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E E ES S ST T TU U UD D DI I IO O O D D DE E E S S SU U UP P PE E ER R RF F FI I IC C CI I IE E ES S S D D DE E E B B BI I IO O OR R RR R RE E EC C CO O ON N NO O OC C CI I IM M MI I IE E EN N NT T TO O O D D DE E E O O OC C CR R RA A AT T TO O OX X XI I IN N NA A A A A A E E EN N N E E EL L L D D DE E ES S SA A AR R RR R RO O OL L LL L LO O O D D DE E E U U UN N NA A A P P PL L LA A AT T TA A AF F FO O OR R RM M MA A A M M MU U UL L LT T TI I IS S SE E EN N NS S SO O OR R RA A A E E EL L LE E EC C CT T TR R RO O OQ Q QU U UI I IM M MI I IC C CA A A P P PA A AR R RA A A M M MI I IC C CO O OT T TO O OX X XI I IN N NA A AS S S M MA AS ST TE ER R E EN N I IN NV VE ES ST TI IG GA AC CI IÓ ÓN N Q QU UÍ ÍM MI IC CA A D DE EP PA AR RT TA AM ME EN NT TO O D DE E Q QU UÍ ÍM MI IC CA A A AN NA AL LÍ ÍT TI IC CA A, , U UN NI IV VE ER RS SI ID DA AD D D DE E Z ZA AR RA AG GO OZ ZA A CARLOTA CUBEL SÁNCHEZ TRABAJO FIN DE MASTER JULIO 2013 Dr. Juan Ramón Castillo Suárez, Catedrático de Química Analítica de la Universidad de Zaragoza y Dra. Laura Bonel Sanmartín, investigadora del Grupo de Espectroscopía Analítica y Sensores de la Universidad de Zaragoza. CERTIFICAN: Que la memoria titulada “Estudio de superficies de biorreconocimiento de ocratoxina A en el desarrollo de una plataforma multisensora electroquímica para micotoxinas”, presentada por Dña. Carlota Cubel Sánchez, para superar el Máster de Investigación Química, ha sido realizada en el Grupo de Espectroscopía Analítica y Sensores (GEAS) del Departamento de Química Analítica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza bajo su dirección. Zaragoza, 21 de junio de 2013 Fdo. Juan Ramón castillo Suárez Fdo. Laura Bonel Sanmartín Í ÍN ND DI IC CE E A AB BR RE EV VI IA AT TU UR RA AS S R RE ES SU UM ME EN N Capítulo 1: INTRODUCCIÓN 1.1. MICOTOXINAS Y SU IMPORTANCIA 1.1.1. Ocratoxina A 1.1.2. Toxicidad 1.1.3. Legislación 1.2. METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA LA DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A 1.2.1. Métodos cromatográficos para la determinación de ocratoxina A 1.2.2. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 1.2.3. Biosensores y Aptasensores 1.3.USO DE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS EN BIOSENSORES Capítulo 2: OBJETIVOS Capítulo 3: EXPERIMENTAL 3.1. ESTUDIO DE LA REACCIÓN DE AFINIDAD ENTRE LA OCRATOXINA A Y APTÁMERO SOBRE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS: ESQUEMA DIRECTO E INDIRECTO 3.1.1. Materiales e Instrumentación 3.1.2. Reactivos y tampones 3.1.3. Procedimiento experimental 3.1.3.1. Esquema directo 3.1.3.2. Esquema indirecto 3.1.4. Resultados y discusión 3.2. ESTUDIO DE LA REACCIÓN DE AFINIDAD ENTRE OCRATOXINA A-BSA Y APTÁMERO BIOTINILADO POR RESONANCIA DE PLASMÓN SUPERFICIAL (SPR) 3.2.1. Materiales e Instrumentación 3.2.2. Reactivos y tampones 3.2.3. Procedimiento experimental 3.2.4. Resultados y discusión 3.3. ESTUDIO DE LA REACCIÓN DE AFINIDAD ENTRE LA OCRATOXINA A Y UN ANTICUERPO MONOCLONAL SOBRE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS: ESQUEMA DIRECTO 3.3.1. Materiales e Instrumentación 3.3.2. Reactivos y tampones 3.3.3. Procedimiento experimental 3.3.4. Resultados y discusión Capítulo 4: CONCLUSIONES A AN NE EX XO OS S R RE EF FE ER RE EN NC CI IA AS S B BI IB BL LI IO OG GR RÁ ÁF FI IC CA AS S ABREVIATURAS AptOTA: Aptámero específico de ocratoxina A AptOTA-bi: Aptámero específico de ocratoxina A biotinilado AuNPs: Nanopartículas de oro BSA: Albúmina Sérica bovina DON: Deoxinivalenol ELISA: Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay eaMBs: Micropartículas magnéticas funcionalizadas con estreptavidina EDC: 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida FAO: Food and Agriculture Organization FB: Fumonisina HPLC-FLD: Cromatografía líquida de alta resolución con detección fluorescente HPLC-MS: Cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas HRP: Peroxidasa de rábano picante IARC: Agencia Internacional para la investigación sobre el Cáncer LOD: Límite de detección mAbOTA : Anticuerpo monoclonal específico para OTA MBs: Partículas magnéticas MBs-prG: Partículas magnéticas funcionalizadas con proteína G NHS: N-hidroxisuccinimida OTA: Ocratoxina A OTA-BSA: Conjugado ocratoxina A con la albúmina sérica bovina OTA-HRP: Conjugado ocratoxina A con la peroxidasa OTB: Ocratoxina B OTC: Ocratoxina C pAbOTA: Anticuerpo policlonal de OTA PBS: Tampón fosfato salino PBS: Tampón fosfato salino con Tween 20 SELEX: Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment SPR: Resonancia de Plasmón Superficial TLC: Cromatografía líquida en capa fina TMB: 3,3´,5, 5´- tetrametilbencidina RESUMEN La ocratoxina A (OTA) es una micotoxina producida por ciertas especies de hongos Aspergillus o Penicillium en una serie de alimentos y presenta actividad nefrotóxica, teratogénica, carcinogénica e inmunotóxica que afecta tanto a animales como a humanos. Se encuentra presente en numerosos tipos de alimentos como vino, mosto, frutos secos, cerveza, trigo, etc. Las principales vías de incorporación son a través de la ingestión, inhalación y absorción a través de la piel. Debido a estos efectos toxicológicos, la legislación internacional en referencia a la OTA es extremadamente restrictiva y cada vez más exigente. Los contenidos máximos permitidos de OTA en diferentes alimentos y piensos están en los niveles de ng g-1. Se va a llevar a cabo el estudio de diferentes elementos de biorreconocimiento mediante la técnica espectrofotométrica ELISA. Los estudios que se llevan a cabo son mediante dos esquemas de trabajo diferente, esquema competitivo directo donde el elemento de biorreconocimiento es inmovilizado sobre la superficie de las partículas magnéticas o mediante un esquema competitivo indirecto en el cual es el analito objeto de estudio es el que se une a las partículas magnéticas. Las partículas mejoran considerablemente el rendimiento de la reacción inmunológica debido a una rápida cinética de inmunoensayo ya que las partículas se encuentran en suspensión, facilitando además los protocolos de lavado y separación. Durante el ensayo se llevan a cabo etapas de lavado y separación con la ayuda de un separador magnético evitándose adsorciones inespecíficas o interferencias de matriz sobre la superficie de la placa ELISA, posteriormente se lleva a cabo la etapa de competición entre la OTA y la OTA marcada con la enzima peroxidasa (HRP), ésta última compite con la primera por los sitios de unión libres del elemento de biorreconocimiento. La reacción enzimática se lleva a cabo mediante el uso de 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) en un tiempo de 20 minutos y una posterior medida de absorbancia a una longitud de onda de 450 nm. Complementariamente a estos ensayos se recurre a otras técnicas espectroscópicas (SPR, fluorescencia y absorción UVVis) que nos permitan estudiar tanto el grado de inmovilización sobre las partículas magnéticas como las posibles reacciones de afinidad entre el elemento de biorreconocimiento y el analito. 6 Capítulo 1: Introducción Existen numerosos métodos ELISA disponibles comercialmente para la determinación de micotoxinas basados en un ensayo competitivo. Estos kits son portables, rápidos y muy específicos así como de fácil manejo pero presentan como desventajas, principalmente que son de uso individual lo que incrementa su coste económico, otras desventajas son su limitado rango de detección debida a la poca sensibilidad de los anticuerpos, [15] además de sus largos tiempos de análisis y la gran cantidad de falsos positivos y negativos que puede haber [19]. La sensibilidad y especificidad de un método ELISA depende en su mayor parte de la naturaleza, del origen y de las propiedades del anticuerpo utilizado, [20] presentando mayor sensibilidad los ensayos ELISA competitivos indirectos que de los directos [21]. La gran ventaja que presenta el método ELISA es que es una técnica cuantitativa, rápida, de fácil operación para determinar una gran cantidad de muestras y es sensible [22] . BIOSENSORES Desde las últimas dos décadas se ha comenzado a reconocer los beneficios del uso de los biosensores como herramienta de investigación de una forma rutinaria. Los biosensores son dispositivos que usan receptores biológicos o químicos en contacto con un transductor para detectar analitos en una muestra. Los receptores biológicos suelen ser enzimas, tejidos animales o vegetales, antígenos, anticuerpos, ácidos nucléicos, etc, son usados como elementos de biorreconocimiento para dotar al dispositivo de la selectividad y especificidad requeridas para la determinación de analitos de origen muy variado en el ámbito clínico, toxicológico, medioambiental, agroalimentario, etc [24]. El rendimiento de un biosensor depende de su capacidad para inmovilizar receptores, de la accesibilidad de los receptores y de la baja adsorción inespecífica sobre el soporte sólido. Estos requisitos son los que aportan especificidad y sensibilidad al biosensor.[25] Se pueden dividir los biosensores en cuatro grupos principales en función de las propiedades físico-químicas de las micotoxinas:[4] luminiscentes /calorimétrico, de plasmón superficial (SPR), de microbalanza de cuarzo o sensores electroquímicos teniendo estos últimos la ventaja de su alta sensibilidad y simplicidad. El uso de biosensores en el análisis de contaminantes en alimentos es una tecnología emergente y todavía no existen en el mercado más que un número muy limitado para la determinación de OTA [26] basándose la mayoría en la transducción SPR. La resonancia de plasmón superficial (SPR) es una técnica óptica donde la luz se utiliza para excitar los plasmones en una lámina delgada de oro unido a la superficie de un prisma de vidrio. La resonancia es un acoplamiento entre la energía de la luz y los plasmones superficiales en la película de oro, cuando se produce la resonancia hay una absorción resultante de la energía y una disminución en la intensidad de la luz reflejada. El ángulo de la luz incidente en el que se produce este proceso se conoce como ángulo de resonancia y depende de los índices de refracción del prisma y de la superficie del sensor.[27] Estudio de superficies de biorreconocimiento de ocratoxina A en el desarrollo de una plataforma multisensora electroquímica para micotoxinas 7 Los ensayos SPR se pueden clasificar dependiendo de las características del analito, de la muestra y de la sensibilidad que tiene el instrumento ya que la detección directa solamente es útil para muestras que tienen un peso molecular mayor a 10 kDa por lo que en el caso de la OTA, al ser una molécula de bajo peso molecular (403,8 Da), se necesitan ensayos de tipo sándwich o ensayos competitivos.[28] Figura 4: Esquema de la etapa de interacción antígeno-anticuerpo en SPR SPR es una técnica útil para monitorizar interacciones en tiempo real, permite caracterizar cada paso de la inmovilización y el proceso de unión del analito, por lo que es de gran interés para la determinación de OTA [29], según la bibliografía los biosensores basados en SPR con aplicaciones en micotoxinas son los más numerosos [30], se han desarrollado métodos para la detección simultánea de múltiples micotoxinas en un bajo tiempo de análisis con un límite de detección para la OTA de 0,1 ng ml-1 [31] además de obtener un rango de respuesta muy amplio[32]. Mediante la combinación de las ventajas de la reacción inmunológica específica de antígenoanticuerpo y la alta sensibilidad y fiabilidad de la señal de transducción, los inmunoensayos SPR ofrecen unos rendimientos excepcionales con respecto a la sensibilidad, especificidad, velocidad y detección multianalito en matrices analíticas complejas.[33] 1.2.2.1 INMUNOSENSORES Y APTASENSORES En los últimos años, la tecnología ha experimentado un interés particular por el uso de inmunosensores y aptasensores para la determinación de OTA [32], [34]. Los inmunosensores y aptasensores son biosensores de afinidad y se pueden clasificar atendiendo al elemento de biorreconocimiento, si se lleva a cabo la inmovilización del elemento de bioreconocimiento se trata de inmunosensores o aptasensores directos y en el caso de la inmovilización del antígeno se hablará de indirectos. Un inmunosensor o aptasensor competitivo se basa en la competición entre el analito y el analito marcado normalmente con una enzima (en nuestro caso HRP) por los sitios de unión 8 Capítulo 1: Introducción del anticuerpo por lo que cuanto mayor es la concentración del analito menor es la unión del analito marcado al anticuerpo produciéndose de esta forma una menor señal [35], [36]. En este tipo de esquema se cumple que la concentración de analito es inversamente proporcional a la señal. Los inmunosensores están basados en el uso de anticuerpos como elemento de biorreconocimiento de la OTA. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales siendo los últimos mucho más específicos y de mayor afinidad hacia el analito que los primeros. Figura 5: Representación gráfica de un anticuerpo En los esquemas directos, la inmovilización del elemento de bioreconocimiento se considera como un paso crítico en el desarrollo de un inmunosensor, la mayor afinidad entre antígenoanticuerpo depende de la orientación del anticuerpo [37]. Cada vez es más emergente el uso de inmunosensores, de ahí que se pueda encontrar una amplia bibliografía, se encuentran artículos donde se estudian las diferentes superficies sólidas donde llevar a cabo la inmovilización tanto del anticuerpo como del antígeno como es el caso del uso de membranas de nitrocelulosa donde se usa BSA como bloqueante [35]. Dado que nuestro trabajo de investigación se centra en la determinación de OTA se va a mencionar a continuación algunos estudios para esta micotoxina. En los últimos años se ha desarrollado el uso de inmunosensores electroquímicos para la determinación de OTA en vino y cereales basados en inmunoensayos competitivos directos e indirectos. En ambos casos se consiguieron obtener límites de detección por debajo de los límites legales establecidos [38] . Este tipo de inmunosensor permite una cuantificación sencilla y sensible de la OTA muy por debajo de los límites de concentración regulados por la Comisión Europea donde los resultados obtenidos demuestran que son unas potentes y novedosas herramientas analíticas para la determinación de OTA, manteniendo una alta correlación con los resultados obtenidos con la metodología oficial (HPLC-FD) [39]. Son posibles mejoras analíticas mediante el uso de nanopartículas de oro como superficie sólida de inmovilización[40] como se comentará posteriormente. La determinación de la concentración de OTA en un inmunoensayo competitivo se lleva a cabo a partir del ajuste a una sigmoide mediante el modelo de los 4 parámetros logísticos a través de la ecuación: Estudio de superficies de biorreconocimiento de ocratoxina A en el desarrollo de una plataforma multisensora electroquímica para micotoxinas 9 Los inmunosensores han revolucionado el análisis moderno ya que son instrumentos sensibles, selectivos, de monitoreo en tiempo real. La técnica de trabajo es sencilla y tienen una gran velocidad de respuesta [32]. La selectividad de un inmunosensor está dada por el anticuerpo monoclonal que se usa, mientras que la alta sensibilidad se debe a la alta afinidad del anticuerpo y la sensibilidad de la detección electroquímica [39]. El descubrimiento de los aptámeros en el año 1990 [41] abrió nuevas perspectivas en el campo de los biosensores. Los aptáremos son secuencias cortas (20 a 90 oligonucleótidos) de oligonucleótidos de cadena sencilla (ADN, ARN) seleccionadas in vitro [4].El procedimiento SELEX, permite en un principio la posibilidad de crear receptores artificiales para un rango de tipos de moléculas prácticamente ilimitado, tanto de alto peso molecular como de moléculas de pequeño tamaño [42]. Los aptáremos, debido a que tienen cadenas sencillas y flexibles, tienen la capacidad en determinadas condiciones físico químicas de adquirir conformaciones tridimensionales facilitando las interacciones específicas con la molécula diana [43]. Los aptáremos ofrecen varias ventajas sobre los anticuerpos ya que pueden ser sintetizados in vitro en unos pocos minutos, también presentan la ventaja de su estabilidad y pueden ser modificados fácilmente proporcionando una gran flexibilidad durante el ensayo [44], son muy selectivos y específicos por lo que son utilizados como elementos de biorreconocimiento útiles para biosensores para determinar OTA en alimentos. Son muchas las investigaciones donde los aptasensores han sido desarrollados, usando técnicas de polarización por flourescencia [45], cromatografía de afinidad acoplados a la detección por fluorescencia molecular [44] o por colorimetría donde se usan las nanopartículas de oro (AuNPs) como indicador colorimétrico [46]. Pero son los aptasensores electroquímicos los que han sido desarrollados más recientemente, estando muchos de ellos basados en ensayos competitivos mediante el uso de partículas magnéticas como superficie sólida de inmovilización [36]. Estos tipos de aptasensores presentan una alta sensibilidad, un tiempo de respuesta rápida, bajo costo, presenta una instrumentación sencilla [47] y con posibilidad de hacer un análisis in situ. 1.3 USO DE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS Para que un elemento de biorreconocimiento funcione correctamente es necesario que se inmovilice sobre un soporte sólido. Esta etapa de inmovilización es muy importante que se controle para conseguir una alta reactividad, buena orientación y accesibilidad, estabilidad sobre la superficie y conseguir una mínima unión inespecífica. Las partículas magnéticas (MBs) son una herramienta poderosa que se presenta en una gran variedad de bioensayos ya que su uso aporta una gran variedad de ventajas. Su uso mejora la afinidad entre antígeno y el elemento de biorreconocimiento mediante una cinética rápida debido a que las MBs se encuentran en suspensión. El posible efecto matriz se reduce considerablemente debido a que gracias a un separador magnético se pueden efectuar correctamente las etapas de lavado y de 10 Capítulo 1: Introducción separación [48], aportan sensibilidad y un sistema de detección rápido y portable [49], aumenta considerablemente el rendimiento del inmunoensayo debido al incremento considerable de la superficie de biorreconocimiento [50]. La unión de los elementos de biorreconocimiento sobre las partículas magnéticas se produce a través de los grupos funcionales (amino, carboxilo, proteína, etc) presentes en la superficie sólida de éstas. Dicha unión se produce mediante la formación de un enlace covalente. En nuestro tema de estudio se usan diferentes tipos de partículas magnéticas como superficie sólida donde se lleva a cabo la inmovilización de los elementos de biorreconocimiento. Antes de la etapa de inmovilización se lleva a cabo una serie de lavados [39] que permitan eliminar los posibles conservantes que puedan contener, dichas etapas de lavados antes, durante y después de la etapa de inmovilización se realizan con la ayuda de un separador magnético que es capaz de atraer a las partículas magnéticas con los bioreactivos inmovilizados y permite eliminar los bioreactivos que no han reaccionado. Figura 6: ejemplo de inmovilización de las MBs mediante un esquema directo. Estudio de superficies de biorreconocimiento de ocratoxina A en el desarrollo de una plataforma multisensora electroquímica para micotoxinas 11 Capítulo 2: OBJETIVOS El objetivo general que se plantea en este trabajo de investigación se centra en el estudio de diferentes elementos de biorreconocimiento para la determinación de la OTA, estudiándose la reacción de afinidad entre este elemento de biorreconocimiento selectivo a la OTA y ésta última. Estos dos elementos de biorreconociemiento objeto de estudio son un aptámero y un anticuerpo monoclonal, que son el elemento fundamental para el desarrollo posible final tanto de un aptasensor como de un inmunosensor electroquímicos respectivamente. Una vez planteado el objetivo general, se pretende conseguir los siguientes objetivos más específicos: 1. Estudio y optimización de los diferentes parámetros que intervienen en la reacción de afinidad entre la OTA que es el analito objeto de estudio y el aptámero de la OTA (AptOTA). Se estudiaron dos aptámeros, uno modificado con biotina en el extremo 5’ y otro sin biotina. En todos los casos se trabajó sobre partículas magnéticas (MBs) como superficie sólida para inmovilizar el elemento de biorreconocimiento, tanto en el estudio de un esquema directo como indirecto competitivo mediante ensayo ELISA realizando previamente los oportunos estudios de inmovilización sobre las MBs y estudios de afinidad. Entre los parámetros a optimizar se encuentran la elección de las partículas magnéticas óptimas, elección de bloqueantes y activadores, concentración de AptOTA y AptOTA-bi, etc 2. Estudio de la reacción de afinidad entre los diferentes elementos de biorreconocimiento y la OTA-BSA mediante la técnica de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR). Para ello se lleva a cabo la inmovilización del conjugado OTA-BSA sobre la superficie del chip de dextrano y a continuación se hace reaccionar con el correspondiente elemento de biorreconocimiento. 3. Estudio y optimización de los diferentes parámetros que intervienen en la reacción de afinidad entre la OTA que es el analito objeto de estudio y el anticuerpo monoclonal sobre las MBs, en el estudio de un esquema directo competitivo mediante ensayo ELISA. Entre los parámetros a optimizar se encuentran la concentración del conjugado enzimático (OTA-HRP), la elección de las partículas magnéticas óptimas, el tiempo de la etapa de inmovilización y de competición, etc. 12 Capítulo 3: Experimental Capítulo 3: EXPERIMENTAL 3.1. ESTUDIO DE LA REACCIÓN DE AFINIDAD ENTRE LA OCRATOXINA A Y APTÁMERO SOBRE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS: ESQUEMA DIRECTO E INDIRECTO En este primer apartado se describe la caracterización de la reacción de afinidad entre el aptámero selectivo a OTA y la OTA y/o OTA-HRP mediante diferentes técnicas espectroscópicas usando MBs como superficie sólida donde tiene lugar la etapa de inmovilización y competición. También se llevó a cabo una experiencia donde se estudiaron las posibles uniones inespecíficas que pueda haber tanto entre la enzima peroxidasa con las MBs en ausencia de elemento de biorreconocimiento o del AptOTA con las MBs que presentan grupo NH2. El estudio sobre el aptámero puede quedar dividido principalmente en dos esquemas de ensayo:  Esquema directo competitivo: eaMBs-AptOTA-bi + OTA/OTA-HRP En este primer esquema de trabajo se pretende estudiar, mediante la técnica espectrofotométrica ELISA, diferentes tipos de MBs funcionalizadas con estreptavidina y optimizar las concentraciones de OTA-HRP y de AptOTA-bi. Al ser un esquema directo se inmoviliza el AptOTA-bi sobre las MBs.  Esquema indirecto competitivo: MBs-NH2-OTA/OTA + AptOTA-bi/AptOTA Este esquema de trabajo abarca el uso de diferentes técnicas (ELISA espectrofotométrico, fluorescencia y abosorbancia) ya que se pretende estudiar nuevamente, mediante espectroscopía de absorción y mediante inmunoensayo espectrofotométrico la afinidad entre aptámeros (con y sin biotina), de diferentes casas comerciales, con la OTA. Al ser un esquema indirecto, la OTA se inmoviliza sobre las MBs modificadas con el grupo amino y a continuación se hacen reaccionar con el aptámero. Mediante fluorescencia se estudiará el porcentaje de inmovilización de la OTA (previamente activada) sobre las MBs-NH2. 3.1.1 Materiales e instrumentación El instrumento usado para el estudio de dichas reacciones de afinidad mediante técnicas espectrofotométricas es un lector de placas ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (Biorad microplat reader, Modelo 680) como el que se muestra a continuación: Estudio de superficies de biorreconocimiento de ocratoxina A en el desarrollo de una plataforma multisensora electroquímica para micotoxinas 13 Figura 7. Lector de placas ELISA (Biorad microplat reader, Modelo 680) Para llevar a cabo las diferentes etapas para el estudio de afinidad se usan placas ELISA de poliestireno con 96 pocillos (IWAKI, Japón; figura 8) y un separador magnético (Life Technologies, figura 9) que ayuda a que las partículas magnéticas queden retenidas adecuadamente. Figura 8. Placa ELISA de poliestireno Figura 9. Separador magnético ELISA Se usan también eppendorfs donde se lleva a cabo la inmovilización tanto del elemento de biorreconocimiento como del analito, según el tipo de esquema que se siga, sobre las partículas magnéticas y su correspondiente separador magnético (Promega, Madison, USA; figura 10) para realizar las sucesivas etapas de separación. Figura 10. Separador magnético para eppendorfs Las micropipetas a usar son de volúmenes comprendidos entre 5 y 1000 μl (Crison, Barcelona, España). También se necesita un agitador Thermomixer Compact, para 24 viales eppendorf (Eppendorf Ibérica, Madrid, España; figura 11) y un agitador tipo vortex (Reax-control; figura 12). 14 Capítulo 3: Experimental Figura 11. Thermomixer Compact (Eppendorf Ibérica, Madrid, España) Figura 12.Aagitador tipo vortex (Reax-control) En los casos de estudio por espectroscopía de absorción molecular UV-Vis y fluorescencia se trabaja con los siguientes equipos: Figura 13. Espectrofotómetro de fluorescencia (Perkin Elmer, USA) Figura 14. Espectrofotómetro diode Array (Hewlett Packard, USA) 3.1.2 Reactivos y tampones Tampones  Tampón A: 5 mM Tris –HCl, 0,5 mM EDTA, 1M NaCl, pH 7,5.  Tampón B: 10 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2, pH 8,5.  Tampón C: 10 mM PBS, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2 pH 7.  Tampón D: 10 mM PBS, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2, Tween 20 (0,1%) pH 7.  Tampón E: 10 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2, Tween 20 (0,1%) pH 8,5.  Tampón F: 10 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2, pH 6,5.  Tampón G: 50 mM MES pH= 6.  Tampón H: 5 mM Tris-HCl pH= 7.5, 0.5 M EDTA, 1 M NaCl. Estudio de superficies de biorreconocimiento de ocratoxina A en el desarrollo de una plataforma multisensora electroquímica para micotoxinas 15  Tampón I: 40 mM Tris pH= 7. Reactivos generales  Superblock Blocking buffer (Thermo Scientifics)  3, 3´,5,5´- Tetrametilbencidina, TMB (Sigma-Aldrich) H2SO4 95% (Merck, Madrid, España)  Tween 20 (Sigma Aldrich)  1-Etil-3-(3-dimetillaminopropil)carbodiimida, EDC (Fluka)  N-hidroxisuccinimida, NHS (Sigma-Aldrich)  Etanolamina (Sigma-Aldrich)  Agua MilliQ  Biotina (Sigma-Aldrich) Reactivos de inmunoensayo  Partículas magnéticas Dynabeads M-270 Streptavidin, Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynabeads MyOne Streptavidin C1, Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (10 mg ml-1, Dynal, Invitrogen, Oslo, Noruega)  Partículas magnéticas magMP-NH2 (28 mg ml-1, Nanomyp, Granada)  Partículas magnéticas MBs-NH2 M-270 (30 mg ml-1, Dynal, Invitrogen, Oslo, Noruega)  Ocratoxina A (ACROS ORGANICS)  AptOTA-bi y AptOTA (AptaRes, Mittenwalde, Alemania)  AptOTA-bi y AptOTA (IBA, Alemania)  Conjugado OTA-HRP (Europroxima)  eaHRP (Sigma-Aldrich) 3.1.3 Procedimiento experimental El esquema de trabajo se divide en dos: • Esquema directo:  ELISA espectrofotométrico con diferentes partículas magnéticas funcionalizadas con estreptavidina. Principalmente se pretende seleccionar las mejores partículas magnéticas modificadas con estreptavidina para llevar a cabo la inmovilización el AptOTA-bi. Por ello, se estudian 22 Capítulo 3: Experimental  Medidas por flourescencia y absorbancia Se ha llevado a cabo el estudio, gracias a la fluorescencia intrínseca de la molécula de OTA, su espectro de emisión a diferentes concentraciones (1, 10, 40 y 80 ng ml-1) tanto de la OTA como de la OTA con el activante EDC, posteriormente se llevó a cabo la inmovilización tanto de las diferentes concentraciones de la OTA como de la OTA + EDC durante 3 horas y a temperatura ambiente siendo medido el sobrenadante por fluorescencencia, el porcentaje de inmovilización más elevado conseguido fue de 50 % correspondiente a una concentración de OTA de 80 ng ml-1. A partir de ahí se estudió la afinidad entre el AptOTA y la OTA inmovilizada sobre las MBs mediante absorbancia y la posible unión inespecífica del AptOTA con las MBs-NH2. El aptámero (AptOTA-bi y AptOTA) utilizado es de la casa comercial AptaRes. En primer lugar se estudió la absorbancia que presentan los aptámeros de concentración 0,5 μM en tampón J, posteriormente se estudió la suspensión tanto de las MBs-NH2-OTA como de las MBs-NH2 y finalmente la afinidad del AptOTA por la OTA (80 ng ml-1)inmovilizada sobre las partículas como por las MBs-NH2, tanto el sobrenadante recogido en el separador magnético como la disolución resultante tras haber llevado a cabo un filtrado (filtros de 0,22 μm de diámetro de poro). La concentración de AptOTA adicionada es proporcional a los moles de OTA (2.10-7 moles). Los resultados mostraron que el AptOTA muestra una mayor afinidad respecto al AptOTA-bi y que prácticamente no hay unión inespecífica del AptOTA sobre las MBs-NH2. Para obtener unos resultados consolidados se llevó a cabo la repetición de la experiencia anterior donde se usó únicamente AptOTA mediante el mismo protocolo de trabajo indicado en el Anexo IV los resultados obtenidos mostraron una elevada unión inespecífica y una baja unión específica. Como consecuencia de estos resultados experimentales poco satisfactorios, se decidió estudiar la inmovilización de la OTA sobre otras MBs modificadas con el grupo NH2. MBs-NH2 (M-270, Dynal)  Medidas por fluorescencia y absorbancia Mediante estas dos técnicas analíticas se pretende estudiar la reacción de inmovilización de la OTA sobre las MBs-NH2 y posteriormente la reacción de unión específica e inespecífica sobre esta superficie sólida, utilizando el AptOTA como elemento de biorreconocimiento. Para el estudio con las MBs-NH2 (M-270) se usan como activantes EDC y EDC/NHS de concentración 10 mg ml-1para el caso de EDC y de 15 mg ml-1 para el caso de NHS. Se llevaron a cabo las mismas experiencias que en el caso de usar MBs-NH2 (Nanomyp) pero aplicando las siguientes variaciones respecto a las indicadas en el Anexo II apartado A: tanto en las medidas de fluorescencia como en las de absorbancia se usó el protocolo de trabajo de acondicionamiento de las MBs recogido en el apartado B del citado Anexo y se modificó [7] del Anexo IV apartado A por un tiempo de incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. En el estudio por absorbancia se trabajó con AptOTA de las casas comerciales AptaRes e IBA adicionando tanto un defecto como un exceso de moles respecto a los moles adicionados de OTA. Estudio de superficies de biorreconocimiento de ocratoxina A en el desarrollo de una plataforma multisensora electroquímica para micotoxinas 23 Los resultados obtenidos no fueron satisfactorios para el caso de las medidas por fluorescencia, ya que se obtuvo únicamente un 11 % de inmovilización de la OTA sobre las MBs-NH2. En el caso de las medidas por absorbancia indicar que se obtuvo un 64 % de afinidad del AptOTA de la casa comercial IBA en el caso de encontrarse en exceso respecto a los moles de OTA. La unión inespecífica existente fue de un 15 %.  ELISA espectrofotométrico Unión específica e inespecífica con diferentes aptámeros. En el estudio de la reacción de afinidad entre AptOTA y OTA inmovilizada sobre MBs-NH2 y activadas tanto con EDC como con EDC/NHS + NH2OH, de forma general se observó que con el aumento de concentración de AptOTA se consiguen mayores valores de absorbancia pero los valores obtenidos son demasiado bajos. Se repitió el ensayo en las mismas condiciones, pero aplicando las siguientes variaciones [16] con respecto al protocolo inicial de trabajo que se recoge en el Anexo II apartado B: Añadir en cada uno de los pocillos 50 µl de concentraciones crecientes de AptOTA (0; 0,5; 1 y 2 μM) o en su defecto tampón J (según estudio de especificidad). Para comprobar si el aumento de absorbancia respecto a un incremento de la concentración de AptOTA es debido a la afinidad entre AptOTA y OTA o es debido a la unión inespecífica del AptOTA sobre las MBs-NH2 se amplió el ensayo con las mismas condiciones de trabajo pero con MBs-NH2 sin OTA inmovilizada, pudiéndose comprobar en la siguiente gráfica comparativa: Figura 19: Resultados experimentales de estudio de afinidad por ELISA. 2 horas de incubación de MBs-NH2-OTA y MBs-NH2 activadas con EDC o con EDC/NHS + NH2OH .30 minutos de inmovilización de AptOTA. Concentraciones de AptOTA-bi (0; 0,02; 0,2 y 0,5 μM). Adición ea-HRP 1/100000. Tiempo incubación 30 min. 24 Capítulo 3: Experimental A la vista de los resultados se puede concluir que hay una baja unión inespecífica del AptOTA y de la eaHRP a las MBs-NH2. En el caso de haber modificado las MBs-NH2 con EDC/NHS se produce un mayor efecto de unión inespecífica y es debida al AptOTA ya que aumenta respecto al aumento de concentración. Se observa que en presencia de la OTA inmovilizada y activada con EDC/NHS + NH2OH para una concentración máxima de AptOTA la absorbancia es elevada (0,35) por lo que corresponde a una unión inespecífica considerable. Uso de diferentes bloqueantes Con el uso de dos bloqueantes diferentes para bloquear las MBs-NH2 y evitar que se produzca reacción de afinidad con el AptOTA se obtuvieron absorbancias menores para las uniones específicas entre AptOTA y OTA inmovilizada sobre las MBs-NH2. Se repitió el ensayo anterior en las mismas condiciones, pero adicionando el siguiente punto que irá a continuación de [15] con respecto al protocolo inicial de trabajo que se recoge en el Anexo II apartado B: De cada uno de los bloqueantes se añaden 50 µl de bloqueante en tampón J durante 30 minutos con agitación suave, constante y a temperatura ambiente. Se adiciona antes de añadir el AptOTA con el fin de evitar su unión no específica sobre la superficie de las MBs-NH2. En el estudio de la BSA se trabajó con una concetración de 0 y 0,5 μM de AptOTA: Figura 20: Resultados experimentales de estudio de afinidad con el uso de BSA como bloqueante por ELISA. 2 horas de incubación de MBs-NH2-OTA y MBs-NH2 activadas con EDC o con EDC/NHS + NH2OH .30 minutos de inmovilización de AptOTA Concentraciones de AptOTA (0 y 0,5 μM). Adición ea-HRP 1/100000. Tiempo incubación 30 min. Estudio de superficies de biorreconocimiento de ocratoxina A en el desarrollo de una plataforma multisensora electroquímica para micotoxinas 25 Para el caso de la experiencia con la etanolamida se usan concentraciones de 0 y 2 μM de AptOTA: Figura 21: Resultados experimentales de estudio de afinidad con el uso de etanolamida como bloqueante por ELISA. 2 horas de incubación de MBs-NH2-OTA y MBs-NH2 activadas con EDC o con EDC/NHS + NH2OH .30 minutos de inmovilización de AptOTA. Concentraciones de AptOTA (0 y 0,5 μM). Adición ea-HRP 1/100000. Tiempo incubación 30 min. En el caso de utilizar estos dos bloqueantes, el efecto que se ha conseguido el bloquear la OTA inmovilizada sobre las MBs-NH2, de manera que el aptámero es incapaz de unirse selectivamente a la OTA inmovilizada. 3.2 ESTUDIO DE LA REACCIÓN DE AFINIDAD ENTRE OCRATOXINA A-BSA Y APTÁMERO BIOTINILADO POR RESONANCIA DE PLASMÓN SUPERFICIAL (SPR) Se llevó a cabo el estudio de la reacción de afinidad entre los diferentes elementos de biorreconocimiento y la OTA mediante la técnica de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR). De los dos esquemas posibles de trabajo, se ha trabajado con el esquema indirecto, la OTABSA se inmoviliza sobre la superficie del chip y una vez inmovilizado se estudia la interacción con el AptOTA y con el AptOTA-bi. 26 Capítulo 3: Experimental 3.1.3 Materiales e instrumentación Todas las reacciones de afinidad se llevan a cabo en el instrumento de Resonancia de Plasmón Superficial Biacore T200 (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, England) Figura 22: Instrumento de Resonancia de Plasmón Superficial (Biacore T200) En el caso de llevar a cabo las inmovilizaciones se usa un chip Serie S CM5 con una superficie de oro recubierta de dextrano (figura 23. Apt. a) que se coloca directamente en el equipo (figura 23. Apt. b) Figura 23. Apt a) chip Serie S CM5. Apt b) Introducción del chip en el instrumento de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR). También fueron necesarias micropipetas de volúmenes comprendidos entre 5 y 1000 μl (Crison, Barcelona, España) y un agitador tipo vortex para homogenizar los reactivos (Reaxcontrol). 3.1.4 Reactivos y tampones Tampones  Running buffer: HBS-E, pH 7.4 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % polysorbate 20 (surfactante).  Tampón de inmovilización:Acetato (0,1 M, pH 4)  Tampón SB: (10 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCL2 pH 7)  Tampón BB: (10 mM Tris pH 8,5, 120 mM NaCl, 5 mM KCl y 20 mM CaCl2) Estudio de superficies de biorreconocimiento de ocratoxina A en el desarrollo de una plataforma multisensora electroquímica para micotoxinas 27 Reactivos generales  1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) (Fluka)  Biotina(Sigma Aldrich)  Ácido acético al 25 %  Glicina-HCl  N-hidroxisuccinimida (NHS) (Sigma-Aldrich)  Etanolamida (Sigma Aldrich)  Agua Milli Q Reactivos de inmunoensayo  Aptámero de OTA ( AptOTA, AptaRes)  Aptámero de OTA biotinilado ( AptOTA-bi, AptaRes)  Aptámero de OTA ( AptOTA, IBA)  Albúmina serica bovina (BSA) EC Nº 232-936-2 (Sigma-Aldrich)  OTA-BSA (sintetizada laboratorio) 3.1.5 Procedimiento experimental Inmovilización de la BSA y OTA-BSA sobre la superficie del microchip de dextrano. Las condiciones que se fijaron en el equipo fueron:  Running buffer: HBS-E, pH 7.4 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % polysorbate 20 (surfactante)).  Flujo : 5 μl min-1  Temperatura de análisis: 25 ºC  Temperatura del compartimento de muestra: 25 ºC El microchip presenta cuatro canales donde se puede realizar cada una de las inmovilizaciones, en un canal se inmoviliza la OTA-BSA y en otro la BSA. La inmovilización de los diferentes ligandos nombrados anteriormente sobre la superficie del microchip requiere un total de tres etapas. 1º etapa: Activación del grupo carboxilo del dextrano de la superficie del microchip mediante la química de las aminas primarias, para ello se requiere la inyección de 50 μl de la mezcla EDC (200 mM) + NHS (50 mM). 2º etapa: Unión del ligando sobre la superficie activada del microchip. Las condiciones de inyección dependen del ligando. OTA-BSA: Inyección de 100 μl de OTA -BSA (50 mg/l) en tampón acetatos pH 9,6 + 100 μl de ácido acético al 25 %. BSA: Inyección de 60 μl de 50 mg/l de BSA en tampón acetatos pH 4. 28 Capítulo 3: Experimental 3º etapa: Bloqueo de los sitios de unión inespecífica del microchip con etanolamina mediante la inyección de 60 μl de etanolamina (1 M, pH 8.5). • Estudio de la reacción de afinidad entre AptOTA-bi y AptOTA con la OTA-BSA y la BSA Una vez que el ligando ha sido inmovilizado sobre la superficie del microchip se debe añadir el elemento de biorreconocimiento (AptOTA) para poder estudiar la reacción de afinidad entre estas dos moléculas. Para dicho estudio hace falta inyectar 60 μl de cada uno de los distintos elementos de biorreconocimiento (AptOTA-bi, AptOTA de dos casas comerciales diferentes) a diferentes caudales (5-20 μl min-1) y en diferentes tampones (SB y BB). También se estudia el efecto de la temperatura a un caudal menor (2 μl min-1). 3.1.6 Resultados y discusión • Inmovilización de la OTA-BSA y BSA en diferentes canales Una vez terminada la etapa de activación de la superficie del microchip y la etapa de inmovilización de la OTA-BSA y de la BSA cada uno en su canal se obtuvieron unas señales de 2698,4 RU y de 6313,1 RU respectivamente. Los sensogramas correspondientes se muestran a continuación: Figura 24: Sensorgrama obtenido en el proceso de inmovilización del ligando. Figura 5.a: inmovilización de OTA-BSA sobre dextrano del chip CM5. Figura 5.b inmovilización de BSA sobre dextrano del chip CM5 Por lo que se puede concluir que ha sido más satisfactoria la inmovilización de la BSA (más RU) sobre la superficie del dextrano que la OTA-BSA considerándose dicho valor como una buena inmovilización sobre el microchip. • Estudio de la reacción de afinidad entre los diferentes ligandos y aptámeros. Una vez concluida las tres etapas indicadas con anterioridad donde tanto la OTA-BSA como la BSA han quedado previamente inmovilizadas sobre la superficie del microchip, se estudian las diferentes reacciones de afinidad, para ello se estudian tres aptámeros diferentes, uno de ellos es biotiniliado en el extremo 5’ y los otros dos sin biotinilar siendo de diferentes casas Estudio de superficies de biorreconocimiento de ocratoxina A en el desarrollo de una plataforma multisensora electroquímica para micotoxinas 29 comerciales pudiéndose así realizar una comparativa entre ellos y saber cuál presenta una mayor afinidad hacia la OTA. Para cada uno de los aptámeros se intentó estudiar las condiciones óptimas de trabajo para lograr una reacción de afinidad óptima. Los resultados se muestran a continuación: CONCENTRACIÓN (μM) TAMPÓN CAUDAL (μl min-1) T° (°C) RESULTADO (RU) AptOTA-bi (AptaRes) 5 SB 20 -24,9 5 BB 20 -0,6 5 BB 5 -2,1 5 BB 5 37 -29,3 AptOTA (IBA) 5 SB 20 -35,5 5 BB 20 -1,2 5 BB 5 -0,8 5 SB 2 37 -32,3 AptOTA (AptaRes) 5 SB 20 -42,7 5 BB 20 -2,0 5 BB 5 -0,7 5 SB 2 37 -70,5 5 BB 2 37 19,3 Tabla 2: Representación de la optimización de diferentes parámetros para diferentes aptameros mediante la técnica SPR. Vistos los resultados mostrados anteriormente se puede concluir que no hay ningún tipo de reconocimiento entre ninguno de los aptámeros estudiados con la OTA-BSA inmovilizada. Ninguno de los cambios realizados en las diferentes variables ha mejorado considerablemente el reconocimiento. Esto nos sirve para poder confirmar que el aptámero no es el elemento de biorreconocimiento adecuado para nuestro analito, por ello se decide continuar el estudio con un anticuerpo monoclonal específico de OTA. 3.3 ESTUDIO DE LA REACCIÓN DE AFINIDAD ENTRE LA OCRATOXINA A Y UN ANTICUERPO MONOCLONAL SOBRE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS: ESQUEMA DIRECTO En este apartado se va a llevar a cabo la optimización de todos los parámetros experimentales que pueden influir en la reacción de afinidad entre la OTA y un anticuerpo monoclonal específico y selectivo a esta molécula. Además se ha optimizado la reacción de competición entre la OTA y el conjugado enzimático OTA-HRP por los sitios libres de unión del anticuerpo monoclonal mediante la técnica espectrofotométrica ELISA. El esquema de trabajo planteado es un esquema directo competitivo usando la superficie sólida de las MBs funcionalizadas con proteína G (MBs-prG) para llevar a cabo la inmovilización del anticuerpo monoclonal. 30 Capítulo 3: Experimental 3.1.7 Materiales e instrumentación Tanto los materiales como la instrumentación requerida se indico previamente en el apartado 3.1.1, exceptuando el equipo de fluorescencia y de absorción molecular UV-Vis. 3.1.8 Reactivos y tampones Tampones  Tampón fosfato (PBS): HPO4-2/H2PO4- (0,1 M) y NaCl (0,138 M) pH=7,4  Tampón lavado (PBST): PBS con Tween20 (0,02% m/v) Reactivos generales  Superblock Blocking buffer (Thermo Scientifics)  NaCl (Scharlau, Barcelona, España)  Na2HPO4 (Sigma Aldrich)  NaH2PO4 (Scharlau, Barcelona, España)  3,3´,5,5´- Tetrametilbencidina, TMB (Sigma-Aldrich)  H2SO4 95% (Merck, Madrid, España)  Tween 20 (Sigma Aldrich) Reactivos de inmunoensayo  Partículas magnéticas Dynabeads protein G, MBs-prG (30 mg ml-1, Novex, Life Technologies, Oslo, Noruega)  Ocratoxina A (ACROS ORGANICS)  Anticuerpo monoclonal selectivo a OTA (DE 4, R-Biopharm)  Conjugado OTA-HRP (Europroxima, BN Arnhem, Bélgica) 3.1.9 Procedimiento experimental Se pretende llevar a cabo, en primer lugar, el estudio de la unión inespecífica de la OTA-HRP sobre las MBs-prG, donde tiene lugar la reacción de inmovilización del anticuerpo monoclonal (mAbOTA) , y en segundo lugar el estudio de la afinidad entre la OTA y OTA-HRP con el anticuerpo monoclonal específico de OTA inmovilizado previamente en la superficie sólida de dichas MBs-prG, por último se optimizará la reacción de competición entre la OTA y la OTAHRP por los sitios libres de unión del anticuerpo monoclonal inmovilizado Se usa la técnica ELISA espectrofotométrico para estudiar y optimizar dichas reacciones, tanto la unión específica como inespecífica. Para conseguir las condiciones adecuadas para que se produzca una afinidad óptima se llevó a cabo una serie de optimizaciones que se mostrarán a continuación. Estudio de superficies de biorreconocimiento de ocratoxina A en el desarrollo de una plataforma multisensora electroquímica para micotoxinas 31 El esquema de trabajo para el estudio de la unión específica es por tanto un esquema directo competitivo, MBs-prG-mAbOTA-(OTA/OTA-HRP) donde se llevan a cabo las siguientes etapas: -Inmovilización del anticuerpo monoclonal sobre las partículas magnéticas funcionalizadas con proteína G. -Etapa de competición entre OTA y OTA-HRP por los sitios libres del mAbOTA. -Etapa de revelado. -Medida espectrofotométrica a 450 nm. Entre las diferentes etapas se incluye una etapa de lavado de las partículas magnéticas para eliminar el exceso de reactivos que no hayan reaccionado El protocolo de trabajo para ambos estudios de especificidad se muestra en el Anexo V. 3.1.10 Resultados y discusión: Comparativa unión específica e inespecífica. En primer lugar se estudió, como se indicó en el punto anterior, la posible unión inespecífica de las MBs-prG con la OTA-HRP con y sin competición con la OTA y compararlo con la unión específica que existe con la MBs-prG-mAbOTA en la misma situación anterior. Figura 25: Resultados experimentales de absorbancia ELISA. Estudio de unión inespecífica 8, 33 µl de MBsprG, 25 µl OTA-HRP y 25 µl OTA (300 mg/l) o 25 µl de tampón PBS. Estudio de unión específica 8, 33 µl de MBsprG-mAbOTA, 25 µl OTA-HRP y 25 µl OTA (300 mg/l) o 25 µl de tampón PBS. Tiempo competición= 30 min. A la vista de los resultados recogidos en la figura 25 se puede observar la elevada reacción de afinidad entre el anticuerpo monoclonal inmovilizado y el conjugado enzimático OTA-HRP. 38 Capítulo 4: Conclusiones 6313,1 RU y en el caso de la OTA-BSA es de 2698,4 RU por lo que se puede concluir que la BSA ha sufrido una mejor inmovilización sobre el chip. - Con las modificaciones llevadas a cabo en el estudio de afinidad de los diferentes aptámeros no se consiguió obtener señales representativas por lo que se puede concluir que no hay ningún tipo de reconocimiento entre ninguno de los aptámeros estudiados con la OTA-BSA inmovilizada. - Esto nos sirve para poder confirmar que el aptámero no es el elemento de biorreconocimiento adecuado para nuestro analito. III) Estudio de la reacción de afinidad entre mAbOTA y OTA sobre partículas magnéticas: Esquema directo. - Elevada unión específica entre mAbOTA y la OTA/OTA-HRP y despreciable unión inespecífica entre la OTA/OTA-HRP por las partículas magnéticas es ausencia de elemento de biorreconocimiento. - Se ha llevado a cabo la optimización de las condiciones de trabajo para el inmunoensayo competitivo directo entre OTA y OTA-HRP con ELISA espectrofotométrico, las condiciones óptimas son: 1. mAbOTA de concentración 5 mg l-1, que es la estequiométrica respecto a la cantidad de partículas magnéticas, teniendo en cuenta su capacidad de unión. 2. La cantidad de MBs-prG-mAbOTA es de 25 μg. 3. La dilución de 1/1 de OTA-HRP para poder competir con un rango de concentración de OTA entre 0,01-100 ng ml-1 4. La sensibilidad del inmunosensor en las condiciones óptimas anteriores fue: IC50 de 1,357 ng ml-1 y la sensibilidad es de -0,6978 ml ng-1 de OTA. Como conclusiones generales relevantes se quiere remarcar que el uso de AptOTA no es viable como elemento de biorreconocimiento debido a su elevada unión inespecífica, no suficiente unión especifica y al bajo porcentaje de inmovilización de la OTA sobre las diferentes partículas magnéticas con grupo amino terminal. El aptámero no es capaz de reconocer a la OTA y esto puede ser debido a que no es capaz de plegarse adecuadamente sobre el analito, indicando como inconveniente el bajo peso molecular de la OTA. Por todo lo anterior indicar que el anticuerpo monoclonal sí que es considerado como un elemento de reconocimiento óptimo, mediante el esquema directo donde es inmovilizado sobre las MBs y es capaz de reconocer a la OTA donde ha quedado reflejado en todos los ensayos realizados, muestra una elevada unión específica y una baja unión inespecífica comportándose claramente como un ensayo competitivo donde a mayor concentración de analito se obtiene señales medidas menores. Anexos ANEXO I. PROTOCOLOS DE TRABAJO CON M-270, M-280, C1 Y T1 POR ELISA A continuación se recogen los tampones específicos necesarios para trabajar con eaMBs (M270, M-280, C1 Y T1): Tampón A: 5 mM Tris –HCl, 0,5 mM EDTA, 1M NaCl, pH 7,5. Tampón B: 10 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2, pH 8,5. Tampón C: 10 mM PBS, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2 pH 7. Tampón D: 10 mM PBS, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2, Tween 20 (0,1%) pH 7. Tampón E: 10 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2, Tween 20 (0,1%) pH 8,5. Tampón F: 10 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2, pH 6,5. 1º Inmovilización AptOTA sobre las diferentes eaMBs (para ello se tiene en cuenta la capacidad de unión de cada una de ellas por el oligonucleótido): 1. Agitar 5 minutos las eaMBs y se toma la cantidad deseada (50 µl, 10 mg/ml). 2. Lavar con tampón B, 3 lavados. 3. Añadir la cantidad requerida de AptOTA-bi 4. Para M-270 y M-280: 100 µl (1 µM) en tampón B. 5. Para C1: 250 µl (1 µM) en tampón B 6. Para T1: 200 µl (1 µM) en tampón B (Estas cantidades son en función de la capacidad de unión de las eaMBs). 7. Incubación 10-15 minutos con agitación a temperatura ambiente. 8. Colocar en el separador magnético. 9. Lavar con tampón B, 3 veces. 10. Adición de biotina (100 ppm) en tampón B. 11. Incubación durante 30 minutos con agitación suave, constante y a temperatura ambiente. 12. Lavar 3 veces con tampón B. 13. Re-suspender en 500 µl con tampón B y almacenar a 4 ° C hasta su uso. Una vez que el aptámero ha sido inmovilizado sobre las partículas se lleva a cabo el siguiente protocolo de trabajo: 14. Añadir de 300 µl de tampón de bloqueo libre de proteína en cada pocillo durante 60 minutos. 15. Eliminar el tampón de bloqueo En diferentes eppendorfs (uno por cada experiencia). 16. Adición de un volumen fijo eaMBs--5´-biAptOTA de cada una de las diferentes partículas. 17. Lavado de las eaMBs--5´-biAptOTA con tampón B. Anexos 18. Añadir concentraciones diferentes del conjugado enzimático OTA-HRP según la experiencia o de tampón B en su defecto. 19. Incubación de la OTA-HRP durante 30 minutos con agitación suave, constante y a temperatura ambiente. 20. Lavar dos veces con tampón D 21. Lavar una vez con tampón C 22. Re-suspender en 30 µl de tampón F. 23. Colocar en cada pocillo de la placa ELISA 10 µl de partículas. 24. Añadir 50 µl de TMB. 25. Reacción durante 20 minutos con agitación suave constante y a temperatura ambiente. 26. Adición 50 µl H2SO4 0,5 M que actúa como reactivo de parada entre la HRP y el TMB. 27. Medir el valor de absorbancia en el lector ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Anexos ANEXO II. PROTOCOLOS DE TRABAJO CON MBs-NH2 POR ELISA A. MBs-NH2 (nanomyp) A continuación se recogen los tampones específicos necesarios para trabajar con MBs-NH2 (nanomyp): Tampón G: 50 mM MES pH= 6. Tampón H: 5 mM Tris-HCl pH= 7.5, 0.5 M EDTA, 1 M NaCl. Tampón I: 40 mM Tris pH= 7. Tampón B: 10 mM de Tris-HCl pH 8.5, 120 mM de NaCl, 5mM de KCl y 20 mM de CaCl2. 1º Inmovilización aptOTA sobre las diferentes eaMBs (para ello se tiene en cuenta la capacidad de unión de cada una de ellas por el oligonucleótido): 1. Agitar 5 minutos las MBs y se toma la cantidad deseada (17,9 µl, 28 mg/ml, 500 µg). 2. Lavar con tampón G dos veces. 3. Añadir la cantidad calculada de OTA o en su defecto adicionar tampón G (según estudio de especificidad). 4. Añadir 100 µl de EDC de concentración 10 mg/ml en agua milli-Q. 5. Añadir tampón G hasta un volumen final de 500 µl. 6. Incubación durante 3 horas con agitación suave, constante y a temperatura ambiente. 7. Colocar en el separador magnético. 8. Lavar dos veces con tampón I durante 10 minutos. 9. Re-suspender en 500 µl con tampón B y almacenar a 4 ° C hasta su uso Una vez que la OTA ha sido inmovilizado sobre las partículas se lleva a cabo el siguiente protocolo de trabajo: 10. Añadir de 300 µl de tampón de bloqueo libre de proteína en cada pocillo durante 60 minutos. 11. Eliminar el tampón de bloqueo 12. Añadir en los pocillos de la placa ELISA 5 µl de MBs-NH2-OTA o MBs-NH2 (5 µg). 13. Lavar con tampón B dos veces. 14. Añadir en cada uno de los pocillos 100 µl de las concentraciones deseadas de AptOTAbi o en su defecto tampón B (según estudio de especificidad). 15. Incubación durante 30 minutos con agitación y a temperatura ambiente. 16. Lavar con tampón H dos veces. 17. Añadir 100 µl de la disolución eaHRP 1:10000 en tampón H. 18. Incubación durante 30 minutos con agitación suave, constante y a temperatura ambiente. 19. Lavar con tampón H dos veces. 20. Añadir 50 µl de TMB 21. Reacción durante 20 minutos con agitación suave, constante y a temperatura ambiente. Anexos 22. Adición 50 µl H2SO4 0,5 M que actúa como reactivo de parada entre la HRP y el TMB. 23. Medir el valor de absorbancia en el lector ELISA a una longitud de onda de 450 nm. B. MBs-NH2 (M-270, Dynal) A continuación se recogen los tampones específicos necesarios para trabajar con MBs-NH2 (Dynal M-270 ): Tampón K: 0,1 M MES, 0,5 M NaCl pH= 6. Tampón J: 10 mM HEPES pH 7, 120 mM NaCl, 5mM KCl y 5 mM MgCl2. Tampón L: 10 mM de HEPES pH 7, 120 mM NaCl, 5mM KCl y 5 mM MgCl2, Tween 20 (0,1%). 1º Inmovilización aptOTA sobre las diferentes eaMBs (para ello se tiene en cuenta la capacidad de unión de cada una de ellas por el oligonucleótido): 1. Agitar 5 minutos las MBs y se toma la cantidad deseada (10 µl, 30 mg/ml). 2. Lavar con tampón K dos veces. 3. Añadir la cantidad calculada de OTA en tampón K o en su defecto adicionar tampón K (según estudio de especificidad). 4. Añadir el volumen requerido de EDC (10 mg ml-1) o de EDC (10 mg ml-1) y de NHS (15 mg ml-1) en agua milli-Q. 5. Añadir tampón K hasta un volumen final de 500 µl. 6. Incubación durante 2 horas con agitación suave, constante y a temperatura ambiente. 7. Colocar en el separador magnético. 8. Eliminar el sobrenadante y añadir si es preciso 500 µl de NH2OH (10 mM) 9. Incubación durante 15 minutos con agitación a temperatura ambiente 10. Lavar con tampón L durante 5 minutos cuatro veces. 11. Re-suspender en 500 µl con tampón L y almacenar a 4 ° C hasta su uso. Una vez que las partículas magnéticas están preparadas, tanto habiendo inmovilizado OTA como únicamente habiendo sido acondicionadas se lleva a cabo el siguiente protocolo de trabajo: 12. Añadir de 300 µl de tampón de bloqueo libre de proteína en cada pocillo durante 60 minutos. 13. Eliminar el tampón de bloqueo. 14. Añadir en los pocillos de la placa ELISA el volumen requerido de MBs-NH2-OTA o MBsNH2 (5 µg). 15. Lavar con tampón J dos veces. 16. Añadir en cada uno de los pocillos 50 µl de concentraciones crecientes de AptOTA-bi (0; 0,02; 0,2 y 0,5 μM) o en su defecto tampón J (según estudio de especificidad). 17. Incubación durante 30 minutos con agitación suave, constante y a temperatura ambiente. 18. Lavar con tampón L dos veces. Anexos 19. Añadir 50 µl de la disolución eaHRP 1:100000 en tampón J. 20. Incubación durante 30 minutos con agitación suave, constante y a temperatura ambiente. 21. Lavar con tampón J dos veces. 22. Añadir 50 µl de TMB 23. Reacción durante 20 minutos con agitación suave, constante y a temperatura ambiente. 24. Adición 50 µl H2SO4 0,5 M que actúa como reactivo de parada entre la HRP y el TMB. 25. Medir el valor de absorbancia en el lector ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Anexos ANEXO III. PROTOCOLOS DE TRABAJO CON MBs-NH2 POR FLUORESCENCIA A. MBs-NH2 (nanomyp) y MBs-NH2 (M-270, Dynal) A continuación se recogen los tampones específicos necesarios para trabajar con MBs-NH2: Tampón G: 50 mM MES pH= 6. Protocolo de trabajo: 1. Preparación de las diferentes concentraciones de OTA en tampón G 2. Realizar medida por fluorescencia. 3. Preparación de las diferentes concentraciones de OTA + 100 μl de 10 mg ml-1 de EDC en tampón G. 4. Activación durante 30 minutos a temperatura ambiente. 5. Realizar medida por fluorescencia. 6. Inmovilizar la OTA o OTA + EDC sobre las partículas magnéticas según el protocolo de trabajo indicado en el ANEXO 2 apartado A. 7. Una vez terminada la incubación eliminar el sobrenadante y realizar medidas por fluorescencia. Anexos ANEXO IV. PROTOCOLOS DE TRABAJO CON MBs-NH2 POR ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR UV-VIS A. MBs-NH2 (nanomyp) y (M-270, Dynal) A continuación se recogen los tampones específicos necesarios para trabajar con MBs-NH2 : Tampón J: 10 mM de HEPES pH 7, 120 mM de NaCl, 5mM de KCl y 5 mM de MgCl2. Protocolo de trabajo: 1. Preparación de las alícuotas de AptOTA-bi y AptOTA en tampón J de la concentración requerida. 2. Medida por espectroscopía de absorción UV-Vis en el máximo de absorción. 3. Guardar alícuotas para su posterior uso. 4. Tomar 30 µl de MBs-NH2-OTA o de MBs-NH2 en diferentes eppendorfs. 5. Lavar con tampón J dos veces 6. Añadir a cada eppendof 500 µl de AptOTA-bi y AptOTA 7. Incubar durante 15 minutos con agitación suave, constante y a temperatura ambiente. 8. Medir el sobrenadante por absorbancia en el máximo. 9. Fitrar el sobrenadante mediante filtros de 0,22 μm. 10. Medir el sobrenadante por absorbancia en el máximo. Anexos ANEXO V. PROTOCOLOS DE TRABAJO EN INMUNOENSAYOS POR ELISA 1º Inmovilización mAbOTA sobre MBs-prG (para ello se tiene en cuenta la capacidad de unión, 8 μg de mAbOTA por mg de MBs-prG): 1. Adicionar 10 µl (300 µg) de partículas magnéticas MBs-prG mouse. 2. Lavar 2 veces con 500 µl de tampón PBST y 1 vez con 500 µl de tampón PBS. 3. Se adiciona 500 µl de anticuerpo (MAbOTA)mouse de la concentración precisa, en el caso de estudiar la unión inespecífica se añade 500 µl de PBS. 4. Se realiza la incubación durante 10 minutos en agitación y a temperatura ambiente. 5. Lavar 2 veces con 500 µl de tampón PBST y 1 vez con 500 µl de tampón PBS. 6. Una vez inmovilizado el anticuerpo sobre las MBs-aIgG y resuspendido en tampón PBS es requerido su almacenamiento 4ºC. Una vez que las partículas están modificadas con el mAbOTA (unión específica) o simplemente han sido acondicionadas (unión inespecífica) se lleva a cabo el siguiente protocolo de trabajo: 1. Bloquear la placa ELISA 3 veces x 300 µl de Superblock Blocking buffer. 2. Añadir un volumen fijo de MBsprG-mAbOTA o de MBsprG. 3. Añadir concentraciones diferentes de OTA-HRP según la experiencia (y OTA si es una experiencia competitiva) 4. Tiempo de reacción de competición de 30 minutos (excepto en el caso del estudio de los tiempos de competición ya que fueron a 15, 30 y 60 min) con agitación constante. 5. Eliminar sobrenadante 6. 2 lavados con PBST y 1 lavado de PBS 7. Añadir 50 µl de TMB 8. Reacción durante 20 min. 9. Adición 50 µl H2SO4 0,5 M que actúa como reactivo de parada entre la HRP y el TMB. 10. Medir el valor de absorbancia en el lector ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Referencias Bibliográficas REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] J. W. Bennett, M. Klich, Clinical Microbiology Reviews 2003, 16(3), 497-+. [2] V. Sirot, J.-M. Fremy, J.-C. Leblanc, Food and Chemical Toxicology 2013, 52, 1-11. [3] FAO, Food and Agriculture Organization. [4] L. B. Juan C. Vidal, Alba, S. H. Ezquerra, Juan R Bertolin,, Carlota, J. R. C. Cubel, Biosensors and Bioelectronics 2013. [5] EMAN, European Mycotoxin Awareness Netwoek, http://www.mycotoxins.org. [6] J. L. Richard, International Journal of Food Microbiology 2007, 119(1-2), 3-10. [7] M. M. Ngundi, L. C. Shriver-Lake, M. H. Moore, M. E. Lassman, F. S. Ligler, C. R. Taitt, Analytical Chemistry 2005, 77(1), 148-154. [8] M. A. Fernandez-Baldo, F. A. Bertolino, G. A. Messina, M. I. Sanz, J. Raba, Talanta 2010, 83(2), 651-657. [9] H. Xiao, S. Madhyastha, R. R. Marquardt, S. Z. Li, J. K. Vodela, A. A. Frohlich, B. W. 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