Repositorio Institucional de Documentos

Proyecto Fin de Carrera ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. Autor: SAÚL CANALÍS ARISTE DIRECTOR Jorge Jesús Rodríguez Chueca PONENTE Rosa Mosteo Abad ESPECIALIDAD Química Industrial CONVOCATORIA Mayo/Junio 2013 ÍNDICE Resumen...…………………………………………………………………….11 1. Introducción y objetivos…………………………………………………..... 15 2. Control de calidad de las aguas de abastecimiento……………………….19 2.1. Desinfección de aguas………………………………………………...19 2.2. Normas de calidad microbiológica en aguas……………………….20 2.3. Contaminación biológica……………………………………………..22 2.3.1. Virus……………………………………………………………….23 2.3.2. Protozoos………………………………………………………….24 2.3.3. Bacterias…………………………………………………………...24 3. Procesos de desinfección ……………………………………………………27 3.1. Procesos convencionales de desinfección…………………………..27 3.2. Procesos avanzados de desinfección………………………………..29 3.2.1. Generalidades...…...…….………………………………….....29 3.1.1. Radiación solar con H2O2………………………………….….31 3.1.2. Fotocatálisis………………………………………………........32 3.1.3. Fotocatálisis combinado con oxidantes….………………….33 3.1.4. Ozonización/Fotocatálisis/H2O2………….………………….35 4. Procedimiento experimental………………………………………………..37 4.1. Análisis microbiológico para E.Coli…………...………………………37 4.1.1. Procedimiento normalizado………………………………….37 4.1.2. Medios de cultivo…………………….……………...………..37 4.1.3. Equipos y material de laboratorio……….…...……………...39 4.1.4. Diluciones decimales seriadas....…….… ...………….......….39 4.1.5. Método de filtración de membrana e incubación………….41 4.1.6. Recuento e inactivación………………………...………….…43 4.2. Preparación de muestras fortificadas…….………………………….43 4.3. Metodología de análisis de parámetros físico-químicos…………...44 4.4. Experimentos de fotocatálisis………..……….……………………….45 4.4.1. Materiales y reactivos………………………………...……....45 4.4.2. Agentes de reacción………………………………………...…46 4.4.3. Condiciones de operación……………………………………49 4.5. Procedimiento para la determinación de cinéticas………………….50 4.5.1. Modelos cinéticos……………………...……………………...51 4.5.2. Ajuste de datos experimentales e índices de error……...…55 5. Resultados e interpretación………………….……….……………………...59 5.1. Resultados físico-químicos……..……….......……………...………….59 5.2. Resultados del tratamiento de irradiación…….……………..……….59 5.3. Resultados del tratamiento de fotocatálisis…..…....…….……….…..61 5.4. Resultados del tratamiento de irradiación/H2O2…..........…………...62 5.5. Resultados del tratamiento de fotocatálisis/H2O2….........…………..64 5.6. Resultados del tratamiento de O3/H2O2/TiO2……...………..………..66 5.7. Resultados de ECM, R2 y Gráficas de la modelización cinética….…67 7. Conclusiones…………….………………………………………………….85 8. Bibliografía……………….…………………………………………………89 AGRADECIMIENTOS: Me gustaría dar las gracias a… A mis padres por su cariño, confianza y apoyo incondicional. A Jorge por enseñarme todo lo que he aprendido sobre microbiología y por el apoyo y la ayuda que me ha prestado para la realización de este proyecto fin de carrera. A Rosa por haberme dado la oportunidad de realizar este proyecto y por su ayuda y disposición. A Pilar por su inestimable ayuda en el día a día en el laboratorio. A los compañeros de laboratorio por los buenos momentos vividos juntos, así siempre es más fácil y agradable trabajar y siempre me han ayudado en lo que les he necesitado. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 16 ácidos halogenados (tricloroacético y percloroacético) (Bueno, 1997), sustancias consideradas como peligrosas por la legislación vigente. Ante esta problemática se plantea la aplicación de otros procesos de oxidación como son los Procesos de Oxidación avanzada (POA), cuyo finalidad es la generación de radicales hidroxilos (OH-), a partir del acoplamiento de oxidantes (O3/H2O2, UV/H2O2, Fe2+/H2O2, etc.). En efecto, los POAs son variados, unos más eficaces que otros, dependiendo del compuesto orgánico a oxidar o patógenos a inactivar así como de las condiciones de aplicación. Hay factores como: la turbidez, color del agua, concentración de los compuestos orgánicos e inorgánicos disueltos como hierro, calcio…, formación de agregados de microorganismos, presencia de biofilms sobre la superficie de la lámpara; que pueden reducir la eficiencia del tratamiento. El objetivo principal de este proyecto es estudiar la desinfección de aguas mediante procesos avanzados de oxidación (POAs), aplicables tanto como alternativa o como complementación a los procesos convencionales de desinfección, con el fin de obtener una buena calidad de las aguas tratadas. Este objetivo principal se asienta sobre estos subobjetivos: A. Puesta en marcha de una metodología de preparación de una muestra fortificada. Identificación de Escherichia coli, germen patógeno objeto de estudio. B. Aplicación de Procesos de Oxidación Avanzada como tratamientos de agua alternativos de desinfección. Entre ellos se evalúan sistemas basados en irradiación, peróxido de hidrógeno ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 17 (H2O2), dióxido de titanio (TiO2) y ozono (O3), y así como combinaciones entre ellos: irradiación/H2O2, fotocatálisis (irradiación/TiO2), fotocatálisis/H2O2 y, (O3/H2O2/fotocatálisis). C. Estudio comparativo relativo a cinéticas de inactivación de otros microorganismos para los procesos seleccionados en este PFC. Este trabajo forma parte del proyecto de investigación "Evaluación de procesos en el tratamiento de aguas y fangos de EDARs, para la reducción de contaminantes con riesgo sanitario y ambiental (UZ2012-TEC-06)" financiado por el Banco Santander-Universidad de Zaragoza. Además, cuenta con la financiación DGA-FSE. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 19 2. Control de la calidad de las aguas de abastecimiento 2.1.Desinfección de aguas La desinfección se define como proceso mediante el cual se eliminan los microorganismos patógenos en el agua. Este proceso no solo debe inactivar a los microorganismos presentes en el agua, sino que también debe tener un efecto residual, lo que significa que debe mantener agentes activos en el agua tras la desinfección para prevenir el recrecimiento de los microorganismos en las tuberías provocando la recontaminación del agua. Durante siglos y antes de los descubrimientos en microbiología, especialmente los estudios de Kock y Pasteur, debido a que se desconocían las causas y por las pésimas condiciones de higiene, las plagas infecciosas arrasaban con poblaciones enteras en Europa. Una vez demostrado que los microorganismos son la causa de las terribles enfermedades que causaban tantas muertes, se buscó la manera de evitar o disminuir la incidencia de contaminación de las aguas potables y sus fuentes, dando inicio a la ciencia de la higiene. Uno de los primeros tratamientos implementados para tratar de evitar las enfermedades infecciosas transmitidas por el agua fue la sedimentación y filtración, que disminuyen la carga microbiana pero no garantizan la desinfección total. En 1850 John Snow después de un ataque de cólera en Londres, implementó un sistema de desinfección por cloro para una fuente de abastecimiento en esta ciudad. Sims Woodhead en 1897 con los antecedentes de Snow y tratando de dar alivio a una epidemia de tifoidea en Kent Inglaterra, también empleó cloro liquido para aliviar los estragos de la enfermedad. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 20 Lo éxitos de estas experiencias hicieron que en Inglaterra se empleara la cloración como una medida preventiva de contaminación microbiológica del agua y posteriormente en 1908 en New Jersey en Estados Unidos se implementó la cloración como un proceso de tratamiento en la potabilización del agua, y se hizo evidente la disminución de incidencia de enfermedades infecciosas en los consumidores. En años posteriores se generalizó la desinfección del agua con cloro y sus derivados en todo el país y finalmente en todo el mundo. Las aguas contaminadas, en general, son procesadas eficientemente por plantas de tratamiento biológico, por adsorción con carbón activado u otros adsorbentes, o por tratamientos químicos convencionales (oxidación térmica, cloración, ozonización, radiación solar, etc.). Sin embargo, en algunos casos estos procedimientos resultan inadecuados para alcanzar el grado de pureza requerido por ley o por el uso ulterior del efluente tratado. En estos casos y cada vez más crecientemente, se está recurriendo al uso de los llamados Procesos Avanzados de Oxidación ( PAOs). Los métodos pueden usarse solos o combinados entre ellos (radiación solar, radiación solar/H2O2, fotocatálisis , etc.), o con métodos convencionales. 2.2. Normas de calidad microbiológica en aguas La Ley 14/1986 General de Sanidad establece la obligación de las Administraciones públicas sanitarias de orientar sus actuaciones prioritariamente a la promoción de la salud y la prevención de las enfermedades. Es por ello que las actividades y productos que, directa o indirectamente, puedan tener consecuencias negativas para la salud deben ser sometidos a un control sanitario. En lo que respecta al uso al cual va a ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 21 ir destinado un suministro de agua, las normas de calidad microbiológica exigidas son más o menos estrictas. La Orden del 11 Mayo de 1988 relativa a las aguas prepotables establece la obligatoriedad de controlar coliformes fecales y totales, Estreptococos fecales y Salmonella spp. para clasificar las aguas superficiales destinadas a la producción de agua potable en categoría A1, A2, A3 o peor que A3. Salvo el parámetro Salmonella, que tiene asociado un valor imperativo, el resto de parámetros microbiológicos cuentan con valores indicativos deseables. La Directiva 2006/7/CE relativa a la gestión de la calidad de las aguas de baño establece obligatorio realizar el recuento de E. Coli y enterococos. En función de los resultados, el agua posee una calidad suficiente, buena o excelente. En la Directiva 2006/113/CE sobre las aguas destinadas a la cría de moluscos, se establece la recomendación de realizar el control de coliformes fecales, para los cuales sólo hay valores guía. A pesar de ello, la legislación subraya que a la espera de una directiva relativa a la protección de los consumidores sobre esta clase de productos, ese valor debería ser obligatoriamente respetado en aquellas aguas en las que habiten los moluscos directamente comestibles. En lo referente a la calidad exigida en las aguas aptas para peces, la Directiva 2006/44/CE no indica ningún parámetro microbiológico a controlar. En el Real Decreto 140/2003, transposición al marco legislativo español de la Directiva 98/83/CE, por el que se establecen los criterios sanitarios de la calidad del agua de consumo humano, se establecen como parámetros microbiológicos de obligado análisis E. Coli, Enterococos y Clostridium perfringens (incluidos los esporos). El recuento de colonias a 22 °C y de ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 22 coliformes son sólo parámetros indicadores. En el caso de incumplimiento de estos parámetros indicadores, la autoridad sanitaria valora la calificación del agua como “apta o no para el consumo humano” en función del riesgo para la salud. Finalmente, el RD 1620/2007 establece el régimen jurídico de la reutilización de las aguas depuradas. En función del uso al cual van a ir destinadas las aguas, se analizaran unos parámetros biológicos u otros. E. Coli y nemátodos (al menos los géneros Ancylostoma, Trichuris y Ascaris) deben ser analizados para todos los usos establecidos. El análisis de Legionella también es obligatorio para todos los usos de agua establecidos salvo para el uso ambiental, que no contempla su control. Salmonella spp. únicamente es contemplada en las aguas regeneradas con fines agrícolas e industriales. Por último, controlar Taenia saginata y Taenia solium es obligatorio si el agua se destina a regar pastos para consumo de animales productores de carne, ya que son los hospedadores intermediaros de estos parásitos. 2.3. Contaminación biológica Se reconoce que el agua es uno de los principales vehículos transportadores de microorganismos causante de enfermedades provenientes del aparato digestivo del hombre y de otros animales. Los coliformes fecales son un grupo grande de microorganismos, habitantes usuales de los intestinos de los animales superiores. Los microorganismos patógenos están relacionados con enfermedades específicas de transmisión hídrica. La fiebre tifoidea, las fiebres paratifoideas, la disentería bacteriana y el cólera son causadas por bacterias, la amibiosis o disentería amebiana por protozoarios, la ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 23 esquistosomosis por gusanos (helmintos) y larvas, en tanto que ciertos virus originan la hepatitis infecciosa y la poliomielitis. Los indicadores de contaminación fecal se han elegido de acuerdo a los siguientes criterios: Ser fáciles de aislar y cultivar en el laboratorio. Ser relativamente inocuos para el hombre y los animales.  Estar presentes en las heces de humanos y animales en grandes cantidades.  No multiplicarse en aguas naturales. Persistir en el agua de manera similar a los patógenos fecales. El grado de eliminación durante el tratamiento del agua debe ser similar al de los patógenos. La unidad de medida de la contaminación microbiológica es la UFC (Unidades Formadoras de Colonias). Así, el valor de UFC por metro cúbico (UFC/m³), indica el grado de contaminación microbiológica de un ambiente. Así pues, a continuación se detalla un resumen de las características principales de los microorganismos patógenos que pueden encontrarse en el agua : Virus , Protozoos y Bacterias. 2.3.1. Virus Es una entidad infecciosa submicroscópica que sólo puede multiplicarse dentro de las células de otros organismos. Si no están alojados en una “célula huésped”, se encuentran en forma inactiva, además poseen una capa protectora. Su morfología varía desde espiral, esférica o como célula pequeñas. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 24 Estos no se encuentran en el cuerpo humano de forma natural, a diferencia de lo que ocurre con las bacterias. Si un ser humano queda infectado por un virus, este generalmente se elimina por las heces en grandes cantidades, (Madigan et al., 2003). 2.3.2. Protozoos Los Protozoos, son organismos microscópicos, unicelulares Eucarioras, la mayoría de vida libre, aunque existen especies que son parásitas y viven de sus hospedadores. Son heterótrofos, fagótrofos, depredadores o detritívoros, a veces mixótrofos (parcialmente autótrofos), según su alimentación. Viven en ambientes húmedos o directamente en medios acuáticos, ya sean aguas saladas o aguas dulces. La reproducción puede ser asexual por bipartición y también sexual por isogametos o por conjugación intercambiando material genético, (Tortor et al., 1993). 2.3.3. Bacterias Las bacterias son microorganismos unicelulares de tipo procariótico, es decir, son organismos que solo se pueden observar al microscopio, constituidos por una sola célula autónoma, con membrana nuclear. Su tamaño oscila entre 0,5 y 5 μm. Las bacterias pueden ser alargadas (bacilos), esféricas (cocos) o en forma espiral (espirilos). Se pueden asociar en grupos; cuando se agrupan por parejas se llaman diplococos, cuando forman cadenas bacterianas se llaman estreptococos y cuando se agrupan en racimos se llaman estafilococos. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 25 Debido a su presencia en muchos tipos de agua, y a que es considerado como indicador fecal, así como su fácil control, cabe citar a la bacteria, Escherichia Coli, objeto de estudio en este proyecto, algunas de sus características más importantes son: Es una bacteria facultativa, es decir, puede adaptarse para crecer y metabolizar tanto en presencia como ausencia de oxígeno. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacteriólogo. La E.coli puede causar infecciones intestinales y extraintestinales generalmente graves, tales como infecciones del aparato excretor, cistitis, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia y neumonía Gram-negativa. Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biología molecular. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram (Gram-negativo), no forma esporas y es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa, (Chris Bell et al., 1998). ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 32 H2O2 + O2-  O2 + OH- + OH• [1.5] 3.2.3. Fotocatálisis En procesos de fotocatálisis la generación de ROS tiene lugar por combinación de un catalizador y luz. Numerosos trabajos de investigación avalan la efectividad de los procesos fotocatalíticos en la eliminación de compuestos altamente persistentes en agua como los pesticidas utilizados en la agricultura (Ormad et al, 2010; Miguel, 2010), antibióticos y otros fármacos (Elmolla y Chaudhuri, 2009, 2010) y microorganismos presentes en el agua (Blake et al., 1999; Rincón y Pulgarin 2003, 2007; Chong et al., 2010). El catalizador semiconductor más estudiado en la actualidad en los tratamientos de radiación solar es el dióxido de titanio por sus características de alta fotoactividad, bajo coste, recuperación del catalizador, estabilidad química y biológica e inocuidad. Esencialmente ocurre una promoción de electrones de la banda de valencia a la de conducción, lo que a su vez forma un hueco positivo en dicha banda de valencia, y estos interactúan con iones hidróxido y agua para formar el radical libre -OH. Los electrones en la banda de conducción interactúan con el Oxigeno molecular para formar el radical Superóxido (- O2) y Peróxido de Hidrógeno (H2O2) que a su vez generan radicales -OH. TiO2 + hν  TiO2 (e¯ + h+) [1.6] e¯ + O2 (ad)  O2• ¯ [1.7] h+ + H2O (ad)  ·OH [1.8] h+ + OH¯ (ad)  ·OH [1.9] ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 33 O2•¯ + H+ HO2• [1.10] O2• ¯ + HO2•  ·OH + O2 + H2O2 [1.11] 2HO2•  O2 + H2O2 [1.12] La efectividad de la fotocatálisis se atribuye a la actuación de radicales hidroxilo y al resto de ROS. Estas especies radicalarias son capaces de generar estrés oxidativo sobre los microorganismos, siendo la pared externa celular la primera barrera defensiva al ataque de cualquier tipo de agresión. Una vez superada esta defensa, los radicales ROS atacan la membrana plasmática, compuesta por fosfolípidos y proteínas integrales. Progresivamente, aumenta la permeabilidad de la membrana lo que permite la liberación del contenido intracelular. La rápida pérdida de iones potasio va a influir en una reducción de la viabilidad celular, desequilibrando las funciones vitales y provocando la muerte de la bacteria. También las partículas de TiO2 tienen vía libre para introducirse en las células dañadas, lo que lleva al ataque directo de los componentes intracelulares, acelerando su muerte (Huang et al., 2000). Como resumen general hay que decir que debe existir un contacto directo entre el catalizador y el microorganismo, y un fenómeno de adsorción, para producirse la oxidación directa de los componentes celulares. 3.2.4. Fotocatálisis combinada con oxidantes En los tratamientos fotocatalíticos, además del dióxido de titanio y la radiación solar, pueden adicionarse otros oxidantes auxiliares, como el peróxido de hidrógeno, o el peroxidisulfato sódico (Na2S2O3) para mejorar ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 34 la eficacia del proceso (Rincón et al., 2001, Rincón y Pulgarin, 2004; Kositzi et al., 2004). El H2O2 es una molécula de alto potencia redox (1,77V). Sus propiedades desinfectantes provienen de una acción directa molecular, pero en mayor medida de radicales libres formados en la catálisis. Si se adiciona peróxido de hidrógeno al proceso fotocatalítico, el H2O2 participa junto con el oxígeno como aceptor de electrones en las reacciones redox que se producen sobre el catalizador [1.13], ayudando a evitar la recombinación de los pares electrón-hueco que pueden formarse en el proceso fotocatalítico, lo que conllevaría a unos resultados de desinfección inferiores [1.14]. El peróxido de hidrógeno también adsorbe directamente la radiación UV de la luz solar. Esta acción provoca una rotura de su enlace peroxídico, descomponiéndose en radicales OH y consecuentemente, incrementándose la destrucción de microorganismos presentes en el agua [1.15]. De manera negativa, si el H2O2 está en exceso, también puede participar como secuestrador de radicales OH o formar peroxocompuestos en la superficie del TiO2, perjudicando el proceso fotocatalítico, ya que estos últimos compuestos son menos reactivos [1.16] (Kositzi et al., 2004). H2O2 + e¯  ·OH + OH¯ [1.13] e¯ + h+  e¯ + calor [1.14] H2O2 + hν  2 ·OH [1.15] ·OH + H2O2  HO2· + H2O [1.16] ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 35 3.2.5. Ozonización/Fotocatálisis/H2O2 Si se utiliza el ozono como oxidante cabe destacar que además de reaccionar con las bacterias, oxida los sólidos en suspensión y los compuestos orgánicos e inorgánicos que el agua normalmente contiene, afectando a la eficacia de la ozonización (Ireland, 1993). En el grupo de investigación “Calidad y tratamiento de las aguas” de la Universidad de Zaragoza se han realizado estudios donde se observa la influencia tratamientos combinados de ozono con peróxido de hidrogeno, sistema peroxona (O3/H2O2), de ozono con dióxido de titanio (O3/TiO2) y ozono con dióxido de titanio y peróxido de hidrógeno (O3/TiO2/H2O2), sobre Enterococcus sp. , y Clostridium perfringens. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 37 4. Procedimiento experimental 4.1.Análisis microbiológico para E.Coli 4.1.1. Procedimiento normalizado El cultivo y el recuento de Escherichia coli se llevan a cabo de acuerdo al método de filtración por membrana establecido en la Norma UNE-EN ISO 9308-1:2001. En primer lugar se filtra la muestra al vacío a través de membranas de celulosa estériles (Millipore®) de 0,45 μm de tamaño de poro y 47mm de diámetro. La muestra filtrada se coloca en una placa de Petri (agar MacConkey (Scharlau®)) y se incuba a 42 ±2 ºC, durante 24±2h. Pasado este tiempo, se realiza el recuento de las colonias rosas que se han formado y se lleva a cabo el test de tintura de Gram para confirmar algunas de ellas. El coeficiente de variación del método es del 15% aproximadamente. El recuento de colonias se expresa en (Unidades Formadoras de Colonias) por 100ml de muestra. 4.1.2. Medio de cultivo Un medio de cultivo es un material nutritivo artificial preparado para el crecimiento de microorganismos en un laboratorio. Algunas de las bacterias pueden crecer en casi cualquier medio de cultivo; otras requieren medios especiales. A la hora de cultivar una bacteria determinada el medio de cultivo tiene que satisfacer una serie de criterios. Debe contener los nutrientes adecuados para la bacteria específica que se desea desarrollar. También debe contener humedad suficiente, un pH ajustado y una concentración conveniente de oxígeno. El medio en el que se siembra debe ser estéril, es decir, en un principio no debe tener bacterias viables, de modo que el ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 38 cultivo tenga sólo las bacterias que se agreguen al medio. Por último, el medio de cultivo sembrado debe incubarse a la temperatura adecuada. Se dispone de una amplia variedad de medios de cultivo para el crecimiento de bacterias en el laboratorio. Casi todos esos medios están deshidratados y sólo precisan el agregado de agua y un proceso de esterilización. Cuando se desea que las bacterias se desarrollen sobre un medio sólido se agrega un agente solidificante como el agar. Es un polisacárido complejo proveniente de un alga marina. Posee algunas propiedades muy importantes que lo convierten en valioso para la microbiología. Pocos microorganismos pueden degradarlo, de modo que permanece en estado sólido. Se licua a una temperatura de alrededor de 100ºC. Para el uso en laboratorio se mantiene en baños de agua a 50ºC. Este agar es selectivo de E.Coli y por lo tanto tiene inhibido el crecimiento de otras bacterias. La composición de este agar es la que figura en la tabla 2. Tabla 2. Composición de agar MacConkey. Ingredientes Cantidad (g/L) Peptona 20 Lactosa 10 Sales biliares 1.5 Cloruro de sodio 5 Rojo neutro 0.03 Violeta cristal 0.001 Agar 15 ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 39 Para preparar este medio de cultivo es preciso diluir 51,5 gramos del medio deshidratado en un litro de agua y llevarlo a ebullición. Tras someterlo al proceso de esterilización en el autoclave, se vierte el medio fundido en placas Petri y una vez solidificado se conservan en la nevera hasta su utilización. 4.1.3. Equipos de laboratorio Los equipos utilizados para la experimentación desarrollada en esta investigación son los siguientes:  Mechero Bunsen.  Vórtex agitador.  Contador de Colonias electrónico (Interscience Scan 100).  Estufa incubadora (Selecta Incubidit 36 L).  Autoclave (Selecta, Presoclave II 50). 4.1.4. Diluciones decimales seriadas El volumen de agua a filtrar depende de la concentración bacteriana de la muestra. El volumen recomendado por el RD 140/2003 es 100 mL, pero en aguas naturales sin tratar, el número de bacterias en este volumen puede variar desde pocas decenas hasta cientos de millares, lo que impediría en este último caso un recuento adecuado de las colonias. Por tanto, como no se conoce de antemano la concentración microbiológica presente en la muestra de agua a analizar, se realizan diluciones de la muestra inicial. A partir del agua natural (dilución 0), se toma 1 mL de la muestra con micropipeta y se transfiere a un tubo con 9 mL de agua destilada al 0,9 % NaCl, estéril. A continuación, se homogeniza en un vortex, obteniéndose ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 40 de esta forma la dilución 1:10 (o dilución -1). Para hacer las diluciones sucesivas, se toma 1 mL de la dilución precedente bien homogeneizada y se lleva a un tubo con 9 mL de agua destilada al 0,9% NaCl, todo ello en ambiente de trabajo estéril, proporcionado con un mechero Bunsen. La Figura 1 refleja el procedimiento de diluciones decimales seriadas de manera gráfica y la Figura 2 el aspecto de las placas de Petri después de la siembra de dichas diluciones. Figura 1.Procedimiento de diluciones decimales seriadas. Figura 2. Aspecto de las placas de Petri después de la siembra de las diluciones decimales de una muestra de agua (de la más concentrada 0 a la más diluida -2). ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 41 4.1.5. Métodos de filtración por membrana e incubación Para llevar a cabo la cuantificación y recuento de células viables de Escherichia coli presentes en la muestra de agua se puede llevar a cabo mediante dos métodos diferentes: a) Método en placa difusa (MPD) b) Método de Filtración por membrana (MFM) a).Método en placa difusa (MPD): Para llevar a cabo la siembra se pipetea sobre la superficie del agar dispuesto en la placa el volumen de muestra o de dilución deseada (20 - 500 μL) y a continuación se extiende de forma homogénea por toda la superficie de la placa con ayuda de un asa Drigalsky. Ante el desconocimiento de la concentración exacta de bacterias en la muestra de agua, se siembran varias placas con diferentes volúmenes y diluciones con el fin de asegurar una placa adecuada para el recuento final. Este modelo de análisis se utiliza cuando se espera una concentración de bacterias superior a 600 UFC 100 mL-1. Una vez ya se ha extendido la muestra por el Agar uniformemente se procede a la incubación de las placas de Petri en la estufa durante 24 ± 2 horas a una temperatura de 42 ± 2 ºC según establece la norma (UNE EN ISO 9308-1:2000), (Figura 3). Figura3.Colonias de E. Coli en placas petri después de la incubación ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 48 funciona en régimen semicontinuo, continuo respecto al gas y discontinuo respecto al líquido. Este reactor es de vidrio Pyrex con forma esférica y una capacidad de 3 L. El ozono gas se trasfiere a la muestra por la parte superior del reactor a través de un difusor poroso (O3 introducido). La transferencia del ozono al agua produce un burbujeo que proporciona agitación a la muestra, favoreciendo el contacto ozono-agua. El ozono introducido se mantiene se mantiene constante a lo largo de cada experimento. Como todo el ozono producido no llega a consumirse en la reacción, el exceso debe destruirse (O3 no consumido). Para ello se conectan en serie al reactor dos o tres borboteadotes (5) que contienen una disolución de yoduro potásico al 2%. El ozono reacciona con el yoduro reduciéndose a oxígeno y liberándose a la atmósfera. El experimento debe llevarse a cabo en una campana de extracción ya que el ozono es un elemento tóxico. En la figura 6 se observa la instalación utilizada en la ozonización. Figura 6. Descripción de la instalación de ozonización. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 49 4.4.3. Condiciones de operación Es importante destacar que todo el material de vidrio y los medios de cultivos son preparados en el autoclave a 121 ºC y 1 bar de presión durante 15 minutos para lograr su completa esterilización. La duración máxima de los experimentos de irradiación, irradiación/H2O2, fotocatálisis y fotocatálisis/H2O2 es de 30 minutos, mientras que para el experimento de ozonización/fotocatálisis/ H2O2 es de 10 minutos. El rango de trabajo utilizado para la fuente de radiación corresponde al intervalo 320-800 nm, comprendiendo los rangos UVA y visible del espectro solar, a través del uso conjunto del filtro de cuarzo y el filtro de ventana. Los ensayos se realizan por duplicado. Los reactores se introducen en la cámara solar, siempre en agitación. Los experimentos se realizan a temperatura ambiente (23°C) y las temperaturas máximas que se alcanzan durante los tratamientos son 29- 30°C. Está bien establecido que parte de la inactivación bacteriana en estudios de desinfección solar se debe a un incremento en la temperatura de las muestras (40-45°C) (McGuigan et al., 1998); sin embargo, la temperatura más alta alcanzada en los experimentos realizados es muy inferior, siendo el grado de desinfección atribuido a este factor despreciable. El caudal de oxígeno seleccionado para el ensayo con el ozono es de 50 L h-1 y la dosis de ozono generada con este caudal de oxígeno es de 289 mg O3 h-1. El volumen de la muestra a tratar es 0,75 L y el ensayo también se realiza a temperatura ambiente (23 °C). ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 50 En los tratamientos en los que participa el catalizador TiO2, para favorecer una mezcla perfecta de la muestra en el reactor, se introduce un imán magnético que evita que el TiO2 se deposite en el fondo durante el experimento. La concentración de TiO2 utilizada en los tratamientos en los que participa es de 1 g·L-1. Concentraciones muy elevadas del catalizador pueden dar como resultado la saturación del medio y con ello, una menor efectividad en la desinfección con radiación solar, ya que la luz no puede penetrar fácilmente en el agua y tanto la actividad del catalizador como la acción directa de la luz ven disminuidos su efecto. Maness (1999) obtiene como concentración más efectiva de TiO2 para la eliminación de E. Coli, mediante fotocatálisis, el valor de 1 g·L-1. A lo largo del desarrollo de los experimentos, se toman muestras a diferentes intervalos de tiempo con el fin de evaluar el efecto de los tratamientos. En las muestras provenientes de los tratamientos en los que participa el H2O2, cuya dosis inicial es 0,04 mM (1,365 mg H2O2·L-1), su dosis residual se neutraliza con “catalasa” con el objeto de anular su efecto bactericida. Esta se prepara en el laboratorio, adicionando 10mg de catalasa sólida, sobre 100 ml de agua Mili-Q. 4.5. Procedimiento para determinación de cinéticas Los resultados obtenidos durante los tratamientos de irradiación, irradiación/H2O2, fotocatálisis, fotocatálisis/H2O2 y O3/H2O2/TiO2 se analizan a través de 3 modelos matemáticos, el modelo de Hom, el modelo bifásico y el modelo de Mafart. Se suministra o bien ozono o bien de aplica irradiación de manera continua y constante al reactor que alberga la muestra, por lo que se ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 51 considera que la concentración de ozono o el suministro de irradiación aplicada es constante, mostrando consonancia con los fundamentos del modelo de Hom el cual no asume una disminución del desinfectante a lo largo del tratamiento, sino habría de haberse aplicado en modelo cinético de Hom modificado. 4.5.1. Modelos cinéticos La microbiología predictiva es una parte esencial de la microbiología que pretende conocer la respuesta de las poblaciones microbianas frente a diversas condiciones ambientales o tratamientos. Combina conocimientos de diferentes disciplinas (matemáticas, microbiología, ingeniería y química) con el objetivo común de desarrollar modelos matemáticos que describan y permitan predecir el ritmo de inactivación de los microorganismos de una determinada población, sometidos a condiciones tecnológicas o medioambientales determinadas (Gómez, 2005). Dentro de los tipos modelos matemáticos existentes, este estudio de investigación se centra en los modelos de inactivación, modelos que estudian el ritmo de mortandad de las poblaciones bacterianas a lo largo de un proceso. La inactivación bacteriana en aguas ha sido bastante estudiada en la última década aplicando una gran variedad de modelos cinéticos de desinfección. La modelización cinética nace con la finalidad de simplificar e idealizar fenómenos complejos (Lee y Nam, 2002). Con ella se consigue obtener una expresión matemática que facilite el diseño adecuado de un sistema de desinfección. La Tabla 4 recoge los modelos matemáticos propuestos para describir las gráficas de inactivación obtenidas en el presente trabajo de investigación. La selección de estos modelos se realiza en base al principio ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 52 de parsimonia según el cual los modelos han de ser tan simples como sea posible, es decir, con el menor número de parámetros posible (Gómez, 2005). La bondad del ajuste puede mejorar en gran medida añadiendo más parámetros al modelo; sin embargo, en ocasiones, aumentar mucho el número de parámetros puede llevar a que las predicciones no tengan sentido. Tabla 4. Modelos cinéticos de estudios aplicados. Modelo de Hom (1972) Hom, tras analizar los resultados de diversos experimentos de cloración sobre sistemas algales-bacterianos y observar que respondían a cinéticas curvilíneas más que a lineales, generalizó de manera empírica la ley de Chick-Watson mediante la ecuación [1.18], donde k es la constante de velocidad de inactivación de primer orden, C es la concentración del desinfectante, n el coeficiente de dilución y m una constante empírica del modelo (Li, 2004; Méndez et al., 2008). En el caso de que la concentración sea constante, el modelo se simplifica integrándose esta concentración en una constante de velocidad aparante (kap= k· Cn) dando lugar a la ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 53 ecuación [1.19], siendo esta kap una constante de pseudo-primer orden (min-1) (Malato et al., 2009). Este modelo no considera que el agua tenga una demanda de desinfectante y por tanto, que la concentración del mismo disminuya a lo largo del tratamiento (Haas y Joffe, 1994). 1mn tNCmk dt dN    mn ttCk N N Log  0 [1.18] m ap ttk N N Log  0 [1.19] El nivel de inactivación predicho por el modelo de Hom es una función no lineal de C y t, que dependen de los parámetros del modelo n y m, respectivamente. Este modelo y se simplifica al modelo Chick-Watson para n=1 y m=1. Cuando m es menor que la unidad, se visualiza un efecto de cola o tailing-off. Modelo bifásico de Pruitt y Kamau (1993) En 1993, Pruitt y Kamau establecen un modelo bifásico basado en la existencia de dos poblaciones microbianas que presentan una sensibilidad al tratamiento diferente, siguiendo en ambos casos una cinética de inactivación de primer orden. La expresión matemática del modelo se define por la ecuación [1.20], donde P significa la fracción de microorganismos supervivientes correspondientes a la subpoblación 1, (1- P) es la fracción de supervivientes de la subpoblación 2, k1 representa la constante de inactivación de la población sensible y k2 es la constante de inactivación de la población resistente. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 54     tk tk tePePLog N N Log · ···   1 1 0 [1.20] Modelo de Mafart (2002) Peleg y Cole (1998) proponen el uso de distribuciones estadísticas tipo Weibull para desarrollar modelos que incluyan tanto cinéticas convexas, con un periodo inicial sin aparente inactivación, como cóncavas en las que no se consigue una inactivación completa. La distribución de Weibull es una distribución de probabilidades diseñada para describir el comportamiento de sistemas que tienen cierto grado de variabilidad. El modelo asume que la inactivación microbiana se debe a la incapacidad de la célula para resistir las duras condiciones impuestas por algún tipo de estrés, después de cierto tiempo; también asume que la población es heterogénea, es decir, que cada célula tarda un tiempo diferente en morirse. En definitiva, es un modelo que implica la existencia de una distribución de resistencias dentro de la población microbiana. La resistencia sigue una distribución de probabilidad de Weibull, definida por la ecuación [1.21]. Mafart (2002) modifica la ecuación Weibull según la ecuación [1.22], donde  es el parámetro de escala y se corresponde con el tiempo necesario para reducir el primer ciclo logarítmico decimal de la población bacteriana y p es el parámetro de forma e indica la forma de la curva de la ecuación, ya que ésta toma formas convexas cuando n es mayor que 1 y cóncavas cuando es menor que 1. Este modelo se fundamenta en modelos de inactivación termal, ya utilizado para describir perfiles de desinfección sobre diferentes tipos de ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 55 microorganismos, fotorreactores y parámetros operacionales en fotocatálisis (Boyle et al., 2008; Gomes et al., 2009).   n b t ne b t b n tf                1 [1.21] p tt N N Log         0 [1.22] 4.5.2. Ajuste de datos experimentales e índices de error Para obtener los coeficientes cinéticos de cada modelo descritos anteriormente, es necesario ajustar los valores experimentales a las correspondientes ecuaciones mediante técnicas de regresión no lineal. Los parámetros de los modelos se ajustan a ecuaciones mediante algoritmos interactivos basados en el método de los mínimos cuadrados (Pernistky et al., 1995; Cho et al., 2003). En la actualidad, muchos programas informáticos estadísticos permiten realizar estos ajustes. Entre ellos, en este trabajo experimental se utiliza la herramienta Solver y la herramienta de GInaFiT del programa Microsoft Excel (Geeraerd and Van Impe Inactivation Model Fitting Tool). Para evaluar la calidad de los ajustes de los modelos a los datos experimentales obtenidos se utilizan dos índices: el coeficiente de determinación (R2) y el error cuadrático medio (ECM). También se utiliza con este propósito la representación gráfica de los valores estimados frente a los obtenidos experimentalmente. El coeficiente de determinación, R2, se utiliza como una medida global de la calidad del ajuste. Este coeficiente informa sobre la proporción de variabilidad total de la variable dependiente que es explicable por el modelo. Cuanto más cercano sea el valor R2 a 1, mejor es la precisión ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 56 predictiva del modelo, y por tanto, más concuerdan los valores predichos con los valores observados. La ecuación del coeficiente de determinación viene determinada por la ecuación [1.23], donde i y ~ son los valores estimados y es la media de los valores reales (Gómez, 2005).            1 2 1 2 2 ii n ii yy yy R ~ [1.23] El error cuadrático medio, ECM, se define como la raíz cuadrada de la media del cuadrado de los residuos (diferencia entre los valores observados y los valores estimados) y viene determinado por la ecuación [1.24], donde n es el tamaño de la muestra. Un valor de ECM igual a 0 indica que existe un perfecto acuerdo entre los valores predichos y los valores reales. n yy ECM n ii    1 2 ) ~ ( [1.24] Para comparar modelos diferentes se representan gráficamente los valores observados frente a los valores estimados. Si el modelo se ajusta perfectamente a los datos, los puntos se encuentran distribuidos a lo largo de la línea de equivalencia. La bondad del modelo será mayor cuanto más próximos estén los puntos a dicha línea (Gómez, 2005). El cálculo de estos parámetros, R2 y ECM, se realiza con el programa Excel 2007 (Microsoft). Los modelos matemáticos aplicados en este proyecto son modelos primarios y como tales, describen cómo varía el recuento de las poblaciones bacterianas respecto al tiempo. Son ecuaciones matemáticas ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 57 que describen el cambio de una respuesta, que en este caso son las unidades logarítmicas de inactivación, a lo largo del tiempo y bajo unas condiciones determinadas. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 64 sp donde alcanza un resultado de inactivación de 0.4 unidades logarítmicas. 5.5.Resultados del tratamiento de fotocatálisis/H2O2 La Tabla 9 muestra los recuentos bacterianos obtenidos durante los tratamientos de fotocatálisis/H2O2. La Figura 10 representa el efecto desinfectante que la combinación de fotocatálisis y H2O2 ejerce sobre la población de E. Coli. Tabla 9. Recuento de E. Coli durante fotocatálisis/H2O2 . Figura 10. Inactivación de la bacteria E. Coli durante el tratamiento de fotocatálisis/H2O2. Se obtiene una reducción poblacional de 0.3 unidades logarítmicas al final del experimento. Con la aplicación de este tratamiento, Lanao (2012) obtiene resultados de inactivación de C. perfringens en la misma matriz acuosa y aplicando el Tiempo(minutos) 0 5 10 15 20 25 30 Recuento(Nt) 2,99E+07 2,62E+07 2,39E+07 1,81E+07 1,72E+07 1,68E+07 1,50E+07 -0,35 -0,3 -0,25 -0,2 -0,15 -0,1 -0,05 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Fotocatálisis+H2O2 ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 65 mismo tratamiento de 6.9 unidades logarítmicas en su forma vegetativa y de 1 unidades logarítmicas en su forma de esporos, esto nos muestra que la forma esporulada es más resistente. También aplica el mismo tratamiento, en mismas condiciones sobre las poblaciones bacterianas de Enterococcus sp donde alcanza un resultado de inactivación de 1.8 unidades logarítmicas. Con este resultado, 0.3 unidades logarítmicas, se observa que es el proceso fotocatálisis/H2O2 ligeramente inferior al obtenido con el tratamiento de irradiación/H2O2, 0.53 unidades logarítmicas, y este es inferior al obtenido con la irradiación en solitario, 0.8 unidades logarítmicas, y este muy inferior a la inactivación alcanzada mediante el tratamiento de fotocatálisis, 3.2 unidades logarítmicas. De estos resultados se puede derivar que no se aprecia un fenómeno de sinergia entre el TiO2 y el H2O2, en presencia de irradiación, que permita obtener los máximos resultados de desinfección entre todos los tratamientos aplicados, como cabría esperar, pues participan conjuntamente tres agentes desinfectantes. Este comportamiento puede deberse a que ante una concentración tan elevada de radicales activos, el H2O2 en lugar de favorecer la acción desinfectante del proceso, participe como secuestrador de radicales hidroxilo formando radicales hidroperóxidos o peroxo-compuestos en la superficie del TiO2, perjudicando la actividad del proceso fotocatalítico, tal y como describe Kositzi (2004). Estos radicales hidroperóxidos son menos reactivos en cuanto a desinfección (Legrini et al., 1993). De aquí se deriva la importancia de que se establezca una dosis adecuada en la combinación de tratamientos para no obtener un efecto contrario al buscado. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 66 A continuación se muestra una gráfica donde se puede observar la comparativa de la inactivación de la bacteria E.Coli según el tratamiento de radiación que se ha llevado a cabo, figura 11: Figura 11. Representación conjunta de la inactivación de E.Coli mediante los tratamientos de irradiación. 5.6.Resultados del tratamiento de O3/H2O2/TiO2 En la Tabla 10 se muestran las poblaciones bacterianas supervivientes a lo largo del experimento conjunto. Tabla 10. Recuento de E. Coli durante O3/H2O2 /TiO2 La Figura 12 representa la curva de inactivación durante el tratamiento. Se observa una caída inicial brusca de la población, seguida de un periodo Tiempo(minutos) 0 1 4 7 10 Recuento(Nt) 4,35E+08 1,09E+06 5,60E+04 7,18E+03 5,89E+03 mg O3/L consumido 0 4,14 19,44 34,74 50,04 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 irradiación irradiación+H2O2 fotocatálisis fotocatálisis+H2O2 tiempo(min) log(Nt/N0) Gráfica - conjunta - radiación ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 67 de inactivación más lento que finaliza con una reducción bacteriana de 5.1 unidades logarítmicas. Figura 12. Inactivación de la bacteria E. Coli durante el tratamiento de O3/H2O2 /TiO2. En este tratamiento, Lanao (2012) obtiene resultados de inactivación sobre Enterococcus sp en la misma matriz acuosa y aplicando el mismo tratamiento de 2.2 unidades logarítmicas. 5.7.Resultados de ECM, R2 y Gráficas de la modelización cinética Las Tablas 11, 12, 13, 14 y 15 recogen los valores de los parámetros cinéticos obtenidos tras aplicar los modelos matemáticos seleccionados, el ajuste de cada uno de los modelos a los resultados experimentales obtenidos para la bacteria de estudio, mediante el coeficiente de determinación (R2) y el error cuadrático medio (ECM). -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 O3/H2O2/TiO2 mg O3/L consumido ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 68 Tabla 11. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de la bacteria de estudio en el tratamiento de irradiación (λ: 320-800 nm). Tabla 12. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de la bacteria de estudio en el tratamiento de fotocatálisis (λ: 320-800 nm). Tabla 13. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de la bacteria de estudio en el tratamiento de irradiación /H2O2 (λ: 320-800 nm). Bacteria E. Coli Modelo de Hom kap (min-1 · W m-2) m ECM R2 0.004 1.49 0.07 0.91 Modelo bifásico P k1 (min-1) k2 (min-1) ECM R2 0.99 0.05 0.05 0.08 0.87 Modelo de Mafart p δ (min) ECM R2 2.46 35.60 0.06 0.93 Bacteria E. Coli Modelo de Hom kap (min-1 · W m-2) m ECM R2 0.19 0.837 0.27 0.95 Modelo bifásico P k1 (min-1) k2 (min-1) ECM R2 0.997 0.37 0.06 0.08 0.87 Modelo de Mafart p δ (min) ECM R2 0.79 6.11 0.27 0.95 Bacteria E. Coli Modelo de Hom kap (min-1 · W m-2) m ECM R2 0.001 1.66 0.03 0.96 Modelo bifásico P k1 (min-1) k2 (min-1) ECM R2 0.996 0.04 0.04 0.051 0.91 Modelo de Mafart p δ (min) ECM R2 2.11 42.49 0.03 0.97 ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 69 Tabla 14. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de la bacteria de estudio en el tratamiento de fotocatálisis/H2O2 (λ: 320-800 nm). Tabla 15. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de la bacteria de estudio en el tratamiento de O3/H2O2/TiO2. Los valores de los índices de ajuste, ECM y R2, en los tratamientos aplicados son bastante buenos, pues tienen valores cercanos a 1 en el caso del coeficiente de correlación (R2) y valores cercanos a 0 en el caso del error cuadrático medio (ECM), a excepción de los índices de los modelos Hom, Bifásico y Mafart en el tratamiento de irradiación, el modelo Bifásico en fotocatálisis e irradiación/H2O2, donde el valor R2 está muy alejado del valor óptimo, por debajo de un 0,95. Bacteria E. Coli Modelo de Hom kap (min-1 · W m-2) m ECM R2 0.019 0.807 0.02 0.95 Modelo bifásico P k1 (min-1) k2 (min-1) ECM R2 1 0.02 0.02 0.025 0.94 Modelo de Mafart p δ (min) ECM R2 0.78 132.34 0.02 0.96 Bacteria E. Coli Modelo de Hom kap (min-1 · W m-2) m ECM R2 3.26 0.20 0.07 0.99 Modelo bifásico P k1 (min-1) k2 (min-1) ECM R2 0.99 5.93 0.23 0.29 0.97 Modelo de Mafart p δ (min) ECM R2 0.20 0.00 0.08 0.99 ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 70 Comparando los valores de los parámetros cinéticos obtenidos para los distintos tratamientos aplicados se observa que los valores de las constantes de velocidad de inactivación (kap en el modelo de Hom y la k1 y K2 en el modelo bifásico) son muy superior en el tratamiento de O3/H2O2/TiO2 que en el resto, y mucho menor que este pero mayor que el resto estaría el tratamiento de fotocatálisis. El parámetro δ del modelo de Mafart, que indica el tiempo necesario para conseguir 1 unidad logarítmica de inactivación, es muy inferior en el tratamiento de fotocatálisis que en los demás tratamientos, excluyendo al tratamiento de O3/H2O2/TiO2 donde su valor es cero. En la siguiente tabla, (Tabla16), se muestra una comparativa de los mismos parámetros cinéticos sobre las curvas de inactivación durante los tratamientos de irradiación, fotocatálisis, irradiación/H2O2, fotocatálisis/H2O2 y O3/H2O2/TiO2. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 71 Tabla 16. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de la bacteria E. Coli en los tratamientos de irradiación, Irradiación/H2O2, Fotocatálisis, Fotocatálisis/H2O2 y O3/H2O2/TiO2 . Modelo de Hom kap (min-1 · W m-2) m ECM R2 Irradiación 0.004 1.49 0.07 0.91 Irradiación/H2O2 0.001 1.66 0.03 0.96 Fotocatálisis 0.19 0.837 0.27 0.95 Fotocatálisis/H2O2 0.019 0.807 0.02 0.95 O3/H2O2/TiO2 3.26 0.20 0.07 0.99 Modelo bifásico P k1 (min-1) k2 (min-1) ECM R2 Irradiación 0.99 0.05 0.05 0.08 0.87 Irradiación/H2O2 0.996 0.04 0.04 0.05 0.91 Fotocatálisis 0.997 0.37 0.06 0.08 0.87 Fotocatálisis/H2O2 1 0.02 0.02 0.025 0.94 O3/H2O2/TiO2 0.99 5.93 0.23 0.29 0.97 Modelo de Mafart p δ (min) ECM R2 Irradiación 2.46 35.60 0.06 0.93 Irradiación/H2O2 2.11 42.49 0.03 0.97 Fotocatálisis 0.79 6.11 0.27 0.95 Fotocatálisis/H2O2 0.78 132.34 0.02 0.96 O3/H2O2/TiO2 0.20 0.00 0.08 0.99 Como observamos en la Tabla 16, en ningún tratamiento de radiación llegamos a unos valores de R2 cercanos al 0.99. Por ello, se han aplicado otros modelos cinéticos adicionales, presentes en el programa informático GInaFit.xla y Solver, para intentar buscar un ajuste mejor de los datos a un modelo cinético, y estos son algunos de los datos obtenidos (Tabla 17). ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 72 Tabla 17. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos adicionales aplicados sobre la inactivación de la bacteria E. Coli en los tratamientos de irradiación, Irradiación/H2O2, Fotocatálisis, Fotocatálisis/H2O2 y O3/H2O2/TiO2 Se puede observar que los valores de coeficiente de correlación (R2) con estos modelos cinéticos son más cercanos a 1 que en los modelos cinéticos anteriores, y los errores cuadráticos medios (ECM), se acercan más al valor 0 que en los modelos anteriormente mencionados. En la siguiente tabla 18, se muestran los parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados por Lanao (2012) sobre la bacteria Enterococcus sp.: Bacteria E. Coli Modelo de Coroller P Delta1 Delta2 ECM R2 Irradiación 4.73 1.47 33.84 0.05 0.96 Fotocatálisis 2.32 9.10 30.64 0.03 0.999 Modelo Geeraerd Sl Kmáx. ECM R2 Irradiación/H2O2 23.22 0.11 0.02 0.97 Fotocatálisis/H2O2 9.68 0.20 0.01 0.97 ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 73 Tabla 18. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de Enterococcus sp. en los tratamientos de irradiación, Irradiación/H2O2, Fotocatálisis, Fotocatálisis/H2O2 y O3/H2O2/TiO2 Modelo de Hom kap (min-1 · W m-2) m ECM R2 Irradiación 0,003 1,28 0,019 0,94 Irradiación/H2O2 0,0002 2,17 0,04 0,90 Fotocatálisis 0,049 1,13 0,08 0,98 Fotocatálisis/H2O2 O3/H2O2/TiO2 0,087 3,180 0,90 0,19 0,14 0,16 0,95 0,97 Modelo bifásico P k1 (min-1) k2 (min-1) ECM R2 Irradiación --- --- --- --- --- Irradiación/H2O2 --- --- --- --- --- Fotocatálisis --- --- --- --- --- Fotocatálisis/H2O2 O3/H2O2/TiO2 --- 0,99991 --- 5,93 --- 0,18 --- 0,16 --- 0,99 Modelo de Mafart p δ (min) ECM R2 Irradiación 1,36 83,65 0,02 0,94 Irradiación/H2O2 2,28 46,38 0,05 0,90 Fotocatálisis 1,10 13,47 0,11 0,98 Fotocatálisis/H2O2 O3/H2O2/TiO2 0,86 0,19 13,77 0,002 0,19 0,26 0,95 0,97 Como se puede observar en comparación con la tabla 18, se aprecian algunas diferencias significativas, utilizando los mismos tratamientos y en las mismas condiciones entre la bacteria Enterococcus sp. (Lanao 2012) y la bacteria E. Coli tratada en este proyecto. En primer lugar, en el modelo de Hom se observa que las Kap de los tratamientos de irradiación son muy parecidas, en cambio en los tratamientos de irradiación/H2O2 y fotocatálisis las Kap en la bacteria E.Coli son mayores, es decir se obtiene una mayor efectividad. En cambio en el ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 80 Figura 19. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre las bacterias E. Coli mediante tratamiento de fotocatálisis. En la figura 19 se representan los valores logarítmicos de inactivación observados frente a los valores logarítmicos de inactivación estimados en los modelos cinéticos aplicados sobre la bacteria E.Coli en el tratamiento de fotocatálisis. R² = 0,9745 -4 -3 -2 -1 0 1 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 modelo Bifásico R² = 0,9493 -4 -3 -2 -1 0 1 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 modelo de Mafart R² = 0,9609 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 modelo Hom ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 81 Figura 20. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre las bacterias E. Coli mediante tratamiento de irradiación/H2O2. En la figura 20 se representan los valores logarítmicos de inactivación observados frente a los valores logarítmicos de inactivación estimados en los modelos cinéticos aplicados sobre la bacteria E.Coli en el tratamiento de irradiación/H2O2. R² = 0,9485 -4 -3 -2 -1 0 1 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 modelo de Hom R² = 0,9077 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 modelo Bifásico R² = 0,956 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 -0,35 -0,3 -0,25 -0,2 -0,15 -0,1 -0,05 0 0,05 modelo de Mafart ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 82 Figura 21. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre las bacterias E. Coli mediante tratamiento de fotocatálisis/H2O2. En la figura 21 se representan los valores logarítmicos de inactivación observados frente a los valores logarítmicos de inactivación estimados en los modelos cinéticos aplicados sobre la bacteria E.Coli en el tratamiento de fotocatálisis/H2O2. R² = 0,9675 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 modelo Mafart R² = 0,9431 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 -0,35 -0,3 -0,25 -0,2 -0,15 -0,1 -0,05 0 modelo Bifásico R² = 0,9558 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 -0,35 -0,3 -0,25 -0,2 -0,15 -0,1 -0,05 0 modelo de Hom ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 83 Figura 22. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre las bacterias E. Coli mediante tratamiento de O3/H2O2/TiO2. En la figura 22 se representan los valores logarítmicos de inactivación observados frente a los valores logarítmicos de inactivación estimados en los modelos cinéticos aplicados sobre la bacteria E.Coli en el tratamiento de O3/H2O2 /TiO2. R² = 0,9809 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 modelo de Bifásico R² = 0,9984 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 modelo de Mafart R² = 0,9984 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 modelo de Hom ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 85 6. Conclusiones Las conclusiones alcanzadas en este Proyecto Final de Carrera son las expuestas a continuación:  En la aplicación de los tratamientos de desinfección de E. Coli en este proyecto se han obtenido tanto valores de desinfección bajos (0.3, 0.8), como valores de desinfección altos (3.3, 5.1), por lo que podemos demostrar que se puede eliminar de las aguas la bacteria E.Coli de manera eficaz usando POAs de manera alternativa a los procesos de cloración convencionales.  En el agua utilizada las características físico-químicas afectan a la desinfección obtenida a través de parámetros como la turbidez o los sólidos en suspensión, materia orgánica presente. o Como por ejemplo, la presencia de materia orgánica natural en el agua reduce el poder bactericida del ozono ya que compite con las bacterias presentes en la muestra por las especies reactivas desinfectantes generadas durante el proceso, confirmando que la desinfección con ozono depende de la calidad del agua.  Es necesaria la activación del dióxido de titanio mediante una fuente de radiación adecuada (λ<385 nm) para que participe activamente en el fenómeno de desinfección. , ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 86  No se aprecia un fenómeno de sinergia entre el TiO2 y el H2O2 en presencia de radiación solar en los ensayos.  Las variables más influyentes en la inactivación de E.Coli son el tiempo de tratamiento y el TiO2 en lo que a radiación solar se refiere, mientras que en el tratamiento que combina ozono con dióxido de titanio y con peróxido de hidrógeno mejora los resultados de inactivación obtenidos en relación a los tratamientos de irradiación.  Los modelos matemáticos primarios de Hom, bifásico y Mafart describen adecuadamente las cinéticas de desinfección de los tratamientos estudiados.  Comparando los valores de los parámetros cinéticos obtenidos para los distintos tratamientos aplicados se observa que los valores de las constantes de velocidad de inactivación (kap en el modelo de Hom y la k1 y K2 en el modelo bifásico) son muy superior en el tratamiento de O3/H2O2/TiO2 que en el resto, y mucho menor que este pero mayor que el resto estaría el tratamiento de fotocatálisis. El parámetro δ del modelo de Mafart, que indica el tiempo necesario para conseguir 1 unidad logarítmica de inactivación, es muy inferior en el tratamiento de fotocatálisis que en los demás tratamientos, excluyendo al tratamiento de O3/H2O2/TiO2 donde su valor es cero. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 87  Todos los modelos representados para los tratamientos estudiados muestran una nube de puntos cercana a la recta, si bien cabe destacar el mejor ajuste del modelo de Mafart y Hom en el tratamiento de O3/H2O2/TiO2.  El tratamiento más efectivo en términos de desinfección en las condiciones estudiadas corresponde el que combina ozono/peróxido/dióxido de titanio alcanzando valores de desinfección de 5.1 unidades logarítmicas, y sin contar con el tratamiento en el que interviene el ozono el tratamiento más efectivo recaería sobre el tratamiento de fotocatálisis donde se alcanzan valores de desinfección de 3.2 unidades logarítmicas.  Si se comparan los resultados de inactivación de Enterococcus sp. con los obtenidos a partir de C. perfringens, en el estudio de Lanao (2012), se deriva que las células vegetativas de C. perfringens son las formas bacterianas más sensibles a los tratamientos de irradiación aplicados, pues alcanzan mayores niveles de inactivación en menor tiempo con respecto a Enterococcus sp. Comparándose los resultados de inactivación de E.Coli con los resultados obtenidos por Lanao (2012) sobre C. perfringens y Enterococcus sp. , se observa que las células vegetativas C. perfringens son una forma bacteriana más sensible a los tratamientos de irradiación aplicados que la bacteria E.Coli, ( objeto de estudio en este PFC), y esta bacteria a la vez, es más sensible que la bacteria Enterococcus sp. ESTUDIO DE LA INACTIVACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS DE FOTOCATÁLISIS. 89 7. Bibliografía  Blake D.M., Maness P.C., Huang Z., Wolfrum E.J., Huang J. 1999. Application of the photocatalytic chemistry of titanium dioxide to disinfection and killing of cancer cells. Separation and Purification Methods, 28(1), 1-50.  Blanco J., Malato S., Fernández-Ibañez P., Alarcón D., Gernjak W., Maldonado M.I. 2009. Review of feasible solar energy applications to water processes. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 13, 1437– 1445.  Boyle M., Sichel C., Fernández-Ibañez P., Arias-Quiroz B., Iriarte- Puña M., Mercado A., Ubomba-Jaswa E., McGuigan K.G. 2008. Bactericidal effect of solar water disinfection under real sunlight conditions. Applied and Environmental Microbiology, 74 (10), 2997-3001.  Bueno J. L., Sastre, H., Lawing, A. G., “Contaminación e Ingeniería Ambiental.Contaminación de las Aguas”. Ed. F.I.C.Y.T. 1997.  C.P. Huang, Ch. Dong y Z. Tang, Waste Management, 13, 361-377 (1993).  Chong M.N., Jin B., Chow C.W.K., Saint C. 2010. Recent developments in photocatalytic water treatment technology: A review. Water Res. 44, 2997-3027.  Cho M., Chung H., Yoon J. 2003. Disinfection of water containing natural organic matter by using ozoneinitiated radical reactions. Applied and Environmental Microbiology, 69 (4), 2284-2291.  Directiva 98/83/CE de 3 de noviembre de 1998 relativa a la calidad de las aguas destinadas al consumo humano.  Directiva 2006/113/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 12 de diciembre de 2006 relativa a la calidad exigida a las aguas para cría de moluscos.