Repositorio Institucional de Documentos

Me gustaría dar las gracias… A Rosa y Peña, por su ayuda, sus consejos y disponibilidad. A Munia, Pili, Jorge y Andrea, por ayudarme en mis comienzos en el mundo de la microbiología. A todos mis compañeros de laboratorio por hacer más ameno el trabajo diario, en especial a Isabel y Noelia por echarme una mano siempre que lo he necesitado. A José Luis, por estar siempre ahí y darme ánimos en todo momento. A mi familia y mis amigos, por su paciencia y su apoyo incondicional. Inactivación de Enterococcus sp. presentes en aguas de salida de depuradora, mediante procesos convencionales y avanzados de oxidación Resumen El agua que sale de las depuradoras todavía contiene una serie de contaminantes, entre los que se encuentran los microorganismos patógenos, capaces de causar enfermedades en el hombre. El agua residual depurada puede reutilizarse con distintitos fines, incluyendo usos agrícolas, urbanos, industriales, recreativos o medioambientales, siempre que cumpla con los criterios de calidad establecidos en la legislación. El objetivo principal de este trabajo es evaluar la eficacia de diversos procesos de desinfección sobre un agua residual depurada con vistas a su reutilización, utilizando Enterococcus sp., una bacteria grampositiva patógena para el hombre, como indicador bacteriano de origen fecal. Los tratamientos de desinfección aplicados incluyen procesos comunes como la cloración, y diversos procesos de oxidación avanzada: ozonización, peroxona (O3/H2O2), irradiación/H2O2, fotocatálisis (irradiación/TiO2) y fotocatálisis/H2O2. Se estudia el efecto del tiempo de tratamiento, dosis y tipo de agentes desinfectantes. Además, mediante estudio de las cinéticas de inactivación bacteriana se evalúa la eficiencia de los tratamientos de desinfección aplicados en este trabajo y se comparan los resultados con los obtenidos en el grupo de investigación, Calidad y Tratamiento de Aguas de la Universidad de Zaragoza, en procesos de potabilización de aguas naturales. Finalmente, se realiza un estudio económico de los tratamientos de desinfección aplicados en el presente trabajo. La cloración resulta el tratamiento más efectivo y económico de los estudiados, ya que alcanza la inactivación total de la población de enterococos (7’5 unidades logarítmicas). El aumento de la dosis de cloro en el rango estudiado (3’8 - 65 mg/L Cl2) supone un aumento de la velocidad de desinfección, como se observa en las constantes de velocidad de inactivación bacteriana de los diversos modelos matemáticos aplicados. Los tratamientos basados en ozono, ozonización y peroxona, con dosis de 1’4 y 20 mg/L H2O2, consiguen también una desinfección eficaz (6 unidades logarítmicas de inactivación) con un consumo de ozono de hasta 110 mg/L O3, aunque con cinéticas de inactivación más lentas y un coste más elevado, debido principalmente al asociado a la generación de ozono. La adición de H2O2 en las dosis aplicadas no influye sobre la eficacia del proceso. De los tratamientos basados en irradiación UV/visible (320-800 nm) el único que supera la unidad logarítmica de inactivación es la fotocatálisis/H2O2, siendo necesario un tiempo de tratamiento prolongado (60 minutos) y una concentración de 680 mg/L H2O2 para alcanzar 4 unidades logarítmicas de inactivación. El coste de este tratamiento es muy elevado debido al coste del TiO2 empleado. Utilizando las mismas condiciones de operación (tiempo, tipo y dosis de agentes desinfectantes), las constantes de velocidad de inactivación de Enterococcus sp. son mayores en aguas naturales que en aguas de salida de depuradora, lo que supone una desinfección más rápida y eficaz en las primeras, o la necesidad de aumentar los tiempos de tratamiento y las dosis para las aguas de salida de depuradora. i Índice Memoria CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS ..................................................................................................1 CAPÍTULO 2. CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICA DE LAS AGUAS DE SALIDA DE DEPURADORA ..........................................................................................................................................................3 CAPÍTULO 3. TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN ......................................................................................5 3.1. TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN CONVENCIONALES: CLORACIÓN ..................................................... 5 3.2. PROCESOS DE OXIDACIÓN AVANZADA ........................................................................................... 6 3.2.1. Tratamientos basados en ozono .................................................................................. 6 3.2.2. Tratamientos basados en luz UV/visible ...................................................................... 7 CAPÍTULO 4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Y TRATAMIENTO DE DATOS ............................. 11 4.1. METODOLOGÍA ANALÍTICA ....................................................................................................... 11 4.1.1. Análisis de parámetros físico-químicos ...................................................................... 11 4.1.2. Análisis de parámetros microbiológicos: Enterococcus sp. ........................................ 12 4.2. MUESTRAS ............................................................................................................................ 14 4.3. TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN APLICADOS .............................................................................. 15 4.3.1. Cloración .................................................................................................................... 15 4.3.2. Tratamientos basados en ozono ................................................................................ 16 4.3.3. Tratamientos basados en luz UV/vis (320-800 nm) ................................................... 17 4.4. TRATAMIENTO DE DATOS: MODELOS CINÉTICOS DE INACTIVACIÓN MICROBIANA ................................. 19 CAPÍTULO 5. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN ...................................................................................... 21 5.1. RESULTADOS DE INACTIVACIÓN DE ENTEROCOCCUS SP. .................................................................. 21 5.1.1. Cloración .................................................................................................................... 21 5.1.2. Tratamientos basados en ozono ................................................................................ 23 5.1.3. Tratamientos basados en luz UV/visible .................................................................... 24 5.2. MODELIZACIÓN CINÉTICA ......................................................................................................... 26 5.2.1. Cloración .................................................................................................................... 26 5.2.2. Tratamientos basados en ozono ................................................................................ 28 5.2.3. Tratamientos basados en luz UV/vis.......................................................................... 31 5.3. ESTUDIO ECONÓMICO ............................................................................................................. 32 5.3.1. Cloración .................................................................................................................... 32 5.3.2. Tratamientos basados en ozono ................................................................................ 33 5.3.3. Tratamientos basados en luz UV/visible .................................................................... 34 CAPÍTULO 6. CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 37 CAPÍTULO 7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 39 ii Anexos ANEXO I. CRITERIOS DE CALIDAD DEL AGUA REUTILIZADA SEGÚN SUS USOS ............................. 47 ANEXO II. TERMINOLOGÍA MICROBIOLÓGICA........................................................................................... 53 ANEXO III. DESARROLLO DE LA METODOLOGÍA ANALÍTICA FÍSICO-QUÍMICA ............................. 55 III.I. PH ...................................................................................................................................... 55 III.II. TURBIDEZ ........................................................................................................................... 55 III.III. CONDUCTIVIDAD ................................................................................................................. 55 III.IV. SÓLIDOS EN SUSPENSIÓN TOTALES (SST) ................................................................................. 55 III.V. CARBONO ORGÁNICO TOTAL (COT) ......................................................................................... 55 III.VI. DEMANDA QUÍMICA DE OXÍGENO (DQO) ............................................................................... 57 III.VII. PERÓXIDO DE HIDRÓGENO (H2O2) ........................................................................................ 57 III.VIII. NITRÓGENO AMONIACAL (N-NH3) ...................................................................................... 57 III.IX. CLORO LIBRE ...................................................................................................................... 57 III.X. DEMANDA DE CLORO ............................................................................................................. 57 ANEXO IV. METODOLOGÍA MICROBIOLÓGICA........................................................................................... 59 IV.I. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL DE FORTIFICACIÓN DE MUESTRAS CON ENTEROCOCCUS SP. ................. 59 IV.II. TINCIÓN DE GRAM ................................................................................................................ 60 IV.III. ANÁLISIS DE ENTEROCOCCUS SP. ............................................................................................ 62 IV.III.i. Medios de cultivo ..................................................................................................... 62 IV.III.ii. Diluciones decimales seriadas ................................................................................. 62 IV.III.iii. Métodos de siembra .............................................................................................. 63 IV.III.iv. Repetibilidad del método de análisis de Enterococcus sp. ..................................... 64 ANEXO V. TRATAMIENTOS BASADOS EN OZONO ..................................................................................... 67 V.I. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INSTALACIÓN DE OZONIZACIÓN ........................................................ 67 V.II. CALIBRACIÓN DEL OZONIZADOR ................................................................................................ 67 V.II.i. Método yodométrico .................................................................................................. 67 V.II.ii. Recta de calibrado ..................................................................................................... 68 ANEXO VI. MODELOS CINÉTICOS DE INACTIVACIÓN MICROBIANA ................................................... 69 VI.I. DESCRIPCIÓN DE MODELOS ...................................................................................................... 69 VI.I.i. Modelo de Hom (1972) ............................................................................................... 71 VI.I.ii. Modelo de Hom modificado (1994) ........................................................................... 71 VI.I.iii. Modelo bifásico de Pruitt y Kamau (1993) ............................................................... 72 VI.I.iv. Modelo de Mafart (2002) ......................................................................................... 72 VI.I.v. Modelo de Geeraerd (2000) ....................................................................................... 73 VI.II. AJUSTE DE DATOS EXPERIMENTALES E ÍNDICES DE ERROR .............................................................. 73 ANEXO VII. RESULTADOS .................................................................................................................................. 75 VII.I. RESULTADOS DE INACTIVACIÓN ............................................................................................... 75 VII.I.i. Cloración ................................................................................................................... 75 VII.I.ii. Tratamientos basados en ozono .............................................................................. 76 VII.I.iii. Tratamientos basados en luz UV/visible ................................................................. 77 VII.II. CINÉTICAS DE INACTIVACIÓN .................................................................................................. 78 VII.II.i. Cloración .................................................................................................................. 78 VII.II.ii. Tratamientos basados en ozono ............................................................................. 82 VII.II.iii. Tratamientos basados en luz UV/vis ...................................................................... 85 Capítulo 2. Contaminación microbiológica de las aguas de salida de depuradora 4 Cabe destacar que la presencia de microorganismos patógenos en el agua de salida de depuradora no sólo puede suponer un riesgo para la salud de las personas, puesto que son transmisores de enfermedades, sino también causar turbidez, mal olor e incrementar la demanda de oxígeno. Los patógenos presentes en el agua residual no suelen medirse de forma directa ya que sus concentraciones varían y los procedimientos analíticos son difíciles de realizar o tienen un coste elevado. En su lugar, se utilizan indicadores de contaminación fecal, como Escherichia coli, coliformes termotolerantes, o enterococos intestinales, cuya medida representa la concentración de patógenos con propiedades similares en el agua residual. La presencia de estos grupos de bacterias no siempre supone un riesgo por sí misma, sino que indica la posible existencia de patógenos causantes de enfermedades como bacterias, virus y protozoos que también viven en el sistema digestivo de animales y humanos [WHO, 2006]. Además, estos indicadores pueden servir para cuantificar la eficacia de un tratamiento de desinfección. Sin embargo, no existe un organismo que sea el indicador perfecto, ya que cada microorganismo presenta distinta resistencia a los tratamientos de desinfección, normalmente siguiendo este orden: bacterias no formadoras de esporas < virus < bacterias formadoras de esporas < helmintos < protozoos [Malato et al., 2009]. Aunque el RD 1620/2007 solo establece límites máximos para Escherichia coli, una bacteria gramnegativa, se considera necesario el estudio de los tratamientos de desinfección sobre otro tipo de bacterias más resistentes, como son los enterococos, bacterias grampositivas, que poseen una pared celular mucho más gruesa y por tanto resultan más difíciles de inactivar. Por eso, el microorganismo objeto de estudio del presente trabajo de investigación es Enterococcus sp., una bacteria que debido a su origen fecal se encuentra comúnmente en el agua de salida de depuradora. Los enterococos resultan un indicador útil tanto en aguas superficiales como en aguas marinas ya que su comportamiento se asimila más al de muchos patógenos que otros indicadores [water.epa.gov]. El género Enterococcus sp. presenta células esféricas u ovoides (cocos) en parejas o cadenas cortas, no esporuladas, a veces inmóviles, con un tamaño de 0’6 a 2’5 µm. Son bacterias anaerobias facultativas, grampositivas, quimioheterótrofas, y mesófilas, que fermentan los hidratos de carbono a lactato sin producción de gas. Algunas especies representativas del género Enterococcus sp. son E. faecalis, E. faecium, E. avium, E. durans y E. gallinarum. Los enterococos como E. faecalis, un patógeno oportunista que puede producir infecciones urinarias y endocarditis, son habitantes normales del tracto intestinal de los seres humanos y de la mayoría de los animales [Willey et al., 2009]. En el ANEXO II se describen con más detalle algunos de los términos microbiológicos utilizados. Teniendo en cuenta los criterios de calidad que ha de cumplir el agua para poder reutilizarse y las concentraciones de microorganismos presentes en el agua de salida de depuradora, en la mayoría de los casos va a ser necesario someter dicha agua a un tratamiento adicional de desinfección. En el Capítulo 3 se describen algunos de estos tratamientos enfocados a la eliminación de los microorganismos patógenos presentes en el agua. Capítulo 3. Tratamientos de desinfección 5 CAPÍTULO 3. TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN La desinfección se define como la destrucción parcial de los microorganismos patógenos mediante tratamientos físicos o químicos. Además de prevenir la propagación de enfermedades, en el caso de aplicar la desinfección en aguas residuales depuradas, se protegen los abastecimientos de agua potable, las aguas de baño y las zonas de vida piscícola. En este capítulo se describen algunos tratamientos de desinfección tanto convencionales como de oxidación avanzada habitualmente utilizados. 3.1. Tratamientos de desinfección convencionales: Cloración La cloración es el tratamiento de desinfección más antiguo y continúa siendo un importante método para desinfectar el agua residual municipal. El cloro está disponible en diversas formas, cuyas características influyen en gran medida sobre el sistema de desinfección. Se puede utilizar cloro líquido o gaseoso, o bien en forma de hipoclorito de sodio (NaClO) o de calcio (Ca(ClO)2). El hipoclorito de sodio, comúnmente conocido como lejía, es la forma más utilizada. Se trata de un líquido transparente que suele comercializarse en concentraciones de 5%, 10% y 15% en peso de cloro disponible. En algunas EDARs de gran tamaño se prefiere el uso de NaClO como medida para evitar el peligro que supone el almacenamiento de cloro líquido o gaseoso en contenedores a elevadas presiones de vapor. El cloro que se añade al agua residual depurada reacciona en cuestión de segundos con el nitrógeno amoniacal presente, dando lugar a la formación de cloraminas (NH2Cl, N2HCl, N3Cl). Simultáneamente, se producen otras reacciones con otros iones inorgánicos como S2-, HS-, SO32-, NO2- Fe2+ y Mn2+. Estas sustancias reaccionan tanto con el cloro libre como con las cloraminas, reduciendo ambos compuestos al ion cloruro, que es estable y no bactericida. El consumo de cloro durante el primer minuto de tratamiento se debe principalmente a su reacción con sustancias inorgánicas, mientras que durante los siguientes minutos el cloro reacciona con los compuestos orgánicos de forma mucho más lenta [Black & Veatch Corporation, 2010]. La eliminación de microorganismos durante la cloración se produce por difusión del cloro a través de la pared celular, produciendo una disfunción de los grupos enzimáticos internos y por tanto, inactivando las células. Además, el cloro puede reaccionar con los materiales de la pared celular, por ejemplo, oxidando los grupos amino de proteínas, lo que disminuye la fortaleza de la pared y acaba matando la célula. Sin embargo, la cloración no afecta a la integridad de la célula por lo que no se observan daños severos en la superficie de la célula ni lisis celular [Diao et al., 2004]. Los principales parámetros a tener en cuenta para llevar a cabo la cloración son el tiempo de contacto (T), la dosis o concentración de cloro (C) y la agitación, ya que la desinfección del agua mediante cloración es más eficaz si hay buena mezcla en el punto de aplicación. A menudo, en la práctica suele utilizarse el parámetro CT, combinación de la concentración de cloro (C) y el tiempo de contacto (T). Uno de los problemas más importantes que plantea la cloración es la formación de subproductos de desinfección, como los trihalometanos (THMs), compuestos formados por reacción del cloro con las sustancias orgánicas presentes en el agua. Los THMs son Capítulo 3. Tratamientos de desinfección 6 cancerígenos, por lo que resulta imprescindible minimizar su generación. Para ello hay que considerar diversas variables como la concentración de precursores de THMs, la concentración de cloro libre, el tiempo de contacto, la temperatura, el pH, la concentración de iones bromuro y yoduro, etc. Los THMs más importantes en el agua son el cloroformo, el bromodiclorometano, el dibromoclorometano y el bromoformo [Black & Veatch Corporation, 2010]. 3.2. Procesos de oxidación avanzada Los procesos de oxidación avanzada (POAs) se basan en la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS), entre las que destaca el radical hidroxilo (*OH) por su elevado poder oxidante, tan solo superado por el del flúor. El radical hidroxilo es capaz de degradar una amplia variedad de compuestos orgánicos y de inactivar microorganismos patógenos. La formación de ROS puede iniciarse mediante fotólisis, ozono, peróxido de hidrógeno, calor, etc. Durante los POAs tienen lugar un gran número de reacciones, por lo que resulta difícil predecir todos los productos de oxidación. Además, el grado de oxidación de compuestos orgánicos y la desinfección alcanzadas dependen de multitud de factores, como la concentración de contaminantes, la concentración de oxígeno, el pH, la temperatura, la presencia de “scavengers” o atrapadores de radicales (ej. ión bicarbonato)… [Parsons, 2004]. A continuación se describe el fundamento teórico de los POAs aplicados en el presente trabajo de investigación. 3.2.1. Tratamientos basados en ozono Ozonización El ozono (O3) se lleva utilizando desde hace mucho tiempo en las estaciones de tratamiento de aguas potables para desinfectar, controlar los compuestos que generan malos olores y sabores, y eliminar el color del agua. El ozono puede reaccionar mediante dos mecanismos: de forma directa o indirecta. Cuando el pH del agua a tratar es ácido, prevalece la reacción directa del ozono, que es muy selectiva. Por ejemplo, el ozono reacciona con la materia orgánica por adición electrofílica a los dobles enlaces. Por otra parte, el ozono se descompone en el agua generando radicales hidroxilo que reaccionan de manera no selectiva con los contaminantes presentes. El poder oxidante del ozono (2’07 eV) es inferior al del radical hidroxilo (2’80 eV), por lo que interesa favorecer la formación de *OH. Esto puede conseguirse aumentando el pH del medio, adicionando H2O2, combinando el O3 con luz ultravioleta… En general, a pH neutro el ozono reacciona mediante los dos mecanismos citados [Matilainen y Sillanpää, 2010]. Los elevados potenciales de oxidación del ozono y del radical hidroxilo hacen de la ozonización un potente tratamiento de desinfección. Durante la ozonización, la inactivación de las células tiene lugar debido a la desintegración de la pared de la célula y la consiguiente lisis celular [Diao et al., 2004]. Sistema peroxona (O3/H2O2) La combinación del ozono con el peróxido de hidrógeno recibe el nombre de sistema peroxona. El H2O2 es un iniciador del mecanismo radicalario del ozono, favoreciendo la formación de radicales hidroxilo. Capítulo 3. Tratamientos de desinfección 7 Uno de los parámetros a optimizar en el sistema peroxona es el ratio O3/H2O2, ya que el peróxido de hidrógeno no solo actúa como generador de *OH, sino como “atrapador” de estos radicales. El rango óptimo de concentración de H2O2 depende del tipo de contaminantes presentes y su concentración en el agua a tratar [Kosaka et al., 2001]. 3.2.2. Tratamientos basados en luz UV/visible Radiación solar La radiación solar que llega a la superficie terrestre comprende un rango que va desde el infrarrojo hasta el ultravioleta (UV) del espectro electromagnético. Dentro de este intervalo, la luz ultravioleta, que supone tan solo un 7% de la radiación, presenta las mejores propiedades de desinfección. Los rangos de las longitudes de onda del UV son: 400-315 nm para UVA, 315-280 nm para UVB y 280–100 nm para UVC. La irradiación solar que incide en un día despejado de verano sobre el ecuador es de unos 1120 W/m2. Esto supone una energía óptica de 1’12 kJ/m2 disponibles cada segundo para inactivar cualquier microbio patógeno presente en el agua expuesta a la radiación solar. Este valor se reduce conforme la latitud aumenta alejándose del ecuador [McGuigan et al., 2012]. Algunos contaminantes son capaces de absorber la radiación UV, pasando a un estado excitado a partir del cual tiene lugar su degradación. Además, el agua puede absorber la radiación UVC por debajo de 190 nm, produciéndose así la fotólisis del agua y la formación de ROS [Parsons, 2004], tal y como se muestra en la ecuación 3.1: [3.1] La inactivación bacteriana en el agua irradiada con luz solar se debe a que parte de la luz UV que incide sobre las células, principalmente en el rango UVB y UVC, puede absorberse por el ADN celular, modificándolo y dificultando a las enzimas polimerasa la réplica del ADN. Sin embargo, las células poseen varios mecanismos capaces de reparar su ADN, eliminando la parte afectada y sustituyéndola por ADN polimerasa. Además, aunque las longitudes de onda del UVA no son suficientemente energéticas como para modificar directamente las bases del ADN, juegan un papel importante en la formación de ROS tanto en el agua como en el interior de la célula. Una vez formadas, estas especies reactivas del oxígeno pueden causar daños en el ADN, oxidar los grupos amino de las proteínas u oxidar los ácidos grasos poliinsaturados de los lípidos. Cuando el agua alcanza temperaturas superiores a 45oC se observa un fuerte efecto sinergístico entre la inactivación óptica y termal, ya que, además de un efecto de pasteurización, el aumento de la temperatura del agua inhibe los mecanismos de reparación del ADN celular [McGuigan et al., 2012]. Las investigaciones realizadas hasta el momento indican que la radiación solar es capaz de inactivar con éxito una amplia variedad de bacterias, virus y protozoos parásitos presentes en el agua [Heaselgrave y Kilvington, 2011]. Los tratamientos basados en irradiación con luz solar suponen un método barato y sencillo para inactivar patógenos presentes en el agua, por lo que su uso está extendiéndose en muchos países en desarrollo con escasez de agua potable. La técnica utilizada recibe el nombre de SODIS (Solar Disinfection) y consiste en introducir el agua en recipientes de plástico o cristal y exponerlos a radiación solar entre 6 y 48 horas, dependiendo de la intensidad de la luz solar y de la sensibilidad de los patógenos. Capítulo 3. Tratamientos de desinfección 8 Radiación solar con H2O2 La combinación de radiación solar con ciertas sustancias, como el H2O2, en el tratamiento de aguas puede incrementar la formación de ROS, y por tanto, favorecer la inactivación de microorganismos patógenos. La fotólisis del peróxido de hidrógeno tiene lugar a longitudes de onda de 254 nm, dando lugar a la formación de ROS (Ecuación 3.2). [3.2] Normalmente para generar una cantidad de ROS suficiente para degradar compuestos orgánicos o desinfectar el agua se necesitan concentraciones de H2O2 elevadas. Sin embargo, el H2O2 en exceso actúa como atrapador de radicales, haciendo el proceso menos efectivo, por lo que es necesario alcanzar un compromiso [Parsons, 2004]. En general, la adición de H2O2 acelera la descomposición de la materia orgánica y aumenta la velocidad de inactivación de las células. Además de los mecanismos descritos anteriormente en este apartado, la inactivación de bacterias en presencia de H2O2 y luz solar tiene lugar principalmente por tres métodos. En primer lugar la fotolisis del H2O2 genera *OH, aunque este hecho solo es significativo a longitudes de onda menores de 254 nm, y los radicales generados tienen un periodo de vida extremadamente corto. En segundo lugar, el H2O2 puede atacar directamente la membrana celular, incrementando su permeabilidad y afectando a la viabilidad de las células. Por último, el H2O2 es relativamente estable y no tiene carga, por lo que es capaz de penetrar la membrana bacteriana y difundir en las células. El H2O2 intracelular puede reaccionar con los iones metálicos presentes en el interior de la célula dando lugar a la formación de *OH altamente reactivos y otras ROS tóxicas para la célula [Spuhler et al., 2010]. Fotocatálisis La generación de ROS en los procesos de fotocatálisis tiene lugar por combinación de un catalizador y luz. El dióxido de titanio (TiO2) es uno de los fotocatalizadores más utilizados en el tratamiento de agua, debido a su elevada actividad fotocatalítica, a su estabilidad y a sus propiedades benignas desde el punto de vista medioambiental. La irradiación del TiO2 con luz ultravioleta a longitudes de onda entre 300 y 390 nm, induce la excitación de los electrones desde la banda de valencia hasta la banda de conducción, dando lugar a la creación de huecos altamente oxidantes en la banda de valencia, y a la formación de ROS, como el radical hidroxilo *OH. La Figura 1 muestra el mecanismo de formación foto-inducido de un par hueco-electrón en una partícula semiconductora de TiO2 en presencia de un contaminante del agua (P). Los compuestos orgánicos se degradan en los huecos de la superficie del TiO2 y mediante los radicales formados presentes en el agua [Matilainen y Sillanpää, 2010], dando lugar a la aparición de compuestos intermedios, y su posterior mineralización en CO2 y agua. La inactivación bacteriana durante la fotocatálisis con TiO2 tiene lugar mediante varios mecanismos. Inicialmente los radicales atacan la superficie de la membrana externa de la pared celular, causando daños en la capa de peptidoglicano y en la capa de lipopolisacáridos. A continuación, tiene lugar la peroxidación de la membrana lípida y la oxidación de las proteínas y de los polisacáridos de la membrana. Esto produce la pérdida de funciones esenciales de la célula, como la actividad respiratoria, causando finalmente la muerte bacteriana. Capítulo 3. Tratamientos de desinfección 9 Figura 1. Formación del par hueco-electrón en una partícula de TiO2 [Chong et al., 2010]. El dióxido de titanio ha sido utilizado con éxito como fotocatalizador en múltiples estudios, para la eliminación de distintas bacterias como Serratia marcescens, Escherichia coli, o Streptococcus aureus. Sin embargo, otros autores han encontrado muy poca diferencia en la inactivación de bacterias en agua real con luz solar en presencia o ausencia de TiO2 [Malato et al., 2009]. Fotocatálisis con H2O2 Uno de los problemas que plantea el uso de TiO2 es la recombinación del par huecoelectrón, que, en ausencia de un aceptor de electrones adecuado, limita la efectividad del proceso. Una estrategia de inhibir este efecto de recombinación es añadir otros aceptores de electrones a la reacción que, además, contribuyan a aumentar la producción de ROS. El peróxido de hidrógeno es un oxidante utilizado con este fin. En general, la adición de H2O2 es beneficiosa y aumenta la efectividad del proceso. Sin embargo, el efecto depende de la dosis de H2O2, existiendo un rango óptimo de concentración. Si se sobrepasa cierta concentración, el H2O2 puede adsorberse sobre la superficie del TiO2, ocupando los huecos formados y reaccionando con los radicales hidroxilo producidos. La adición de H2O2 en dosis adecuadas consigue aumentar la velocidad de reacción, lo que se traduce en la disminución de las dimensiones del foto-reactor, que es el componente más caro y una barrera para su comercialización, reduciendo así el coste del proceso. Los mecanismos de desinfección en la fotocatálisis combinada con peróxido de hidrógeno incluyen los descritos para la radiación solar, el peróxido de hidrógeno y la fotocatálisis. Capítulo 3. Tratamientos de desinfección 10 Capítulo 4. Procedimiento experimental y tratamiento de datos 11 CAPÍTULO 4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Y TRATAMIENTO DE DATOS 4.1. Metodología analítica 4.1.1. Análisis de parámetros físico-químicos La Tabla 2 muestra los parámetros físico-químicos analizados, los métodos analíticos y la instrumentación utilizada durante el desarrollo de este proyecto. Tabla 2. Métodos analíticos e instrumentación Parámetro Método Equipo Marca y modelo Rango Error pH 4500-HB Standard Methods pH-metro CRISON GLP 21 1-14 ± 0’02 Turbidez ISO 7027 Turbidímetro HANNA Instruments LP 2000 0 - 1000 UNT ± 0’5UNT Conductividad UNE-EN ISO 27888 Conductímetro CRISON Basic 30 0,01 – 19999 µS/cm ± 0’02 µS/cm Sólidos en suspensión totales (SST) 2540D Standard Methods Espectrofotómetro Hach LANGE DR 2800 5 – 750 mg/l ± 0’1 mg/l Carbono Orgánico Total (COT) 5310 B Standard Methods Analizador de COT SHIMADZU TOC-VCSH CT: 0- 25000mg/l 5-10% CI: 0- 30000mg/l DQO 410.4 EPA (adaptado) Fotómetro multiparámetro de sobremesa HANNA Instruments HI 83099 0 - 150mg/l ± 1mg/l Reactor de DQO HANNA Instruments HI 839800 - - H2O2 - Test indicador de peróxidos Merckoquant® 0-100mg/l - 100- 1000mg/l Nitrógeno amoniacal (N-NH3) D1426-92 Manual ASTM (adaptado) Fotómetro multiparámetro de sobremesa HANNA Instruments HI 83099 0-10 mg/L ± 0’05 mg/l Cloro libre residual (Cl2) DPD 330.5 EPA (adaptado) Fotómetro multiparámetro de sobremesa HANNA Instruments HI 83099 0-2’5 mg/L ± 0’03 mg/l Demanda de cloro (CD) 5710 B Standard Methods Valoración volumétrica - - - Capítulo 4. Procedimiento experimental y tratamiento de datos 12 En el ANEXO III se presenta, de forma desarrollada, la metodología analítica y la instrumentación utilizada en este trabajo. 4.1.2. Análisis de parámetros microbiológicos: Enterococcus sp. El indicador bacteriano de contaminación fecal objeto de estudio del presente trabajo de investigación es Enterococcus sp. El cultivo y recuento de estas bacterias se realiza siguiendo el procedimiento descrito en la Norma Española UNE-EN ISO 7899-2:2001: “Detección y recuento de enterococos intestinales” y el método normalizado 9215.C [Clesceri et al., 2005]. Equipos Los equipos utilizados en el análisis microbiológico de Enterococcus sp. se muestran en la Tabla 3. Todo el material de vidrio utilizado se esteriliza en autoclave a 121oC y 1 bar de presión durante 15 minutos. Tabla 3. Equipos utilizados en los análisis microbiológicos Instrumento Marca Modelo Función Estufas de cultivo J.P. Selecta INCUDIGIT 36 L Cultivo bacteriológico Baño termostático J.P. Selecta PRECISTEM 20 L Mantenimiento de medio de cultivo en estado líquido Autoclave J.P. Selecta 437-P Esterilización del material Microscopio óptico Zeiss Axiostar Plus Pruebas de confirmación bacteriológicas Rampa de filtración Millipore Sistema Microfil Análisis microbiológico Agitador Vortex Velp Scientifica ZX3 Mezcla de soluciones en tubos Mechero bunsen Crear condiciones de esterilidad Medios de cultivo El medio utilizado para el cultivo de Enterococcus sp. es el agar selectivo Slanetz & Bartley (Scharlau). Las colonias de enterococos adquieren un color granate característico en este agar (Figura 2). La composición y preparación del medio de cultivo se detalla en el ANEXO IV. Figura 2. Aspecto de las colonias de Enterococcus sp. en el agar S&B. Método de siembra en superficie (izquierda) y método de filtración de membrana (derecha). Capítulo 4. Procedimiento experimental y tratamiento de datos 13 Métodos de siembra En el presente trabajo de investigación se utilizan el método de filtración por membrana (UNE-EN ISO 7899-2:2001) y el método de siembra en superficie (Standard Methods 9215.C [Clesceri et al., 2005]) para el cultivo de Enterococcus sp. Cuando la población bacteriana no es muy elevada se utiliza el método de filtración, mientras que el método de siembra en superficie se utiliza cuando la población es mayor. Además, para analizar un volumen de muestra que permita un recuento adecuado de colonias de Enterococcus sp. en el método de siembra en superficie, se realizan diluciones decimales seriadas. En el ANEXO IV se describen los métodos de siembra y el método de diluciones decimales seriadas en mayor profundidad. Incubación Las placas sembradas se invierten e introducen en la estufa incubadora a 37 °C durante 48 horas. Tras finalizar el periodo de incubación, se cuentan todas las colonias que presentan una coloración roja, marrón o rosa, bien en su centro o en su periferia (Figura 2). Recuento Teóricamente, cada colonia procede de la multiplicación de una sola célula; sin embargo, una colonia también puede ser el resultado de la multiplicación de un agregado de células. Por otra parte, no todas las células bacterianas son capaces de formar colonias, ya que no crecen en los medios de cultivo. Por ello, en el recuento en placa lo más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) [Gamazo et al., 2005]. Los datos de cada experimento realizado se expresan en UFC/100 mL. El número de colonias que aparecen en las placas no ha de ser demasiado grande, pues algunas colonias se pueden fusionar dando estimaciones erróneas, ni demasiado pequeño, para que el cálculo sea estadísticamente significativo. En el método de filtración de membrana se cuentan las placas cuyo número de colonias se encuentra entre 20 y 200. En el método de siembra en superficie se cuentan las placas con un número de colonias entre 30 y 300 [Clesceri et al., 2005]. Cuando no se detecta ningún microorganismo en la placa sembrada, el valor que se toma es 1 UFC/100 mL para permitir el cálculo posterior con logaritmos. Para obtener el número apropiado de colonias se diluye la muestra por el método de diluciones decimales seriadas, tal y como se explica en el ANEXO IV. Tras seleccionar las placas con crecimiento adecuado, el recuento bacteriano se obtiene aplicando la ecuación 4.1, donde Fd es el factor de dilución, es decir, la inversa de la dilución seleccionada. [4.1] Repetibilidad del método de análisis de Enterococcus sp. Ibarz (2008) calculó el coeficiente de variación del método de filtración de membrana sobre Enterococcus sp., estableciendo un CV entre el 3-10 %. En este trabajo se ha determinado el coeficiente de variación del método de siembra en superficie, siendo del 2%, tal y como se describe en el ANEXO IV. Capítulo 4. Procedimiento experimental y tratamiento de datos 20 Los modelos cinéticos de inactivación microbiana son modelos matemáticos que estudian el ritmo de mortandad de las poblaciones bacterianas a lo largo de un proceso [Lee y Nam, 2002]. Mediante la modelización cinética se pretende obtener una expresión matemática que facilite el diseño adecuado de un sistema de desinfección. La Tabla 6 recoge los modelos matemáticos propuestos para describir las gráficas de inactivación obtenidas en el presente trabajo de investigación. En el ANEXO VI se desarrolla con más detalle cada uno de los modelos matemáticos seleccionados. Tabla 6. Modelos cinéticos de inactivación bacteriana aplicados. Modelo cinético Ecuación integrada Coeficientes cinéticos Referencias Modelo de Hom m ap mn ttktCk N N Log · 0  kap, m Hom, 1972 Modelo de Hom modificado m m tnk n m teCk nk m N N Ln                     ' 0 0 1 ' k, k’, n, m Haas y Joffe, 1994 Modelo bifásico     tktk tePePLog N N Log ·· 0 21 ·1·   P,k1,k2 Pruitt y Kamau, 1993 Modelo de Mafart p tt N N Log         0  , p Mafart et al., 2002 Modelo de Geeraerd     res tkSIk SIk tk rest N ee e eNNN              maxmax max max ·11 ·· · 0 kmáx, SI Geeraerd et al., 2000 Para calcular los coeficientes cinéticos de cada modelo y tratamiento se utiliza la herramienta Solver y el complemento GInaFiT (Geeraerd and Van Impe Inactivation Model Fitting Tool) [Geeraerd et al., 2005] del programa Excel (Microsoft). La calidad de los ajustes de los modelos a los datos experimentales obtenidos se evalúa mediante dos índices: el coeficiente de determinación (R2) y el error cuadrático medio (ECM) (ecuaciones 4.6 y 4.7), y mediante la representación gráfica de los valores estimados frente a los obtenidos experimentalmente. El cálculo de estos parámetros, R2 y ECM, se realiza con el programa Excel (Microsoft).            1 2 1 2 2 i i n ii yy yy R ~ [4.6] n yy ECM n ii    1 2 ) ~ ( [4.7] Capítulo 5. Resultados e interpretación 21 CAPÍTULO 5. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN 5.1. Resultados de inactivación de Enterococcus sp. 5.1.1. Cloración La Tabla 7 refleja la población de Enterococcus sp. superviviente y el cloro residual en cada tiempo muestreado para cada dosis de cloro empleada durante el proceso de cloración. La Figura 8 representa las curvas de inactivación bacteriana durante los distintos ensayos. Tras el tratamiento, en todos los casos queda cloro residual sin reaccionar, que se neutraliza con tiosulfato sódico. En el ANEXO VII se muestran todos los resultados de cloración. Tabla 7. Recuento de Enterococcus sp. (Nt) y cloro residual durante los tratamientos de cloración Dosis de cloro aplicadas Tiempo (min) 3'8 mg/L Cl2 15 mg/L Cl2 30 mg/L Cl2 65 mg/L Cl2 Nt (UFC/ 100 mL) Cloro residual (mg/L Cl2) Nt (UFC/ 100 mL) Cloro residual (mg/L Cl2) Nt (UFC/ 100 mL) Cloro residual (mg/L Cl2) Nt (UFC/ 100 mL) Cloro residual (mg/L Cl2) 0 6'6·107 3’8 3'2·107 15’0 6'6·107 30’0 3'4·107 65’0 0’5 3'0·107 2’6 1'6·107 10’2 6'8·105 19’0 1'5·103 40’1 1 1'2·107 2’4 1'6·107 10’1 1'7·105 15’8 2'8·101 33’3 3 3'0·106 2’1 6'8·105 8’2 5·102 13’8 0 25’2 5 4'5·106 1’9 9'0·104 7’5 2·101 12’3 0 19’2 10 1'0·106 1’8 8 6’2 4 11’8 0 15’9 30 4'4·104 1’5 1 6’2 2 11’7 0 15’7 Figura 8. Inactivación de Enterococcus sp. durante los tratamientos de cloración. N0= 3’2- 6’6·107 UFC/100 mL. En general, se observa que al aumentar la dosis de cloro la desinfección es más rápida, es decir, que para un tiempo dado se consigue mayor inactivación bacteriana cuanto más hipoclorito sódico se añade. Con la dosis de cloro más baja (3’8 mg/L Cl2) no se llegan a inactivar por completo las bacterias estudiadas, consiguiéndose una inactivación de 3’2 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Log(Nt/N0) Tiempo (min) 3'8 mg/L Cl2 15 mg/L Cl2 30 mg/L Cl2 65 mg/L Cl2 Capítulo 5. Resultados e interpretación 22 unidades logarítmicas tras 30 minutos de tratamiento. Este valor es comparable con los niveles de desinfección de enterococos alcanzados en la cloración de efluentes secundarios de EDARs a escala real [Tyrrell et al., 1995; Srinivasan et al., 2011]. Sin embargo, al adicionar la demanda de cloro correspondiente a la muestra (65 mg/L Cl2) se observa una rápida disminución de Enterococcus sp. durante los primeros instantes de estudio. A los 30 segundos de tratamiento se obtiene una reducción bacteriana de más de 4 ciclos logarítmicos, alcanzándose al tercer minuto de experimento, con un consumo de cloro de 40 mg/L Cl2, la desinfección completa de la muestra (7’5 unidades logarítmicas). Tras 30 minutos de tratamiento, se obtiene la misma inactivación bacteriana con dosis intermedias de 15 y 30 mg/L Cl2 que aplicando la demanda de cloro de la muestra, siendo el consumo de cloro notablemente menor, 9 y 18 mg/L Cl2, respectivamente. Esto indica que, para llevar a cabo la desinfección de la muestra estudiada bajo las condiciones de operación aplicadas, no es necesario satisfacer su demanda de cloro, y por tanto, se pueden aplicar dosis menores de cloro que, aumentando el tiempo de tratamiento, consigan el mismo resultado de desinfección. Este hecho se refleja en la Figura 9, donde se representa la inactivación de Enterococcus sp. frente al parámetro CT (concentración de cloro x tiempo de contacto). Figura 9. Inactivación de Enterococcus sp. en los tratamientos de cloración en función del parámetro CT. N0= 3’2-6’6·107 UFC/100 mL. Se observa que todos los valores siguen la misma tendencia y que, aproximadamente para un valor CT de 350 mg Cl2·min/L se alcanza la inactivación total. Esta inactivación se puede conseguir, por ejemplo, mediante aplicación de dosis de 35 mg/L Cl2 durante 10 minutos o con dosis de 10 mg/L Cl2 durante 35 minutos. Existen algunos modelos que relacionan la inactivación bacteriana alcanzada en la cloración con el parámetro CT. Por ejemplo, el modelo Selleck-Collins, descrito según la ecuación: Log(Nt/N0)=-3·Log(1+0’23CT) sirve para predecir la reducción de bacterias coliformes para una dosis de cloro determinada al final de un tiempo de contacto específico [Black & Veatch Corporation, 2010]. De manera similar, en este trabajo se modeliza la inactivación de Enterococcus sp. en función del parámetro CT, obteniéndose la siguiente ecuación: Log(Nt/N0)= =-3’9·Log(0’89+0’14CT), con un coeficiente de correlación (R2) de 0’85. -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Log(Nt/N0) CT (mg Cl2·min/L ) 3'8 mg/L Cl2 15 mg/L Cl2 30 mg/L Cl2 65 mg/L Cl2 modelo calculado Capítulo 5. Resultados e interpretación 23 5.1.2. Tratamientos basados en ozono En la Tabla 8 se recogen los resultados de supervivencia de enterococos durante los distintos tratamientos basados en ozono. La Figura 10 representa la curva de inactivación de Enterococcus sp. a lo largo de los ensayos. En general, se observa que los resultados obtenidos en los tres tratamientos son muy similares, por lo que, en el rango estudiado, no se aprecia interacción entre el peróxido de hidrógeno y el ozono. En el ANEXO VII se muestran todos los resultados de los tratamientos basados en ozono. Tabla 8. Recuento de Enterococcus sp. (Nt) y ozono consumido por la muestra durante los tratamientos basados en ozono Ozonización Peroxona (1’4 mg/L H2O2) Peroxona (20 mg/L H2O2) Tiempo (min) O3 consumido (mg/L) Nt (UFC/100 mL) O3 consumido (mg/L) Nt (UFC/100 mL) O3 consumido (mg/L) Nt (UFC/100 mL) 0 0 1’3·108 0 1’4·108 0’0 1’8·108 0’5 7’2 1’2·108 7’2 9’3·107 7’2 1’6·108 1 15’0 7’5·107 14’9 9’5·107 15’3 1’6·107 3 34’3 2’7·107 37’5 6’1·107 39’2 9’0·107 6 56’6 5’1·106 51’5 1’6·107 60’2 4’0·106 9 72’8 6’5·103 72’8 2’3·103 71’7 9’8·103 15 90’1 1’6·102 90’1 5’6·101 107’4 2’7·102 Figura 10. Inactivación de Enterococcus sp. en los tratamientos basados en ozono. N0= 1’3- 1’8·108 UFC/100 mL. Las curvas de inactivación (Figura 10) de los tres ensayos muestran que durante los primeros minutos del tratamiento la disminución de la población bacteriana es lenta, alcanzándose una inactivación aproximada de 2 ciclos logarítmicos tras 6 minutos de ozonización, lo que equivale a un consumo de ozono de unos 50-60 mg/L O3. A partir de esa dosis, la inactivación de Enterococcus sp. es más rápida y presenta un descenso lineal. Al final del tratamiento se consigue una reducción de unas 6 unidades logarítmicas, lo que supone un consumo de ozono de 90-110 mg/L O3. El hombro inicial o fase “lag” que presentan estas -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 20 40 60 80 100 120 Log(Nt/N0) O3 consumido (mg/L) Ozonización Peroxona (1'4 mg/L H2O2) Peroxona (20 mg/L H2O2) Capítulo 5. Resultados e interpretación 24 curvas de inactivación puede deberse a distintos factores, ya sea a una mezcla inadecuada del ozono en la muestra, a un retraso en la difusión del desinfectante a los puntos de acción bacterianos, a una resistencia inicial de los microorganismos al ataque del ozono o a la presencia de materia oxidable en la muestra. Mientras que las curvas de inactivación de los ensayos de cloración (Figura 8) presentan forma cóncava y una rápida desinfección inicial, en los tratamientos basados en ozono (Figura 10), se observa que las curvas de inactivación tienen forma convexa y que la disminución de la población de Enterococcus sp. al comienzo de los ensayos es lenta, haciendo necesario un gran consumo de ozono para obtener más de 2 unidades logarítmicas de inactivación. Este resultado es similar al obtenido por Gehr et al. (2003) en la inactivación de enterococos y coliformes fecales mediante ozonización en el efluente primario de una EDAR, cuyos estudios también reflejan la necesidad de grandes cantidades de ozono (30-50 mg/L O3) para alcanzar una inactivación de 2 unidades logarítmicas. Otras investigaciones muestran una mayor resistencia de Enterococcus sp. al ozono en agua de salida de depuradora, consiguiendo tan solo la inactivación de 1 ciclo logarítmico decimal tras 10 min de tratamiento con un caudal de ozono alimentado de 8 g/h [Tyrrell et al., 1995]. 5.1.3. Tratamientos basados en luz UV/visible En primer lugar se aplicaron los siguientes tratamientos: irradiación, irradiación combinada con peróxido de hidrógeno (1’4 mg/L y 20 mg/L H2O2), irradiación catalizada con dióxido de titanio (fotocatálisis) y fotocatálisis combinada con H2O2 (20 mg/L y 200 mg/L). La duración de cada uno de estos tratamientos fue de 30 minutos. Puesto que durante la realización de estos ensayos se observó que las dosis de peróxido de 1’4 mg/L y 20 mg/L H2O2 eran insuficientes para obtener una inactivación bacteriana significativa, se decidió aumentar la concentración hasta 200 mg/L H2O2. En la Tabla 9 se muestra la población de Enterococcus sp. superviviente, Nt, y la inactivación de estos, log(Nt/N0), alcanzada al finalizar cada uno los ensayos. En el ANEXO VII se muestran todos los resultados obtenidos en los ensayos basados en luz UV/visible. Tabla 9. Inactivación de Enterococcus sp. en los tratamientos basados en luz UV/visible Tiempo (min) Nt (UFC/100mL) Log (Nt/N0) Muestra inicial 0 1’55·108 0,00 UVA-vis 30 1’57·108 0,01 UVA-vis + 1’4 mg/L H2O2 30 1’21·108 -0,11 UVA-vis + 20 mg/L H2O2 30 1’19·108 -0,11 UVA-vis + 1 g/L TiO2 30 1’34·108 -0,06 UVA-vis + 20 mg/L H2O2 + 1 g/L TiO2 30 8’10·107 -0,28 UVA-vis + 200 mg/L H2O2 + 1 g/L TiO2 30 6’20·107 -0,40 En las condiciones de trabajo estudiadas se observa que apenas disminuye la población bacteriana tras 30 minutos de tratamiento. En los ensayos de irradiación/H2O2 (20 mg/L H2O2) y de fotocatálisis se obtiene una disminución de la población bacteriana de 0’11 y 0’06 ciclos logarítmicos, respectivamente. Sin embargo, al combinar la fotocatálisis con 20 mg/L H2O2, la inactivación de enterococos es de 0’28 unidades logarítmicas, valor mayor que la suma de las inactivaciones por separado, lo que sugiere la existencia de un efecto sinergístico entre estos Capítulo 5. Resultados e interpretación 25 factores. Además, el aumento de la dosis de peróxido hasta 200 mg/L H2O2 en combinación con la fotocatálisis, supone una disminución mayor de la población de Enterococcus sp., alcanzándose una inactivación de 0’4 unidades logarítmicas. Otros autores han obtenido una desinfección ligeramente superior, 0’6-0’8 unidades logarítmicas de inactivación de enterococos, utilizando la misma dosis de TiO2 y el mismo tiempo de tratamiento en fotocatálisis aplicada en agua residual depurada [Rincón y Pulgarín, 2003; Lydakis-Simantiris et al., 2010]. Las investigaciones de estos autores sugieren que se necesitan tiempos de tratamiento más prolongados y temperaturas mayores para mejorar la eficacia del proceso. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos y la bibliografía consultada, se decide realizar dos experimentos adicionales aumentando la dosis de peróxido de hidrogeno hasta 680 mg/L H2O2 (20mM), dosis máxima utilizada por Ibarz (2008) en la eliminación de Enterococcus sp. mediante fotocatálisis combinada con peróxido de hidrógeno en aguas naturales. Se realiza un ensayo de irradiación/H2O2 (680 mg/L H2O2) y un ensayo de fotocatálisis/H2O2 (680 mg/L H2O2). Además, se aumenta el tiempo de tratamiento hasta 60 minutos para poder obtener una curva de inactivación que permita la posterior aplicación de modelos cinéticos. En la Tabla 10 se recogen los resultados de inactivación de Enterococcus sp. obtenidos en ambos ensayos adicionales y el H2O2 residual para cada tiempo. En el tratamiento de irradiación/H2O2 se observa que el aumento de la dosis de H2O2 y del tiempo de aplicación supone un ligero aumento de la inactivación bacteriana, en comparación con los resultados obtenidos para dosis menores de H2O2 (Tabla 9). En la fotocatálisis combinada con 680 mg/L H2O2 se aprecia una disminución considerable de la población bacteriana de estudio. Tras 30 minutos de tratamiento se consigue una desinfección de 2’20 unidades logarítmicas, mientras que con irradiación/680 mg/L H2O2 y fotocatálisis por separado, tan solo se obtiene una reducción de 0’30 y 0’06 unidades logarítmicas respectivamente. Además, el consumo de H2O2 es mucho mayor en presencia de TiO2, indicando la formación de mayor número de radicales desinfectantes y confirmando así la existencia de un efecto sinergístico entre el peróxido de hidrógeno y el dióxido de titanio. Tabla 10. Inactivación de Enterococcus sp. en los ensayos de irradiación/H2O2 (680 mg/L H2O2) y fotocatálisis/H2O2 (680 mg/L H2O2) UVA-vis + 680 mg/L H2O2 UVA-vis + 680 mg/L H2O2 + 1 g/L TiO2 Tiempo (min) Nt (UFC/ 100 mL) Log (Nt/N0) [H2O2] (mg/L) Nt (UFC/ 100 mL) Log (Nt/N0) [H2O2] (mg/L) 0 1’07·108 0 680 1’05·108 0,00 680 15 - - 3’30·107 -0,50 >200 30 5’40·107 -0,30 200-400 6’60·105 -2,20 30-100 45 - - 1’90·105 -2,74 3-10 60 2’60·107 -0,61 200-400 1’00·104 -4,02 0 La Figura 11 representa la curva de inactivación de Enterococcus sp. durante el tratamiento de fotocatálisis combinada con 680 mg/L H2O2. Capítulo 5. Resultados e interpretación 26 Figura 11. Inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de fotocatálisis combinada con peróxido de hidrógeno (680 mg/L H2O2). N0= 1’05·108 UFC/100 mL. En comparación con los tratamientos de cloración (7’5 unidades logarítmicas de inactivación) y los basados en ozono (6 un. log.), los tratamientos basados en luz UV/visible aplicados en el presente trabajo de investigación presentan una menor eficacia de desinfección de Enterococcus sp., ya que se alcanzan 4 unidades logarítmicas de inactivación en el mejor de los casos. Es necesario aumentar considerablemente la dosis de peróxido de hidrógeno y el tiempo de tratamiento, para que, en combinación con dióxido de titanio e irradiación UVA/visible se consiga una inactivación de Enterococcus sp. importante. Además, en el tratamiento fotocatalítico se consume por completo el H2O2 añadido, por lo que cabe esperar que no haya una inactivación adicional prolongando el tiempo de tratamiento, mientras que en la cloración y la ozonización quedan dosis residuales, de cloro y ozono respectivamente, que pueden incrementar la inactivación o evitar el recrecimiento bacteriano. 5.2. Modelización cinética Los datos experimentales de las curvas de inactivación de Enterococcus sp. obtenidas en los tratamientos de cloración, ozonización, peroxona y fotocatálisis/680 mg/L H2O2, se analizan mediante diversos modelos matemáticos. En cada caso se aplican los modelos que mejor se ajustan a la curva de inactivación obtenida. En el ANEXO VII de la presente memoria se desarrollan con más detalle cada uno de estos modelos. Además, los resultados de inactivación de Enterococcus sp. obtenidos en este trabajo de investigación, en el que se utiliza un agua de salida de depuradora, se comparan con resultados previos del grupo de investigación en muestras de agua natural desinfectadas mediante los mismos tratamientos. 5.2.1. Cloración Las curvas de inactivación cóncavas que describen la desaparición de Enterococcus sp. en el tratamiento de cloración se analizan mediante 3 modelos matemáticos: el modelo de Hom modificado, el modelo bifásico y el modelo de Mafart, modelos utilizados por Lanao (2012). El modelo de Hom modificado asume que la población bacteriana se inactiva a lo largo del tratamiento conforme el desinfectante se va descomponiendo. El modelo bifásico reconoce la existencia de dos poblaciones con distinta resistencia al tratamiento, respondiendo ambas a una cinética de primer orden. Finalmente, el modelo de Mafart también asume que existe una distribución de resistencias frente al tratamiento dentro de la población bacteriana, pero estas resistencias siguen la distribución de Weibull. -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Log (Nt/N0) Tiempo (min) Capítulo 5. Resultados e interpretación 27 Las Tablas 11, 12 y 13 muestran los parámetros cinéticos y el ajuste de cada uno de los modelos a los resultados experimentales obtenidos, mediante el coeficiente de determinación (R2) y el error cuadrático medio (ECM). Además, se incluyen los valores de los parámetros obtenidos por Lanao (2012) en aguas naturales al aplicar su demanda de cloro de 3’8 mg/L Cl2. Los índices ECM y R2, y la representación de los valores observados y de los valores estimados mediante los diferentes modelos (ANEXO VII) indican, en conjunto, una buena adecuación del modelo de Hom modificado y del modelo bifásico a los valores experimentales de inactivación obtenidos. Tabla 11. Parámetros cinéticos del modelo de Hom modificado aplicado sobre la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de cloración. Muestra Dosis de cloro (mg/L Cl2) k (min-1) k’(min-1) m n ECM R2 Agua salida depuradora 3’8 0’634 0’428 0’47 0’001 0’14 0’98 15 1’450 0’806 0’50 0’002 1’02 0’89 30 1’783 1’432 0’76 0’168 0’14 1’00 65 1’949 3’295 0’89 0’417 0’02 1’00 Agua natural [Lanao, 2012] 3’8 2’077 0’45 0’50 1’01 0’12 0’99 En la Tabla 11 se observa que en el agua de salida de depuradora, tanto k como k’, constantes de velocidad de inactivación y de descomposición del desinfectante, respectivamente, aumentan conforme se incrementa la dosis de cloro. Utilizando una dosis de 3’8 mg/L Cl2 la desinfección es mucho más rápida en el agua natural que en el agua residual depurada, tal y como indican los valores de k. Además, cuando se satisface la demanda de cloro, la constante de velocidad de inactivación es muy similar en ambos tipos de agua. Tabla 12. Parámetros cinéticos del modelo bifásico aplicado sobre la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de cloración. Muestra Dosis de cloro (mg/L Cl2) P k1 (min-1) k2 (min-1) ECM R2 Agua de salida de depuradora 3’8 0’93265892 1’35 0’15 0’16 0’98 15 0’99999952 1’52 0’11 0’36 0’99 30 0’99999969 4’04 0’10 0’55 0’98 65 0’99999996 15’10 0’02 0’44 0’98 Agua natural [Lanao, 2012] 3’8 0’99999997 23’79 0’25 0’57 0’96 Los valores de los parámetros del modelo bifásico de la Tabla 12 indican la existencia de una subpoblación 1 más sensible al tratamiento de cloración, cuya constante de inactivación es k1, y otra subpoblación 2 más resistente que presenta una constate de inactivación menor, k2. Al incrementar la dosis de cloro, la constante k1 y P, la fracción de la población sensible al tratamiento, aumentan, mientras que k2 disminuye. En el agua natural, los valores de ambas constantes de inactivación, k1 y k2, son mayores, lo que supone una inactivación más rápida, y la subpoblación resistente (1-P) es similar a la que presenta el agua de salida de depuradora al aplicarle su demanda de cloro (65 mg/L Cl2). Capítulo 5. Resultados e interpretación 28 Tabla 13. Parámetros cinéticos del modelo de Mafart aplicado sobre la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de cloración. Muestra Dosis de cloro (mg/L Cl2) p δ (min) ECM R2 Agua salida depuradora 3’8 0’47 2’56 0’14 0’98 15 0’56 0’72 0’99 0’89 30 0’26 0’008 0’84 0’90 65 0’13 0’000001 0’72 0’92 Agua natural [Lanao, 2012] 3’8 0,13 0,0000005 0,50 0,96 Según el modelo de Mafart (Tabla 13), el valor del parámetro de forma, p, es inferior a 1, indicando que las curvas de inactivación presentan una forma cóncava, lo que se traduce en la aparición de una cola. El parámetro de escala, δ, se corresponde con el tiempo necesario para reducir el primer ciclo logarítmico decimal de la población bacteriana. En el agua de salida de depuradora, se observa que al aumentar la dosis de cloro, δ disminuye hasta alcanzar valores muy pequeños. Mientras que con una dosis de 3’8 mg/l Cl2 se necesitan más de 2 minutos para reducir el primer ciclo logarítmico decimal de Enterococcus sp., al aplicar a la muestra su demanda de cloro (65 mg/l Cl2), esta reducción es casi instantánea. En el agua natural también se aprecia una rápida inactivación del primer ciclo logarítmico decimal al aplicarle su demanda de cloro (3’8 mg/l Cl2). En general, se observa que, al satisfacer la demanda de cloro de una muestra, independientemente de su matriz, la velocidad de inactivación de Enterococcus sp. es similar. 5.2.2. Tratamientos basados en ozono Las curvas de inactivación de Enterococcus sp. obtenidas durante los tratamientos de ozonización y peroxona (1’4 mg/L H2O2 y 20 mg/L H2O2), se analizan a través de 4 modelos matemáticos: el modelo de Hom, el modelo bifásico, el modelo de Mafart y el modelo de Geeraerd. Dos de los modelos matemáticos utilizados, el modelo bifásico y el de Mafart, coinciden con los modelos seleccionados para el tratamiento de cloración. El modelo de Hom asume que no hay disminución del desinfectante a lo largo del tratamiento y, puesto que el ozono se suministra de manera continua y constante al reactor que alberga la muestra, se considera que la concentración de ozono aplicada es constante, siendo esta suposición consistente con el modelo de Hom. Además, dado que las curvas de inactivación parecen presentar fenómenos de hombro, una fase de inactivación lineal y cola, se utiliza también el modelo de Geeraerd. Las tablas 14, 15, 16 y 17 recogen los valores de los parámetros cinéticos obtenidos tras aplicar los modelos matemáticos seleccionados sobre las curvas de inactivación de Enterococcus sp. durante los tratamientos de ozonización y peroxona. Se incluyen también los resultados obtenidos por Lanao (2012) en aguas naturales mediante los mismos tratamientos. Los valores de los parámetros cinéticos calculados para cada modelo son similares en los tres tratamientos basados en ozono aplicados en este trabajo de investigación, lo que confirma que la adición de peróxido de hidrógeno en las dosis estudiadas (1’4 mg/L y 20 mg/L H2O2) no influye sobre el resultado del tratamiento de ozonización. Capítulo 5. Resultados e interpretación 29 Tabla 14. Parámetros cinéticos del modelo de Hom aplicado sobre la inactivación de Enterococcus sp. en los tratamientos basados en ozono. Muestra Tratamiento kap (min-1 · mg L-1) m ECM R2 Agua salida depuradora Ozonización 0’249 1’18 0’46 0’96 Peroxona 1’4 mg/L H2O2 0’178 1’34 0’68 0’92 Peroxona 20 mg/L H2O2 0’231 1’21 0’46 0’96 Agua natural (Lanao, 2010) Ozonización 3,001 0,26 0,69 0,94 Peroxona 1’4 mg/L H2O2 4,321 0,21 0,58 0,96 En el modelo de Hom (Tabla 14) se observa que el parámetro m, constante empírica del modelo, es mayor de 1, lo que significa que las curvas tienen forma convexa. Sin embargo, en el agua natural las curvas presentan valores de m menores de la unidad, siendo su forma cóncava, y las constantes de velocidad aparente, kap, son considerablemente mayores, lo que se traduce en una inactivación bacteriana más rápida en el agua natural que en el agua de salida de depuradora. Tabla 15. Parámetros cinéticos del modelo bifásico aplicado sobre la inactivación de Enterococcus sp. en los tratamientos basados en ozono. Muestra Tratamiento P k1 (min-1 ) k2 (min-1 ) ECM R2 Agua salida depuradora Ozonización 1’000000 0’903 0’903 0’50 0’95 Peroxona 1’4 mg/L H2O2 1’000000 0’951 0951 0’79 0’91 Peroxona 20 mg/L H2O2 1’00000 0’894 0’894 0’53 0’96 Agua natural (Lanao, 2010) Ozonización 0,999993 3,862 0,185 0,49 0,98 Peroxona 1’4 mg/L H2O2 0,999998 5,98 0,24 0,94 0,95 En el modelo bifásico (Tabla 15) aplicado a los datos de inactivación de Enterococcus sp. en agua de salida de depuradora mediante tratamientos basados en ozono, se observa que en los 3 casos, las constantes k1 y k2 tienen el mismo valor. Esto indica que es improbable que existan dos subpoblaciones microbianas distintas que presenten una sensibilidad al tratamiento diferente. Sin embargo, en el agua natural, el modelo bifásico sí que explica el comportamiento de inactivación de las bacterias de estudio, observándose la existencia de dos subpoblaciones, una más sensible y otra más resistente. En cualquier caso, las constantes de inactivación de la población sensible, k1, indican que la reducción bacteriana mediante los tratamientos basados en ozono es mayor en el agua natural que en el agua de salida de depuradora. Tabla 16. Parámetros cinéticos del modelo de Mafart aplicado sobre la inactivación de Enterococcus sp. en los tratamientos basados en ozono. Muestra Tratamiento p δ (min) ECM R2 Agua salida depuradora Ozonización 1’18 3’231 0’46 0’96 Peroxona 1’4 mg/L H2O2 1’34 3’622 0’68 0’92 Peroxona 20 mg/L H2O2 1’21 3’354 0’46 0’96 Agua natural (Lanao, 2010) Ozonización 0,23 0,002 0,74 0,93 Peroxona 1’4 mg/L H2O2 0,21 0,001 0,58 0,96 Capítulo 5. Resultados e interpretación 36 Capítulo 6. Conclusiones 37 CAPÍTULO 6. CONCLUSIONES De los resultados de inactivación de Enterococcus sp. en agua de salida de depuradora mediante los distintos tratamientos de desinfección aplicados se concluye que:  En general, la cloración es el tratamiento más eficaz, ya que permite alcanzar la inactivación completa de los enterococos presentes la muestra. Los tratamientos basados en ozono consiguen también una inactivación elevada con tiempos de tratamiento cortos, mientras que la fotocatálisis/H2O2 no alcanza una desinfección tan eficaz como en los otros procesos, pese a consumir gran cantidad de peróxido de hidrógeno y necesitar tiempos de tratamiento prolongados.  La cloración, tratamiento de desinfección convencional, resulta un tratamiento muy eficaz. Al aumentar la dosis de cloro en el rango estudiado (3’8-65 mg/L Cl2) la desinfección es más rápida. Además, para llevar a cabo la desinfección total no es necesario satisfacer la demanda de cloro, pudiéndose aplicar dosis menores de cloro que, prolongando el tiempo de tratamiento, consigan el mismo resultado de desinfección.  Los tratamientos basados en ozono consiguen un buen grado de inactivación bacteriana, en torno a las 6 unidades logarítmicas, aunque menor que la cloración. Los resultados de los tratamientos peroxona, con dosis de 1’4 mg/L y 20 mg/L H2O2, son similares a los de ozonización, por lo que no se aprecia una clara interacción entre el ozono y el peróxido de hidrógeno con las dosis aplicadas. Las curvas de inactivación de los tres tratamientos basados en ozono presentan una fase inicial de resistencia bacteriana en la cual la desinfección es más lenta, haciendo necesario un elevado consumo de ozono (50-60 mg/L O3) para conseguir una reducción de la población de enterococos de más de 2 unidades logarítmicas decimales  Los tratamientos basados en luz UV/visible (320-800 nm) resultan mucho menos eficaces que la cloración o la ozonización. La irradiación, la irradiación combinada con peróxido de hidrógeno y la fotocatálisis no llegan a alcanzar ni una unidad logarítmica de inactivación de Enterococcus sp. La fotocatálisis combinada con peróxido de hidrógeno permite lograr una inactivación mayor, de hasta 4 unidades logarítmicas, aunque requiere utilizar dosis de H2O2 elevadas (680 mg/L) y tiempos de tratamiento prolongados (60 minutos). Por tanto, el aumento de la dosis de peróxido en la fotocatálisis mejora la eficacia del proceso. Además, el consumo de H2O2 es mucho mayor en presencia de TiO2, indicando la formación de mayor número de radicales desinfectantes y confirmando así la existencia de un efecto sinergístico entre el peróxido de hidrógeno y el dióxido de titanio. De la modelización cinética de los resultados de inactivación de Enterococcus sp. en aguas de salida de depuradora y su comparación con los parámetros de los modelos cinéticos en aguas naturales se concluye que:  El modelo de Hom modificado y el modelo bifásico describen adecuadamente las curvas de inactivación bacterianas obtenidas en los tratamientos de cloración. Las constantes de velocidad de inactivación aumentan conforme aumenta la dosis de cloro aplicada. Al satisfacer la demanda de cloro de una muestra, independientemente de su matriz, la velocidad de inactivación de Enterococcus sp. es similar. Utilizando una dosis de 3’8 mg/L Capítulo 6. Conclusiones 38 Cl2, demanda de cloro de un agua natural, la desinfección es mucho más rápida en el agua natural que en el agua residual depurada.  Los valores de los parámetros cinéticos de cada modelo son similares para los tres tratamientos basados en ozono estudiados. Las constantes de velocidad de inactivación son mayores para el agua natural que para el agua de salida de depuradora. En el agua natural las curvas de inactivación presentan forma cóncava, con una rápida inactivación inicial y cola, mientras que en el agua de salida de depuradora las curvas son convexas, con una fase inicial en la que la inactivación transcurre de forma lenta, seguida de un periodo de inactivación lineal y cola, por lo que el modelo de Geeraerd es el que mejor se ajusta a su forma.  El modelo de Hom y el modelo de Mafart describen adecuadamente la curva de inactivación de Enterococcus sp. del tratamiento de fotocatálisis/H2O2 en agua de salida de depuradora. En general, los valores de los parámetros cinéticos indican que en el agua natural la velocidad de inactivación es algo mayor que en el agua de salida de depuradora; sin embargo, hay que tener en cuenta que la dosis de peróxido empleada en este trabajo (680 mg/L H2O2) es muy superior que la aplicada en el agua natural (1’4 mg/L H2O2).  La fotocatálisis combinada con peróxido de hidrógeno presenta constantes de velocidad de inactivación mucho menores que la cloración o la ozonización, haciendo necesario el uso de tiempos de tratamiento más prolongados para alcanzar el mismo nivel de desinfección.  En general, los parámetros cinéticos de todos los modelos en cada uno de los tratamientos estudiados indican que la velocidad de inactivación de Enterococcus sp. es menor en el agua de salida de depuradora que en el agua natural, comprobándose así la influencia de la matriz de agua sobre la inactivación de la población bacteriana de estudio. Del estudio económico se concluye que, para la inactivación de una unidad logarítmica de Enterococcus sp. en agua de salida de depuradora:  El tratamiento de cloración es el más rentable desde el punto de vista económico, con un coste muy bajo por m3 de muestra tratada.  Los tres tratamientos basados en ozono estudiados tienen un coste similar, que es superior al de la cloración, debido principalmente al coste que supone la producción de ozono.  La fotocatálisis combinada con peróxido de hidrógeno resulta excesivamente cara en comparación con la cloración o la ozonización, ya que el dióxido de titanio y el consumo eléctrico de la lámpara tienen un coste elevado. Como conclusión final, la cloración es el tratamiento más eficaz y económico para la inactivación de Enterococcus sp. en agua de salida de depuradora, aunque la posible generación de compuestos organoclorados podría suponer un problema para su reutilización. La ozonización resulta también muy eficaz y aunque su coste es notablemente superior, evita el problema de la formación de trihalometanos. Para reducir el coste del tratamiento de fotocatálisis/H2O2 sería necesario estudiar la recuperación del TiO2 y el uso de luz solar natural como fuente de luz. Sin embargo, el elevado consumo de H2O2 hace que el coste de este proceso siga siendo mayor que el de la cloración o la ozonización, y no se consigue un grado de inactivación de enterococos tan elevado. Capítulo 7. Bibliografía 39 CAPÍTULO 7. BIBLIOGRAFÍA  Bellamy W.D., Hickman G.T., Mueller P.A., Ziembra N. “Treatment of VOC-contaminated groundwater by hydrogen peroxide and ozone oxidation”. Research Journal Water Pollution Control Federation 63, 120-128, 1991.  Black & Veatch Corporation. “White’s Handbook of Chlorination and Alternative Disinfectants”. Ed. Wiley, Nueva Jersey, 5ª edición, 2010.  Cho M., Chung H., Choi W., Yoon J. “Linear correlation between inactivation of E. coli and OH radical concentration in TiO2 photocatalytic disinfection”. Water Research 38, 1069- 1077, 2004.  Chong M.N., Jin B., Chow C.W.K., Saint C. “Recent Developments in Photocatalytic Water Treatment Technology: A Review”. Water research 44, 2997-3027, 2010.  Clesceri L.S., Eaton A.D., Rice E.W., Greenberg A.E. “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater”, 21ª edición. APHA, AWWA, WEF, 2005.  Diao H.F., Li X.Y., Gu J.D., Shi H.C., Xie Z.M. ”Electron microscopic investigation of the bactericidal action of electrochemical disinfection in comparison with chlorination, ozonation and Fenton reaction”. Process Biochemistry 39, 1421–1426, 2004.  Directiva 82/243/CEE del Consejo referente a la aproximación de las legislaciones de los Estados Miembros relativas a los métodos de control de la biodegradabilidad de los tensoactivos aniónicos. Diario Oficial de las Comunidades Europeas L109, de 22 de abril de 1982.  Directiva 91/271/CEE de 21 de mayo de 1991 sobre el tratamiento de las aguas residuales urbanas. Diario Oficial de las Comunidades Europeas 135, 40-52, 1991.  EPA (Environmental Protection Agency). “Guidelines for Water Reuse”. Estados Unidos, 2012.  Gamazo C., López-Goñi I., Díaz R. “Manual práctico de microbiología”. Ed. Masson. Barcelona, 2005.  Geeraerd A.H., Herremans C.H., Van Impe J.F. “Structural model requirements to describe microbial inactivation during a mild heat treatment”. International Journal of Food Microbiology 59, 185-209, 2000.  Geeraerd A.H., Valdramidis V.P., Van Impe J.F. “GInaFiT, a freeware tool to assess non-log- linear microbial survivor curves”. International Journal of Food Microbiology 102, 95-105, 2005.  Gehr R., Wagner M., Veerasubramanian P., Payment P. “Disinfection efficiency of peracetic acid, UV and ozone after enhanced primary treatment of municipal wastewater”. Water Research 37, 4573-4586, 2003.  Gyürek L.L., Finch G.R. “Modelling water treatment chemical disinfection kinetics”. Journal of Environmental Engineering 124, 783-793, 1998. Capítulo 7. Bibliografía 40  Haas C.N., Joffe J. “Disinfection under dynamic conditions: modification of Hom’s model for decay”. Environmental Science and Technology 28, 1367-1369, 1994.  Heaselgrave W., Kilvington S. “The efficacy of simulated solar disinfection (SODIS) against Ascaris, Giardia, Acanthamoeba, Naegleria, Entamoeba y Cryptosporidium”. Acta Tropica 119, 138-143, 2011.  Hom L.W. “Kinetics of chlorine disinfection in an ecosystem”. Journal of Sanitary Engineering Division 98, 183-193, 1972.  Huang J.J., Hu H.Y., Tang F., Li Y., Lu S.Q., Lu Y. “Inactivation and reactivation of antibioticresistant bacteria by chlorination in secondary effluents of a municipal wastewater treatment plant”. Water Research 45, 2775-2781, 2011.  Ibarz C. “Desactivación de Enterococos en Agua Natural mediante Fotocatálisis con Dióxido de Titanio y Radiación Solar”. Tesis Doctoral. Universidad de Zaragoza, 2008.  Kosaka K., Yamada H., Shishida K., Shinya E., Minear R.A., Tsuno H., Matsui S. “Evaluation of the treatment performance of a multistage ozone/hydrogen peroxide process by decomposition by-products”. Water Research 35, 3587-3594, 2001.  Lanao M. “Investigación de la inactivación de Clostridium perfringens y Enterococcus sp. en aguas mediante procesos convencionales y avanzados de oxidación”. Tesis Doctoral. Universidad de Zaragoza, 2012.  Lanao M., Ormad M.P., Mosteo R., Ovellerio J.L. “Inactivation of Enterococcus sp. by photolysis and TiO2 photocatalysis with H2O2 in natural water”. Solar Energy 86, 619-625, 2012.  Lee Y., Nam S. “Reflection on kinetic models to the chlorine disinfection for drinking water production”. The Journal of Microbiology 40, 119-124, 2002.  Lucas M.S., Peres J.A, Puma G.L. “Treatment of winery wastewater by ozone-based oxidation processes (O3, O3/UV and O3/UV/H2O2) in a pilot-scale bubble column reactor and process economics”. Separation and Purification Technology 72, 235-241, 2010.  Lydakis-Simantiris N., Riga D., Katsivela E., Mantzavinos D., Xekoukoulotakis N.P. “Disinfection of spring water and secondary treated municipal wastewater by TiO2 photocatalysis”. Desalination 250, 351-355, 2010.  Mafart P., Couvert O., Gaillard S., Leguerinel I. “On calculating sterility in thermal preservation methods: application of the Weibull frequency distribution model”. International Journal of Food Microbiology 72, 107-113, 2002.  Malato S., Fernández P., Maldonado M.I., Blanco J., Gernjak W. “Decontamination and Disinfection of Water by Solar Photocatalysis: Recent Overview and Trends”. Catalysis Today 147, 1-59, 2009.  Matilainen A., Sillanpää M. “Removal of Natural Organic Matter from Drinking Water by Advanced Oxidation Processes”. Chemosphere 80, 351-365, 2010. Capítulo 7. Bibliografía 41  McGuigan K.G., Conroy R.M., Mosler H.J., Preez M., Ubomba-Jaswa E., Fernández-Ibáñez P. “Solar water disinfection (SODIS): A review from bench-top to roof-top”. Journal of Hazardous Materials 235-236, 29-46, 2012.  Medema G.J., Bahar M., Schetss F.M. “Survival of Cryptosporidium parvum, Escherichia coli, faecal enterococci and Clostridium perfringens in river water: influence of temperature and autochthonous microorganisms”. Water Science and Technology 35, 249-252, 1997.  Miguel, N. “Estudio de la eliminación de plaguicidas presentes habitualmente en aguas de la cuenca del Ebro mediante procesos de oxidación avanzada”. Tesis doctoral. Universidad de Zaragoza, 2010.  Mosteo R., Ormad M.P., Goñi P., Rodríguez-Chueca J., García A., Clavel A. “Identification of pathogen bacteria and protozoa in treated urban wastewaters discharged in the Ebro River (Spain): Water reuse possibilities”. Water Science and Technology. Aceptado a 18 de febrero de 2013.  Norma UNE-EN ISO 7899-2:2001. Calidad del agua. Detección y recuento de enterococos intestinales. Parte 2: método de filtración de membrana.  Ormad P., Cortés S., Puig A., Ovelleiro J.L. “Degradation of organochloride compounds by O3 and O3/H2O2”. Water Research 31, 2387-2391, 1997.  Parsons S. “Advanced Oxidation Processes for Water and Wastewater Treatment”. IWA Publishing, Londres, Reino Unido, 2004.  Pruitt K.M., Kamau D.N. “Mathematical models of bacteria growth, inhibition and death under combined stress conditions”. Journal of Industrial Microbiology 12, 221-231, 1993.  Real Decreto 1620/2007, de 7 de diciembre, por el que se establece el régimen jurídico de la reutilización de las aguas depuradas. Boletín Oficial del Estado 294, 50639-50661, 2007.  Real Decreto 60/2011, de 21 de enero, sobre las normas de calidad ambiental en el ámbito de la política de aguas. Boletín Oficial del Estado 19, 6854-6870, 2011.  Rincón A.G., Pulgarín C. “Photocatalytical inactivation of E. coli: effect of (continuousintermittent) light intensity and of (suspended-fixed) TiO2 concentration”. Applied Catalysis B: Environmental 44, 263-284, 2003.  Robertson J.M.C., Robertson P.K.J., Lawton L.A. “A comparison of the effectiveness of TiO2 photocatalysis and UVA photolysis for the destruction of three pathogenic microorganisms”. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 175, 51-56, 2005.  Sommer R., Pribil W., Pfleger S., Haider T., Werderitsch M., Gehringer P. “Microbicidal efficacy of an advanced oxidation process using ozone/hydrogen peroxide in water treatment”. Water Science and Technology 50, 159-164, 2004.  Spuhler D., Rengifo-Herrera J.A., Pulgarín C. “The effect of Fe2+, Fe3+, H2O2 and the photo- Fenton reagent at near neutral pH on the solar disinfection (SODIS) at low temperatures of water containing Escherichia coli K12”. Applied Catalysis B: Environmental 96, 126-141, 2010. Capítulo 7. Bibliografía 42  Srinivasan S., Aslan A., Xagoraraki I., Alocilja E., Rose J.B. “Escherichia coli, enterococci, and Bacteroides thetaiotaomicron qPCR signals through wastewater and septage treatment”. Water Research 45, 2561-2572, 2011.  Tyrrell S.A., Rippey S.R., Watkins W.D. “Inactivation of bacterial and viral indicators in secondary sewage effluents, using chlorine and ozone”. Water Research 29, 2483-2490, 1995.  Valero P. “Regeneración de aguas depuradas mediante procesos físico-químicos y desinfección convencional”. Proyecto Fin de Carrera. Universidad de Zaragoza, 2008.  WHO. “WHO Guidelines for the Safe use of wastewater, excreta and greywater”. World Health Organization, 2006.  Willey J.M., Serwood L.M., Woolverton C.J. “Microbiología de Prescott, Harley y Klein” McGraw-Hill, Madrid, 2009.  Yuranova T., Enea O., Mielczarski E., Mielczarski J., Albers P., Kiwi J. “Fenton immobilized photo-assisted catalysis through a Fe/C structured fabric”. Applied Catalysis B: Environmental 49, 39-50, 2004. Páginas web consultadas:  EPA (Environmental Protection Agency). Water: Monitoring and Assesment, Fecal Bacteria: http://water.epa.gov/type/rsl/monitoring/vms511.cfm  Iberdrola. Tarifas y precios electricidad: https://www.iberdrola.es/webibd/corporativa/iberdrola?IDPAG=ESWEBCLIHOGASEINFLEG ELE 43 44 45 ANEXOS Anexo I. Criterios de calidad del agua reutilizada según sus usos 52 Tabla VI. Criterios de calidad de reutilización de las aguas para usos ambientales Anexo II. Terminología microbiológica 53 ANEXO II. Terminología microbiológica  Bacteria: organismo unicelular procariota con membranas formadas principalmente por diésteres de diacilglicerol y con rRNA bacteriano. Las bacterias pueden presentarse principalmente en forma de cocos o de bacilos. Los cocos son células más o menos esféricas que aparecen como células individuales o asociados en agrupaciones. Los bacilos son células con forma de bastón que suelen presentarse individualmente, aunque algunos permanecen juntos tras su división formando parejas o cadenas. Además, la mayoría de las bacterias se pueden dividir en dos grupos principales de acuerdo con su respuesta a la tinción de Gram: bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas. La pared grampositiva consiste en una única capa homogénea, de 20 a 80 nm de grosor, de peptidoglicano situada externamente a la membrana plasmática. En cambio, la pared gramnegativa contiene una capa de peptidoglicano de 2 a 7 nm cubierta por una membrana externa de 7 a 8 nm de grosor. Puesto que su pared de peptidoglicano es más gruesa, las paredes de las células grampositivas son más resistentes a la presión osmótica que las gramnegativas.  Clostridium perfringens: bacilo grampositivo, anaerobio, inmóvil y formador de esporas. es la especie más habitual en aguas dentro del grupo de las bacterias anaerobias sulfitoreductoras. Su origen no es exclusivamente fecal, ya que pueden encontrarse en múltiples lugares como suelo, polvo, sedimento marino, etc. Sus esporos sobreviven en el agua mucho más tiempo que los coliformes y pueden ser resistentes a los tratamientos de desinfección si no se realizan de manera adecuada. Es patógeno para los animales y para el hombre.  Enterococcus sp.: denominados también como enterococos intestinales, este género presenta células esféricas u ovoides (cocos) en parejas o cadenas cortas, no esporuladas, a veces inmóviles, con un tamaño de 0’6 a 2’5 µm. Son bacterias anaerobias facultativas, grampositivas, quimioheterótrofas, y mesófilas, que fermentan los hidratos de carbono a lactato sin producción de gas. Algunos enterococos, como Enterococcus faecalis, son patógenos para el hombre.  Escherichia coli: bacteria aerobia gramnegativa con forma de bacilo con un tamaño de 1’1 a 6 µm. Reside en el colon de los seres humanos y de otros animales de sangre caliente. Suele utilizarse en el análisis de aguas para determinar si existe contaminación fecal. Algunas cepas producen gastroenteritis o infecciones de las vías urinarias.  Espora o esporo: forma diferenciada y especializada que puede utilizarse para la diseminación, la supervivencia en condiciones adversas (gracias a su resistencia al calor y a la deshidratación) y/o la reproducción. Las esporas suelen ser unicelulares y pueden desarrollarse en organismos vegetativos o gametos. Pueden reproducirse sexual o asexualmente y pueden ser de varios tipos.  Esporulación: proceso de formación de esporas.  Helminto: los helmintos o gusanos son animales multicelulares, en los cuales se distinguen células diversas formando órganos con funciones especiales.  Lisis: rotura o desintegración física de una célula. Anexo II. Terminología microbiológica 54  Mesófilo: Organismo que tiene una temperatura óptima de crecimiento de entre 20 y 42oC.  Protozoo: organismo eucariota unicelular o acelular cuyos orgánulos presentan un papel funcional de órganos y tejidos de forma compleja. Los protozoos varían mucho en tamaño, morfología, nutrición y ciclo vital.  Pseudomonas aeruginosa: bacteria con forma de bacilos rectos o ligeramente curvados, con medidas de 0’5 a 5 µm, que se desplazan mediante uno o varios flagelos polares. Son bacterias quimioheterótrofas, gramnegativas, que generalmente realizan una respiración aerobia. Algunas pseudomonas como P. aeruginosa, son patógenos muy importantes de animales y plantas, infectando a personas bajas de defensas, invadiendo zonas de quemaduras o produciendo infecciones de las vías urinarias.  Quimioheterótrofo: microorganismo que utiliza compuestos orgánicos como fuente de energía, electrones, y carbono para la biosíntesis.  Staphylococcus aureus: bacteria anaerobia facultativa, grampositiva , que presenta células esféricas u ovoides en parejas o cadenas, inmóviles y no esporuladas, con un tamaño de 0’5 a 2 µm. S. aureus es el estafilococo patógeno más importante en el ser humano y causa furúnculos, abscesos, infecciones de heridas, neumonía y otras enfermedades.  Virus: agente infeccioso que tiene una organización acelular simple con una envoltura proteica y un genoma de ácidos nucleicos. No posee metabolismo independiente y se reproduce únicamente en el interior de células vivas. Bibliografía  Willey J.M., Serwood L.M., Woolverton C.J. “Microbiología de Prescott, Harley y Klein” McGraw-Hill, Madrid, 2009. Anexo III. Desarrollo de la metodología analítica físico-química 55 ANEXO III. Desarrollo de la metodología analítica físico-química III.I. pH El pH es la medida del grado de acidez o alcalinidad de una disolución acuosa y se define como el logaritmo negativo de la concentración de iones H+. Para determinar el pH de las muestras acuosas se utiliza un pH-metro marca CRISON, modelo GLP 21, previamente calibrado con disoluciones tampón de pH 7’00 y 4’01. El método utilizado es el 4500-HB del Standard Methods [Clesceri et al., 2005]. III.II. Turbidez La turbidez se define como la reducción de la transparencia de un líquido originada por la presencia de materias sin disolver. Para medir la turbidez se utiliza un turbidímetro marca HANNA Instruments modelo LP 2000, de acuerdo a la norma ISO 7027:1999. Los turbidímetros constan de una fuente de luz para iluminar la muestra y detectores fotoeléctricos que miden la intensidad de la luz dispersada a 90o respecto a la fuente. El procedimiento consiste en medir la intensidad de la radiación dispersada por la muestra a una determinada longitud de onda y compararla con la de la disolución patrón. Los resultados se expresan en unidades nefelométricas de turbidez: UNT. III.III. Conductividad La conductividad es la expresión numérica de la capacidad de un agua para transportar la corriente eléctrica. Indica la concentración total de iones en el agua. Su determinación se realiza utilizando un conductímetro CRISON modelo Basic 30, provisto de una célula de dos electrodos (constante de la célula 1 cm-1) y de acuerdo a la norma UNE-EN ISO 27888:1994. Para conocer la conductividad de una muestra se introduce la célula en ella, se agita y se espera unos minutos antes de tomar el valor. Los resultados se expresan en mS/cm o en µS/cm, según el rango de trabajo. III.IV. Sólidos en suspensión totales (SST) Los sólidos en suspensión totales se analizan mediante un espectrofotómetro de marca Hach Lange, modelo DR 2800. Se emplea el método 2540D de Standard Methods [Clesceri et al., 2005]. Los sólidos en suspensión totales se miden a 810nm. III.V. Carbono orgánico total (COT) La medida del Carbono Orgánico Total (COT) sirve para cuantificar la materia orgánica presente en el agua. Se mide de acuerdo al método 5310B del Standard Methods [Clesceri et al., 2005]. Para ello se utiliza un equipo SHIMADZU, modelo TOC-VCSH (Figura I). Anexo III. Desarrollo de la metodología analítica físico-química 56 Figura I. Analizador de Carbono Orgánico Total SHIMADZU, modelo TOC-VCSH Fundamento del equipo En el agua están presentes dos tipos de carbono: carbono orgánico y carbono inorgánico. El carbono orgánico (COT) corresponde a los compuestos orgánicos, mientras que el carbono inorgánico (CI) se encuentra disuelto en el agua como CO2, o bien en forma de compuestos inorgánicos tales como los carbonatos y bicarbonatos. Conjuntamente, ambos tipos de carbonos constituyen el carbono total, CT, y por lo tanto cumplen la relación: COT=CT–CI. El equipo utilizado se basa en esta relación para medir el COT. Material y reactivos  Equipo SHIMADZU, modelo TOC-VCSH.  Viales de 50 ml  Unidad de filtración de plástico de 250 ml.  Filtros de 0’45 µm de diámetro de poro.  Ácido fosfórico.  Ácido clorhídrico.  Agua milli-Q. Procedimiento y cálculo Se filtra el agua a analizar utilizando un filtro de 0’45µm para no obstruir la aguja de inyección de la muestra en el equipo. Una vez filtrada la muestra se introduce en los viales y se programa el equipo con las rectas de calibrado que mejor se ajusten, según los valores esperados de COT. Validación del método La validación del método para la medición de carbono orgánico total (COT) y las rectas de calibrado utilizadas se muestran en la Tabla VII. Tabla VII. Validación de la metodología para la medición de COT. Límite de detección Límite de cuantificación Rango de medida Rectas de calibrado Carbono total 1 mg/L 3 mg/L 0-25000 mg/L 0-100 mg/L Carbono inorgánico 1 mg/L 2 mg/L 0-30000 mg/L 0-100 mg/L Anexo III. Desarrollo de la metodología analítica físico-química 57 III.VI. Demanda Química de Oxígeno (DQO) La DQO es la cantidad de oxígeno consumido por las especies reductoras presentes en el agua. Este parámetro se determina mediante una adaptación del Método 410.4 EPA, en un fotómetro multiparámetro marca Hanna Instruments, modelo HI 83099. Este método se basa en que los compuestos orgánicos oxidables reducen el ión dicromato (naranja) a ión cromo (III) (verde). Se determina la cantidad de cromo formada, utilizando para ello una lámpara de tungsteno con filtro de interferencia de banda estrecha a 420 nm. III.VII. Peróxido de hidrógeno (H2O2) La concentración de peróxidos se determina semicuantitativamente por comparación colorimétrica mediante un test indicador de peróxidos marca Merckoquant®. La peroxidasa transfiere el oxígeno del peróxido a un indicador redox orgánico, formándose un producto de oxidación azul (0-100mg/l) o amarillo (100-1000mg/l). La zona de reacción de la tira de ensayo se compara visualmente con una escala colorimétrica. III.VIII. Nitrógeno amoniacal (N-NH3) La determinación del nitrógeno amoniacal se lleva a cabo mediante un fotómetro multiparamétrico de sobremesa, marca Hanna Instruments, modelo HI 83099. El método empleado es una adaptación del Método Nessler de ASTM Manual of Water and Environmental Technology, D1426-92. La reacción entre el amoniaco y los reactivos origina una coloración amarilla en la muestra. Para su medición se utiliza una lámpara de Tungsteno con filtro de interferencia de banda estrecha a 420 nm. III.IX. Cloro libre La determinación del cloro libre se realiza mediante un fotómetro multiparamétrico de sobremesa, marca Hanna Instruments, modelo HI 83099. El método empleado es una adaptación del método DPD 330.5 de la EPA. La reacción entre el cloro libre y el reactivo DPD origina una coloración rosa en la muestra que se mide utilizando una lámpara de Tungsteno con filtro de interferencia de banda estrecha a 525 nm. III.X. Demanda de cloro La demanda de cloro (CD) se define como la cantidad mínima de cloro que se necesita añadir a la muestra para satisfacer el consumo de desinfección y oxidación de los compuestos presentes. Para determinar este parámetro se utiliza el método estándar 5710 B [Clesceri et al., 2005]. Anexo III. Desarrollo de la metodología analítica físico-química 58 El método consiste en adicionar un exceso de cloro (D0) a la muestra y analizar el cloro residual (R) no consumido después de un mínimo de 4 horas, siendo la demanda de cloro (CD) la diferencia de ambos valores en mg/L, como indica la ecuación I: [I] Para determinar D0 se añaden 5 mL de hipoclorito sódico comercial de 50.000 mg/L Cl2 diluido al 10%, en un frasco de 350 mL con tapón de vidrio y se completa hasta rebose con agua destilada. Del contenido de este frasco se valoran 100 mL en un erlenmeyer con tiosulfato sódico 0,025 N (Na2S2O4·5H2O, 99%, Panreac), incluyendo en el contenido 5 mL de ácido acético (99’8%, Panreac), 1 g de yoduro potásico (99%, Panreac) y 2 mL de almidón (Scharlau) como indicador hasta la desaparición del color. La dosis de cloro exacta suministrada a la muestra se calcula según la ecuación II, donde Vv es el volumen del agente valorante (tiosulfato sódico) consumido en la valoración, N es la normalidad del mismo (0,025 N) y Vm es el volumen de muestra valorado (100 mL). [II] De manera similar, para calcular R, en un frasco de las mismas características se añaden 5 mL de hipoclorito sódico comercial diluido al 10% y 5 mL de tampón fosfato (68,1 g KH2PO4 y 11,7 g NaOH en 1L de agua destilada), completando el volumen con la muestra objeto de análisis. Se almacena durante mínimo 4 horas a temperatura ambiente en oscuridad con el tapón sellado herméticamente para evitar pérdidas de cloro por volatilidad. Trascurrido ese tiempo, en el cual el cloro reacciona con la materia orgánica y los microorganismos presentes en la muestra, se mide el cloro residual, R, (ecuación III). [III] La concentración del reactivo de cloración utilizado (Rc) se calcula según la ecuación IV: [IV] Bibliografía  Clesceri L.S., Eaton A.D., Rice E.W., Greenberg A.E. “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater”, 21ª edición. APHA, AWWA, WEF, 2005. Anexo IV. Metodología microbiológica 59 ANEXO IV. Metodología microbiológica IV.I. Procedimiento experimental de fortificación de muestras con Enterococcus sp. La cepa de Enterococcus sp. utilizada proviene del stock del grupo de investigación de Calidad y Tratamiento de Aguas. Al estar ya identificada y haber sido utilizada en otros estudios previos [Ibarz, 2008], no se considera necesario realizar ninguna prueba bioquímica de confirmación, salvo la tinción de Gram, que se explica en el apartado IV.II del presente anexo. La fortificación de las muestras de agua de salida de depuradora se realiza a partir de un vial congelado a -20 °C. Tras descongelarse, se toma un inóculo con el asa de siembra y se realiza un aislamiento en superficie por agotamiento (Figura II) en agar nutritivo (Tabla VIII), incubándose las placas a 37 °C durante 48 horas en aerobiosis con el fin de disponer de un cultivo bacteriano joven y abundante. Figura II. Técnica de aislamiento en superficie por agotamiento Tabla VIII. Composición del agar nutritivo El agar nutritivo no es un tipo de agar selectivo, por lo que en él puede crecer cualquier tipo de bacterias. Es importante observar las colonias crecidas tras la incubación para ver si el cultivo es homogéneo. Las colonias de Enterococcus sp. en este agar son de color crema, redondas, con límite definido (Figura III). Ingredientes Concentración (g/L) Peptona (proteína parcialmente digerida) 5’0 Extracto de carne 1’0 Extracto de levadura 2’0 Cloruro de sodio 8’0 Agar 15’0 Anexo IV. Metodología microbiológica 60 Figura III. Colonias de Enterococcus sp. en agar nutritivo Tras el periodo de incubación, se prepara una suspensión bacteriana concentrada transfiriendo las colonias a un tubo con suero fisiológico esterilizado (NaCl 0’9%). El número de colonias presentes en el inóculo se calcula en relación a la turbidez que presenta esta suspensión. Una vez alcanzada la turbidez deseada, se adiciona la suspensión de Enterococcus sp. a la muestra esterilizada, consiguiéndose una concentración bacteriana en torno a 107-108 UFC/100 mL. Hay que tener en cuenta que las poblaciones bacterianas iniciales para cada uno de los experimentos realizados no van a ser exactamente las mismas debido a la propia dificultad de preparación y calibración de la suspensión celular concentrada. IV.II. Tinción de Gram Desarrollada en 1884 por el médico danés Christian Gram, es el método de tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Es un ejemplo de tinción diferencial, procedimiento que se utiliza para diferenciar organismos en base a sus características de tinción. La tinción de Gram divide las bacterias en dos clases: gramnegativas y grampositivas. La pared grampositiva consiste en una única capa homogénea, de 20 a 80 nm de grosor, de peptidoglicano (mureína), un enorme polímero formado por muchas subunidades idénticas, que se sitúa externamente a la membrana plasmática. En cambio, la pared gramnegativa es bastante compleja, contiene una capa de peptidoglicano de 2 a 7 nm cubierta por una membrana externa de 7 a 8 nm de grosor. Puesto que su pared de peptidoglicano es más gruesa, las paredes de las células grampositivas son más resistentes a la presión osmótica que las bacterias gramnegativas [Willey et al., 2009]. El procedimiento de la tinción de Gram se muestra en la Figura IV. Previamente, se realiza un frotis de la colonia que se quiere estudiar en un portaobjetos. Cuando la muestra está seca, se procede a la tinción. En el primer paso, el frotis se tiñe con el colorante básico cristal de violeta, el colorante primario. Tras un minuto de contacto, se lava el porta con agua destilada y se añade el segundo colorante, el lugol. Éste intensifica la interacción entre la célula y el colorante de manera que la célula se tiñe más intensamente. Tras otro minuto de contacto se decolora el frotis lavándolo con acetona o etanol. Este paso produce el aspecto diferencial de la tinción de Gram; las bacterias grampositivas retienen el cristal violeta, mientras que las Anexo IV. Metodología microbiológica 61 bacterias gramnegativas lo pierden y aparecen incoloras. Finalmente, el frotis se tiñe de nuevo (tinción de contraste) con un colorante básico, simple, de un color diferente al del cristal violeta. La safranina, el colorante de contraste más común, tiñe las bacterias gramnegativas de rosa a rojo, dejando a las bacterias grampositivas de color morado oscuro. Figura IV. Método de la tinción de Gram Los enterococos son bacterias grampositivas, por lo que al realizar la tinción de Gram, se tiñen de color morado oscuro. La Figura V muestra la imagen de los enterococos utilizados en el presente trabajo de investigación, observados al microscopio óptico tras la tinción de Gram. Figura V. Tinción de Gram de Enterococcus (grampositivo: color morado oscuro) observados al microscopio óptico Anexo V. Tratamientos basados en ozono 68 La cantidad de ozono, en mg, se calcula según la ecuación I, donde V es el volumen del agente valorante (tiosulfato sódico) consumido, N es la normalidad del tiosulfato (0’025N), V´ es el volumen de yoduro potásico utilizado en la valoración, y 24, el peso equivalente del ozono. [I] Como se trabaja con dos borboteadotes en serie, los mg O3 totales son la suma de los mg O3 retenidos por cada borboteador. El agente valorante, tiosulfato sódico, al no ser patrón primario, se debe estandarizar con dicromato potásico para determinar exactamente su concentración [Clesceri et al., 2005]. Para ello, se toman 80 ml de agua destilada a la que se añade 1 mL de H2SO4 96%, 1 g de KI y 10 mL de K2Cr2O7 0’1 N. Esta mezcla debe permanecer 6 minutos en oscuridad antes de ser valorada con la disolución de tiosulfato que se va a estandarizar. Igualmente, se valora hasta que el color pardo rojizo pasa a amarillo y tras la adición del almidón, se valora hasta la desaparición del color morado. La normalidad real del tiosulfato sódico se calcula según la ecuación II. [II] V.II.ii. Recta de calibrado En la Figura IX se representa la recta de calibrado del ozonizador, que representa el ozono generado (mg O3) en función del tiempo de tratamiento. Permite calcular el ozono introducido en la muestra. Figura IX. Recta de calibrado del ozonizador Bibliografía  Clesceri L.S., Eaton A.D., Rice E.W., Greenberg A.E. “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater”, 21ª edición. APHA, AWWA, WEF, 2005.  Kolthoff I.M., Belcher R. Volumetric Analysis III. Ed. New York: Interscience, 1957. y = 14,797x - 0,2152 R² = 0,9982 0 50 100 150 200 250 0 2 4 6 8 10 12 14 16 O3 generado (mg) tiempo (min) Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación microbiana 69 ANEXO VI. Modelos cinéticos de inactivación microbiana VI.I. Descripción de modelos La microbiología predictiva es una parte esencial de la microbiología que pretende conocer la respuesta de las poblaciones microbianas frente a diversas condiciones ambientales o tratamientos. Su objetivo es desarrollar modelos matemáticos que describan y permitan predecir el ritmo de inactivación de los microorganismos de una determinada población, sometidos a condiciones tecnológicas o medioambientales determinadas. Este estudio de investigación se centra en los modelos de inactivación, modelos que estudian el ritmo de mortandad de las poblaciones bacterianas a lo largo de un proceso. La inactivación bacteriana en aguas ha sido bastante estudiada en la última década aplicando una gran variedad de modelos cinéticos de desinfección [Lee y Nam, 2002]. Mediante la modelización cinética se consigue obtener una expresión matemática que facilite el diseño adecuado de un sistema de desinfección. Durante la mayor parte del siglo XX, en los sistemas de desinfección, solía emplearse un exceso de desinfectante para cumplir así con los requisitos de calidad del agua exigidos. Sin embargo, en la actualidad, se considera que el diseño óptimo y el funcionamiento correcto de un sistema de desinfección exigen el desarrollo previo de modelos cinéticos que puedan ser fácilmente incorporados a las distintas configuraciones de los reactores que se emplean en el campo del tratamiento de aguas. Los modelos cinéticos desarrollados en la literatura tratan de representar la acción de un desinfectante y su particular modo de actuación sobre los microorganismos presentes en el agua, bajo las condiciones específicas del sistema que se estudia. En 1908 Chick formula la primera cinética de inactivación de primer orden para la modelización de las gráficas de inactivación lineales. Con ella intenta explicar el proceso de desinfección como si de una reacción química se tratara. Considera que este proceso es análogo a una reacción química de primer orden en la que la velocidad de la reacción depende de las concentraciones relativas del desinfectante y los microorganismos, estando el desinfectante en exceso. Este modelo se expresa mediante la ecuación III donde Nt es el número de bacterias supervivientes en el instante t, N0 es el número de bacterias inicial (t=0) y k es la constante de velocidad de la reacción. Nk dt dN ·  tk N N Ln t 0 [III] En el mismo año Watson (1908) incluye una modificación al modelo de Chick, incorporando el efecto de la concentración del desinfectante en el proceso de desinfección. El modelo de Chick-Watson se representa por la ecuación IV, donde C es la concentración del desinfectante y n es el número de moléculas de desinfectante necesarias para la inactivación microbiana, también descrito como coeficiente de dilución, un factor empírico que suele considerarse la unidad [Pernitsky et al., 1995]. Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación microbiana 70 NCk dt dN ··  tCk N N Ln n t 0 [IV] Estas cinéticas sencillas asumen que todos los microorganismos de la población presentan la misma sensibilidad al agente letal por lo que, cuando se representa su inactivación frente al tiempo de tratamiento, bajo una intensidad constante, se obtiene una línea recta. Sin embargo, estos modelos lineales no permiten explicar desviaciones observadas en muchos procesos de inactivación microbiana, como se refleja en la Figura X. La curva de inactivación A representa la cinética de primer orden o muerte exponencial, en la que la velocidad de inactivación es constante e independiente del tiempo de tratamiento. La curva B muestra un hombro inicial (shoulder) o fase “lag” en la que una fracción de microorganismos supervivientes se mantiene constante en los primeros instantes del tratamiento, produciéndose seguidamente un descenso lineal de los mismos. Se atribuye a una mezcla inadecuada del desinfectante en la muestra, un retraso en la difusión del desinfectante a los puntos de acción bacterianos o a una resistencia inicial de los microorganismos al ataque del desinfectante. Las curvas C se caracterizan por una fase de inactivación lineal inicial rápida seguida de una disminución de las poblaciones lenta, lo que se traduce en la formación de una cola o tailing-off [Gyürék y Finch, 1998]. Del mismo modo que en el fenómeno de los hombros, existen varias teorías acerca de la aparición de colas. Puede ser debido a agrupaciones de microorganismos, a la presencia de subpoblaciones con una resistencia variable al desinfectante, bien de carácter innato o como respuesta a una adaptación al medio, o también, a que se produzca una disminución en la concentración del desinfectante durante el tratamiento. Finalmente, las curvas D presentan ambas desviaciones lineales, mostrando una fase inicial de hombro seguida de una fase lineal de inactivación y finalizando con un fenómeno de cola (curvas sigmoideas). Figura X. Curvas de inactivación microbiana posibles [Gyürék y Finch, 1998]. Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación microbiana 71 A partir de estas teorías se desarrollan cinéticas alternativas que permiten describir curvas de supervivencia no lineales y que han sido aplicados por numerosos autores para describir el comportamiento de diversos microorganismos en el campo de la desinfección. La Tabla 6 recoge los modelos matemáticos propuestos para describir las gráficas de inactivación obtenidas en el presente trabajo de investigación. La selección de estos modelos se realiza en base al principio de parsimonia según el cual los modelos han de ser tan simples como sea posible, es decir, con el menor número de parámetros posible [Lanao, 2012]. La bondad del ajuste puede mejorar en gran medida añadiendo más parámetros al modelo; sin embargo, en ocasiones, aumentar mucho el número de parámetros puede llevar a que las predicciones no tengan sentido. A continuación se desarrollan con más detalle cada uno de los modelos matemáticos seleccionados. VI.I.i. Modelo de Hom (1972) Hom, tras analizar los resultados de diversos experimentos de cloración sobre sistemas algales-bacterianos y observar que respondían a cinéticas curvilíneas más que a lineales, generalizó de manera empírica la ley de Chick-Watson mediante la ecuación V, donde k es la constante de velocidad de inactivación de primer orden, C es la concentración del desinfectante, n el coeficiente de dilución y m una constante empírica del modelo [Pernitsky et al., 1995]. En el caso de que la concentración sea constante, el modelo se simplifica integrándose esta concentración en una constante de velocidad aparente (kap= k· Cn) dando lugar a la ecuación VI, siendo esta kap una constante de pseudo-primer orden (min-1) [Malato et al., 2009]. Este modelo no considera que el agua tenga una demanda de desinfectante y por tanto, que la concentración del mismo disminuya a lo largo del tratamiento. 1mn tNCmk dt dN    mn ttCk N N Log  0 [V] m ap ttk N N Log  0 [VI] El nivel de inactivación predicho por el modelo de Hom es una función no lineal de C y t, que dependen de los parámetros del modelo n y m, respectivamente. Este modelo puede describir las curvas A-D de la Figura X y se simplifica al modelo Chick-Watson para m=1. Cuando m es menor que la unidad, se visualiza un efecto de cola o tailing-off. VI.I.ii. Modelo de Hom modificado (1994) Años más tarde, Haas y Joffe en 1994 modifican el modelo de Hom estableciendo que la concentración del desinfectante puede cambiar con el tiempo, debido a la demanda de los microorganismos o de otros componentes presentes en el agua. Si la descomposición del desinfectante residual es de primer orden, como frecuentemente se observa para la descomposición del cloro y ozono, se establece una relación entre la concentración residual y el tiempo según la ecuación VII donde C0 es la concentración inicial y k’ la constante de velocidad de descomposición del desinfectante (min-1). Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación microbiana 72 tk eCC ' 0  [VII] A partir de las ecuaciones V y VII, se obtiene el modelo de Hom modificado, ecuación VIII. Este modelo añade una constante al modelo de Hom, k’, considerando la demanda del desinfectante por parte de la muestra. m m tnk n m teCk nk m N N Log                     ' 0 0 1 ' [VIII] VI.I.iii. Modelo bifásico de Pruitt y Kamau (1993) En 1993, Pruitt y Kamau establecen un modelo bifásico basado en la existencia de dos poblaciones microbianas que presentan una sensibilidad al tratamiento diferente, siguiendo en ambos casos una cinética de inactivación de primer orden. La expresión matemática del modelo se define por la ecuación IX, donde P significa la fracción de microorganismos supervivientes correspondientes a la subpoblación 1, (1-P) es la fracción de supervivientes de la subpoblación 2, k1 representa la constante de inactivación de la población sensible y k2 es la constante de inactivación de la población resistente.     tktk tePePLog N N Log ·· 0 21 ·1·   [IX] VI.I.iv. Modelo de Mafart (2002) Este modelo asume que la inactivación microbiana se debe a la incapacidad de la célula para resistir las duras condiciones impuestas por algún tipo de estrés, después de cierto tiempo; también asume que la población es heterogénea, es decir, que cada célula tarda un tiempo diferente en morirse. En definitiva, es un modelo que implica la existencia de una distribución de resistencias dentro de la población microbiana. La resistencia sigue una distribución de probabilidad de Weibull, definida por la ecuación X. La distribución de Weibull es una distribución de probabilidades diseñada para describir el comportamiento de sistemas que tienen cierto grado de variabilidad.   n b t ne b t b n tf                1 [X] Mafart (2002) modifica la ecuación de Weibull según la ecuación XI, donde δ es el parámetro de escala y se corresponde con el tiempo necesario para reducir el primer ciclo logarítmico decimal de la población bacteriana y p es el parámetro de forma e indica la forma de la curva de la ecuación, ya que ésta toma formas convexas cuando n es mayor que 1 y cóncavas cuando es menor que 1. p tt N N Log         0 [XI] Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación microbiana 73 VI.I.v. Modelo de Geeraerd (2000) Este modelo matemático se basa en diversos argumentos que describen el comportamiento de los microorganismos cuando se presentan fenómenos de hombro, una fase de inactivación lineal y cola, es decir, cuando describen curvas sigmoideas [Geeraerd et al., 2000]. La incorporación de cada fenómeno se engloba en la ecuación XII, donde Nres es la concentración de bacterias supervivientes, kmax es la velocidad específica de inactivación y SI es el parámetro que representa la duración del hombro.     res tkSIk SIk tk rest N ee e eNNN              maxmax max max ·11 ·· · 0 [XII] VI.II. Ajuste de datos experimentales e índices de error Para obtener los coeficientes cinéticos de cada modelo descritos anteriormente, es necesario ajustar los valores experimentales a las correspondientes ecuaciones mediante técnicas de regresión no lineal. Los parámetros de los modelos se ajustan a ecuaciones mediante algoritmos interactivos basados en el método de mínimos cuadrados [Pernistky et al., 1995]. En la actualidad, muchos programas informáticos estadísticos permiten realizar estos ajustes. Entre ellos, en este trabajo experimental se utiliza la herramienta Solver y el complemento GInaFiT (Geeraerd and Van Impe Inactivation Model Fitting Tool) del programa Microsoft Excel. Para evaluar la calidad de los ajustes de los modelos a los datos experimentales obtenidos se utilizan dos índices: el coeficiente de determinación (R2) y el error cuadrático medio (ECM). También se utiliza con este propósito la representación gráfica de los valores estimados frente a los obtenidos experimentalmente. El cálculo de R2 y ECM se realiza con el programa Excel (Microsoft). El coeficiente de determinación, R2, se utiliza como una medida global de la calidad del ajuste. Este coeficiente informa sobre la proporción de variabilidad total de la variable dependiente que es explicable por el modelo. Cuanto más cercano sea el valor R2 a 1, mejor es la precisión predictiva del modelo, y por tanto, más concuerdan los valores predichos con los valores observados. La ecuación del coeficiente de determinación viene descrita por la ecuación XIII, donde i y ~ son los valores estimados y es la media de los valores reales.            1 2 1 2 2 i i n ii yy yy R ~ [XIII] El error cuadrático medio, ECM, se define como la raíz cuadrada de la media del cuadrado de los residuos (diferencia entre los valores observados y los valores estimados) y viene determinado por la ecuación XIV, donde n es el tamaño de la muestra. Un valor de ECM igual a 0 indica que existe un perfecto acuerdo entre los valores predichos y los valores reales. Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación microbiana 74 n yy ECM n ii    1 2 ) ~ ( [XIV] Para comparar modelos diferentes se representan gráficamente los valores observados frente a los valores estimados. Si el modelo se ajusta perfectamente a los datos, los puntos se encuentran distribuidos a lo largo de la línea de equivalencia. La bondad del modelo es mayor cuanto más próximos están los puntos a dicha línea. Bibliografía  Chick H. “An investigation of the laws of disinfection”. Journal of Hygiene 8, 92-158, 1908.  Geeraerd A.H., Herremans C.H., Van Impe J.F. “Structural model requirements to describe microbial inactivation during a mild heat treatment”. International Journal of Food Microbiology 59, 185-209, 2000.  Gyürek L.L., Finch G.R. “Modelling water treatment chemical disinfection kinetics”. Journal of Environmental Engineering 124, 783-793, 1998.  Haas C.N., Joffe J. “Disinfection under dynamic conditions: modification of Hom’s model for decay”. Environmental Science and Technology 28, 1367-1369, 1994.  Hom L.W. “Kinetics of chlorine disinfection in an ecosystem”. Journal of Sanitary Engineering Division 98, 183-193, 1972.  Lanao M. “Investigación de la inactivación de Clostridium perfringens y Enterococcus sp. en aguas mediante procesos convencionales y avanzados de oxidación”. Tesis Doctoral. Universidad de Zaragoza, 2012.  Lee Y., Nam S. “Reflection on kinetic models to the chlorine disinfection for drinking water production”. The Journal of Microbiology 40, 119-124, 2002.  Mafart P., Couvert O., Gaillard S., Leguerinel I. “On calculating sterility in thermal preservation methods: application of the Weibull frequency distribution model”. International Journal of Food Microbiology 72, 107-113, 2002.  Malato S., Fernández P., Maldonado M.I., Blanco J., Gernjak W. “Decontamination and Disinfection of Water by Solar Photocatalysis: Recent Overview and Trends”. Catalysis Today 147, 1-59, 2009.  Pernitsky D.J., Finch G.R., Huck P.M. “Disinfection kinetics of heterotrophic plate-count bacteria in biologically treated potable water”. Water Research 29, 1235-1241, 1995.  Pruitt K.M., Kamau D.N. “Mathematical models of bacteria growth, inhibition and death under combined stress conditions”. Journal of Industrial Microbiology 12, 221-231, 1993.  Watson H.E. “A note on the variation of the rate of disinfection with change in the concentration of the disinfectant”. Jounal of Hygiene 8, 536-542, 1908. Anexo VII. Resultados 75 ANEXO VII. Resultados VII.I. Resultados de inactivación VII.I.i. Cloración Las tablas XI-XIV muestran los resultados de inactivación de Enterococcus sp. (en UFC/100 mL), así como el cloro residual (en mg/L Cl2), durante los ensayos de cloración. Tabla XI. Inactivación de enterococos y cloro residual Dosis de cloro 3'8 mg/L Cl2 Tiempo Nt Log(Nt) Log(Nt/N0) Cloro residual (mg/L Cl2) 0 6,6E+07 7,82 0 3,8 0,5 3,0E+07 7,48 -0,34 2,6 1 1,2E+07 7,08 -0,74 2,4 3 3,0E+06 6,48 -1,34 2,1 5 4,5E+06 6,65 -1,17 1,9 10 1,0E+06 6,00 -1,82 1,8 30 4,4E+04 4,64 -3,18 1,5 Tabla XII. Inactivación de enterococos y cloro residual Dosis de cloro 15 mg/L Cl2 Tiempo Nt Log(Nt) Log(Nt/N0) Cloro residual (mg/L Cl2) 0 3,2E+07 7,51 0,00 15,0 0,5 1,6E+07 7,20 -0,30 10,2 1 1,6E+07 7,20 -0,30 10,1 3 6,8E+05 5,83 -1,67 8,2 5 9,0E+04 4,95 -2,55 7,5 10 8,0E+00 0,90 -6,60 6,2 30 1,0E+00 0,00 -7,51 6,2 Tabla XIII. Inactivación de enterococos y cloro residual Dosis de cloro 30 mg/L Cl2 Tiempo Nt Log(Nt) Log(Nt/N0) Cloro residual (mg/L Cl2) 0 6,6E+07 7,82 0,00 30,0 0,5 6,8E+05 5,83 -1,99 19,0 1 1,7E+05 5,23 -2,59 15,8 3 5,0E+02 2,70 -5,12 13,8 5 2,0E+01 1,30 -6,52 12,3 10 4,0E+00 0,60 -7,22 11,8 30 2,0E+00 0,30 -7,52 11,7 Anexo VII. Resultados 76 Tabla XIV. Inactivación de enterococos y cloro residual Dosis de cloro 65 mg/L Cl2 Tiempo Nt Log(Nt) Log(Nt/N0) Cloro residual (mg/L Cl2) 0 3,4E+07 7,53 0,00 65,0 0,5 1,5E+03 3,18 -4,36 40,1 1 2,8E+01 1,45 -6,08 33,3 3 0,0E+00 0,00 -7,53 25,2 5 0,0E+00 0,00 -7,53 19,2 10 0,0E+00 0,00 -7,53 15,9 30 0,0E+00 0,00 -7,53 15,7 La Figura XI representa el cloro residual a lo largo de los distintos tratamientos de cloración. En todos los casos se observa un rápido consumo de cloro durante los primeros instantes del tratamiento. Posteriormente la desaparición de cloro es cada vez más lenta, quedando cloro residual tras 30 minutos de tratamiento en todos los ensayos. Figura XI. Cloro residual durante los tratamientos de cloración. VII.I.ii. Tratamientos basados en ozono Las tablas XV-XVII muestran los resultados de inactivación de Enterococcus sp. durante los tratamientos basados en ozono, así como el control de ozono durante el proceso. Tabla XV. Inactivación de enterococos en el tratamiento de ozonización Tiempo (min) O3 generado (mg) O3 no consumido (mg) O3 consumido (mg/L) Nt log(Nt) log(Nt/N0) 0 0,0 0,0 0,0 1,32E+08 8,12 0,00 0,5 7,2 0,0 7,2 1,15E+08 8,06 -0,06 1 14,6 0,0 15,0 7,50E+07 7,88 -0,25 3 44,2 12,8 34,3 2,66E+07 7,42 -0,70 6 88,6 32,0 56,6 5,10E+06 6,71 -1,41 9 133,0 60,2 72,8 6,50E+03 3,81 -4,31 15 221,7 131,7 90,1 1,64E+02 2,21 -5,91 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 0 5 10 15 20 25 30 35 Cloro residual (mg/l Cl2) Tiempo (min) 3'8 mg/l Cl2 15 mg/l Cl2 30 mg/l Cl2 65 mg/l Cl2 Anexo VII. Resultados 77 Tabla XVI. Inactivación de enterococos en el tratamiento peroxona (1’4 mg/L H2O2) Tiempo (min) O3 generado (mg) O3 no consumido (mg) O3 consumido (mg/L) Nt log(Nt) log(Nt/N0) 0 0,0 0,0 0,0 1,35E+08 8,13 0,00 0,5 7,2 0,0 7,2 9,30E+07 7,97 -0,16 1 14,6 0,0 14,9 9,50E+07 7,98 -0,15 3 44,2 8,8 37,5 6,10E+07 7,79 -0,35 6 88,6 37,0 51,5 1,56E+07 7,19 -0,94 9 133,0 60,2 72,8 2,30E+03 3,36 -4,77 15 221,7 131,7 90,1 5,60E+01 1,75 -6,38 Tabla XVII. Inactivación de enterococos en el tratamiento peroxona (20 mg/L H2O2) Tiempo (min) O3 generado (mg) O3 no consumido (mg) O3 consumido (mg/L) Nt log(Nt) log(Nt/N0) 0 0,0 0,0 0,0 1,80E+08 8,26 0,00 0,5 7,2 0,0 7,2 1,60E+08 8,20 -0,05 1 14,6 0,0 15,3 1,60E+08 8,20 -0,05 3 44,2 8,9 39,2 9,00E+07 7,95 -0,30 6 88,6 28,3 60,2 4,00E+06 6,60 -1,65 9 133,0 61,3 71,7 9,80E+03 3,99 -4,26 15 221,7 114,3 107,4 2,66E+02 2,42 -5,83 VII.I.iii. Tratamientos basados en luz UV/visible La Tabla XVIII muestra los resultados de inactivación de Enterococcus sp. durante los tratamientos basados en luz UV/visible. Tabla XVIII. Inactivación de enterococos en los tratamientos basados en irradiación UV/vis + 20 mg/L H2O2 UV/vis + 1 g/L TiO2 UV/vis + 680 mg/L H2O2 Tiempo (min) Nt (UFC/100 mL) Log (Nt/N0) Nt (UFC/100 mL) Log (Nt/N0) Nt (UFC/100 mL) Log (Nt/N0) 0 1,55E+08 0 1,55E+08 0 1,07E+08 0 5 1,55E+08 0 _ _ _ _ 10 _ _ 1,40E+08 -0,04 _ _ 15 1,47E+08 -0,02 _ _ _ _ 20 1,41E+08 -0,04 1,37E+08 -0,05 _ _ 30 1,19E+08 -0,11 1,34E+08 -0,06 5,40E+07 -0,30 60 _ _ _ _ 2,60E+07 -0,61 Anexo VII. Resultados 84 Figura XXIV. Representación de los valores estimados frente a los valores observados en el tratamiento peroxona 1’4 mg/L H2O2. Figura XXV. Representación de los valores estimados frente a los valores observados en el tratamiento peroxona 20 mg/L H2O2. -8 -6 -4 -2 0 -8 -6 -4 -2 0 Estimados Observados Peroxona 1'4 mg/L. Modelo de Hom -8 -6 -4 -2 0 -8 -6 -4 -2 0 Estimados Observados Peroxona 1'4 mg/L. Modelo bifásico -8 -6 -4 -2 0 -8 -6 -4 -2 0 Estimados Observados Peroxona 1'4 mg/L. Modelo de Mafart -8 -6 -4 -2 0 -8 -6 -4 -2 0 Estimados Observados Peroxona 1'4 mg/L. Modelo de Geeraerd -8 -6 -4 -2 0 -8 -6 -4 -2 0 Estimados Observados Peroxona 20 mg/L. Modelo de Hom -8 -6 -4 -2 0 -8 -6 -4 -2 0 Estimados Observados Peroxona 20 mg/L. Modelo bifásico -8 -6 -4 -2 0 -8 -6 -4 -2 0 Estimados Observados Peroxona 20 mg/L. Modelo de Mafart -8 -6 -4 -2 0 -8 -6 -4 -2 0 Estimados Observados Peroxona 20 mg/L. Modelo de Geeraerd Anexo VII. Resultados 85 VII.II.iii. Tratamientos basados en luz UV/vis En la Figura XXVI se representa el ajuste de los distintos modelos matemáticos a los datos experimentales observados durante el tratamiento de fotocatálisis combinada con 680 mg/L H2O2. Figura XXVI. Ajuste de los tres modelos matemáticos a la curva de inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento fotocatálisis/ 680 mg/L H2O2 En la Figura XXVII se representan los valores experimentales observados de inactivación de Enterococcus sp. frente a los valores estimados por los distintos modelos. Cuanto más se aproximen estos datos a una línea recta, mejor es el ajuste. Figura XXVII. Representación de los valores estimados frente a los valores observados en el tratamiento fotocatálisis/H2O2 (680 mg/L H2O2). -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Log(Nt/N0) Tiempo (min) Observados Hom Bifásico Mafart -8 -6 -4 -2 0 -8 -6 -4 -2 0 Estimados Observados Fotocatálisis/H2O2. Modelo de Hom -8 -6 -4 -2 0 -8 -6 -4 -2 0 Estimados Observados Fotocatálisis/H2O2. Modelo bifásico -8 -6 -4 -2 0 -8 -6 -4 -2 0 Estimados Observados Fotocatálisis/H2O2. Modelo de Mafart Anexo VII. Resultados 86