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UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA. FACULTAD DE CIENCIAS EFECTOS DE LA ADIPONECTINA EN LA HOMEOSTASIS DE LOS CARBOHIDRATOS MASTER EN BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR REBECA LOPEZ PEREZ Director: Dr. Jose Miguel Arbones Mainar Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud. Unidad de Investigación Traslacional Hospital Universitario Miguel Servet. 2 3 INDICE Índice 3 Abreviaturas 5 1. Introducción 7 1.1. Obesidad y tejido adiposo 7 1.2. Estructura de la adiponectina 8 1.3. Modificaciones post-traduccionales 10 1.4. Regulación transcripcional de la adiponectina 11 1.5. Receptores 11 1.6. Mecanismos de acción de la adiponectina 12 1.7. Efectos fisiológicos de la adiponectina 13 1.8. Adiponectina y diabetes tipo 2 14 1.9. Vectores lentivirales 15 2. Objetivos 17 3. Metodología 19 3.1. Cepa bacteriana y vectores plasmídicos 19 3.2. Líneas celulares modelo 19 3.3. Medios de cultivo 20 3.4. Primers 21 3.5. Transformación de células E.coli 21 3.6. Extracción de los plásmidos 22 3.7. Cultivo celular y diferenciación 22 3.8. Clonajes 22 3.8.1. Subclonaje 22 3.8.2. Clonaje 23 3.9. Lentivirus 24 3.9.1. Producción de partículas lentivirales 24 3.9.2. Infección de las líneas celulares C2C12 y 3T3L1 24 4 3.10. Extracción de RNA total 25 3.11. RT-PCR y qPCR 26 3.12. Extracción de proteínas totales 26 3.13. Análisis de proteínas mediante SDS-PAGE y Western blot 26 3.13.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) 26 3.13.2. Transferencia de proteínas a la membrana e inmunodetección 27 3.14. Captación deoxi-D-Glucosa tritiada 28 3.15. -Oxidación 28 3.16. Tinción de la grasa de adipocitos 29 3.17. Análisis estadístico 29 4. Resultados 31 4.1. Obtención del plásmido de transferencia con el gen Adipoq 31 4.2. Subclonaje 31 4.3. Clonaje en el vector de transferencia 32 4.4. Lentivirus 33 4.4.1. Producción de partículas lentivirales 33 4.4.2. Infección de las líneas celulares C2C12 y 3T3L1 34 4.5. Sobreexpresión de adiponectina en 3T3L1-Adipoq y C2C12-Adipoq 35 4.6. Funcionalidad de la adiponectina 38 4.6.1. Secreción de complejos de adiponectina 38 4.6.2. Diferenciación líneas celulares 41 4.7. Implicaciones metabólicas de la sobreexpresión de Adipoq 42 4.7.1. Absorción de glucosa 43 4.7.2. Oxidación 44 4.7.3. Expresión génica 44 5. Discusión 47 6. Conclusiones 51 7. Bibliografía 53 5 ABREVIATURAS µCi Microcurio aa Aminoácidos ACC Acetil-CoA carboxilasa AMPK Proteína quinasa activada por AMP BMI Índice masa corporal: peso (Kg)/altura2(m2) BSA Albumina bovina sérica CPM Cuentas por minuto CPT-1 Carnitina palmitoil transferasa-1 DEPC Dietil pirocarbonato DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s medium Fas Acido graso sintasa FBS Suero fetal bovino G-6-Pase Glucosa 6 fosfatasa GST Glutatión transferasa IRS-1 Sustrato del receptor de la insulina-1 HIF-1 Factor inducible por hipoxia LB Medio Luria-Bertrani MAPK Proteína quinasa p38 activada por mitógenos mRNA Ácido ribonucleico mensajero PBS Tampón fosfato salino PCR Reacción en cadena de la polimerasa PEPCK fosfoenolpiruvato carboxiquinasa pI Punto Isoeléctrico PI3-K fosfatidil inositol 3 kinasa PKA Proteína kinasa A PPAR Receptor gamma activador de la proliferación de los peroxisomas RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción reversa 6 SDS Dodecil sulfato sodico TAE Tampon tris-acetato-EDTA TZDs Tiazoladinedionas 7 1. INTRODUCCION 1.1. OBESIDAD Y TEJIDO ADIPOSO La obesidad se define como la acumulación excesiva de grasa que puede ser perjudicial para la salud (OMS). De etiopatogenia multifactorial, en su inicio y desarrollo están involucrados factores de diverso tipo como son ambientales, genéticos, sociales y psicológicos (1). El parámetro más utilizado para cuantificar la obesidad es el índice de masa corporal (IMC, kg/m2), que se calcula dividiendo el peso del individuo en kilogramos entre la altura expresada en metros al cuadrado. Atendiendo a esta fórmula se definen distintos grados de obesidad. Diversos estudios epidemiológicos asocian la obesidad y el sobrepeso con un aumento de comorbilidades como enfermedades de las articulaciones, ciertos tipos de cáncer, diabetes de tipo 2 y enfermedad cardiovascular (1). En condiciones fisiológicas normales, el almacenamiento de lípidos se produce de una forma segura en el tejido adiposo. Sin embargo, en situación de obesidad, el tejido adiposo queda desbordado y este almacenamiento también se produce en otros órganos como el hígado y el músculo. Esto constituye un almacenamiento ectópico de grasa y puede estar asociado con lipotoxicidad debido al acúmulo de productos dañinos del metabolismo de lípidos, como ceramidas o diacilgliceroles (2) (3). Para investigar todos estos fenómenos hay que estudiar el tejido adiposo y comprender que el adipocito no es simplemente un “almacén” de ácidos grasos, sino que cumple importantes funciones en la homeostasis del organismo. Actualmente el tejido adiposo se considera un órgano endocrino que secreta un gran número de proteínas que intervienen en la regulación de procesos fisiológicos. En conjunto, estas proteínas se denominan adipoquinas y algunas de ellas son la leptina, resistina, adipsina y adiponectina (4). En esta última se centra nuestro estudio. Clasificación de IMC Insuficiencia ponderal Intervalo normal, normopeso Sobrepeso Obesidad clase I Obesidad clase II Obesidad clase III obesidad mórbida Tabla 1: Clasificación del IMC según la OMS 8 1.2. ESTRUCTURA DE LA ADIPONECTINA En humanos, el gen de la adiponectina (ADIPOQ) se localiza en el brazo largo del cromosoma 3, en el locus 3q27 y está formado por 3 exones y 2 intrones que se extienden a lo largo de 17 Kb (5). Este locus se ha asociado a diabetes tipo 2 (6). En ratón, el gen de la adiponectina (Adipoq) se localiza en el cromosoma 16. La adiponectina fue descubierta por Scherer y colaboradores en 1995 (7) y presenta una gran homología con subunidades de C1q y colágeno tipo VIII y X (7). En las primeras referencias sobre la adiponectina se describe su estructura, que consta de cuatro dominios (Fig 2): una secuencia señal en el extremo amino terminal que permite la secreción de la adiponectina, seguida de un dominio variable, un dominio colágeno y un dominio globular en su extremo carboxilo terminal (7). La proteína humana tiene 244 aa mientras que la de ratón tiene 247 aa. Estas pequeñas diferencias son debidas al dominio variable de la adiponectina (8). Figura 1: Tejido adiposo como órgano endocrino. El tejido adiposo secreta una gran número de proteínas que ejercen diversos efectos en el organismo (56) Figura 2. Dominios en la secuencia de adiponectina de ratón (18) 9 La adiponectina se sintetiza como un monómero y posteriormente se van ensamblando los distintos homocomplejos. En la circulación se observan trímeros (low-molecular weight, LMW), hexámeros (médium-molecular weight, MMW), y complejos formados por 12-18 unidades (high molecular weight, HMW) (8). Mediante microscopia electrónica, se puede apreciar que los trímeros presentan una cabeza globular seguida de un tallo de triple hélice y una esfera globular de menor tamaño en el extremo opuesto (9). Esta estructura se forma gracias a interacciones hidrófobas entre sus cabezas globulares e interacciones no covalentes entre los dominios colágenos que forman una triple hélice. La forma MMW, consta de dos dominios globulares triméricos adyacentes y un único tallo formado por dominios de colágeno. Se forma gracias a enlaces disulfuro entre dos trímeros (9). Estos enlaces disulfuro se forman entre residuos de cisteína localizados en el dominio variable (Cys36 en humano y Cys39 en ratón)(8). La eliminación o sustitución de este residuo impide la formación de estructuras superiores al trímero (8). Los complejos de orden superior, HMW, presentan gran heterogeneidad en cuanto al número de subunidades que los constituyen posiblemente debido a que el residuo cisteína importante para la multimerización se encuentra en la región variable en el extremo amino-terminal y esta región tiene muy baja homología entre especies(8). En esta multimerización participa la chaperona del retículo endoplásmico, ERp44 (10). ERp44 interacciona de forma covalente con la Cys36 y mantiene a la proteína en el retículo, para que sufra las correspondientes modificaciones postraduccionales. Una oxido-reductasa del retículo, Ero1L interviene en la formación de los enlaces disulfuro en adiponectina, también se une a ERp44 y compite con la adiponectina, lo que permite la su liberación (11). Otra oxido-reductasa que Figura 3: Representación esquemática de los multímeros de adiponectina (18) 16 17 2. OBJETIVOS La adiponectina presenta un papel clave en la homeostasis del organismo. El presente trabajo se centrará en profundizar sobre el efecto de la adiponectina en el metabolismo energético utilizando modelos in vitro con los siguientes objetivos: 1. A partir de su cDNA, se producirá un vector lentiviral capaz de aumentar la expresión de la adiponectina en diversos modelos. 2. Generar líneas celulares de los principales reguladores de la homeostasis energética (adipocitos y miocitos) que sobreexpresen adiponectina. 3. Estudiar los cambios metabólicos asociados a dicha sobreexpresión, especialmente los relacionados con el metabolismo de la glucosa y la resistencia a la insulina. 18 19 3. METODOLOGIA 3.1. Cepa bacteriana y vectores plasmídicos La cepa bacteriana utilizada para la amplificación de los distintos plásmidos fue la cepa DH5 de E.coli (INVITROGEN). Los plásmidos utilizados incluyen el gen de resistencia a ampicilina, lo que permitió su selección. El medio de cultivo utilizado para su crecimiento fue LB con una concentración de ampicilina de 0,1 mg/ml para la selección de las bacterias transformadas. Los vectores plasmídicos utilizados fueron:  pT7T3D-PacI /Adipoq. Es el vector comercial en el que se clonó el gen de la adiponectina, Mus musculus adiponectin (Harvard PlasmID #MmCD00310641)  pJET1.2/blunt (THERMO SCIENTIFICS). Utilizamos este vector para clonaje intermedio. Este plásmido se comercializa linealizado con extremos romos. Presenta la peculiaridad de que al recircularse sin inserto, expresa un gen letal que impide el crecimiento.  pWPXLd-IRES-PuroR es el vector de transferencia en el que realizamos el clonaje de la adiponectina. Se obtuvo a partir del vector comercial pWPXLd (Addgene #12258) al sustituir GFP por un casete de resistencia a puromicina.  psPAX2 (Addgene #12260) es el plásmido de empaquetamiento (packaging plasmid). Se trata de un sistema de empaquetamiento de segunda generación que en un único plásmido tiene los genes Gag, Pol, Rev y Tat.  pMD2.G (Addgene #12259) es el plásmido de envoltura (envelope plasmid). El gen Env se ha reemplazado por VSV-G, que codifica para la glicoproteína de membrana y que facilita que la infección se pueda llevar a cabo en diversos tipos celulares 3.2. Líneas celulares modelo  C2C12 es una línea celular de mioblasto de ratón utilizada como modelo de células musculares ya que, diferencia rápidamente y es capaz de formar miotubos contráctiles y producir proteínas características de músculo.  3T3L1 es una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón ampliamente utilizada por su capacidad de diferenciación a adipocitos. 20 3.3. Medios de cultivo  Medio cultivo 3T3L1 y 293T: DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium) alto en glucosa (4,5 g/L) , 1mM Piruvato de sodio, 4mM Glutamina, y 10% FBS (Fetal Bovine Serum)  Medio cultivo C2C12: DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium) alto en glucosa (4,5 g/L) , 1mM Piruvato de sodio, 4mM Glutamina, y 20% FBS (Fetal Bovine Serum)  Medio diferenciación 3T3L1 (500 µM IBMX+1.67 µM Insulina+ 1µM Dex+ 10% FBS en DMEM alto en glucosa)  Medio Insulina 3T3L1 (Insulina 1.67 M en 10% FBS DMEM alto glucosa)  Medio diferenciación C2C12 (2% Horse Serum en DMEM alto en glucosa)  Medio LB: medio de cultivo líquido de bacterias compuesto por 5 g/L de NaCl, 10 g/L de peptona y 5 g/L de extracto de levadura  Medio 2xTY, medio rico de cultivo utilizado para la recuperación de las bacterias transformadas. Compuesto por 5 g/L de NaCl, 16 g/L de peptona y 10 g/L de extracto de levadura  LB sólido, para el cultivo en placa de las bacterias, misma composición que LB líquido más 15 g/L de agar y 0,1 mg/ml de ampicilina 21 3.4. Primers Tabla 2. Lista primers utilizados 3.5. Transformación de las células E.coli La cepa de E.coli utilizada, DH5 ya posee competencia. El método de trasformación utilizado consiste en la incubación de las bacterias competentes con el DNA plasmídico resultante de la ligación durante 30 minutos en hielo. A continuación se les somete a un choque térmico que consiste en un minuto de incubación a 42oC y dos minutos en hielo. Tras ello se les añaden 125µl de medio 2xTY y se incuban durante una hora a 37oC con agitación. Después se extienden sobre placas de LB con ampicilina (0,1 mg/ml) y se deja toda la noche a 37oC. Los clones resistentes se inoculan en medio LB líquido con ampicilina (0,1 mg/ml) para el posterior aislamiento plasmídico. Nombre Secuencia Utilizado para mAdipoQ.PmeI-dir mAdipoQ.BamHI-rev pJET1.2 Forward pJET1.2 Reverse CHACHI-dir CHACHI-rev ActinB-dir ActinB-rev FASn-dir FASn-rev GLUT4-dir GLUT4-rev mACCalpha-dir mACCalpha-rev mAdiponectin-dir mAdiponectin-rev mCK-dir mCK-rev mMyf5-dir mMyf5-rev mPDK4-dir mPDK4-rev mCPT1b-dir mCPT1b-rev GTTTAAACTGGATCTGACGACACCAA GGATCCAAGTCGTTTAAATGAACAAG CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG GGGTACAGTGCAGGGGAAAG AGATCTCAAGCCTGCCACAC GGCTGTATTCCCCTCCATCG CCAGTTGGTAACAATGCCATGT GGCTCTATGGATTACCCAAGC CCAGTGTTCGTTCCTCGGA GTGACTGGAACACTGGTCCTA CCAGCCACGTTGCATTGTAG ATGGGCGGAATGGTCTCTTTC TGGGGACCTTGTCTTCATCAT GGAGATGCAGGTCTTCTTGG CGAATGGGTACATTGGGAAC CTGACCCCTGACCTCTACAAT CATGGCGGTCCTGGATGAT CTGCTCTGAGCCCACCAG GACAGGGCTGTTACATTCAGG AGGGAGGTCGAGCTGTTCTC GGAGTGTTCACTAAGCGGTCA GCACACCAGGCAGTAGCTTT CAGGAGTTGATTCCAGACAGGTA Clonaje Clonaje Clonaje Clonaje Clonaje Clonaje qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR qPCR 22 3.6. Extracción de los plásmidos. Los plásmidos se obtuvieron a partir de 7-9 ml de cultivo bacteriano utilizando el kit Gene Elute Plasmid Miniprep (SIGMA). La concentración de DNA plasmídico se determinó por absorbancia a 260/280 nm en el nanodrop 2000c de Thermo Scientific. 3.7. Cultivo celular y diferenciación La línea celular C2C12 se hizo crecer en medio DMEM suplementado al 20% con suero fetal bovino a 37oC y 5% CO2. Para inducir la miogénesis, el medio de cultivo utilizado fue DMEM suplementado al 2% con suero de caballo. Para la línea celular 3T3L1 se utilizó medio DMEM suplementado al 10% con suero fetal bovino a 37oC y 5% CO2. Para inducir la adipogénesis, el medio de cultivo utilizado era medio de diferenciación para 3T3L1 y tras dos días se cambiaba el medio por medio insulina para 3T3L1, que se mantenía durante dos días más. Tras ello, se seguía utilizando el medio DMEM al 10% en FBS. La línea celular 293T utilizada para la obtención de virus se hacía crecer en medio DMEM al 10% FBS. 3.8. Clonajes 3.8.1. Subclonaje Para la amplificación del gen de la adiponectina, Adipoq, se realizó una PCR a partir del plásmido original. Los primers utilizados para ello incorporan secuencias de reconocimiento para las enzimas PmeI en el primer directo (mAdipoQ.PmeI-dir) y BamHI en el reverso (mAdipoQ.BamHIrev). La PCR se realizo con la polimerasa de alta fidelidad Advantage HD Polymerase (CLONTECH), en el termociclador 2720 Thermo Cycler de Applied Biosystem. El programa de PCR utilizado fue de 30 ciclos de 10 segundos a 98oC, 10 segundos a 55 oC y un minuto a 72oC. El producto de amplificación tiene extremos romos. Tras electroforesis del producto de PCR en gel de agarosa, se extrajo la banda del gel y se purificó en columnas de sílice siguiendo el protocolo del kit GeneJET Gel Extraction (THERMO SCIENTIFIC). El producto de esta extracción se utilizó para llevar a cabo el clonaje intermedio en el plásmido pJET/blunt, utilizando T4 DNA ligasa (FERMENTAS) y una 23 incubación de 25 minutos a temperatura ambiente. Se llevo a cabo la transformación en E.coli DH5 y las colonias viables se crecieron en LB líquido con ampicilina. El plásmido pJET/Adipoq se obtuvo usando el kit GenElute Plasmid Miniprep (SIGMA). Para la comprobación de que el clonaje se había producido correctamente, realizamos una PCR con los primers pJET1.2 Forward y pJET1.2 Reverse. Estos primer flanquean el sitio de clonaje del plásmido pJET/blunt. Obtuvimos un amplicón de 1050pb correspondiente al inserto Adipoq en pJET/blunt. 3.8.2. Clonaje La digestión del plásmido pJET/Adipoq y del plásmido vector pWPXLd-IRES-PuroR se llevó a cabo mediante una doble digestión con las enzimas PmeI (FERMENTAS) y BamHI (SIGMA). Las condiciones de digestión fueron de 1 hora a 37oC y 20 minutos a 65oC para la inactivación de las enzimas. Los productos de digestión se separaron en gel de agarosa y fueron extraídos con el kit GeneJET Gel Extraction. Los fragmentos de DNA purificados se trataron con la enzima T4 DNA ligasa. La ligación se realizo a temperatura ambiente durante 3 horas. Posteriormente, con esa mezcla de ligación de transformaron las bacterias E.coli DH5. Para comprobar que el clonaje se había realizado correctamente, realizamos una PCR con los primers CHACHI-dir y CHACHI-rev, que amplifican la zona entre los sitios de corte de las enzimas PmeI y BamHI. Obtuvimos un amplicón correspondiente a la inserción de AdipoQ en pWPXLd-IRESPuroR. Para asegurarnos de que el clonaje se había realizado correctamente, llevamos muestras al Servicio de Secuenciación y Genómica Funcional del Centro de Investigación Biomédica de Aragón (CIBA). De las muestras secuenciadas, la que presentaba mayor correspondencia con las secuencias de las bases de datos de AdipoQ fue la que utilizamos para la producción de partículas virales. 24 3.9. Lentivirus 3.9.1. Producción de partículas lentivirales La línea celular 293T se sembró por duplicado a una densidad celular de 4·106 células/ml en placas de cultivo de 10 cm, el día anterior a la transfección. Dos horas antes de la transfección, se añadió a la línea celular 293T medio DMEM con una concentración de 25µM de cloroquina. La mezcla de transfección se preparó con el plásmido de transferencia (10µg), pWPXLd-IRES-puro para el control y pWPXLd-IRES-puro + Adiponectina, el plásmido de empaquetamiento (6,5µg) psPAX2, el vector de envoltura (3,5µg) pMD2.G e IBAFECT (60µl). Toda esta mezcla se lleva a un volumen final de 1 ml (completando con medio DMEM) y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de la transfección. La mezcla de transfección se añade a los cultivos de 293T y se deja incubando durante 8 horas a 37oC y 5% CO2. Pasado este tiempo, el medio de cultivo se sustituyó por DMEM alto en glucosa 10% FBS. A las 48 y 72 horas, se recogió el medio de cultivo, rico en partículas virales, y se centrifugó a 3000rpm durante 5 minutos. Este medio obtenido se pasa por un filtro de 0,22 µm y se reservó este medio que contenía los virus formados para la posterior infección. Los virus fueron conservados a -20oC. 3.9.2. Infección de las líneas celulares C2C12 y 3T3L1 El día anterior a la infección, se sembraron las líneas celulares C2C12 y 3T3L1 en placas de 10 cm y a unas densidades de 2000 células/cm2 y 2500 células/cm2 respectivamente. Para la infección, se utilizó 1ml del medio con virus más 9ml de medio de cultivo, al que se le añadió 80l de polibreno. Cada línea celular se infectó tanto con los virus control como con los virus que llevaban el gen de la adiponectina. Al día siguiente se retiró el medio con los virus y se sustituyó por medio normal con puromicina para la selección de las células infectadas. Las concentraciones de puromicina utilizadas fueron de 0,8 µg/ml en el caso de las C2C12 y 3 µg/ml para las 3T3L1. 25 3.10. Extracción de RNA total La extracción de RNA se realizó mediante el uso del reactivo TRI Reagent (TRIZol) (SIGMA), que permite la lisis de las células y la separación de los distintos componentes. A las placas con células se les añadió TRIZol (0,5 ml/10 cm), se recogieron en tubos eppendorf y posteriormente se les añadió cloroformo al 100% (0,2 ml/ml TRIZol), se incubó 15 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó 15 minutos a 12000G y 4oC. Así, se obtuvieron tres fases de la que se separó el RNA, contenido en la fase acuosa. Tras ello, se precipitó el RNA con isopropanol al 100% (0,5 ml/ml TRIZol) incubándolo 10 minutos en hielo y se centrifugó 15 minutos a 12000G y 4ºC. Tras retirar el sobrenadante, se hicieron lavados con etanol al 75% (1 ml/ml de TRIZol). Finalmente el RNA se resuspendió en agua con dietil pirocarbonato (DEPC) que actúa como inhibidor de ribonucleasas. El RNA se resuspendió en un volumen de 50-100 µl y se determinó su concentración midiendo la absorbancia a 260 nm. Tras ello se realizó un tratamiento con DNAsa (FERMENTAS), para eliminar posibles trazas de DNA contaminante. A 1 µg de RNA, se le añadió 1U de DNAsa y se incubó durante 30 minutos a 37oC. Para la inactivación de la DNAsa se utilizo EDTA y se incubo durante 10 minutos a 65 oC. Figura 7. Esquema temporal de las principales etapas de la transducción 32 4.3. Clonaje en el vector de transferencia La digestión del plásmido pJET/Adipoq y del plásmido vector pWPXLd-IRES-PuroR se llevo a cabo mediante una doble digestión con las enzimas PmeI y BamHI. Los fragmentos de DNA purificados se trataron con la enzima T4 DNA ligasa. Posteriormente, con esa mezcla de ligación se transformaron las bacterias E.coli DH5y se sembraron en un medio con ampicilina. Para comprobar que el clonaje se había realizado correctamente, se secuenciaron distintas colonias positivas (resistentes a ampicilina). De las muestras secuenciadas, la que presentaba mayor correspondencia con las secuencias de las bases de datos de Adipoq fue la que utilizamos para la producción de partículas virales. Figura 9.Clonaje en el plásmido de transferencia 33 4.4. Lentivirus 4.4.1. Producción de partículas lentivirales Se sembraron 4·106 de células 293T en placas de cultivo de 10 cm, el día anterior a la transfección. Esto se realiza por duplicado, ya que construimos dos tipos de partículas virales, las que incorporaban plásmido de transferencia pWPXLd-IRES-puroR como control y otro con la construcción con adiponectina. Dos horas antes de la transducción, se añadió a la línea celular 293T medio con cloroquina (25µM). La mezcla de transducción se prepara con el plásmido de transferencia (10µg de pWPXLd-IRES-puroR o pWPXLd-IRES-puroR/Adipoq), el plásmido de empaquetamiento (6,5µg) psPAX2, el vector de envoltura (3,5µg) pMD2.G e IBAFECT (60µl). Toda esta mezcla se lleva a un volumen final de 1 ml (completando con medio DMEM) y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de la infección. La mezcla de transducción se añade a los cultivos de 293T y se deja incubando durante 8 horas a 37oC y 5% CO2. Pasado este tiempo, el medio de cultivo se sustituyo por DMEM alto en glucosa 10% FBS. Dos días después, se recogió el sobrenadante y se centrifugo a 3000rpm durante 5 minutos. El sobrenadante obtenido (10 ml) se pasa por un filtro de 0,22 µm y se reservó este medio que contenía los virus formados para la posterior infección. A las 293T se les volvió a añadir medio (10 ml) y se repitió la operación de obtención de virus al día siguiente, agrupando los virus recogidos en ambos días (10 +10=20ml). Los virus fueron conservados a -20oC. Figura 10. Obtención de partículas virales 34 4.4.2. Infección de las líneas celulares C2C12 y 3T3L1 El día anterior a la infección, se sembraron las líneas celulares C2C12 y 3T3L1 en placas de 10 cm a unas densidades de 2000 células/cm2 y 2500 células/cm2 respectivamente. Para la infección, se utilizó 1 ml del medio con virus más 9 ml de medio de cultivo, y polibreno (8 g/ml). Cada línea celular se infectó tanto con los virus control como con los virus que llevaban el gen de la adiponectina. Al día siguiente se retiro el medio con los virus y se sustituyó por medio normal con puromicina para la selección de las células infectadas. Las concentraciones de puromicina utilizadas fueron de 0,8 µg/ml en el caso de las C2C12 y 3 µg/ml para las 3T3L1. Figura 11.Infección líneas celulares 35 4.5. Sobreexpresión de adiponectina en 3T3L1-Adipoq y C2C12-Adipoq Para comprobar la sobreexpresión de Adipoq en las líneas celulares transducidas, se aisló el RNA total de cultivos celulares, tanto de las líneas transducidas con el gen de Adipoq como con el plásmido control. A partir del RNA total libre de DNA y mediante retrotranscripción, se obtuvo un conjunto de cDNAs correspondientes con el transcriptoma de las líneas celulares. Para comprobar sobreexpresión de Adipoq, realizamos una qPCR utilizando los primers para el gen de la adiponectina. En la Fig12 se muestran la gráfica de amplificación de la qPCR para cada línea celular. Las líneas de color rojo se corresponden con las amplificaciones de muestras de las líneas celulares transducidas con el virus de Adipoq y las líneas verdes se corresponden a las transducidas con el virus control. Como podemos apreciar, en el caso de las 3T3L1, el ciclo al cual se supera el umbral de detección (Ct) en las muestras Adipoq es mucho menor que en el control, aunque el control también produce. En el caso de las C2C12, solo supera el umbral de detección la línea C2C12-Adipoq, ya que las C2C12 no producen adiponectina de forma constitutiva. Además de comprobar que se incrementaba la transcripción de adiponectina, comprobamos que se traducía y que se secretaba al medio. Para ello, realizamos una extracción de proteínas totales de las líneas celulares Adipoq y Control y también recogimos el medio de cultivo tras dos días de de incubación con las células. Con las muestras obtenidas realizamos electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Figura 12. Gráfica amplificación de PCR a tiempo real. El eje vertical representa la cantidad de fluorescencia y el eje horizontal el número de ciclos. 36 La línea celular 3T3L1 es una línea celular comprometida para diferenciarse a adipocitos. Como ya sabemos, la adiponectina es secretada por los adipocitos ya maduros pero no por preadipocitos (47). Para evaluar los efectos de nuestra transfección, realizamos extracción de proteínas tanto en estadio de preadipocito (no diferenciado) como de adipocito ya maduro (diferenciado). En la Fig 13 podemos apreciar como la línea celular 3T3L1-Control solo produce y secreta adiponectina en el estado de adipocito (2, 6) y no en estado de preadipocito (1,5). Sin embrago, la línea transducida con Adipoq produce y secreta adiponectina en ambos estadios (3, 4, 7 y 8) y en mucha más cantidad que el control. Hay que destacar que en el estadio de preadipocito, la mayor parte de la adiponectina se encuentra en el interior de las células, como podemos ver en el extracto de proteína citosólica (7) y que secretan solo una pequeña parte. En todos los casos, la señal producida es debida al monómero de adiponectina, ya que hemos sometido a las muestras a un tratamiento reductor y desnaturalizante. Para evitar posibles interferencias causadas por la adiponectina presente en el medio de cultivo, procedente del suero bovino con el que se prepara, también sometimos a electroforesis una muestra de medio sin haber estado en cultivo con células (9) y no se aprecia señal. Figura 13. Película de revelado tras 5 minutos de exposición de Western Blot de línea celular 3T3L1. Proteína secretada por 3T3L1-Control sin diferenciar (1), diferenciadas (2), secretada por 3T3L1-Adipoq sin diferenciar (3) y diferenciadas (4). Extracto de proteína total de 3T3L1-Control sin diferenciar (5), diferenciadas (6), proteína total de 3T3L1-Adipoq sin diferenciar (7) y diferenciadas (8). Medio de cultivo DMEM 10%SBF (9). PM: Marcador de pesos moleculares en kDa 37 La línea C2C12 crece con mucha rapidez y comienza a diferenciarse espontáneamente a miocitos, por lo que no hemos realizado análisis de la producción y secreción de adiponectina en estadio de fibroblastos, sino solo de miocitos. Analizamos la proteína secretada presente en el medio y la proteína total de los cultivos celulares. La línea C2C12 no produce adiponectina de forma constitutiva por lo que al transducir el gen Adipoq pretendemos producir una expresión ectópica de adiponectina. En la Figura 14 se muestra los resultados del Western realizado con las muestras de C2C12. En primer lugar hemos de destacar que el anticuerpo utilizado tiene reacción cruzada con la adiponectina de caballo presente en el medio de cultivo e interfiere parcialmente con la adiponectina secretada por las células. El tamaño del monómero correspondiente a la adiponectina de caballo es de un tamaño ligeramente inferior al de la adiponectina transducida, como puede verse al comparar la muestra de proteína citosólica de C2C12-Adipoq (7 y 8) y la señal en el medio (9). Esta ligera diferencia nos permite discernir entre la proteína secretada por C2C12Adipoq y la presente en el medio. C2C12-Control no presenta adiponectina en el citosol (5 y 6) y las señales que se aprecian en el exterior celular (1 y 2) presentan el mismo patrón que el medio (9). El patrón de bandas que encontramos en el medio de C2C12-Adipoq es distinto al del control, Figura 14. Película de revelado tras 5 minutos de exposición de Western Blot de línea celular C2C12. Proteína en medio de cultivo de C2C12-Control (1 y 2) y en medio de C2C12-Adipoq (3 y 4). Extracto de proteína total de C2C12-Control (5 y 6) y C2C12Adipoq (7 y 8) Medio de cultivo de diferenciación DMEM 2% Horse Serum (9). PM: Marcador de pesos moleculares en kDa 38 por lo que las bandas que difieren con el control son las correspondientes a la adiponectina secretada por esta línea celular. Estas diferencias las vemos destacadas en la Figura 15. Todas las señales de mayor intensidad se corresponden por tamaño con el monómero de adiponectina, sin embargo, puede observarse una señal muy tenue en las muestras 1, 2, 3, 4 y 9 en torno a 50 KDa que puede corresponderse con algún dímero de adiponectina que no se ha disociado completamente con el tratamiento desnaturalizante. 4.6. Funcionalidad de la adiponectina 4.6.1. Secreción de complejos de adiponectina La adiponectina se sintetiza como un único péptido, sin embargo, son los diferentes complejos de la adiponectina los que producen los efectos asociados a ella. Por lo tanto, para evaluar la funcionalidad de la adiponectina transducida, hemos de analizar la presencia de los diferentes complejos y su correcta secreción. Con esta finalidad, se recogió el medio de cultivo tras dos días en contacto con las diferentes líneas celulares y se realizó una electroforesis en gel de acrilamida (SDS-PAGE) pero sin condiciones reductoras para evitar la ruptura de los puentes disulfuro entre Figura 15. Ampliación Figura 14. 39 monómeros. Utilizamos un tampón de carga Laemmli buffer que no contenía el agente reductor -mercaptoetanol y omitimos el tratamiento previo de calentar a 95oC antes de someter las muestras a electroforesis. En los preadipocitos 3T3L1-Control (Figura 16, línea 1) no se observa la secreción de ningún complejo de adiponectina, resultado esperado ya que tampoco se observaba el monómero en condiciones desnaturalizantes. Una vez diferenciados, la línea celular 3T3L1-Control sí que secreta diversos complejos (Fig 16, línea 2), correspondientes con las formas LMW (trímero), MMW (hexámero) y algunos complejos de mayor tamaño correspondientes con formas de elevado peso molecular, pero con menor intensidad. La línea transducida 3T3L1-Adipoq, secreta adiponectina tanto en estadio de preadipocito (Fi16, línea 3) y de adipocito maduro (Fig 16, línea 4), pero con una clara diferencia entre ambos. Solo en estadio de adipocito maduro es capaz de secretar complejos superiores al trímero. También evaluamos la secreción de los distintos complejos en la línea C2C12 (Fig 17). Hemos de tener en cuenta nuevamente la adiponectina presente en el medio y procedente del suero de caballo. El patrón de bandas en C2C12-Adipoq difiere del control. El de C2C12-Control es similar al del medio de cultivo. Tanto en control como en Adipoq pueden apreciarse distintos complejos correspondientes con las formas de medio peso molecular (MMW) y las de bajo peso molecular (LMW). En el caso de C2C12-Adipoq pueden verse bandas adicionales al control que corresponden con complejos formados por la proteína transducida. Estas pequeñas diferencias las podemos ver en la Fig 21 que es una ampliación de la Fig 20. Figura 16. Análisis de los complejos de adiponectina que la línea 3T3L1. Película de revelado tras 5 minutos de exposición. Proteína secretada por 3T3L1-Control en estado de preadipocito (1) , en estado de adipocito (2), por 3T3L1-Adipoq en estado de preadipocito (3) y en estado de adipocito (4). Medio de cultivo 3T3L1 PM: Marcador de pesos moleculares en kDa 40 Como vemos, al transducir Adipoq en la línea C2C12 no solo se consigue que se produzca la proteína funcional, sino que además se formen y secreten complejos de adiponectina. Aunque en C2C12-Control y el medio de cultivo se observan las mismas bandas, difieren en cuanto a intensidad. En el medio, es más abundante la forma MMW y en C2C12-Control es más abundante la forma trimérica (LMW). Esto sugiere algún posible mecanismo de disociación de los complejos por parte de las C2C12. Figura 17. Análisis complejos adiponectina de C2C12. Película revelado tras 5 min exposición. Proteína secretada por C2C12-Control (1), por C2C12Adipoq (2), presente en el medio de cultivo (3) y extracto proteína citosólica C2C12-Adipoq (4). Figura 18: Ampliación Figura 17 41 4.6.2. Diferenciación líneas celulares Otras evidencias de la funcionalidad que la adiponectina transducida presenta, es su efecto en cuanto a la diferenciación de las líneas celulares. La adipogénesis es un proceso complejo en el que participan numerosos genes. Se caracteriza, entre muchas otras cosas, por la acumulación de lípidos en el interior celular. Esto puede apreciarse visualmente y también con ayuda de un colorante que se une de forma específica con los lípidos. Para valorar la diferenciación de los cultivos, realizamos una tinción con oil red O y visualizamos al microscopio. En la Fig 22 puede apreciarse como en los cultivos de 3T3L1-Adipoq se observan muchos más adipocitos que en el control. Para cuantificar los niveles de lípidos en cada línea celular realizamos una medida de absorbancia del colorante oil red O a 500nm directamente de las placas. Esto nos permite cuantificar el contenido lipídico en ambas líneas celulares. Figura 19: Tinción con oil red O de las líneas 3T3L1-Control y 3T3L1-Adipoq Figura 20: Absorbancia medida a 500nm directamente de las placas de cultivo de 3T3L1-Control y 3T3L1-Adipoq. p<0,00001 48 factores en la oxido-reductasa Ero1-LEsta oxido-reductasa media en la formación de enlaces disulfuro en los complejos de adiponectina. Ero1-Lestá regulada transcripcionalmente por PPAR, factor de transcripción implicado en el proceso de adipogénesis y que tiene su máximo nivel de expresión en adipocitos maduros. Esta es la primera vez que se describe que células musculares también son capaces del ensamblaje y secreción de complejos de adiponectina. Por lo tanto, se plantea la idea de que no solo los adipocitos dispongan de la maquinaria necesaria para el ensamblaje de los complejos de adiponectina y su caracterización debe ser motivo de estudios posteriores. No todos los complejos de adiponectina presentan la misma afinidad por sus receptores (31). AdipoR1 se expresa de forma mayoritaria en músculo y presenta mayor afinidad por los complejos de menor tamaño de la adiponectina (31). En un estudio sobre la mutación C39S en adiponectina y las implicaciones funcionales que esto tenía, se vió que la proteína mutada solo podía formar trímeros y que ejercía un efecto mucho mayor sobre el musculo que la forma wild-type (8). Así se demostró que la forma trimérica es la que mayor efecto ejerce sobre músculo. En relación a todo esto, nosotros hemos observado que los ratios entre hexámeros y trímeros presentes en suero de caballo se invierten tras estar en contacto con los cultivos celulares (Figura 17). El medio de cultivo utilizado con las C2C12, presenta mayores niveles de la forma MMW de caballo. Al dejar este medio en contacto con los cultivos de C2C12-Control, los niveles de MMW disminuyen y aumentan los de la forma LMW. Esto sugiere algún posible mecanismo de disociación de los complejos. El paradigma actual señala que una vez que los complejos se han secretado, estos no cambian en la circulación (8). Sin embargo un trabajo muy reciente hipotetiza que puede haber conversión entre oligómeros cerca de la superficie celular mediante mecanismos redox (55), de acuerdo con este último reporte nosotros proponemos la existencia en músculo de algún mecanismos de disociación que degrade los complejos de alto peso molecular de adiponectina y permita la interacción más específica del receptor con la forma trimérica. En la línea C2C12, pudimos observar las diferencias de tamaño que presentan los monómeros de caballo y los de la proteína transducida. Estas diferencias pueden ser debidas a variaciones en el dominio variable según la especie. El monómero de caballo presenta dos isoformas, probablemente debido a modificaciones postraduccionales y el monómero transducido presenta una única isoforma. Al analizar los complejos de adiponectina derivados de la transfección y los procedentes del suero de caballo, vemos que también hay diferencias en cuanto a movilidad. Los 49 complejos de adiponectina de caballo presentan menor movilidad que los de ratón, al contrario de los que sucede con los monómeros. Esto puede deberse a que los complejos formados en cada especie difieren en cuanto al número de subunidades, como ya se vio que sucedía entre humano y ratón (8) (18). En cuanto a las implicaciones metabólicas que presenta la sobreexpresión de adiponectina existen diferencias notables en función del tipo celular. La adiponectina ejerce un efecto paracrino en el tejido adiposo (37). Se ha visto que la sobreexpresión de adiponectina en este tejido provoca un incremento de la sensibilización frente a la insulina y un mayor acumulo lipídico. Hemos observado que la sobreexpresión de adiponectina en adipocitos provoca un notable incremento de los niveles de mRNA de Glut4. Sin embargo, esta sobreexpresión constitutiva de Glut4 no genera efecto ninguno en cuanto a la absorción de glucosa en ausencia de insulina. Es solamente en presencia de insulina, donde la absorción de glucosa en los adipocitos que sobreexpresan adiponectina es mucho mayor. Los efectos de adiponectina en cuanto a la sensibilización frente a insulina en adipocitos pueden venir determinados por la sobreexpresión de Glut4. En la línea C2C12 transducida, observamos que la adiponectina provoca una disminución en cuanto a los niveles de Glut4 y el efecto de sensibilización frente a la insulina es similar al control, por lo que en este modelo celular, no se aprecia un incremento en cuanto a los efectos de la insulina con respecto del control. Sin embargo, se ha descrito que la administración de adiponectina in vitro, aumenta el consumo de glucosa con respecto del control a corto plazo y produce una mayor sensibilización frente a la insulina en C2C12 (33). Esto revela un efecto dual de la adiponectina, por lo que se ha de tener en cuenta al proponer a la adiponectina como regulador de determinados desordenes metabólicos. Otro efecto derivado de la sobreexpresión de adiponectina es la variación en cuanto a transcripción de la piruvato deshidrogenasa quinasa (Pdk4). Pdk4 interviene en la regulación de la actividad de la piruvato deshidrogenasa, que cataliza la reacción del piruvato para dar Acetil-CoA. Pdk4 fosforila a la piruvato deshidrogenasa y la inactiva. En la línea celular C2C12, la sobreexpresión de adiponectina provoca una disminución de la transcripción de Pdk4. De esta forma el piruvato obtenido mediante la glucólisis puede transformarse en Acetil-CoA y permitir la obtención de energía mediante el ciclo de Krebs y posterior -oxidación. En 3T3L1 la sobreexpresión de adiponectina lleva a un incremento de Pdk4. Este hecho estaría impidiendo el paso de piruvato a Acetil-CoA. Ese piruvato puede convertirse en oxalacetato por acción de la 50 enzima piruvato carboxilasa. Tras ellos, la enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa puede convertirlo en fosfoenolpiruvato y así favorecer el proceso de gluconeogénesis. Esto parece ilógico en las condiciones de cultivo que nosotros hemos utilizado, ya que utilizamos un medio rico en glucosa y no tendría sentido que la célula invierta energía en sintetizarla. Sin embargo, en estas condiciones y con los efectos observados, creemos que en lugar del proceso de gluconeogénesis lo que se está favoreciendo es el proceso de gliceroneogénesis. Ambos procesos comparten muchos pasos, sin embargo, en la gliceroneogénesis, el producto final obtenido seria glicerol 3-fosfato y no glucosa. En este proceso interviene la enzima glicerol 3-fosfato deshidrogenasa, convirtiendo la dihidroxiacetona fosfato obtenida tras varias etapas de la gluconeogénesis, en glicerol 3-fosfato. Este glicerol 3-fosfato es utilizado como esqueleto para la esterificación de ácidos grasos y esto derivar en un mayor acúmulo lipídico como el observado en los adipocitos que sobreexpresan adiponectina. El efecto de incremento de la gliceroneogénesis en tejido adiposo ya se ha observado con los fármacos TDZ, agonistas del PPAR. Se ha visto que estos fármacos favorecen la expresión de la isoforma del tejido adiposo de la PEP-CK, incrementando la gliceroneogénesis. Dado que la adiponectina media la acción de estos fármacos (36), pudiera ser que no solo la PEPCK estuviera implicada en el incremento de la gliceroneogénesis, sino también la Pdk4. Por lo tanto, la sobreexpresión de Pdk4 estaría favoreciendo el acúmulo de lípidos observado en la línea 3T3L1-Adipoq y por tanto la diferenciación. En miocitos, la sobreexpresión de adiponectina provoca un incremento en la transcripción de Fas y ACC, ambas implicadas en la síntesis de lípidos. Sin embargo, la sobreexpresión de adiponectina en esta línea celular también incrementa la-oxidación, por lo que de producirse ambos efectos, se estaría dando un ciclo fútil que no es característico de miocitos. Una posible explicación a estas observaciones nos las pueden dar los mecanismos de regulación. La enzima ACC es regulada por fosforilación de AMPK, quien media en los efectos de adiponectina. La ACC fosforilada es inactiva, por lo que aunque se produzca una mayor transcripción, pudiera ser que se encontrara inactiva. Podemos resumir diciendo que la sobreexpresión de adiponectina presenta un efecto dual en función de la línea celular. Son necesarios más estudios para confirmar el potencial de esta combinación en el tratamiento de desordenes metabólicos, pero la utilización de vectores virales específicos de tejido presenta una gran potencial en el campo de la medicina regenerativa. 51 6. CONCLUSIONES  La adiponectina está implicada en el metabolismo de la glucosa y de los ácidos grasos y los vectores lentivirales son herramientas muy potentes para modificar la expresión de genes y el estudio de sus funciones metabólicas.  Contrariamente a lo descrito en la literatura, los miocitos son capaces de ensamblar y secretar los diferentes complejos de adiponectina.  La sobrexpresión de adiponectina produce un aumento de la diferenciación terminal de los adipocitos y miocitos, sin embargo sus efectos metabólicos dependen del tipo celular. 52 53 7. BIBLIOGRAFIA 1. Haslam DW, James WPT. Obesity. Lancet. 2005 Oct 1;366(9492):1197–209. 2. Summers S a. Ceramides in insulin resistance and lipotoxicity. Progress in lipid research. 2006 Jan;45(1):42–72. 3. Van Herpen N a, Schrauwen-Hinderling VB. Lipid accumulation in non-adipose tissue and lipotoxicity. Physiology & behavior. 2008 May 23;94(2):231–41. 4. Scherer PE. 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