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Abstract
El citoesqueleto es una estructura dinámica formada por un entramado de biopolímeros, principalmente actina, miosina y “complejos de adhesión (CAs)”. Éstos proporcionan soporte interno en las células y juegan un papel determinante en numerosas funciones biológicas y mecánicas como pueden ser la proliferación, la migración y la división celular. El conocimiento de esta estructura es de vital importancia a la hora de entender los procesos biológicos que tienen lugar en la célula, pero a pesar de ser un tema que actualmente está siendo el foco de numerosas investigaciones, el conocimiento que se tiene del funcionamiento mecánico de estos entramados es bastante escaso. El objetivo de este proyecto es avanzar en el entendimiento del papel que ejercen estas estructuras poliméricas (citoesqueleto) en la migración celular, centrándose en la interacción del citado citoesqueleto con la matriz extracelular (ECM), fenómeno conocido como adhesión focal. Para ello se desarrollará un modelo computacional discreto en dos dimensiones, en el lenguaje de programación C++, y se compararán los resultados obtenidos con otros resultados experimentales citados en la bibliografía. Para entender con precisión el fenómeno de la adhesiones focales es necesario conocer las características mecánicas (rigidez y deformabilidad) de la ECM y de los CAs, conglomerados de proteínas que enlazan la actina del citoesqueleto con las proteínas de la ECM (formando así la adhesión focal), así como el fenómeno de polimerización de la actina en filamentos y el papel que juega la miosina como motor celular, haciendo que los filamentos de actina deslicen sobre ella, ejerciendo fuerza sobre ellos. En el modelo se incluirán con detalle las propiedades mecánicas de las adhesiones focales, así como dos fenómenos importantes que rigen su comportamiento: el de adhesión y separación con los filamentos de actina y las integrinas (proteínas de la membrana celular que sirven como punto de unión para las adhesiones focales con la ECM) y el de despliegue. A lo largo del documento se analizará la importancia de la rigidez de la ECM, de la concentración de CAs y de la concentración de integrinas, analizando cómo estos parámetros influyen en la velocidad de movimiento del filamento de actina, condicionando así el tiempo de vida de la adhesión focal. Escribano Jiménez, Jorge; García Aznar, José Manuel; Sánchez Rúa, María Teresa
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P Co m P roy e m po r Jo r J M De p Es e cto F Inge n r tami e bio p r ge Es c J osé Ma n C M aría Te r p artament o cuela de I n Univer s Fin d n iería Ind e nto p olím c riban o Director n uel Gar C o-Directo r r esa Sá n o de Ingen n geniería y s idad de Z a A bril 201 3 d e C a ustrial mec á eros o Jimé cía- A zn a r a n chez R ú iería Mec á y Arquitec t a ragoza 3 a rre r á nic o nez a r ú a á nica t ura r a o de
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez Todoproyectoesfrutodeuntrabajoconjunto.Porello,quierodejarconstanciade miagradecimiento,nuncasuficientementeexplícito,alDr.D.JoséManuelGarcía AznaryalaDraDªMaríaTeresaSánchezRúaporayudarmeenlosmomentosiniciales acentrareltema,porelapoyocontinuoycercanoquemehanproporcionadoenla elaboracióndelProyectoyporhaberrevisadolamemoriafinal. TambiéndeseoexpresarmigratitudalDr.D.JoséManuelGarcíaAznarpor habermeaceptadoenelgrupodetrabajoadscritoalDepartamentodeIngeniería MecánicadelaEscueladeIngenieríayArquitecturadelaUniversidaddeZaragozay dirigidoporélmismo.Agradecimientoquehagoextensivoatodoslosmiembrosde esteequipoyenparticularalaDra.DªMªJoséGómezBenitoporsucontinuoapoyo. APilarporsuempuje,suapoyoincondicionalysucontinuadisposiciónaayudarme entodocuantoestuvieseensumano. Amispadres,PilaryJavier,porquesiemprehanvaloradomiesfuerzoymehan animadoaemprendernuevastareas.
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez Resumen Elcitoesqueletoesunaestructuradinámicaformadaporunentramadode biopolímeros,principalmenteactina,miosinay“complejosdeadhesión(CAs)”.Éstos proporcionansoporteinternoenlascélulasyjueganunpapeldeterminanteen numerosasfuncionesbiológicasymecánicascomopuedenserlaproliferación,la migraciónyladivisióncelular.Elconocimientodeestaestructuraesdevital importanciaalahoradeentenderlosprocesosbiológicosquetienenlugarenlacélula, peroapesardeseruntemaqueactualmenteestásiendoelfocodenumerosas investigaciones,elconocimientoquesetienedelfuncionamientomecánicodeestos entramadosesbastanteescaso. Elobjetivodeesteproyectoesavanzarenelentendimientodelpapelqueejercen estasestructuraspoliméricas(citoesqueleto)enlamigracióncelular,centrándoseenla interaccióndelcitadocitoesqueletoconlamatrizextracelular(ECM),fenómeno conocidocomoadhesiónfocal.Paraellosedesarrollaráunmodelocomputacional discretoendosdimensiones,enellenguajedeprogramaciónC++,ysecompararánlos resultadosobtenidosconotrosresultadosexperimentalescitadosenlabibliografía. Paraentenderconprecisiónelfenómenodelaadhesionesfocalesesnecesario conocerlascaracterísticasmecánicas(rigidezydeformabilidad)delaECMydelosCAs, conglomeradosdeproteínasqueenlazanlaactinadelcitoesqueletoconlasproteínas delaECM(formandoasílaadhesiónfocal),asícomoelfenómenodepolimerización delaactinaenfilamentosyelpapelquejuegalamiosinacomomotorcelular, haciendoquelosfilamentosdeactinadeslicensobreella,ejerciendofuerzasobre ellos. Enelmodeloseincluiráncondetallelaspropiedadesmecánicasdelasadhesiones focales,asícomodosfenómenosimportantesquerigensucomportamiento:elde adhesiónyseparaciónconlosfilamentosdeactinaylasintegrinas(proteínasdela membranacelularquesirvencomopuntodeuniónparalasadhesionesfocalesconla ECM)yeldedespliegue. AlolargodeldocumentoseanalizarálaimportanciadelarigidezdelaECM,dela concentracióndeCAsydelaconcentracióndeintegrinas,analizandocómoestos parámetrosinfluyenenlavelocidaddemovimientodelfilamentodeactina, condicionandoasíeltiempodevidadelaadhesiónfocal.
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PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez I Índice 1.Introducción.............................................................................................1 1.1.Motivación..............................................................................................1 1.2Estadodelarte........................................................................................2 1.3Objetivo...................................................................................................4 1.4.Estructuradelamemoria........................................................................4 2.Modelomatemático.................................................................................5 2.1Modelodesimulación.............................................................................5 2.2Miosinayfilamentodeactina.................................................................5 2.3Complejosdeadhesión(CAs)..................................................................6 2.3.1Fenómenodeplegamiento..............................................................................6 2.3.2Fenómenodeuniónyrupturadeunión..........................................................8 2.3.3DinámicaBrowniana........................................................................................8 2.4 Substratodelamatrizextracelular.........................................................9 3.Implementaciónnumérica......................................................................11 3.1Condicionesyparámetrosiniciales.......................................................11 3.2Desarrollodelprograma.......................................................................11 3.2.1Equilibriodelaactina.....................................................................................12 3.2.2Equilibriodelamatrizextracelular...............................................................12 3.2.3EquilibrioCAsunidosporunextremo..........................................................13 3.2.4EquilibrioCAsunidosporambosextremos..................................................13 3.2.5MovimientoCAssueltos................................................................................14 3.3Hipótesisadicionalessobrelaimplementaciónnuméricadelmodelo.14 3.4Diagramadeflujo..................................................................................15 4.Ejemplosdeaplicación...........................................................................17 4.1Parámetrosycondicionesinicialesaanalizar.......................................17 4.2Tablasdeparámetros............................................................................18
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez II 5.Análisisderesultados.............................................................................19 5.1Validaciónderesultados.......................................................................19 5.2Influenciadecondicionesinicialesysensibilidaddeparámetros.........20 5.2.1Condicionesiniciales......................................................................................21 5.2.2Análisisdesensibilidaddelosparámetrosdelmodelo.................................24 5.3Avancedelfilamento.............................................................................25 6.Conclusionesyfuturaslíneasdeinvestigación........................................27 6.1Conclusiones.........................................................................................27 6.2Futuraslíneasdeinvestigación.............................................................28 Bibliografía...................................................................................................29 AnexoI.Velocidaddelfilamentodeactina....................................................31 AnexoII.CódigoenC++delprogramaimplementado...................................32
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez III Índicedefiguras Figura1‐1Complejodeadhesión(CA).Laactinina,vinculinaytalinaformanlosCAsy conectanlosfilamentosdeactinaconlasintegrinasqueasuvezvanalsubstrato[4]..2 Figura1‐2Esquemadefuncionamientodelmodelo[9]..................................................3 Figura1‐3Resultadosexperimentalesysimuladosdelavelocidadderetrocesodel filamentodeactinafrentealmóduloelásticodelsubstrato[9]......................................3 Figura2‐1Interaccióncélula‐matrizextracelular[2]......................................................5 Figura2‐2Esquemafilopodio[8].....................................................................................5 Figura2‐3Esquemainteracciónmiosina‐filamentodeactina[10].................................6 Figura2‐4EjemplodecurvasFs‐extensióndeunbrazodeCAparaNuf=10.Seha probadoparadosvelocidadesdeextensióndiferentes[11]...........................................7 Figura2‐5Substratodivididoenpequeñasbarraspornudos.Enlapartedearribase puedeverlanumeraciónlocaltantodenudoscomodebarras,yenladeabajola numeraciónglobaldenudos..........................................................................................10 Figura3‐1Equilibriodefuerzasenelfilamentodeactina............................................12 Figura3‐2Equilibriosubstrato.......................................................................................13 Figura3‐3EquilibriodeCAssueltosporunextremo.ElmomentoMbprovocauna fuerzaenelpuntocentraldesplazándolohastasuposicióndeequilibrio....................13 Figura3‐4EquilibrioCAunidaporambosextremos.....................................................14 Figura3‐5Diagramadeflujo..........................................................................................16 Figura5‐1Velocidadmediaderetrocesodelfilamentodeactinafrentealmódulo elásticodelsubstrato.....................................................................................................20 Figura5‐2Velocidadmínimaderetrocesodelfilamentodeactinafrentealmódulo elásticodelsubstrato.....................................................................................................20 Figura5‐3Velocidadmediaderetrocesodelfilamentodeactinaparadistintas longitudesdeéstefrentealmóduloelásticodelsubstrato...........................................21 Figura5‐4Velocidadmediaderetrocesodelfilamentodeactinaparadistintas distanciasentreintegrinasfrentealmóduloelásticodelsubstrato..............................22 Figura5‐5Velocidadmediaderetrocesodelfilamentodeactinaparadistintonúmero deCAsfrentealmóduloelásticodelsubstrato.............................................................22 Figura5‐6Velocidadmediaderetrocesodelfilamentodeactinaparadistintonúmero decabezasdemiosinafrentealmóduloelásticodelsubstrato....................................23 Figura5‐7Velocidadmediaderetrocesodelfilamentodeactinaparadistintosvalores delongituddepersistenciafrentealmóduloelásticodelsubstrato.............................24 Figura5‐8Velocidadmediaderetrocesodelfilamentodeactinaparadistintasvalores máximosdedesplieguedelosCAsfrentealmóduloelásticodelsubstrato.................25 Figura5‐9Velocidadmediadeavancedelfilamentodeactinafrentealmóduloelástico delsubstrato...................................................................................................................25 Figura5‐10Velocidadmediadeavancedelfilamentodeactinaparadistintosvalores delongituddepersistenciafrentealmóduloelásticodelsubstrato.............................26
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez IV Índicedetablas Tabla4‐1Constantesdelmodelomatemático..............................................................18 Tabla4‐2Variablesobjetodeestudio...........................................................................18
PFC I don d C a ocur fenó long i dism des p Fig u pro b I ngenieríaI n uf s k k k d e: peslal o 0, (14 i l desplieg ,e s ese esl a a davezqu e ridoyse menocont i tudesgua r m inuiráen1 p liegueenl a u ra2‐4Ejem p eselpa b abilidadd e n dustrial 0, 2 0, ,120 (2 4(1 ( i b i s ACP l k T p l rr uf k o ngitudde p 030)i n m ue, s larigidez d lcoeficient e a elasticida d e ocurreu n aumentai rario,am e r dadasdur a cadavez. a fuerzaeje p lodecurvas v rámetrod e e queocurr a ´12 ´0 2 ´12 0, ) ( /)( 1 ) i i rr rl 0 0 exp uf uf k k p ersistenci a m ,con (i d elCAaco m e dedespli e d mecánica. n despliegu e en1.Cu a e didaquel a ntelafas e EnlaFigur a rcidapore l Fs‐extensión v elocidades d e unafunci ó a elevento 1 P ´12 ´0 2 ´0 0, ( ) 1 /) i rr rl s s uf s B F kT a , 0,1,..., ) uf N m presiónp o e gueenre p . e seguard a a ndoelb r alongitud ededespl a 2‐4sepu e l brazodel C deunbrazo d d eextensión d ó ndedistr será: * 1 uf kt e ´12 ´0 0, i rr l 12 0 12 0 s i s i rr rr ,eslamá x o rdebajo d p osoy a lalongitu d r azoempi e delbrazo v iegue,ocu r e deverla i C A[13][14 ] d eCAparaN u d iferentes[1 1 ibuciónex p (2.5) JorgeE s 12 0 12 si si r r r r (2.4) x imaextens elalongitu d delbrazo e ceadecr e v ayasiend o r rirásupl e nfluencia d ] . u f=10.Seha p 1 ] p onencial[ 1 s cribanoJi m 0 0 r r (2.3) s iónparaié u ddeequili b alaquee s e cerocurr i o menorq u e gamiento d elfenóme n p robadopar a 1 5],porta n m énez 7 é simo b rio, s teha i ráel u elas ylai n ode dos n tola
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 8 dondeΔteselintervalodetiempoquetranscurreentrecadaevaluacióndel fenómeno. 2.3.2Fenómenodeuniónyrupturadeunión Elfenómenoderupturadelauniónentreproteínasseasemejaaldedespliegue perocambiandolosparámetros: 012 0 012 0 exp si si ub s ub B ub ub F krr kT k krr (2.6) siendo elcoeficientederupturaenreposoylaelasticidadmecánicadela uniónparalaruptura. Enelmodeloquesepresentacuandotienelugarelfenómenoderuptura, independientementedelbrazoenqueocurra,ambosbrazossepliegan completamente(igualacero)ysuslongitudes()vuelvenautomáticamenteasu valordeequilibrio(). Laprobabilidaddequeocurraeleventosecalcularádelamismaformaqueenel apartadoanterior,utilizandolaecuación(2.5). Elfenómenodeuniónocurresimplementeporproximidad.Cuandoelbrazo correspondientedelCAseacercalosuficientealaintegrinaolaactinayningunode ellosestátodavíaunido.Ladistanciadeuniónvieneestablecidaporlaecuación: 1/6 2 12 2d (2.7) dondedesladistanciaentrepartículasyeslamediadelosdiámetrosdecada partícula. 2.3.3DinámicaBrowniana LaecuaciónquegobiernaelcomportamientodelosCAsesladeLangevin[16] 2 2 B ii iiii dr dr mF F dt dt (2.8) dondeeslamasadelaproteína,laposicióndelCA,lafuerzadeinteracción conotrasproteínas,elcoeficientedefricciónconelmedioy esunafuerza estocástica,debidaacolisionesdelmedioconlapartícula,conmediaiguala0yuna correlación[17]: 2 () () Biij BB ij kT FtFt t (2.9) dondeeslaconstantedeBoltzman,Tlatemperatura,ladeltadeKroneckery eseltensorunidaddesegundoorden.Desarrollandoestaecuaciónseobtiene[18]:
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 9 2_ BBi i kT F ni t (2.10) donden_iesunnúmeroaleatoriodeunadistribuciónNormal,N(0,1),demediaceroy desviacióntípica1. Suponiendoque,comounaprimeraaproximación,elCAsepuedaconsiderarcomo unaesfera,sucoeficientedefricciónquedará[19]. 3 ii (2.11) dondeηeslaviscosidaddelmedioyeldiámetrodelaesfera. Porúltimoeltérmino,correspondealasfuerzasdeinteracción,siendoéstasel resultadodelasumadelafuerzainternaejercidaporelbrazoensudirección longitudinal, ylafuerzaqueprovocaelmomentoproducidoporlaresistenciadel brazodelCAagirar[14]: 0 1() 2 bb Mk (2.12) dondeeslarigidezadoblarseylaposicióndeequilibriodelCAconelfilamento deactinaoelsubstratosegúncorresponda. TeniendoencuentaquelosefectosdeinerciadelosCAssondespreciablesenla escaladetiempoaconsiderar,sepuedeeliminareltérminodeaceleracióndela ecuación(2.8),obteniendo: 1() B i ii i dr FF dt (2.13) Apartirdeestaecuaciónyconlosdatosfacilitadosanteriormenteesposible calcularlanuevaposicióndelapartículaparacadaintervalodetiempo. 2.4 Substratodelamatrizextracelular Elsubstratodelamatrizextracelularseconsideracomounelementobarra trabajandoaaxil,portantosucomportamientosepuedeexpresarentérminosde rigidez: est est est FKU (2.14) dondeesladenominadamatrizglobaldelaestructura,elvectorde desplazamientosglobales(gradosdelibertad)delaestructurayelvectorde cargasnodalesdelaestructura. Lamatrizglobaldelaestructuraseconstruiráatravesdelensamblajedelas matriceselementales.Paraelcasodeunaestructuraconunnúmerondenodos (integrinas),yportanton‐1barraslocalescomoseilustraenlaFigura2‐5,quedala siguientematriz:
PFC I Con: don d entr e Fi g nu m P o lasc o que esco g está extr e inte n A l que d E s lose I ngenieríaI n e s K d eEesel m e nodos. g ura2‐5Subs t m eraciónloc a o steriorme n o ndiciones cubreprác t gidoimpo n elfilamen t e molibre, n tedesplaz a l aplicarla s d adelafor m est K s importan t sfuerzosc o n dustrial 1 11 1 21 ( 0 0 s t K K m óduloelá t ratodividid o a ltantoden u n teesnec e decontor n t icamente t n erunem p t odeactin a paraque a a rseconel s condicion e m a: 1 11 11 21 22 ( 0 0 K K KK K t eseñalarq o rtantesol a 1 12 12 22 11 2 21 ( ) 0 K KK K K K stico,Ael o enpequeña s u doscomod e e sarioesta b n o.Enelca s t odoeldo m p otramient o a yendire c a sínoten g f ilamento d e sdecont o 1 12 2 11 2 21 2 ) ( 0 K K K K ueelsubst a flexión. 2 12 23 22 1 1 0 ( K KK z xx z z xy z E A K L EA K L áreadels u s barraspor n e barras,yen b leceruno s s oqueest a m iniodefin o aunadis c cióncontr a g arestricci o d eactina. o rnosobre 2 12 23 22 11 0 ) K K K K ratosolot r 1 1 21 ) n K K A u bstratod e n udos.Enla p ladeabajol a s puntosd e a mosestud i idoparael tanciacon s a riaasu m o nesexter n lamatrizg 2 2 21 22 ( nn K K r abajaante JorgeE s 1 22 0 0 0 n K (2 . laECMy artedearrib a a numeración e apoyopa i andoseti e problema, s iderabled e ovimiento, n asalmo v lobaldela 2 1 11 0 0 0 ) n K cargasaxil e s cribanoJi m .15) eslalo n a sepuedev e globaldenu rapodera e neunsub s portanto e lazona d dejandoe v imientoc u estructura , (2.16) e s,desprec m énez 10 n gitud e rla d os. plicar s trato seha d onde lotro u ando , ésta i ando
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 11 3. Implementaciónnumérica Laimplementacióndelmodelomatemáticosehahechoenellenguajede programaciónC++[20].Suprincipalobjetivoeslacreacióndeunmodelofiableque permitaanalizarlarespuestadelsistemaparadistintascondicionesinicialesypara distintaspropiedadesdeloselementosinvolucrados. Dichomodelopretendereproducirelciclodelaretraccióndelaactinatrasla creacióndelfilopodio.Lamiosinatirarádelfilamentodeactinayestemovimientoserá restringidoporlosCAsqueesténunidosafilamentoysubstrato. Elprogramacreadoincluyelaimplementaciónnuméricadetodaslasecuaciones vistasenelanteriorcapítulo,ademásdeciertashipótesisnecesariasparasu desarrollo.Acontinuaciónseexplicantantolascondicionescomolosparámetrosy propiedadesiniciales,asícomosumododefuncionamientoehipótesisrealizadas. 3.1Condicionesyparámetrosiniciales Antesdeempezararealizarsimulacionesseestablecenlascondicionesiniciales paradefinirdelprograma. Losparámetrosdeentradadelprogramason: NúmeroCAs. Númeromonómerosdeactina(portanto,longituddelfilamentodeactina) Concentracióndeintegrinas. Númerodecabezasdelamiosina. RigidezdelsubstratodelaECM. RigidezCAs. Tiempodesimulación. Númerodedesplieguespermitidos. Comoprimeraaproximación,seconsideraqueelfilamentodeactinapolimerizade formaquelasactinassecreanunadetrásdeotraformandounalínearecta.El substratoesunalínearectaparalelaalfilamentodeactina,aunadistanciadefinidade élyconunalongitudsuficientementegrandeparaqueelfilamentosiemprese encuentresobreél.Superpuestasalsubstratosecreanlasintegrinas,adistancias aleatoriasentresí,queseránlospuntosatravésdeloscualeslosCAspodránunirseal substrato.LaposicióndelosCAstambiénescompletamentealeatoria,asícomosu orientaciónpudiendoencontrarseencualquierlugardeldominiodefinido. 3.2Desarrollodelprograma Comoseverámásadelante,seplanteaunalgoritmoderesolucióntemporalpara resolverelmodelo:Sediscretizaelproblemaentiempodemaneraqueelintervalode simulaciónsedivideenunaseriedeincrementos.Encadaincremento,serepetiráel algoritmodiseñado.Enprimerlugarseanalizaránlasposicionesdelosbrazosdelos CAsconrespectoalasactinaseintegrinas,silosbrazoscorrespondientesacadauna delaspartículascumplenladistanciamínimaseunirántalcomoseexplicóenel apartado2.3.2.Seguidamentesecalcularánlosprocesosderupturadeenlacey
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 12 plegamiento‐desplieguedelCA.Posteriormenteseprocederáaevaluarlanueva posicióndecadaelementoinvolucradoatravésdedistintosequilibriosdefuerzaque severánacontinuaciónyapartirdeahísevolveráarepetirelprocesoparael siguienteintervalodetiempo. 3.2.1Equilibriodelaactina Elmovimientodelsistemacomienzaporreacciónaldesplazamientodelafibrade actina.Éstesedebealresultadodelasfuerzasprovenientesdelamiosina, dependientedelnúmerodecabezasconlasqueestéunidaalfilamento,yala oposiciónqueponganlosCAsunidosporambosextremosaestemovimiento, determinadoporsufuerzainterna, (verecuación(2.3)),ysuorientacióncon respectoalfilamentodeactina(Figura3‐1).Unavezconocidasestasfuerzassepuede calculareldesplazamientodelaactinaatravésdelaecuación(2.2)vistaenelcapítulo anterior.Alproducirseestedesplazamiento,elbrazodelosCAsunidosalaactinase mueveconellaproduciendoundesequilibrioparaelsiguienteintervalodetiempo. Figura3‐1Equilibriodefuerzasenelfilamentodeactina 3.2.2Equilibriodelamatrizextracelular ElsubstratodelaECMesconsideradounelementobarraysuperpuestasaéltiene alasintegrinas.Sóloatravésdelasintegrinassepermitirálaunión.Portantoel substratoseveráafectadoporlasfuerzasinternas ,delosCAs,haciendoqueéstese deformemásomenosenfuncióndesurigidez(verFigura3‐2). Comosehaindicadopreviamente,enesteproyectoseconsideraqueelsubstrato nopuedeflectar,siendoposibleunicamentesudeformaciónlongitudinal.Portantoel vectordecargasestarácompuestoúnicamenteporlasfuerzasaxilesejercidasporlos CAsencadanudo(integrina)yelvectordedesplazamientosseráeldesplazamientode cadanudoenladirecciónlongitudinal.
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 13 Figura3‐2Equilibrioenelsubstrato 3.2.3EquilibrioCAsunidosporunextremo EnelcasodequeelCAestésolamenteunidoporunextremo,laecuaciónquerige sucomportamientoeslaresistenciadelbrazoagirar.ÉstaharáqueelCAquedeconla orientacióndeequilibriodebidoalafuerza(.)creadaporelmomento: / b b brazo FMl (3.1) dondeeslalongituddelbrazodelCA. ElCAseirámoviendoconelfilamentodeactinaoconelsubstrato,según correspondaelcaso(Figura3‐3). θ‐θ0 θ‐θ0 Mb Mb Fb Fb Filamentoactina CA Substrato Integrina CA Figura3‐3EquilibriodeCAssueltosporunextremo.ElmomentoMbprovocaunafuerzaenelpunto centraldesplazándolohastasuposicióndeequilibrio 3.2.4EquilibrioCAsunidosporambosextremos LosCAssevensometidosalestiramientotantoenelladodelaactinacomoenelde laintegrina.Estorompeelequilibriodefuerzasinternoqueposeen,provocandola aparicióndefuerzasinternas, ,ydeotrasfuerzasproducidasporlaresistenciadelos brazosagirarconrespectoalaposicióndeequilibrioconelfilamentodeactinaydel
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 14 substrato,.Lasfuerzasqueresultansonaplicadasalpuntocentraldelaproteína, dondelosdosbrazosseunen,haciendoqueéstesemuevahaciaunanuevaposición deequilibrio(verFigura3‐4).Eldesplazamientodelpuntovendrádeterminadoporla ecuación(2.13),pudiendodespreciarseelefectode . Figura3‐4EquilibriodelCAunidoporambosextremos 3.2.5MovimientoCAssueltos LosCAsqueestáncompletamentesueltossemoveránsegúnlaecuación(2.13) siendolafuerzabrowniana laúnicaqueinfluirásobreellos,produciendoun movimientoaleatorio. 3.3Hipótesisadicionalessobrelaimplementaciónnuméricadel modelo Alahoraderealizarelprogramasehanrealizadounaseriedesuposicionesy simplificaciones,tantoporlanecesidadinherentedeestablecerunoslímites,comopor lapocainfluenciaenelresultadofinaloporlanecesidaddetomarunadecisiónantela faltadedatosbibliográficos.Aunquealgunasdeellasyahansidocomentadasalo largodeestedocumento,acontinuaciónsepresentaunaenumeracióndelasmismas: CuandolosCAsestánunidosporunodesusdosextremos,éstossemantienen enposiciónvertical,esdecir,seconsideraquelarigidezdelpuntodeuniónde ambosbrazosesrazonablementemayorencomparaciónconlasfuerzas brownianas. CuandoocurreelfenómenoderupturadeuniónyunCApasadeestarunido porambosladosaunosolo,ésteinmediatamenterecuperasuposiciónde equilibrio.Estoesdebidoaqueenesemomento,comoyasehaindicado antes,soloactúa,perosusolainfluenciaessuficienteparaequilibrarloen periodosdetiempodemilisegundos. SielCAestáunidoporambosextremoslarigidezdelpuntocentrales despreciableconrespectoalasfuerzasejercidaspory noofreciendoasí ningunaresistenciaalmovimientoqueéstasleprovocan.
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 15 ElfenómenoderupturanuncapodrátenerlugarsielCAestáunidosolamente porunextremo;laprobabilidadestanpequeñaquesehaoptadopor despreciarla. Lasdeformacionesdelsubstratoocurriránsiempredeformaqueparacada intervalodetiempohayanllegadoasuposicióndeequilibrio. PorcadaintegrinayactinasólosepodráunirunúnicobrazodeCAalavez. Elsubstratoyelfilamentodeactinasolosevenafectadosporcargasaxiles. Sólopuedenserdeformadosodesplazados,respectivamente,deforma horizontalsincontemplarlaposibilidaddeesfuerzoscortantesoqueflecten. ApesardequeteóricamentecadabrazodeunCAtienepropiedades diferentes,debidoalafaltadereferenciasbibliográficas,selessuponelas mismascaracterísticas.Portantosusrigidecesseránsimilaresasícomosus probabilidadesderupturadeenlaceydespliegueencondicionessimilares. ElequilibrioparalosCAsunidossehaescogidocomolaposiciónperpendicular alfilamentodeactinaoalsubstrato. 3.4Diagramadeflujo EldiagramadeflujomostradoenlaFigura3‐5representaelprocesoexacto,pasoa paso,quesigueelprogramaimplementadoparadesarrollarelmétododescrito. Éstecomienzacreandolosfilamentosdeactina,elsubstratoconsusintegrinasylos CAs.Apartirdeahíseentraenunbucledondeloexplicadoacontinuaciónserepetirá paracadaintervalodetiempo.SecompruebasialgunodelosladosdelosCAsque estánlibressepuedeuniraunaactinaoaunaintegrina.Seguidamenteseiniciaráotro buclequerecorrerátodoslosCAs,analizándolosunoauno.Dependiendodecómo esténunidosseseguiráuncaminouotroparaactualizarsusposiciones.Mención especialrequierecuandoelCAestáunidoporamboslados.Endichocasoloprimero queseanalizaráessuprobabilidaddedespliegueparaelladodelaactinaysiéste ocurreono,actualizandolaecuaciónde encasoafirmativo.Posteriormentese realizaelmismoprocesoparasabersiocurreelfenómenoderuptura,siéstetiene lugarelCArecuperalaposicióndeequilibrioypasaaformarpartedelgrupoqueestá unidoporlaintegrina.Encasodequenoseseparesevuelveaproducirelmismo procesodedespliegueyrupturaparaelladodelaintegrina.Siocurrelarupturade enlace,comoesdeesperar,elCApasaráaformarpartedelgrupodelosqueestán unidosporlaactina.EncasodequeelCAsigaunidoporambosladosseprocederáa calcularelequilibriodefuerzasyadescrito,seactualizarálaposicióndelpuntocentral delCAyseguardaránlasfuerzasquetransmitentantoalsubstratocomoalaactina. EnelrestodeloscasosseactualizarásuposiciónguardandoydiferenciandolosCAs queestánunidosaactinayaintegrina.Unavezfinalizadotodoesteprocesopasaráa analizarelsiguienteCA. Unavezacabadoelsegundobuclesetendrántodaslasfuerzasqueactúansobrela actinaytodaslasqueactúansobreelsubstrato.Enprimerlugarseprocederáahallar lamatrizderigidezglobalparaelsubstrato(,sehallarásuinversayconsu correspondientevectordefuerzassehallaránlosdesplazamientos.Conlos desplazamientoshalladosseprocederáaactualizarlaposicióndelasintegrinasenel substratodesplazando,deigualmanera,elextremodelosbrazosdelosCAsunidosa ellas.Seguidamenteconlafuerzasobrelaactinasecalculaeldesplazamientodel
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 16 filamento,yéste,comoenelcasoanterior,semoverájuntoconlosextremosdelos brazosdelosCAsunidosaél.Unavezacabadoesteprocesosevolveráaliniciodel primerbucleyserepetiráelprocesoparaelsiguienteintervalodetiempo. Crearelementos: fliamentoactina, ACPseintegrinasen elsubstrato Comprobar uniones INICIOPROGRAMA Comienzaa anlizarlosCAs unoauno Actuaizar posicion(unidoa integrina) Actuaizar posicion(unidoa actina) Actuaizar posicion(unidoa integrina) DESPLIEGUE Ladoactina Dosbrazos libres Ladoactina unido Doslados unidos Ladointegrina unido RecalcularFs SI NO RUPTURAUNIÓN Ladoactina DESPLIEGUE Ladointegrina RUPTURAUNIÓN Ladointegrina Cálculodematrizde rigidez,K Cálculo desplazamientos substrato Actualizarposicion integrina Actualizarposición actina SI SI SI NO NO NO RecalcularFs Repetirprocesoparacada intervalodetiempo Repetirprocesopara cadaACP Actualizar posición(unido amboslados) Figura3‐5Diagramadeflujo
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 23 Númerocabezasmiosina: AlaumentarelnúmerodecabezasdemiosinasepuedeobservarenlaFigura5‐6 quelavelocidadvadisminuyendo,estoesrazonableyaquecadacabezatiradel filamentoconunafuerzaconstante,portantoaldisminuirsunúmerolafuerzade atracciónejercidasobreelfilamentodeactinatambiénserámenor. Figura5‐6Velocidadmediaderetrocesodelfilamentodeactinaparadistintonúmerodecabezasde miosinafrentealmóduloelásticodelsubstrato 92,5 93 93,5 94 94,5 95 95,5 0,1 1 10 100 Velocidad(µm/s) Móduloelástico,E(kPa) 60cabezasdemiosina 69 69,5 70 70,5 71 71,5 0,1 1 10 100 Velocidad(µm/s) Móduloelástico,E(kPa) 45cabezasdemiosina 44 44,5 45 45,5 46 46,5 47 47,5 0,1 1 10 100 Velocidad(µm/s) Móduloelástico,E(kPa) 30cabezasdemiosina
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 24 5.2.2Análisisdesensibilidaddelosparámetrosdelmodelo Longituddepersistencia,p: Comosehaindicadoantes,lalongituddepersistenciaestádirectamente relacionadaconelmóduloelásticodelsubstrato.Portantoalaumentaréste,más cargaseráncapacesdesoportarlosCAscontrarrestandoasí,conmásefectividad,la fuerzaconlaquetiranlasmiosinasyreduciendoportantolavelocidadderetroceso delfilamento.TambiénsepuedeobservarenlaFigura5‐7queamedidaqueaumenta lalongituddepersistenciaesnecesariomayomóduloelásticoparaquelavelocidad vuelvaasubir.EstecomportamientosedebeaquealaumentarE,losCAstambiénson capacesdesoportarmáscargassinqueserompalaadhesión. Figura5‐7Velocidadmediaderetrocesodelfilamentodeactinaparadistintosvaloresdelongitudde persistenciafrentealmódulodeelasticidaddelsubstrato NúmerodevecesquesepermiteeldespliegueNuf ElpermitirdesdoblarsealosCAsprovocaquepuedanestarmástiempounidos,lo quetendráeldobleefectodereducirlavelocidadmediadelfilamentodeactinayque anteunaumentodelmóduloelásticolosCAsseránmásresistentes,pudiendoretrasar einclusoevitarelefectocascadadescritoconanterioridad.Debidoalaaleatoriedad queincluyeelprocesodedespliegue,elcomportamientoserámenospredecible.Este comportamientosepuedeobservarenlaFigura5‐8 102 104 106 108 110 112 114 116 118 120 0,1 1 10 100 Velocidad(µm/s) Móduloelástico,E(kPa) Variaciónp ref p/2 p/3 p/5
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 25 Figura5‐8Velocidadmediaderetrocesodelfilamentodeactinaparadistintasvaloresmáximosde desplieguedelosCAsfrentealmódulodeelasticidaddelsubstrato 5.3Avancedelfilamento Lasfuerzasejercidasporlamiosinasondecaráctercíclico,portantohabráun momentoenelquedejendeactuar.EnesemomentolosCAsquepermanezcanharán queelfilamentovuelvaaavanzarlentamente.EsteavanceestáreflejadoenlaFigura 5‐9,enellasevequelavelocidadestáaltamenteinfluidaporlaaleatoriedaddel proceso.Enlíneasgeneralessepuedeobservarquesegúnvaaumentandoelmódulo elásticolohacetambiénlavelocidad,yquealllegardeformaaproximadaalvalordeE dondelavelocidadderetrocesoeramínimadejadesubirysemantiene aproximadamenteconstante. Figura5‐9Velocidadmediadeavancedelfilamentodeactinafrentealmódulodeelasticidaddel substrato EnlaFigura5‐10semuestracomoalvariarlalongituddepersistencialavelocidad mediadeavancedelfilamentoaumentacomoconsecuenciadelamayorrigidezdelos CAsquelespermitirásoportarmástensiones. 102 104 106 108 110 112 114 116 118 120 0,1 1 10 100 Velocidad(µm/s) Móduloelástico,E(kPa) Númeromáximodedespliegues ref 2 3 5 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,1 1 10 100 Velocidad(µm/s) Móduloelástico,E(kPa) Velocidadmediadeavance
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 26 Figura5‐10Velocidadmediadeavancedelfilamentodeactinaparadistintosvaloresdelongitudde persistenciafrentealmódulodeelasticidaddelsubstrato 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0,1 1 10 100 Velocidad(µm/s) Móduloelástico,E(kPa) Sensibilidadap ref p/2 p/3 p/5
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 27 6. Conclusionesyfuturaslíneasdeinvestigación Enesteapartadoseexponenlasconclusionesquesepuedenextraerdelos resultadosobtenidosenelcapítulo5yseestableceránunaspautasaseguirpara mejorarelfuncionamientodelmodeloyampliarlo,deformaqueseacapazde englobarmáselementosquepuedaninfluirenelcomportamientomecánicodelas adhesionesfocales. 6.1Conclusiones Comosehapodidoverenelapartadoanteriorsehaconseguidocrearunmodelo quesimulasatisfactoriamentelatendenciavistaenlosmodelosexperimentales.Enel tramoenqueelmodeloessensiblealmóduloelástico,lavelocidadderetrocesodel filamentodeactinacomienzaabajarrápidamentehastaalcanzarunmínimoyapartir deahívuelveasubirhastaalcanzarvalorescercanosalmáximo.Sinembargo,enel modelopresentadoseobservaquelosvaloresdevelocidadobtenidossonmucho mayoresquelosreales.Sisecomparaconelmodelodesimulaciónexpuestoenel capítulo1.2,sepuedeverqueenesteexperimentolavelocidadmediabajapocomás de2µm/smientrasqueenelmodelodeChanyOdde[9]bajaalrededorde45µm/s.Si bienesverdadquesiloqueescogemoseslavelocidadmínimaestadiferenciase reduceconsiderablementellegandoabajaralrededorde15µm/s.Alolargodelas simulacionessehavistocomocambiandociertosparámetrosocondicionesinicialesse podíaconseguirquelavelocidaddisminuyese,porejemploaumentandolalongitudde persistenciaoelnúmerodedesplieguesposibles.Conestosvaloressehanobservado descensosdemásde10µm/s.Elproblemaenestoscasoshasidoquelatendencia,a medidaqueibabajandolavelocidad,sealejabamásdelosresultadosexperimentales, necesitandodeunsubstratomásrígidodelodebidoparaquevolvieseasubir,siendo tambiéndichasubidacadavezmenor. Hastaloquesehapodidocomprobarenlaspocasreferenciasbibliográficas existenteselmodelorespondedeformasatisfactoria.Esposiblequealgunosdelos comportamientosobservadosalcambiarparámetrosycondicionesnoseandeltodo precisos.Apesardelacantidaddeparámetrosycondicionesinicialesquehansido objetodeanálisis,hayotrosfactoresquenohansidoconsiderados,yaseaporla necesidaddeestablecerunoslímitesenelnúmerodesimulacionesoporlanecesidad deformularhipótesisdebidoalafaltadedatosquederivadelaincertidumbreque aúnexistesobreestosprocesosbiológicos.Eselcasodeladistanciaentrefilamentode actinaysubstrato,longituddelsubstratoodelaspropiedadesdelosdosbrazosdelos CAsquehansidosupuestasiguales.Parapoderasegurarqueestosresultadossondel todoprecisosseríanecesarialaobtencióndemásmedidasexperimentalessobreeste tipodefenómenossobrelasquebasarseparapoderajustarelmodelo. Portodoellosepuedeconcluirqueelmodeloenlíneasgeneralesreproducede maneracualitativalosresultadosexperimentales,yquepuedeservircomopuntode partidaparaelaborarmodelosmáscomplejosqueincluyanmáselementosdel citoesqueleto. Eltrabajodesarrolladoenesteproyectosuponeunavanceimportanteenel conocimientodeestetipodeadhesionesformandopartedelconsiguientebeneficio queunmayorconocimientodeestaáreapuedeproporcionaralcampodelamedicina
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 28 enaspectoscomolaregeneracióndeheridasyelcontroldecélulastumorales invasivas. 6.2Futuraslíneasdeinvestigación Comocontinuacióndeesteproyectolaprimeratareaserámediroconseguirdatos experimentalesquepermitanajustarconmásprecisiónlosparámetrosdelmodelo paraquelosresultadosobtenidospuedanservalidadosmejor.Lalíneaaseguirserá combinarvarioscambiosdelosvistosenelcapítulo5,especialmenteaumentarla longituddepersistenciayelnúmerodedespliegues.Posteriormenteseríainteresante analizarlainfluenciadeotrosparámetroscomoladistanciaentreelfilamentoyel substrato Unavezqueelmodeloestémejorajustadopresentamuchasposibilidadesde seguirtrabajandosobreél.Sepodráprocederaincluirotroselementosdel citoesqueletoquetambiéntenganinfluenciasobreelfenómenodescrito,comopor ejemplo,lasimulacióndelamembranadelacélula.Éstapasaríaatravésdelas integrinasinteractuandoconellasyseveríaafectadaporelempujedelfilamentode actinaalrecuperarsuposicióndespuésdelciclodeempujedelamiosina.También cabelaposibilidaddesimularelfenómenodepolimerizacióndelaactinaen filamentos.Elúltimopasoseríalacreacióndelmodeloentresdimensiones.
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 29 Bibliografía [1] B.&.B.Geiger,«Assemblyandmechanosensory,»Curr.Opin.CellBiol.,vol.13,nº 584–592.(doi:10.1016/S0955‐0674(00)00255‐6),2001. [2] H.Gao,J.QianyB.Chen,«Probingmechanicalprinciplesoffocalcontactsincellmatrixadhesionwithacoupledstochastic‐elasticmodellingframework,» Interface,2011. [3] A.Y.A.K.S.S.V.J.M.Alexandrova,«Comparativedynamicsofretrogradeactin flowandfocal,»PLoSONE,vol.3,nºe3234.(doi:10.1371/journal.pone.0003234), 2008. [4] P.Roca‐Cusachs,T.IskratschyM.P.Sheetz,«Findingtheweakestlink‐exploring integrin‐mediatedmechanicalmolecularpathways,»JournalofCellScience,2012. [5] C.K.Choi,M.Vicente‐Manazanares,J.Zareno,W.A.Leanna,A.MogilneryA.R. Horwitz,«Actinand‐actininorchestratetheassemblyandmaturationofnascent adhesionsinamyosinIImotor‐independentmanner,»Nature,2008. [6] D.Kong,B.JiyD.Lanhong,«StabilityofAdhesionClustersandCellReorientation underLateralCyclicTension,»BiophysicalJournal,2008. [7] J.E.Olberding,M.D.Thouless,E.M.ArrudayK.Garikipati,«TheNon‐Equilibrium ThermodynamicsandKineticsofTheNon‐EquilibriumThermodynamicsand Kineticsof,»PlosOne,2010. [8] V.S.Deshpande,M.Mrksichb,R.M.McMeekingcyA.G.Evansc,«Abiomechanicalmodelforcouplingcellcontractilitywithfocaladhesionformation,» Journalofthemechanicsandphysicsofsolids,2007. [9] C.E.ChanyD.J.Odde,«TractionDynamicsofFilopodiaonCompliantSubstrates,» SCIENCE,2008. [10]G.Bao,«Mechanicsofbiomolecules,»JournaloftheMechanicsandPhysicsof Solids,2002. [11]S.Furkie,T.ItoyM.Yamakazi,«MechanicalunfoldingofsinglefilaminA(ABP‐280) moleculesdetectedbyatomicforcemicroscopy,»FEBS,2001. [12]T.Kim,ComputationalStudyofActinMorphologyandRheology,2010. [13]T.Kim,W.HwangyR.D.Kamn,«DynamicRoleofCross‐LinkingProteinsinActni Rheology,»BiophysicalJourney,2011. [14]T.Kim,W.HwangyR.D.Kamn,,«ComputattionalAnalysisofaCross‐linkedActinlikeNetwork,»SocietyforExperimentalMechanics,2007. [15]J.J.deVries,«Simulatingbiopolymernetworks:Towardsmobilecrosslinkers,» 2010. [16]R.F,Fundamentalsofstatisticalandthermalphysics,NewYork:McGraw‐Hill, 1965. [17]P.HunderhillyP.Doyle,«Onthecoarse‐grainingofpolymersintobead‐spring chains,»JNon‐NewtonFluidMech,2004. [18]C.J.Cyron,«MicromechanicalContinuumApproachfortheAnalysisofBiopolymer Networks,»2011. [19]Q.Liao,A.DobryninyM.Rubinstein,«Moleculardynamicssimulationsof
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 30 polyelectrolitesolutions:Nonuniformstretchingofchainsandscalingbehaviour,» Macromolecules,2003. [20]B.Gotterfried,ProgramaciónenC,McGraw‐Hill,2003. [21]K.Hu,L.Ji,K.T.Applegateye.al,«Differentialtransmissionofactinmotionwithin focaladhesions,»Science,2007. [22]A.MallavarapuyT.Mitchison,«Regulatedactincytoskeletonassemblyat filopodiumtipscontrolstheirextensionandretraction,»JOURNALOFCELL BIOLOGY,1999. [23]S.L.GuptonyC.M.Waterman‐Storer,«Spatiotemporalfeedbackbetween actomyosinandfocal‐adhesionsystemsoptimizesrapidcellmigration,»Cell, 2006. [24]H.N.Pozzo,H.A.ChertcoffyD.B.H.A.Marcos,«SociedadArgentinade Histotecnología,»2010.[Enlínea].Available:http://www.ht.org.ar/. [25]M.A.Schwartz,«IntegrinsandExtracellularMatrixinMechanotransduction,»Cold SpringHarborPerspectivesinBiology,2010.
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 31 AnexoI.Velocidaddelfilamentodeactina Laecuaciónvistaparaelequilibriodelaactinaecuación(2.2), 1r filment u m F vv F noesunaecuaciónindependientesinoqueprovienedelaecuacióndeLangevin,vista enelcapítulo2.3.Concretamentedelaecuaciónyasimplificada(ecuación(2.13)): 1() B i ii i dr FF dt Sisetieneencuentaquelosmovimientosdebidosafuerzasbrownianasson despreciablesfrentealefectodelasotrasfuerzas( 0),yque ,la ecuaciónqueda: 1() i mr i dr FF dt Volviendoalaprimeraecuacióndesarrollandoseobtiene: () mr u f ilment u m r mm FF v vv FF FF Portantosepuedeobservarquesonlamismaecuacióndonde 1 u mi v F LarazónporlaquenoseusadirectamentelaecuacióndeLangevin,apartedelas quesehandetalladoalolargodeestamemoria,esporqueelfilamentodeactinaseve afectadoporotrasfuerzasquecondicionansumovimiento,comopuedeserelcasode lasderivadasdeunionesconotrosfilamentosdeactina.Aldesconocerestosprocesos, porsufaltaderelevanciaeneltemaatratar,nosepuedeusardirectamentela ecuacióndeLangevin.Porelloesnecesariomedirexperimentalmentelavelocidad máximayusarlaecuaciónadaptada.
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 32 AnexoII.CódigoenC++delprogramaimplementado CABECERA // Main constants #define D_MONOMER 7 //pnm #define BOLTZMANN_ENERGY 0.004142 //K_b*T (kg*nm^2/s^2) energy #define DIM 2 #define VISCOSITY 8.599E-13 // kg/(nm*s) const float PI=103993./33102.; const double DRAG_COEF =3*PI*D_MONOMER*VISCOSITY ; //Valores inciales const int time_slots=2000;// PAra hacer los 500 del vmd const int divid=4; const int range=100; //pm (x,y) const double total_time=1.05e-7; //Tiempo total de simulacion, (s) const int n_actin_chain=120; //Establece longitud de cadena (80) const int n_random_actin=0; //Particulas iniciales para formar cadena const int n_actin=n_actin_chain+n_random_actin; //Partculas totales const int n_crosslinker=50; const int n_integrin=110; //101 const float lenght_cross= 105; // longitud c¡brazo crosslinker, ro const float cross_theta_o= PI; const float actin_theta_o= PI/2; const float integrin_theta_o=cross_theta_o+actin_theta_o; #define K_bend_actin 12.43 #define p 0.11; // 0.33 #define Ko_uf 3e-5; //s-1 #define Ko_ub 0.115; //s-1 #define lambda_uf 0.6 //(nm) 0.6----11.9423 #define lambda_ub 0.6903 //(nm) 0.104---- 2.071 para emular #define ro 105. //(nm) #define K_acp 0.0000423 // IN! //#define K_substrate 1000 //Rigidez substrato (nN/nm) #define steps_int 200 #define A_substrate 10000000. #define E_substrate 10e-9 //kg/(nm*s^2) //const float EA=A_substrate*E_substrate; #define DIST_INTEGRIN 7 const float DIST_BIND=D_MONOMER*pow(2,(1./6.)); const double DRAG_CROSS =3*PI*2*lenght_cross*VISCOSITY ;
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 39 force_fibre=0.; }//for z } //rep for (i=0;i<time_slots;i++) { V_fib[i]=V_fib[i]/rep; print_retro(V_fib[i],f); } }//inc return 0; }
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 40 FUNCIONES #include "stdafx.h" #include <stdio.h> #include <stdlib.h> #include <time.h> #include <math.h> #include "stdlib.h" #include <string> #include <sstream> #include <iostream> #include <fstream> #include "header_b.h" float bending_force(float theta, float theta_o); float brownian_force(float random_gauss , float frame_time, float drag); void print_data(float a, float b, float c, int d, int e ); //Brownian Force float brownian_force(float random_gauss , float frame_time, float drag) { float force; force=sqrt(2*drag*BOLTZMANN_ENERGY/frame_time)*random_gauss; return force; } //Bending force float bending_force(float theta, float theta_o) { float force; force=(theta-theta_o)*K_bend_actin; return force; } float calculate_module(float a[], float b[]) { int j; float mod; mod=0; for(j=0;j<= DIM-1;j++) mod=mod+pow((b[j]-a[j]),2); mod=sqrt(mod); return mod; } // Generador de numeros gaussianos, genera dos numeros(para t y t+At) en cada diemensión float generate_gauss(float v[][DIM]) { double x1, x2, w, y1, y2; int i; for (i=0;i<DIM;i++){ do { x1 = 2.0 * (rand() / 32768.0) - 1.0; x2 = 2.0 * (rand() / 32768.0) - 1.0; w = x1*x1 + x2*x2; } while (w >= 1.0);
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 41 w = sqrt(( -2.0 * log( w )) / w); y1 = x1 * w; //t y2 = x2 * w; //At v[0][i] = y1; v[1][i] = y2; } return v[2][DIM]; } //Inicializador de particulas (cadena) (NO 3D)!!!!!!!! void start_chain(struct chain_point point[], float start_x,float start_y, float distance, int step) { int i; for (i = 0; i < step; i++) { point[i].point[0]=start_x+distance*i; point[i].point[1]=start_y; point[i].bound=false; }; }; //Copiar matriz void copy_matrix(float integrin_initial[][DIM],chain_point integrin[],int step) { int i,j; for (i = 0; i < step; i++) { for(j=0;j<=DIM-1;j++) integrin_initial[i][j]=integrin[i].point[j]; } } void create_file(int step) { char name[30]; char * pref_pdb = "v_"; char * extension_pdb=".txt"; FILE*fOut; //Imprime archivo pdb sprintf_s(name, "%s%d%s", pref_pdb, step , extension_pdb); fOut = fopen(name,"w"); //para reescribir se usa "a" fclose(fOut); } void print_retro(float a,int step) { char name[30]; char * pref_pdb = "v_"; char * extension_pdb=".txt"; FILE*fOut; //Imprime archivo pdb
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 42 sprintf_s(name, "%s%d%s", pref_pdb, step , extension_pdb); fOut = fopen(name,"a"); //para reescribir se usa "a" fprintf (fOut, "%4.2f \n", a); fclose(fOut); } void create_data() { FILE*fOut; //Imprime archivo pdb fOut = fopen("Incremento x1","w"); //para reescribir se usa "a" fclose(fOut); } void print_data(float a, float b, float c, int d, int e ) { FILE*fOut; //Imprime archivo txt fOut = fopen("Incremento x1.txt","a"); //para reescribir se usa "a" fprintf (fOut, "%4.2f \n", a); fclose(fOut); /* fOut=fopen("Time2.txt", "a"); fprintf (fOut, "%4.3f \n", b); fclose(fOut); fOut=fopen("velocidad_actina.txt", "a"); fprintf (fOut, "%4.2f \n", c); fclose(fOut); fOut=fopen("total.txt", "a"); fprintf (fOut, "%4.3d %4.3d \n ", d,e); fclose(fOut);*/ } // Generar crosslinkers void generate_crosslinker(struct crosslinker linker[], float start_x, float start_y, float start_angle, float range_x, float range_y, float range_angle, int step) { //srand( (unsigned)time( NULL ) ); // inicia el generador de númeroa aleatorios int i; float x; //número alatorio entre 0 y 2*pi for (i = 0; i <= step-1; i++) { linker[i].central_point[0]= 400+7*i; linker[i].central_point[1]= 112.5; x= PI/2;
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 43 linker[i].actin_point[0]=linker[i].central_point[0]+cos(x)*lengh t_cross; linker[i].actin_point[1]=linker[i].central_point[1]+sin(x)*lengh t_cross; linker[i].integrin_point[0]=linker[i].central_point[0]+cos(x+cro ss_theta_o)*lenght_cross; linker[i].integrin_point[1]=linker[i].central_point[1]+sin(x+cro ss_theta_o)*lenght_cross; linker[i].actin_bound=false; linker[i].integrin_bound=false; linker[i].actin_N=0; linker[i].integrin_N=0; linker[i].actin_last_unfolding[0]=0; linker[i].integrin_last_unfolding[0]=0; } } void check_union(struct crosslinker linker[], struct chain_point actin[], struct chain_point integrin[]) { int i,c,j; float module; for (c=0; c < n_crosslinker; c++) { i=0; while ((linker[c].actin_bound==false) && (i < n_actin_chain)) { module=0; for(j=0;j<= DIM-1;j++) module=module+pow((linker[c].actin_point[j]-actin[i].point[j]),2); module=sqrt(module); if ((module <= DIST_BIND) && (actin[i].bound==false)) { linker[c].actin_bound=true; actin[i].bound=true; linker[c].pointer_actin=i; } else i=i+1; } i=0; while ((linker[c].integrin_bound==false) && (i < n_integrin)) { //module=calculate_module(linker[c].integrin_point,integrin[i].p oint);
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 44 module=0; for(j=0;j<= DIM-1;j++) module=module+pow((linker[c].integrin_point[j]- integrin[i].point[j]),2); module=sqrt(module); if ((module <= DIST_BIND) && (integrin[i].bound==false)) { linker[c].integrin_bound=true; integrin[i].bound=true; linker[c].pointer_integrin=i; } else i=i+1; } } } void check_unbinding_unfolding(struct crosslinker linker[], struct chain_point actin, struct chain_point integrin, int c) { float module; float lo; float r12; float angle,prob,k_prob_ub,k_prob_uf; int i_n,j; float f_internal_actin, f_internal_integrin, force_subs,force; double probability; float aux2[DIM]; //Actina r12=0; for(j=0;j<= DIM-1;j++) r12=r12+pow((linker[c].central_point[j]-linker[c].actin_point[j]),2); r12=sqrt(r12); //Diametro proteina //Refolding if (r12 < linker[c].actin_last_unfolding[linker[c].actin_N]){ linker[c].actin_N=linker[c].actin_N-1; i_n=linker[c].actin_N; //SEGUN TAEWOON - !! lo=140+30*i_n; if (r12>= ro){ f_internal_actin=-BOLTZMANN_ENERGY*(((2*lo-r12- ro)*(r12-ro))/(4*lo*lo*(1-r12/lo)*(1-r12/lo)*(1-ro/lo)*(1- ro/lo))+(r12-ro)/lo)/p; force=sqrt(f_internal_actin*f_internal_actin); } else force=K_acp*(r12-ro); //Constante inventada. Se puede quitar } //Unfolding else { if (r12>= ro){ i_n=linker[c].actin_N; //SEGUN TAEWOON - !! lo=140+30*i_n;
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 45 f_internal_actin=BOLTZMANN_ENERGY*(((2*lo-r12- ro)*(r12-ro))/(4*lo*lo*(1-r12/lo)*(1-r12/lo)*(1-ro/lo)*(1- ro/lo))+(r12-ro)/lo)/p; force=sqrt(f_internal_actin*f_internal_actin); k_prob_uf=exp(lambda_uf*force/BOLTZMANN_ENERGY)*Ko_uf; } else { f_internal_actin=K_acp*(r12-ro); //Constante inventada k_prob_uf=Ko_uf; } if (linker[c].actin_N<limit_unfolding)// { probability=1-exp(-k_prob_uf*time_un); prob=rand() / 32768.0; if (prob < probability) //Aumentamos N y cambiamos F { linker[c].actin_N=linker[c].actin_N+1; linker[c].actin_last_unfolding[linker[c].actin_N]=r12; //Guardamos distancia de unfolding i_n=linker[c].actin_N; //SEGUN TAEWOON - !! lo=140+30*i_n; f_internal_actin=BOLTZMANN_ENERGY*(((2*lo-r12-ro)*(r12- ro))/(4*lo*lo*(1-r12/lo)*(1-r12/lo)*(1-ro/lo)*(1-ro/lo))+(r12- ro)/lo)/p; force=sqrt(f_internal_actin*f_internal_actin); } } } // Unbinding if (r12>= ro) { k_prob_ub=exp(lambda_ub*force/BOLTZMANN_ENERGY)*Ko_ub; } else { k_prob_ub=Ko_ub; } probability=1-exp(-k_prob_ub*time_un); prob=rand() / 32768.0; if (prob < probability) { linker[c].actin_bound=false; ///Se separa linker[c].actin_N=0; linker[c].integrin_N=0; for(j=0;j<= DIM-1;j++) aux2[j]=linker[c].central_point[j]-linker[c].integrin_point[j]; angle=atan(aux2[1]/aux2[0]); if (angle < 0) angle=angle+PI;
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 46 linker[c].central_point[0]=linker[c].integrin_point[0]+cos(angle )*lenght_cross; //longitud y orientacion iniciales linker[c].central_point[1]=linker[c].integrin_point[1]+sin(angle)*leng ht_cross; linker[c].actin_point[0]=linker[c].central_point[0]+cos(angle)*l enght_cross; linker[c].actin_point[1]=linker[c].central_point[1]+sin(angle)*l enght_cross; } else { //Integrina r12=0; for(j=0;j<= DIM-1;j++) r12=r12+pow((linker[c].central_point[j]- linker[c].integrin_point[j]),2); r12=sqrt(r12); //Diametro proteina //Refolding if (r12 < linker[c].integrin_last_unfolding[linker[c].integrin_N]){ linker[c].integrin_N=linker[c].integrin_N-1; i_n=linker[c].integrin_N; lo=140+30*i_n; if (r12>= ro){ f_internal_integrin=BOLTZMANN_ENERGY*(((2*lo-r12-ro)*(r12- ro))/(4*lo*lo*(1-r12/lo)*(1-r12/lo)*(1-ro/lo)*(1-ro/lo))+(r12- ro)/lo)/p; force=sqrt(f_internal_integrin*f_internal_integrin); } else force=K_acp*(r12-ro); //Constante inventada } //Unfolding else { if (r12>= ro){ i_n=linker[c].integrin_N; lo=140+30*i_n; f_internal_integrin=BOLTZMANN_ENERGY*(((2*lo-r12-ro)*(r12- ro))/(4*lo*lo*(1-r12/lo)*(1-r12/lo)*(1-ro/lo)*(1-ro/lo))+(r12- ro)/lo)/p; force=sqrt(f_internal_integrin*f_internal_integrin); k_prob_uf=exp(lambda_uf*force/BOLTZMANN_ENERGY)*Ko_uf; } else {
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 47 f_internal_integrin=K_acp*(r12-ro); //Constante inventada En este caso se podrá quitar k_prob_uf=Ko_uf; } if (linker[c].integrin_N < limit_unfolding) { probability=1-exp(-k_prob_uf*time_un); prob=rand() / 32768.0; if (prob < probability) { //Aumentamos N y cambiamos F linker[c].integrin_N=linker[c].integrin_N+1; linker[c].integrin_last_unfolding[linker[c].integrin_N]=r12; //Guardamos distancia de unfolding i_n=linker[c].integrin_N; lo=140+30*i_n; f_internal_integrin=BOLTZMANN_ENERGY*(((2*lo-r12-ro)*(r12- ro))/(4*lo*lo*(1-r12/lo)*(1-r12/lo)*(1-ro/lo)*(1-ro/lo))+(r12- ro)/lo)/p; force=sqrt(f_internal_integrin*f_internal_integrin); } } } //Unbinding if (r12>= ro) { k_prob_ub=exp(lambda_ub*force/BOLTZMANN_ENERGY)*Ko_ub; } else { k_prob_ub=Ko_ub; } probability=1-exp(-k_prob_ub*time_un); prob=rand() / 32768.0; if (prob < probability) { linker[c].integrin_bound=false; ///Se separa linker[c].integrin_N=0; linker[c].actin_N=0; for(j=0;j<= DIM-1;j++) aux2[j]=linker[c].central_point[j]-linker[c].actin_point[j]; angle=atan(aux2[1]/aux2[0]); if (angle > 0) angle=angle+PI; linker[c].central_point[0]=linker[c].actin_point[0]+cos(angle)*l enght_cross; //longitud y orientacion iniciales linker[c].central_point[1]=linker[c].actin_point[1]+sin(angle)*l enght_cross;
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 48 linker[c].integrin_point[0]=linker[c].central_point[0]+cos(angle )*lenght_cross; linker[c].integrin_point[1]=linker[c].central_point[1]+sin(angle )*lenght_cross; } } } float interaction_0(struct crosslinker linker[], struct chain_point actin, struct chain_point integrin, int c, float force_substrate[], float force_fibre, float actin_displacement) { float module_aux,module; float lo; float r12; float aux2[DIM]; float angle,prob,k_prob_ub,k_prob_uf; float x,sigma,angle_force,s,t; int i_n,j,i; float displacement; float f_internal_actin, f_internal_integrin, force_subs,force_actin; float actina[2], integrina[2]; float total_force[DIM]; displacement=actin_displacement/steps_int; actina[0]=actin.point[0]; actina[1]=actin.point[1]; integrina[0]=integrin.point[0]; integrina[1]=integrin.point[1]; //Actina for (i=0; i < steps_int;i++ ){ module_aux=0; for(j=0;j<= DIM-1;j++) { aux2[j]=linker[c].actin_point[j]- linker[c].central_point[j]; module_aux=module_aux+pow(aux2[j],2); } angle=atan(aux2[1]/aux2[0]); if (angle < 0) angle=angle+PI; r12=sqrt(module_aux); if (r12>= ro){ i_n=linker[c].actin_N; //SEGUN TAEWOON - !! SACAR AFUERA PARA NO CALUCARLO 30 veces lo=140+30*i_n; // " " " " " " "
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 55 //Imprime archivo pfs //particulas char * pref_psf = "D:/Pelis/z"; char * extension_psf=".psf"; sprintf_s(name, "%s%d%s", pref_psf, step , extension_psf); fOut = fopen(name,"w"); fprintf(fOut, "PSF CMAP\n\n"); fprintf(fOut, "%8d !NTITLE\n\n", 7); fprintf(fOut, "%8d !NATOM\n", 3*n_crosslinker+n_actin_chain+n_integrin); for(c = 0; c < n_crosslinker; c++) { if ((linker[c].actin_bound==true) & (linker[c].integrin_bound==true)) { for (r=1;r<4;r++) { fprintf(fOut, "%8d C 1 LYS G 11%11.5f", 3*c + r, 0.0); fprintf(fOut, "%14.4f%11d\n", 12., 0); } } else { for (r=1;r<4;r++) { fprintf(fOut, "%8d C 1 LYS C 11%11.5f", 3*c + r, 0.0); fprintf(fOut, "%14.4f%11d\n", 12., 0); } } } amount=3*n_crosslinker; for (i=0; i< n_actin_chain; i++) { fprintf(fOut, "%8d A 1 LYS Y 11%11.5f", amount+i+1, 0.0); fprintf(fOut, "%14.4f%11d\n", 12., 0); } amount=amount+n_actin_chain; for (i=0; i< n_integrin; i++) { fprintf(fOut, "%8d I 1 LYS O 11%11.5f", amount+i+1, 0.0); fprintf(fOut, "%14.4f%11d\n", 12., 0); } //Uniones aux=0; num_bonds=2*n_crosslinker+n_actin_chain+n_integrin-2; fprintf(fOut, "\n%8d !NBOND: bonds\n", num_bonds); for(c = 0; c < n_crosslinker; c++) { fprintf(fOut, "%8d%8d%8d%8d", 3*c+1, 3*c+2, 3*c+2, 3*c+3); if ((aux + 1) % 2 == 0) { fprintf(fOut, "\n"); } aux=aux+1; } aux=2*aux; //Para compensar el cambio de cada c 2 uniones amount=3*n_crosslinker;
PFCIngenieríaIndustrial JorgeEscribanoJiménez 56 for (c = 0; c < n_actin_chain-1; c++) { fprintf(fOut, "%8d%8d%", amount+c+1, amount+c+2); if ((aux + 1) % 4 == 0) { fprintf(fOut, "\n"); } aux=aux+1; } amount=amount+n_actin_chain; for (c = 0; c < n_integrin-1; c++) { fprintf(fOut, "%8d%8d%", amount+c+1, amount+c+2); if ((aux + 1) % 4 == 0) { fprintf(fOut, "\n"); } aux=aux+1; } fclose(fOut); }