Vogt, T., Ellis, B. E. y Somerville C.R. (1992). An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant Cell a, 1413-1424. Chen, Y. y Barak, P. (1982). Iron nutrition of plants in calcareous soils. Adv Agron 35, 217- 240. Clark, R.B. (1983). Plant genotype differences in the uptake, translocation, acumulation and use of mineral elements required for plant growth. Plant and Soil 72, 175-196 Djikanovic, D., Simonovic, J., Savic, A. Ristic, I., Bajuk-Bogdanovic, D. Kalazi, A. Cakic, S. Budiuski-Smendic, J. Milonad, J. y Ksenija R. (2012). Structural differences between lipin model polymers. J. Poly Enurom (2012) in press. Donnini, S. Dell´Orto, M y Zocchi, G. Oxidative stress response and root lignification induced by Fe deficiency conditions in pear and quince genotipes. Three Physiology 31, 102-113. Eide, D., Broderius, M., Fett, J., y Guerinot, M.L. (1996). A novel iron-regulated metal transporter from plants identified by functional expression in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5624-5628. Espen, L., Dell'Orto, M., De Nisi, P. y Zocchi, G. (2000). Metabolic responses in cucumber (Cucumis sativus L.) roots under Fe-deficiency: a 31P-nuclear magnetic resonance in-vivo study. Planta 210, 985-992. Fox, T.C., y Guerinot, M.L. (1998). Molecular Biology of Cation Transport in Plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49, 669-696. Bibliografía 37 Hutchinson, T.C. (1967). Coralloid root systems in plants showing lime-induced chlorosis. Nature 214, 943-945. Ishimaru, Y., Kim, S., Tsukamoto, T., Oki, H., Kobayashi, T., Watanabe, S., Matsuhashi, S., Takahashi, M., Nakanishi, H., Mori, S. y Nishizawa, N.K. (2007). Mutational reconstructed ferric chelate reductase confers enhanced tolerance in rice to iron deficiency in calcareous soil. Proc Natl Acad Sci USA 104, 7373-7378. Jiménez, S., Morales, F., Abadía, A., Abadía, J., Moreno, M.A. y Gogorcena, Y. (2009). Elemental 2-D mapping and changes in leaf iron and chlorophyll in response to iron re-supply in iron-deficient GF 677 peach-almond hybrid. Plant Soil 315, 93-106. Johansen, D.A. (1940). Plant microtechnique. McGraw-Hill Book Company, inc. Jones, L. Emmos, A.R. y Tunner, S.R. (2001). Cloning and characterization of irregular xilem 4: o severely lignin deficient mutant of Arabidopsis. Plant J 26, 205-216. Kashirad, A. y Marschner, H. (1974). Effect of pH and phosphate on iron nutrition of sunflower and corn plants. Agrochimica 6, 497–508. Lesins, K.A. and Lesins, L. (1979). Genus Medicago (Leguminosae). A taxogenetic study. Dr W. Junk bv Publishers, The Hague-Boston-London, 228 p. Lindsay, W.L., y Schwab, A.P. (1982). The chemistry of iron in soils and its availability to plants. Journal of Plant Nutrition 5, 821-840. López-Millán A. F., Berggren, K., Chernokalskaya, E., Lazarev, A., Robinson, M. y Patton, W.F. (2000). A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis 21, 3673-3683 Lux, A., Martinka, M., Vaculik, M. y White, P.J. (2011) Root responses to cadmium in the rhizosphere: a review. Journal of Experimental Botany 62: 21-37. Marschner, H. (1995). Mineral nutrition of higher plants (London: Academic Pres). Mengel, K. y Geurtzen, G. (1986). Iron chlorosis on calcareous soils. Alkaline nutritional condition as the cause for the chlorosis. J Plant Nutr 9, 161-173. Moog, P.R., van der Kooij, T.A.W., Brüggemann, W., Schiefelbein, J.W. y Kuiper, P.J.C. (1995). Responses to iron deficiency in Arabidopsis thaliana: The turbo iron reductase does not depend on the formation of root hairs and transfer cells. Planta 195, 505-513. Morales, F., Abadía, A. y Abadía, J. (1990). Characterization of the xanthophyll cycle and other photosynthetic pigment changes induced by iron deficiency in sugar beet (Beta vulgaris L.). Plant Physiol. 94, 607-613. Morales, F., Cerovic, Z.G. y Moya, I. (1994). Characteristics of blue-green fluorescence in the mesophyll of sugar beet (Beta vulgaris L.) leaves affected by iron deficiency. Plant Physiol. 106, 127-133. Morales, F., Grasa, R., Abadía, A. y Abadía, J. (1998). Iron chlorosis paradox in fruit trees. Journal of Plant Nutrition 21, 815-825. Naseer, S., Lee, Y., Lapierre, C., Franke, R., Nawrath, C. y Geldner, N.(2012)Casparian strip diffusion barrier in Arabidopsis is made of a lignin polymer without suberin. Proc Natl Acad Sci U S A. 109(25):10101-6. Nozoye, T., Nagasaka, S., Kobayashi, T., Takahashi, M., Sato, Y., Sato, Y., Uozumi, N., Nakanishi, H. y Nishizawa, N.K. (2011). Phytosiderophore efflux transporters are crucial for iron acquisition in graminaceous plants. J Biol Chem 286, 5446-5454. Anexo 1 44 porta con huevina, que adquirió coloración con el Fast-green provocando la aparición de manchas de fondo en las imágenes. Como se comenta en el apartado de metodología, a pesar de que hasta el momento de la elaboración de este trabajo no se obtuvieron buenos resultados, la técnica parece ser prometedora, y se seguirá trabajando con ella en un futuro.