Repositorio Institucional de Documentos

Trabajo Fin de Máster ESTUDIO DE ENFERMEDAD DE FABRY EN PACIENTES CON MIOCARDIOPATÍA HIPERTRÓFICA DE VENTRÍCULO IZQUIERDO JORGE JAVIER CEBOLLA SANZ Dr. Miguel Pocoví Mieras Dra. Pilar Giraldo Castellano DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR (FACULTAD DE CIENCIAS) 2013 1" ÍNDICE 1" ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 11 1.1. Antecedentes históricos ............................................................................ 11 1.2. Epidemiología ............................................................................................ 12 1.3. Genética molecular en la EF ..................................................................... 12 1.3.1.Mutaciones en el gen GLA ................................................................ 13 1.3.2.Correlación genotipo – fenotipo ......................................................... 14 1.3.3.La EF en las mujeres. Bases Genéticas y moleculares .................... 14 1.3.4.Estructura enzimática ........................................................................ 16 1.3.5.Fisiopatología de la EF ...................................................................... 16 1.4. Características clínicas ............................................................................. 17 1.4.1.Síntomas tempranos ......................................................................... 17 1.4.2.Afectación renal ................................................................................. 18 1.4.3.Afectación cerebrovascular ............................................................... 18 1.4.4.Afectación cardíaca ........................................................................... 19 1.5. Diagnóstico ............................................................................................... 19 1.5.1.Diagnóstico enzimático ...................................................................... 19 1.5.2.Diagnóstico genético ......................................................................... 20 1.5.3.Detección de productos de acúmulo ................................................. 20 1.5.4.Marcadores biológicos ....................................................................... 20 1.6. Tratamiento ............................................................................................... 21 1.6.1.Tratamiento enzimático sustitutivo (TES) .......................................... 21 1.6.2.Tratamiento por reducción de sustrato .............................................. 22 1.6.3.Tratamiento con chaperonas moleculares ........................................ 22 2. OBJETIVOS .................................................................................................... 24 3. MATERIALES Y METODOLOGÍA .................................................................. 27 3.1. Paciente y controles .................................................................................. 29 3.2. Estudio ecocardiográfico ........................................................................... 29 3.3. Extracción de sangre periférica ................................................................ 29 3.3.1. Cribado enzimático y genético en DBS sobre tarjeta con filtro tipo FTA ..................................................................................................... 29 2" 3.3.2.Estudios complementarios ................................................................ 30 3.4. Obtención de un concentrado de leucocitos a partir de sangre periférica 31 3.5. Aislamiento de DNA genómico ................................................................. 32 3.5.1.Procedente de muestra DBS sobre tarjeta tipo FTA ......................... 32 3.5.2.Procedente de muestra de sangre periférica .................................... 33 3.6. Aislamiento de RNA total .......................................................................... 33 3.7. Análisis de concentración, pureza y purificación de ácidos nucleicos ..... 34 3.7.1.Concentración y pureza del DNA genómico ...................................... 34 3.7.2.Concentración y pureza del RNA total .............................................. 34 3.7.3.Purificación del DNA genómico o del RNA total ................................ 35 3.7.4.Determinación de la integridad del RNA ........................................... 35 3.8. Determinación de la actividad enzimática ................................................. 36 3.8.1.En muestras de DBS sobre tarjeta tipo FTA ..................................... 36 3.8.2.En muestras de Plasma .................................................................... 37 3.8.3.EN concentrado de Leucocitos .......................................................... 38 3.9. Análisis molecular del gen GLA ................................................................ 40 3.9.1.Diseño, optimización y amplificación de fragmentos gen GLA .......... 40 3.9.2.Purificación de Producto de PCR ...................................................... 42 3.9.3.Reacción de secuenciación de Sanger combinada con electroforesis capilar. Análisis de secuencias ..................................... 43 3.9.4.Análisis de restricción. Identificación de variantes en el gen GLA .... 45 3.10. Análisis “in silico” de las variantes en zona promotora ........................... 46 3.11. Análisis de variantes de ayuste “splicing” alternativo ............................. 46 3.11.1.Análisis “in silico de las variantes de ayuste alternativo .................. 47 3.11.2.Síntesis de cDNA total ..................................................................... 47 3.11.3.Control de calidad de RT-PCR ........................................................ 48 3.11.4.Amplificación de cDNA específico de gen GLA ............................... 49 3.11.5.Caracterización electroforética de fragmentos de cDNA específico de gen GLA en geles de poliacrilamida .............................................. 20 3.12. Análisis estadístico ................................................................................. 51 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 54 4.1. Características de la muestra de estudio .................................................. 54 4.2. Valoración del estudio ecocardiográfico ................................................... 56 3" 4.3. Cribado enzimático en DBS sobre tarjeta FTA ......................................... 57 4.4. Análisis genético y descripción de variantes nucleotídicas identificadas . 61 4.4.1.Descripción de variantes nucleotídicas identificadas ........................ 63 4.4.2.Análisis de asociación en las variantes identificadas y la EF ............ 63 4.5. Caracterización de las nuevas variantes nucleotídica .............................. 68 4.5.1.Búsqueda de sitios de unión de factores de transcripción a la zona promotora circundante a la variante c.-34 c>t ..................................... 68 4.5.2.Análisis enzimático de las variantes c.-34 c>t y c.192 C>T (p.I64=) . 69 4.5.3.Caracterización mediante separación de fragmentos por electroforesis en geles de PAA al 6% de la variante c.192 C>T (p.I64=) ................................................................................................ 69 4.6. Haplotipos Complejos Intrónicos (HCI) identificados y combinaciones de éstos. Descripción y estudios complementarios ........................................ 70 4.6.1.Análisis enzimático ............................................................................ 72 4.6.2.Caracterización mediante separación de fragmentos por electroforesis en geles de PAA al 6% ................................................. 74 5. CONCLUSIONES ............................................................................................ 78 6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 80 Í 4" INDICE DE FIGURAS Figura 1.1.: Defecto enzimático de la EF. ............................................................. 11 Figura 1.2.: Estructura del gen GLA. ..................................................................... 12 Figura 1.3.: Expresión fenotípica del mosaicismo germinal del locus O-o en la capa de gatas carey. ............................................................................................. 15 Figura 1.4.: Estructura tridimensional de la enzima α-Gal A.. ............................... 16 Figura 1.5.: Angiokeratoma y “Cornea Verticillata”. .............................................. 18 Figura 3.1.: Modelo de tarjeta tipo FTA para recogida y envío de muestras. ....... 30 Figura 3.2.: Proceso de sonicado de leucocitos. ................................................... 39 Figura 4.1.: Distribución de Tipos de MHVI según sexos. ................................... 57 Figura 4.2.: Electroforésis en gel al 3% de agarosa de alta resolución para identificación de variantes en el gen GLA mediante RFLP’S. ............................... 62 Figura 4.3.: Caracterización electroforética en gel de PAA al 6% del cDNA de GLA de la variante c.192 C>T (p.I64=). ............................................................... 70 Figura 4.4.: Distribución de HCI y sus combinaciones según sexos. ................... 72 Figura 4.5. Distribución de HCI y sus combinaciones según tipo de MHVI .......... 72 Figura 4.6.: Caracterización electroforética en gel de PAA al 6% del cDNA de GLA en pacientes con HCI y combinaciones de éstas. ........................................ 75 5" ÍNDICE DE TABLAS Tabla 3.1.: Cebadores específicos para la amplificación de regiones de interés del gen GLA. ......................................................................................................... 11 Tabla 3.2.: Estequeometría para la amplificación por PCR de los diferentes amplicones del gen GLA. ..................................................................................... 41 Tabla 3.3.: Programas térmicos para amplificar por PCR los diferentes amplicones del gen GLA. ...................................................................................... 42 Tabla 3.4.: Estequeometría para la purificación del producto de PCR de los amplicones del gen GLA. ...................................................................................... 43 Tabla 3.5.: Estequeometría para la purificación del producto de secuenciación. . 44 Tabla 3.6.: Cebadores específicos para la amplificación de un fragmento del cDNA correspondiente al mRNA del gen ACTB. .................................................. 48 Tabla 3.7.: Estequeometría para la amplificación por PCR de un fragmento del cDNA correspondiente al mRNA del gen ACTB. .................................................. 49 Tabla 3.8.: Cebadores específico para la amplificación del cDNA correspondiente al mRNA del gen GLA. ............................................................... 49 Tabla 3.9.: Estequeometría para la amplificación por PCR del cDNA correspondiente al mRNA del gen GLA. .............................................................. 50 Tabla 3.10.: Reactivos para polimerización de PAA al 6%. .................................. 51 Tabla 4.1.: Características de los pacientes con MHVI distribuidos por centros participantes. ........................................................................................................ 54-55 Tabla 4.2.: Descripción de los tipos de MHVI según sexos. ................................. 56 Tabla 4.3.: Valores de actividad enzimática de muestras DBS en tarjeta tipo FTA de pacientes. ................................................................................................. 58 Tabla 4.4.: Resultados del cribado enzimático de muestra de DBS en tarjeta tipo FTA, según sexos. .......................................................................................... 59 Tabla 4.5.: Variantes nucleotídicas encontradas por resecuenciación del gen GLA. ...................................................................................................................... 61 Tabla 4.6.: Análisis de asociación genotípica y alélica en mujeres con MHVI y la EF. ......................................................................................................................... 66 Tabla 4.7: Análisis de asociación genotípica y alélica en varones con MHVI y la EF. ......................................................................................................................... 67 6" Tabla 4.8.: Factores de transcripción que potencialmente se unen a la secuencia consenso circundante a la variante c.-34 c>t. ..................................... 68 Tabla 4.9.: Haplotipos Complejos Intrónicos (HCI) de nuestra muestra. ............. 71 Tabla 4.10.: Distribución de HCI y combinaciones de éstos en nuestra muestra. 71 Tabla 4.11.: Actividades enzimáticas en plasma y extracto celular de leucocitos de individuos control. ............................................................................................. 73 Tabla 4.12.: Actividades enzimáticas en plasma y extracto celular de leucocitos de pacientes con HCI Tipo I, Tipo III y las combinaciones de éstos. ................... 74 7" ENLACES dbSNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/ ESP-NHLBI http://evs.gs.washington.edu/EVS/ Fabry Registry® https://www.lsdregistry.net/fabryregistry/ Fabry Outcome Survey® http://www.globaloutcomesurveys.com/ Gene http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ Gene Bank (NCBI/ NIH/NLM) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ HGMD http://www.hgmd.cf.ac.uk/ MatInspector http://www.genomatix.de/ Mutationtaster http://www.mutationtaster.org/ PDB http://www.rcsb.org/pdb/ OMIM http://www.omim.org/ Proyecto 1000 Genomas http://www.1000genomes.org/ RestrictionMapper http://www.restrictionmapper.org/ SSPNN http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html 14" G>T (p.D313Y) (22-24) en las que los diferentes grupos de investigación no unifican su criterio respecto al carácter patogénico o polimórfico de las mismas. 1.3.2. Correlación genotipo-fenotipo En la EF es difícil establecer una correlación entre el genotipo identificado con el fenotipo desarrollado debido entre otros motivos al carácter privado de algunas mutaciones, por lo que el desarrollo del fenotipo dependerá de cada mutación. Incluso la variabilidad fenotípica intrafamiliar, para individuos portadores de la misma mutación, es alta. Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, generalmente se asocia un fenotipo “clásico” a mutaciones que afectan al centro activo y/o a la estabilidad conformacional de la enzima, mientras que se asocia un fenotipo “atípico” a mutaciones alejadas del centro activo de la enzima o bien que desregulen la expresión de ésta. En este último fenotipo, la actividad residual de la enzima juega un papel importante en el retraso en la aparición de los síntomas de la EF. Con el conocimiento actual sobre el desarrollo natural de la enfermedad, se ha propuesto que resultaría más apropiado describir la EF como una enfermedad con amplio espectro de fenotipos clínicos heterogéneos y progresivos (25). 1.3.3. La EF en las mujeres. Bases Genéticas y moleculares En las enfermedades ligadas el cromosoma X las mujeres heterozigotas son descritas como portadoras. En la EF el término portador es erróneo, ya que las mujeres pueden no desarrollar sintomatología o bien la pueden presentar variando desde fenotipos clásicos a atípicos como lo harían los varones, incluso desarrollando más tarde que éstos la afectación de órganos como riñones y corazón (26-29). El hecho de que las mujeres no sean meras portadoras y presenten una amplia variabilidad fenotípica podría ser explicado por los mecanismos epigenéticos de compensación de dosis génica durante la fase embrionaria, en los que se inactiva de forma aleatoria el cromosoma X paterno o materno, fenómeno conocido con el nombre de “Lyonizacion” por ser descubierto por la Dra Mary F 15" Lyon (30). Un ejemplo visual (Figura 1.3.) de este fenómeno es la aparición del color naranja en la capa de las hembras felinas. El color naranja en esta especie está codificado por el locus O-o localizado en el cromosoma X; una hembra heterozigota para ese locus (Oo) expresará un fenotipo mosaico en su capa, con zonas naranjas y no naranjas. Figura 1.3.: Expresión fenotípica del mosaicismo germinal del locus O-o en la capa de gatas carey. La epigenética es un evento de regulación del DNA involucrado en la implementación del programa genético durante la vida de la célula; además no modifica la secuencia nucleotídica del DNA, es estable y heredable tanto en células somáticas como gaméticas. Los principales mecanismos de regulación epigenética son: a. Modificación covalente del DNA (Metilación): adición enzimática, por medio de metil transferasas, de un grupo metilo a la base nitrogenada de citosinas que preceden a guaninas (dinucleotidos CpG) principalmente, formando 5-metilcitosina e inactivando así la expresión génica. Es el principal mecanismo de regulación epigenética. b. Modificación covalente de Histonas (Deacetilación): eliminación enzimática, por medio de histona-deacetilasas de los grupos acetilo unidos a residuos de Lisina del extremo aminoterminal de alguna de las Histonas que intervienen en la formación del nucleosoma e inactivando así la expresión génica. 16" c. Ácidos Ribonucleicos (RNAs) no codificantes. 1.3.4. Estructura enzimática La estructura cristalina de la enzima (Figura 1.3.) se resolvió en el año 2004 (31) y se encuentra indizada en la base de datos PDB (http://www.rcsb.org/pdb/) con el código 1R46. La enzima se encuentra glicosilada y se plega formando homodímeros en los que en cada uno de los monómeros presenta 2 dominios. El dominio aminoterminal (residuo 32 al 328) es una estructura de barril de 8 αhélices/láminas-β que contiene el centro activo de la enzima; el domino carboxiterminal (residuo 329 a 421) es una estructura tipo sándwich β de 8 láminas-β antiparalelas. Figura 1.4.: Estructura tridimensional de la enzima α-Gal A. . 1.3.5. Fisiopatología de la EF Los glucoesfingolípidos son moléculas que forman parte de las membranas plasmáticas de las células de los tejidos del organismo. Puesto que el recambio de eritrocitos se produce con una elevada tasa, la degradación de sus membranas en los órganos del sistema retículo-endotelial por los monocitos 17" residentes en ellos, supone la principal fuente de glucoesfingolípidos. El glucoesfingolípido mayoritario en la membrana de los eritrocitos es la Globotetraosilceramida (Gb4) que será catabolizado por la enzima hexosaminidasa B a Globotriaosilceramida (Gb3). En la EF el defecto enzimático tiene como consecuencia el acúmulo de este glucoesfingolípido mayoritariamente, aunque también se pueden acumular otros como Galabiosilceramida (Ga2), Globotriaosilesfingosina (Lyso-Gb3) y antígenos sanguíneos del grupo B y P1. (32). 1.4. Características clínicas La afectación en la EF se puede producir a nivel multiorgánico o bien quedar afectado un solo órgano o tejido. 1.4.1. Síntomas tempranos La principal sintomatología que se presenta en los enfermos pediátricos son las “Crisis de Fabry”, que consisten en un dolor agudo y ardiente que comienza en las zonas distales de las extremidades irradiando hacia otras partes del cuerpo. No es el único síntoma característico de la infancia/adolescencia si no que también se reporta hipo o anhidrosis (escasez o falta de sudoración), lesiones dérmicas por aparición de una erupción cutánea (“angiokeratoma”) color burdeos en la zona de las nalgas zona inguinal y ombligo, opacidad corneal (“cornea verticillata”) y vasculopatía retinal (Figura 1.5.). Hacia la adolescencia y segunda década de la vida aparecen disfunciones renales, cerebrovasculares y cardíacas. 18" Figura 1.5.: Angiokeratoma y “Cornea Verticillata”. Imagen A: “Cornea Verticillata”. Imagen B: Angiokeratoma. Adaptado de Germain D.P. 1.4.2. Afectación renal El depósito de glucoesfingolípidos tiene lugar en todas las líneas celulares del riñón, tomando importancia los que se producen en podocitos y en el endotelio vascular del glomérulo. El síntoma inicial es la microalbuminuria y conforme avanza el progreso de los depósitos, y por tanto de la EF, se produce degeneración glomerular, exhibiendo albuminuria o proteinuira, glomeruloesclerosis y finalmente insuficiencia renal requiriendo transplante de riñón. 1.4.3. Afectación cardíaca El depósito de glucoesfingolípos se produce principalmente en endocardio y miocardio, además del endotelio de la red coronaria. Se ha comprobado que entre un 40-60% de pacientes con EF padecen algún síntoma cardíaco como hipertrofia de ventrículo izquierdo (HVI), alteraciones de la conducción, angor y disnea como consecuencia de la insuficiencia cardíaca debida a HVI (33). La disfunción diastólica y la HVI concéntrica son los rasgos característicos de la afectación cardíaca en la EF (34), aunque también se observa alteración electrocardiográfica, infarto de miocardio y en estadios finales insuficiencia cardíaca. 19" 1.4.4. Afectación cerebrovascular El depósito de glucoesfingolípos se produce principalmente en el endotelio vascular del sistema nervioso central por lo que las lesiones provienen fundamentalmente por fenómenos trombóticos cuya máxima gravedad se alcanza con el ictus. La prevalencia de del ictus en EF es mayor que en población general de la misma edad (datos de Fabry Registry® y Fabry Outcome Survey) (ver enlaces). 1.5. Diagnóstico La edad media de diagnóstico de la EF para varones es de 25,7±15,3 años, mientras que las para mujeres es de 31,3±17,4 años, con un retraso medio desde el diagnóstico hasta la aparición de síntomas de 12 años (35). Una vez se cuenta con la sospecha clínica es necesario confirmarla en el laboratorio. 1.5.1. Diagnóstico enzimático La actividad enzimática de α-Gal A se lleva a cabo en muestras de suero/plasma y leucocitos mediante el uso de un sustrato artificial (4metilumbeliferil-αD-Galactopiranósido) a pH de 4,6 (36); se incorpora NAcetilgalactosamina para inhibir la enzima α-Galactosidasa B (α-Gal B) responsable de casi el 20 % de la actividad en plasma y de casi el 10% en leucocitos. (37). Este método de diagnóstico es útil para detectar varones que respondan a un fenotipo clásico con un nivel de actividad residual bajo; en el caso de fenotipos con variantes atípicas o de pacientes heterocigotos, el método diagnóstico más apropiado es el análisis mutacional del gen codificante. Para estudios de cribado poblacional se han propuesto técnicas basadas en gota de sangre seca (DBS), detectando perfectamente varones con fenotipo clásico. 1.5.2. Diagnóstico genético 20" El análisis de la secuencia del gen GLA es el método de diagnóstico más eficaz, y resulta imprescindible para caracterizar a los pacientes heterocigotos. Con el método de Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) y Secuenciación Sanger combinada con electroforesis capilar, somos capaces de detectar el 90% de las mutaciones. El porcentaje restante requerirá de otro tipo de técnicas como puede ser “Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification” (MLPA) para estudio de grandes reordenamientos (38,39), PCR cuantitativa (qPCR) etc. (15). 1.5.3. Detección de productos de acúmulo El acúmulo de sustrato en la EF tanto en orina como en plasma es una característica común en muchos de los pacientes pero no en todos. A pesar de esto la determinación de los niveles de acúmulo permite ayudar en la confirmación de un diagnóstico e incluso ver la evolución de un tratamiento. La técnica más utilizada es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y varias formas de espectrometría de masas. Aunque el sustrato de acúmulo mayoritario es Gb3, se ha visto que Lyso-Gb3 está elevada en plasma de varones y de mujeres sintomáticas (40). 1.5.4. Marcadores biológicos Los biomarcadores son moléculas biológicas que se utilizan como indicadores de un proceso biológico; deben cumplir con una serie de requisitos como poderse medir de manera sencilla y objetiva, ser informativos y reflejar un estado fisiológico, patológico o de respuesta a tratamiento. Para la EF no hay buenos biomarcadores en plasma y orina constituyendo uno de los principales retos en la investigación básica. Los niveles Gb3 se incrementan en varones, pero en mujeres puede pasar desapercibidos. La determinación de niveles de Lyso-Gb3 se ha propuesto como un biomarcador interesante para el seguimiento del tratamiento enzimático sustitutivo (TES) (40). 1.6. Tratamiento 21" La síntesis de las primeras enzimas recombinantes humanes fue toda una revolución en el ámbito terapéutico, ya que antes de ese hito sólo se realizaban tratamientos paliativos de la enfermedad. Posteriormente aparecieron otras opciones de tratamiento a TES, algunas de ellas todavía hoy en diversas fases de ensayo clínico. 1.6.1. Tratamiento enzimático sustitutivo (TES) En este tipo de tratamiento la reducción de niveles de acúmulo de sustrato se produce por administración intravenosa (infusión) de la enzima recombinante. En el año 2001, la Agencia Europea del Medicamento aprobó, con fines terapéuticos, el uso de la enzima recombinante humana α-GAL A. En la actualidad existen 2 preparados comerciales, cuya eficacia está probada: • Algasidasa α (Replagal®, Shire HGT): producida a partir de líneas de fibroblastos humanos de la piel. Presenta una serie de características como: requiere dosis menores para lograr el mismo objetivo terapéutico (0,2 mg/Kg cada 2 semanas), el patrón de glicosilación es propio de líneas celulares humanas facilitando incorporación al citosol y eliminando problemas de inmunoreactividad. • Algasidasa β (Fabrazyme®, Genzyme-Sanofi): producida a partir de líneas celular de ovario de hámster chino. Presenta una serie de características como: requiere dosis mayores para lograr el mismo objetivo terapéutico (1 mg/Kg cada 2 semanas), el patrón de glicosilación es diferente de líneas celulares humanas dificultando en ocasiones la incorporación al citosol y con algún problema de inmunoreactividad. Para eliminar muchas de las limitaciones de TES es importante realizar un diagnóstico precoz de la enfermedad para comenzar cuanto antes el tratamiento. 1.6.2. Tratamiento por reducción de sustrato 22" En este tipo de tratamiento la reducción de niveles de acúmulo de sustrato se produce por la depleción de los niveles de ceramida, inhibiendo la enzima responsable de su síntesis (glucosilceramida sintasa). El producto utilizado en fase de ensayo clínico ha sido la NButildeoxinojirimicina (Zavesza®, Actelion Pharmaceuticals) sin demasiado éxito en la EF, aunque es usado a pesar de sus efectos gastrointestinales adversos en Enfermedad de Gaucher. 1.6.3. Terapia con chaperonas moleculares En este tipo de tratamiento la aproximación terapéutica consiste en la intervención del tráfico intracelular de la enzima desde el retículo endoplásmico hasta el lisosoma. La mayoría de mutaciones que tienen lugar en la EF son mutaciones puntuales generando proteínas anómalas que no son conformacionalmente estables y por tanto sufrirán degradación vía proteasoma sin que la enzima funcional llegue al lisosoma. Si esas proteínas conformacionalmente aberrantes fueran estabilizadas podrían llegar al lisosoma y mantener un cierto nivel de actividad enzimática. Basado en este concepto se han sintetizado imino azúcares cuya afinidad por el centro activo de la enzima es alta y permiten estabilizar formas de plegamiento intermedias. Para su aplicación se requiere de un análisis de caracterización de la mutación detectada en cada paciente para administrar la chaperona más idónea (aproximación farmacogenética). El producto que se está investigando en fase de 3 de ensayos clínicos es la 1Deoxigalactonojirimicina (DGJ) (Amigal™, Amicus). Esta mimetiza la αGalactosa de Gb3, estabilizando y facilitando el tráfico al lisosoma de la enzima defectuosa. 23" OBJETIVOS 30" delimitadas de las tarjetas tipo FTA Whatman nº 903 (REF. 535078, Whatman™, GE Healthcare™). (Figura 3.1.) Figura 3.1.: Modelo de tarjeta tipo FTA para recogida y envío de muestras. Tras depositar la sangre, se codificó apropiadamente la tarjeta para realizar estudios posteriores de forma anónima procediendo a su posterior secado durante dos horas a temperatura ambiente y humedad relativa ambiente. Finalizado el secado, las tarjetas se conservaron dentro de una bolsa de plástico de cierre hermético (eliminando el aire residual) a 4 ºC durante un período máximo de tres días hasta el momento de envío al laboratorio. 3.3.2.Estudios complementarios Todos aquellos pacientes que requirieron estudios complementarios para poder confirmar/completar/ampliar su diagnóstico, se les solicitó a las consultas externas de los diferentes centros que extrajeran 9 mL de sangre periférica en viales con K2EDTA (véase apartado 3.3.1. de este mismo capítulo). Se solicitaron también 5 mL de sangre periférica en viales PAXgene® Blood RNA tube (PreAnalitix™, Becton Dickinson™/Quiagen™) de 2,5 mL (metodología de extracción según recomendación del fabricante) para la estabilización del RNA total. 31" Las muestras complementarias se codificaron con el mismo código de paciente que se les asignó a las tarjetas de DBS para realizar todos los estudios posteriores de forma anónima. Se enviaron el mismo día de la extracción, mediante servicio de mensajería, manteniéndolas refrigeradas (no congeladas) durante el transporte. Una vez en el laboratorio: • Vial con 9 mL de sangre en K2EDTA: Se separó el plasma de las células sanguíneas mediante centrifugación a 2.000 x r.p.m. durante 10 minutos a temperatura ambiente en centrífuga Allegra® X-15R (Beckman Coulter™); la fase superior (plasma) se alicuotó convenientemente en microtubos de 1,5 mL (Daslab) previamente codificados que se conservaron a -80ºC para estudios posteriores. Se reconstituyó el volumen de plasma extraído añadiendo el mismo volumen de una solución de suero salino NaCl 0,9 % (p/v) estéril para evitar alterar la concentración de elementos celulares. De este reconstituido, se separó un volumen de 3 mL que se congeló a -20ºC para extraer DNA a posteriori, mientras que los otros 6 mL restantes se utilizaron para obtener un concentrado de leucocitos. • Vial PAXgene® Blood RNA tube (PreAnalitix™, Becton Dickinson™/Quiagen™) con 2,5 mL de sangre periférica: se congelaron a -20ºC y al día siguiente se almacenaron a -80ºC para procesarlos a posteriori. 3.4. Obtención de un concentrado de leucocitos a partir de sangre periférica El concentrado de leucocitos se obtuvo a partir de 6 mL de sangre periférica en viales K2EDTA, no congelada previamente y reconstituida con suero salino estéril (véase apartado 3.3.2. de este mismo capítulo). Para proceder con la separación por gradiente continuo de densidad se mezcló en una jeringa de 20 mL (Terumo®) los 6 mL de sangre reconstituida, con 5 mL de Dextrano al 6% (p/v) disuelto en suero salino estéril (PM = 282 g/mol; SigmaAldrich®); se homogeneizó suavemente por inversión el contenido. 32" Durante una hora y media se dejaron separar las diversas fases celulares por gravimetría. Pasado ese tiempo se recogió la fase superior “color pajizo” en un tubo de fondo cónico de 15 mL (TPP®), evitando tomar contenido de la fase “roja” del concentrado de hematíes. La fase recogida se centrifugó a 2.000 x r.p.m. durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se decantó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió con 1 mL de suero salino estéril; se añadió 5 mL de NH4Cl 0,83 % (p/v) disuelto en agua desionizada estéril, se homogenizó por inversión suave y se dejó incubar la muestra durante 5 minutos a temperatura ambiente. Pasado ese tiempo se centrifugó a 2.000 x r.p.m. durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se decantó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió con 5 mL de suero salino estéril, para después ser centrifugado 2.000 x r.p.m. durante 10 minutos a temperatura ambiente. El precipitado limpio de hematíes, se resuspendió en 2 mL de suero salino estéril y se dividió entre 2 microtubos de 1,5 mL. Para finalizar se centrifugaron los microtubos en una microfuga Eppendorf™ 5145C a 10.000 x r.p.m. durante 30 segundos a temperatura ambiente, se decantó el sobrenadante y los precipitados se congelaron a – 80ºC para estudios posteriores. 3.5. Aislamiento de DNA genómico 3.5.1.Procedente de muestra DBS sobre tarjeta tipo FTA El DNA genómico se obtuvo de gotas de sangre seca en tarjetas tipo FTA, aplicando protocolo modificado de la casa comercial proveedora de las tarjetas. Brevemente, mediante un troquel se obtuvo un disco de 3 mm de diámetro (Ø) impregnado de sangre seca que se depositó en un microtubo de 1,5 mL convenientemente codificado. Se le añadió 300 μL de agua ultrapura libre de DNAasas/RNasas (ddH2O) (Gibco®, Life technologies™), se homogeneizó con un pulso de vórtice, se dio un pulso de microfuga y se dejó incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Pasado ese tiempo se eliminó el sobrenadante mediante pipeteo y se repitió la operación 2 veces más. Finalizado el lavado del disco, se procedió a eluir el DNA genómico mediante lisis alcalina con 35 µL de la Solución 1 (0,1 N NaOH 0,3 mM EDTA pH = 13,0) 33" incubándolo 5 minutos a temperatura ambiente. Se neutralizó la lisis alcalina añadiendo 65 μL de la Solución 2 (0,1 M Tris-HCl pH =7,0), homogeneizando e incubándolo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó a 10.000 x r.p.m durante 30 segundos a temperatura ambiente y se recogió el sobrenadante (DNA genómico disuelto en 66mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA) con micropipeta para transferirlo a un microtubo de 0,5 mL (Daslab) convenientemente codificado. El DNA eluido se conservó, bien 3 días a 4ºC, bien 3 meses a -20ºC; para periodos de conservación más amplios se congeló a -80ºC. La tarjeta FTA se conservó en una bolsa de cierre hermético con un desecante a 4ºC para estudios posteriores.(10) 3.5.2.Procedente de muestra de sangre periférica El DNA genómico se obtuvo de sangre periférica reconstituida con suero salino fisiológico (véase apartado 3.3.2. de este mismo capítulo) tras descongelación a 4ºC. Se utilizó la batería de reactivos Nucleon Bacc 3 Genomic DNA extraction Kit® (Illustra™, GE Healthcare™) siguiendo las instrucciones del fabricante. El único reactivo no incluido en este kit fue Cloroformo (Carlo Erba) Al DNA genómico aislado, se le añadió un volumen variable de TE 1x (Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM pH = 8,0) en función del precipitado observado, y dejó hidratándose durante toda la noche en un agitador orbital. Una vez resuspendido se conservó a 4ºC para estudios a corto-medio plazo o se conservó a -20ºC para estudios a largo plazo. 3.6. Aislamiento de RNA total El RNA total se obtuvo a partir de sangre periférica en vial PAXgene® Blood RNA tube, tras descongelación a temperatura ambiente durante toda la noche. Se utilizó la batería de reactivos PAXgene® Blood RNA Kit (PreAnalitix™, Becton Dickinson™/Quiagen™) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para las etapas de centrifugado de tubos se utilizó la centrífuga refrigerada Eppendorf™ mod. 5810R, mientras que para las etapas de centrifugado de 34" microtubos/columnas/microtubos colectores se utilizó la microfuga refrigerada Ortoalresa mod. Digicen21R (Ortoalresa). Una vez eluida la columna, se procedió con lo especificado en el apartado 3.7. manteniendo las muestras sumergidas en baño de hielo. Finalmente se conservó el RNA total a -80ºC para estudios posteriores. 3.7. Análisis de concentración, pureza y purificación de ácidos nucleicos aislados (DNA genómico y RNA total) Los ácidos nucleicos, debido a las estructuras aromáticas de sus bases nitrogenadas, absorben radiación electromagnética en la zona del espectro del ultravioleta cercano (máximo de absorción λ = 260 nm) lo que permite determinar su concentración. Las proteínas, debido a la presencia de residuos aromáticos en su estructura, absorben en la zona del espectro del ultravioleta cercano (máximo de absorción λ = 280 nm) lo que permite determinar su concentración. Mediante el cociente Absorción a 260 nm/Absorción a 280 nm se determinó la pureza de los ácidos nucleicos aislados, considerándose valores aceptables, para posteriores ensayos moleculares, cuando el rango del cociente era de 1,8 a 2. Si no se superaban los criterios de pureza se procedía a su purificación. 3.8.1. Concentración y pureza del DNA genómico: El DNA genómico aislado y completamente rehidratado (véase apartado 3.5.2. de este mismo capítulo) se procedió a cuantificar su concentración y determinar su pureza mediante espectrofotometría de absorción ultravioleta con el espectrofotómetro NanoVue™ (GE Healthcare™) a λ = 260 nm y 280 nm. 3.8.2. Concentración y pureza del RNA total: El RNA total aislado (véase apartado 3.6. de este mismo capítulo) se procedió a cuantificar su concentración y determinar su pureza mediante espectrofotometría de absorción ultravioleta con el espectrofotómetro NanoDrop 2000C (Thermo Scientific) a λ = 260 nm y 280 nm. 3.8.3. Purificación del DNA genómico o del RNA total 35" Para purificar DNA genómico o RNA total, se añadió en un microtubo de volumen adecuado que contenía una alícuota de los ácidos nucleicos, 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M pH = 5,2 (Sigma - Aldrich®) y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -20ºC (Panreac™); se homogeneizó mediante agitación mecánica y se dejó precipitar durante 1 hora a -20ºC. Pasado ese tiempo se centrifugaron los microtubos en una microfuga a 13.500 x r.p.m. durante 20 minutos, eliminando posteriormente el sobrenadante por decantación. A continuación se procedió a lavar el precipitado con 500 µL de etanol 70 % (v/v) a -20 ºC, homogeneizándose por inversión suave. Se centrifugaron los microtubos a 13.500 x r.p.m. durante 20 minutos, eliminando el sobrenadante por decantación. Esta operación de lavado se repitió y el precipitado se desecó al aire hasta que se evaporaron las microgotas residuales de etanol. En el caso del precipitado a partir de DNA genómico: el precipitado se resuspendió en 50-100 µL de TE 1x (Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM pH = 8,0) y se dejó hidratando durante toda la noche en un agitador orbital. Al día siguiente se procedió a cuantificar y determinar su pureza (véase apartado 3.7.1. de este mismo capítulo). En el caso del precipitado a partir de RNA total: el precipitado se resuspendió en 30μL de ddH2O libre de DNAasas/RNAsas y se homogeneizó mediante pipeteo suave; se colocó en baño de hielo y se procedió a cuantificar y determinar su pureza (véase apartado 3.7.2. de este mismo capítulo). 3.8.4. Determinación de la integridad del RNA: La determinación de la integridad del RNA total aislado se llevó a cabo mediante una electroforesis durante 30 minutos a 90V (célula de electroforesis horizontal Wide mini-sub® cell GT, fuente de alimentación Power Pac™ 300; Bio-Rad) en gel de agarosa al 1% (p/v) (Ecogen) preparado con TAE 1x (TrisAcetato 40 mM EDTA 1 mM pH = 8,0) que contenía 0,5 µg/mL de Bromuro de Etidio (Sigma – Aldrich ®). En cada pocillo se añadieron 500 ng de RNA total y 2 µL de tampón de carga (azul de bromofenol), también se añadió 1 µL de marcador de bajo PM “Low DNA Mass Ladder” (Invitrogen®, Life technologies™). 36" El resultado se visualizó, revelando el gel en el tansiluminador Gel Doc™ 2000 (Bio-Rad). 3.8. Determinación de la actividad enzimática Se realizó determinación de actividad enzimática de α-Gal A en DBS sobre tarjeta tipo FTA para el cribado poblacional y en plasma y leucocitos de aquellos pacientes que los resultados de la secuenciación del gen GLA así lo requerían. 3.8.1. En muestras de DBS sobre tarjeta tipo FTA La determinación de la actividad de la enzima α-Gal A en DBS sobre tarjeta tipo FTA se realizó según protocolo descrito previamente (2) con pequeñas modificaciones. Brevemente, de cada tarjeta tipo FTA se extrajeron 2 discos de 3 mm Ø de la misma área (generando 2 réplicas), mediante el uso de un troquel. Cada uno de estos discos se colocó en un microtubo de 1,5 mL (correctamente codificado) y se les añadió 70 µL por disco de una mezcla de reacción que contenía: como sustrato específico fluorogénico de α-Gal A, 50 µL de una disolución 5 mM de 4-metilumbeliferil-α-D-Galactopiranósido (Sigma – Aldrich ®) en tampón 0,07 M citrato/ 0,15 M fosfato pH = 4,6 (Sigma – Aldrich ®) y disgregado por sonicación (B. Braun Labsonic®U, B. Braun Biotech. International) durante 1 minuto a 29W; y como inhibidor específico de αGalactosidasa B (α-Gal B), 20 µL de una disolución 0,25 M N-Acetil-DGalactosamina (Sigma – Aldrich ®) en agua desionizada estéril. La mezcla anterior se incubó a 37 ºC durante 20 horas en baño termostático seco con agitación (Thermomixer®, Eppendorf™) y protegido de la luz. La tarjeta FTA se conservó en una bolsa de cierre hermético con un desecante a 4ºC para estudios posteriores.(10) Transcurrido el tiempo de reacción, ésta se inhibió mediante la adición de 300 µL de Etilendiamina 0,1 M pH = 11 (Sigma – Aldrich ®) y posterior homogeneización con el vórtice y aplicación de un pulso de microfuga. La medida de fluorescencia, correspondiente al fluorocromo liberado por catálisis del sustrato específico fluorogénico inicial, se llevó a cabo en el sobrenadante. Éste se añadió en una cubeta de cuarzo Suprasil de 10 x 4 mm 37" de paso óptico (Hellma®) y se determinó la fluorescencia a λabsorción = 366 nm / λemisión = 445 nm mediante un fluorímetro LS-45 (Perkin Elmer®) y un filtro atenuador del 8%. Para poder determinar la cantidad de sustrato fluorogénico catalizado, se construyeron rectas de calibrado con 9 estándares del producto fluorogénico 4metilumbeliferona (Sigma – Aldrich®) cuyo rango era 0 - 0,5 nmoles. Como medida de calidad de nuestro laboratorio, se aceptaban rectas cuyo coeficiente de correlación R2 fuera ≥ 0,98 y se rehicieron éstas tras 5 determinaciones consecutivas con la misma recta. Como criterio de aceptación o no de un valor de actividad enzimática, se estimó que si el Coeficiente de Variación de las dos réplicas era ≥ 30%, la determinación debía repetirse. Si la misma muestra se repetía 3 veces el resultado de actividad enzimática era no aceptable y el paciente se diagnosticaba por análisis molecular del gen GLA. 3.8.2. En muestras de Plasma La determinación de la actividad de la enzima α-Gal A en plasma se realizó por duplicado, para cada muestra, añadiendo a un volumen de 100 µL de plasma diluido (½) con agua desionizada estéril, un volumen de 200 µL por réplica de una mezcla de reacción que contenía: como sustrato específico fluorogénico de α-Gal A, 100 µL de una disolución 8,75 mM de 4-metilumbeliferil-α-DGalactopiranósido en agua desionizada estéril y disgregado por sonicación posteriormente durante 1 minuto a 29W; y como tampón de reacción 100 µL de una disolución 0,2 M citrato / 0,4 M fosfato pH = 4,6 en agua desionizada estéril. La mezcla se incubó a 37 ºC durante 2 horas en baño termostático seco (Selecta P®) y protegido de la luz. El plasma restante se conservó a -80ºC para estudios posteriores. Transcurrido el tiempo de reacción, ésta se inhibió añadiendo el producto de reacción a tubos de polipropileno de 5 mL que contenían 2,5 mL de Glicina/NaOH 0,2 M pH = 11 (Sigma – Aldrich ®) y se homogenizó todo en el vórtice. 38" Para realizar la medida de fluorescencia se añadió todo el volumen anterior en una cubeta de cuarzo de 10 x 10 mm de paso óptico (Hellma®) y se determinó la fluorescencia a λabsorción = 366 nm / λemisión = 445 nm mediante un fluorímetro LS-45 y un filtro atenuador del 1%. Para poder determinar la cantidad de sustrato fluorogénico catalizado, se construyeron rectas de calibrado con 9 estándares del producto fluorogénico 4metilumbeliferona cuyo rango era 0 - 2 nmoles. Como medida de calidad de nuestro laboratorio, se aceptaban rectas cuyo coeficiente de correlación R2 fuera ≥ 0,98 y se rehicieron éstas tras 5 determinaciones consecutivas con la misma recta. 3.8.3. En concentrados de Leucocitos La determinación de la actividad de la enzima α-Gal A en leucocitos se realizó, según protocolo descrito previamente (11) con pequeñas modificaciones. Brevemente, se realizó una etapa preparativa de lisado de leucocitos y obtención de extracto. Para ello se colocaron en un baño de hielo los precipitados de leucocitos y se añadió 300 µL de Taurocolato sódico 1% (Sigma – Aldrich ®) disuelto en agua desionizada estéril y se homogeneizaron mediante pipeteo suave. A continuación se llevó a cabo un proceso de lisado celular mediante sonicación, (Figura 3.2.) y posterior cuantificación de la cantidad de proteína total presente en el extracto, mediante espectrofotometría de absorción ultravioleta con el espectrofotómetro NanoVue™ a λ = 280 nm. La concentración de proteínas se ajustó a 0,0013 mg proteína/µL extracto mediante dilución con Taurocolato sódico 1%. 39" Figura 3.2.: Proceso de sonicado de leucocitos. El valor de cantidad de proteína total en el extracto es clave para ajustar la cantidad de extracto celular que se necesita ensayar; de esta forma los valores de actividad enzimática se encuentren dentro del rango lineal de la recta de calibrado del producto fluorogénico y además permiten la normalización del resultado de actividad enzimática. Cada muestra se ensayó por duplicado, añadiendo a un volumen de 30 µL de extracto celular, con la concentración de proteína ajustada a 0,0013 mg proteína/µL de extracto, un volumen de 90 µL de una mezcla de reacción que contenía: como sustrato específico fluorogénico de α-Gal A, 30 µL de una disolución 14 mM de 4-metilumbeliferil-α-D-Galactopiranósido en agua desionizada estéril y disgregado por sonicación durante 1 minuto a 29W; como inhibidor específico de α-Gal B, 30 µL de una disolución 0,4 M de N-Acetil-DGalactosamina en agua desionizada estéril; y como tampón de reacción 30 µL de una disolución 0,4 M citrato / 0,8 M fosfato pH = 4,6 preparado en agua desionizada estéril. La mezcla se incubó a 37 ºC durante 1 hora en baño termostático seco y protegido de la luz. El extracto celular de leucocitos se conservó a -80ºC para estudios posteriores. Transcurrido el tiempo de reacción, ésta se inhibió añadiendo el producto de reacción a tubos de polipropileno de 5 mL que contenían 3 mL de Glicina/NaOH 0,3 M pH = 10,6 y se homogeneizó en el vórtice. La medida de fluorescencia se realizó de la misma forma que en el apartado 3.8.3. de este mismo capítulo. 20 seg. 40W HIELO 30 seg. Descans o en HIELO 15 seg. 40W HIELO 30 seg. Descans o en HIELO 10 seg. 40W HIELO FIN 46" El producto de digestión se sometió a electroforesis durante 45 minutos a 90V en gel de agarosa de alta resolución NuSieve™GTG™ (Lonza) al 3% (p/v) preparada con TAE 1x que contenía 0,5 µg/mL de Bromuro de Etidio. En cada pocillo se añadieron 8 µL de producto de PCR y 8 µL de tampón de carga (azul de bromofenol), también se cargó 2 µL de marcador de bajo PM “Low DNA Mass Ladder”. El producto de digestión se visualizó, revelando el gel en el transiluminador Gel Doc™ 2000 determinado los tamaños de los fragmentos generados en cada amplicón, mediante el software Multi-Analyst® v1.0. El genotipo para cada variante se estableció comparando el patrón de pesos de moleculares de los fragmentos teórico, obtenido bioinformaticamente con la herramienta RestrictionMapper (ver enlaces), con el patrón de pesos moleculares de los fragmentos en la muestra. En estos análisis se incluyó un control positivo hemizigoto u homozigoto para el alelo salvaje, ya que se carecen de controles positivos heterozigotos para los alelos analizados. 3.10. Análisis “in silico” de las variantes en zona promotora Para comprobar el hipotético efecto de variantes desconocidas, en zona promotora, sobre la regulación de la expresión génica; se utilizó la herramienta bioinformática MatInspector (Genomatix) (ver enlaces) que informa de la unión de una secuencia problema a las matrices de factores de transcripción generados bioinformaticamente a partir de una base datos. Comparamos la secuencia de referencia con la secuencia que contenía la variante, analizando el cambio en los perfiles de unión o pérdida de unión de factores de transcripción en la zona circundante a esa variante. 3.11. Análisis de variantes de ayuste “splicing” alternativo Para comprobar que algunas de las variantes encontradas en el análisis molecular del gen GLA pudieran alterar el normal mecanismo normal de ayuste “splicing” del pre-mRNA, se realizaron las siguientes determinaciones sobre la molécula complementaria (cDNA) al mRNA del gen GLA. 47" 3.11.1. Análisis “in silico de las variantes de ayuste alternativo Se utilizaron 2 herramientas bioinformáticas (MutationTaster y Splice Site Prediction Program by Neural Network) para evaluar si nuestras variantes encontradas podían resultar ser patogénicas, si estaban implicadas en creación de nuevos sitios de ayuste o bien en destrucción de sitios de ayuste conservados etc. MutationTaster (ver enlaces) se trata de un predictor de patogenicidad, analizando por procesos estadísticos, el efecto de la variante en los sitios de ayuste, secuencia aminoacídica etc. Splice Site Prediction Program by Neural Network “SSPNN” (ver enlaces) analiza la fortaleza de las regiones de ayuste o circundantes a éstas (valor máximo 1) evaluando hipotéticas eliminaciones y/o generaciones de éstas. 3.11.2. Síntesis de cDNA total Para la retrotranscripción de todo el mRNA a partir del RNA total aislado, se tomó 1 µg de RNA total y se llevó un VF de 20 µL. Se utilizó la batería de reactivos PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara Bio INC.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Toda la manipulación del RNA total se llevó a cabo en baño de hielo y en campana de flujo laminar, además de uso de material exclusivo para RNA. En un primer paso se llevó a cabo la hibridación de OligodT a las colas poliA del mRNA presente en el RNA total aislado; para este paso se adicionó a 1 µg de RNA total, una mezcla de reacción (VF reacción = 10 µL) que contiene por cada muestra: 1 µL de OligodT Primer 50 µM, 1 µL de dNTP mixture (10mM de cada dNTP) y cantidad suficiente (c.s.p.) de ddH2O para volumen final de 10 µL. Se incubó en un termociclador GeneAmp® 9700 PCR System a 65ºC durante 10 minutos y después se mantuvo a 4ºC. En un segundo lugar se llevó a cabo la Retrotranscripción “RT-PCR”, en la que por cada molécula de mRNA que haya hibridado la cola OligodT, se generará una molécula de cDNA (relación 1:1). Al producto de hibridación anterior se le añadió una mezcla de RT-PCR (VF reacción = 10 µL) que contenía por cada muestra: 5 µL de PrimeScript Buffer 5 x, 0,5 µL de RNAase inhibitor (40 UI/µL), 48" 1 µL de PrimeScript RTases (200UI/µL) y c.s.p. de ddH2O para 10 µL. Se incubó en un termociclador GeneAmp® 9700 PCR System a 42 ºC 60minutos, seguido de 95ºC 5 minutos y después se mantuvo a 4ºC. Finalizado este proceso, el producto de RT-PCR se conservó, bien a 4ºC para su uso inmediato, bien a -20ºC para estudios posteriores. 3.11.3. Control de calidad de RT-PCR Mediante PCR específica de un fragmento del gen constitutivo ACTB, codificante para β-Actina, y utilizando como molde el cDNA obtenido anteriormente, se pudo comprobar la calidad de éste para estudios posteriores (12). El diseño de los cebadores específicos para el fragmento del gen ACTB se refleja en la Tabla 3.6. Tabla 3.6.: Cebadores específicos para la amplificación de un fragmento del cDNA correspondiente al mRNA del gen ACTB. CEBADOR 5’-SECUENCIA-3’ Ta AMPLICÓN Beta Actina D ACACTGTGCCCATCTACGAGG 50ºC 621 pb Beta Actina R AGGGGCCGGACTCGTCATACT .Ta= temperatura de “anneling” La PCR se llevó a cabo en microtubos de 0,2 mL incorporando todos los reactivos y el cDNA (Tabla 3.7.) (VF reacción = 10 µL). La reacción se llevó a cabo en un termociclador GeneAmp® 9700 PCR System según el programa térmico 94 2’ / 35 x (94ºC 30’’ 60ºC 30’’ 72ºC 30’’) / 72ºC 4’ / 4ºC mantenimiento El producto final de PCR se sometió a una electroforesis durante 30 minutos a 90V en un gel de agarosa al 2% (p/v) preparada con TAE 1x que contenía 0,5 µg/mL de Bromuro de Etidio. En cada pocillo se añadieron 2 µL de producto de PCR y 2 µL de tampón de carga (azul de bromofenol), también se añadió 1 µL de marcador de bajo PM “Low DNA Mass Ladder”. 49" El producto de PCR se visualizó, revelando el gel en el tansiluminador Gel Doc™ 2000, determinado el tamaño de banda especifico del amplicón mediante el software Multi-Analyst® v1.0. Tabla 3.7.: Estequeometría para la amplificación por PCR de un fragmento del cDNA correspondiente al mRNA del gen ACTB. REACTIVO CANTIDAD (µl) CONC. FINAL ddH2O libre DNAasa/RNAsa 6,3 Tampón 10 x, Bioline® 1 1x dNTPs (2mM), Invitrogen® 1 200 µM Mg2Cl (50mM), Bioline® 0,3 1,5 mM Cebador Directo (10 µM) 0,2 200 nM Cebador Reverso (10 µM) 0,2 200 nM BIOTAQ™ DNA polimerasa 5 UI/µL, Bioline® 0,06 0,75 UI cDNA 1 Los volúmenes anteriores están referidos para 1 PCR de 1 amplicón 3.11.4. Amplificación de cDNA específico de gen GLA Para poder estudiar el efecto de las variantes sobre el hipotético ayuste alternativo, fue necesario obtener una cantidad razonable de cDNA específico de gen GLA (12). El diseño de los cebadores específicos para el cDNA correspondiente al mRNA específico del gen GLA se refleja en la Tabla 3.8. Tabla 3.8.: Cebadores específico para la amplificación del cDNA correspondiente al mRNA del gen GLA. CEBADOR 5’-SECUENCIA-3’ Ta PRODUCTO GLA20 D TGCAGCTGAGGAACCCAGAACTACA 59ºC 1114 pb GLA1113R AGGGAAGCAACTGCGATGGTA Ta= temperatura de “anneling” La PCR se realizó utilizando en placas de 96 pocillos precortadas en las que se incorporaron todos los reactivos y el cDNA (Tabla 3.9). (VF reacción = 50 µL) 50" Tabla 3.9.: Estequeometría para la amplificación por PCR del cDNA correspondiente al mRNA del gen GLA. REACTIVO CANTIDAD (µl) CONC. FINAL ddH2O libre DNAasa/RNAsa 34,5 Tampón 10 x, Bioline® 5 1x dNTPs (2mM), Invitrogen ® 5 200 µM Mg2Cl (50mM), Bioline® 1,5 1,5 mM Cebador Directo (10 µM) 1 200 nM Cebador Reverso (10 µM) 1 200 nM BIOTAQ™ DNA polimerasa 5 UI/µL, Bioline® 0,85 0,75 UI cDNA 1 Los volúmenes anteriores están referidos para 1 PCR de 1 amplicón La reacción se llevó a cabo en un termociclador GeneAmp® 9700 PCR System según el programa térmico 94 2’ / 35 x (94ºC 30’’ 59ºC 30’’ 72ºC 30’’) / 72ºC 4’ / 4ºC y mantenimiento. El producto de PCR se conservó a -20ºC para caracterizaciones posteriores. 3.11.5. Caracterización electroforética de fragmentos de cDNA específico de gen GLA en geles de poliacrilamida Para comprobar un hipotético ayuste alternativo, analizamos el posible grupo de transcritos generados de diversos tamaños, siendo capaces de caracterizarlos mediante geles de poliacrilamida (PAA). Para la preparación de geles de poliacrilamida al 6% se añadieron los siguientes reactivos en orden (Tabla 3.10), sin dejar de homogeneizarse y en campana extractora: agua desionizada estéril, Acrilamida/BisAcrilamida 30%(p/v) (37,5:1) (Bio-Rad), TBE 10x (Tris-Ácido Bórico 0,89 M EDTA 0,5 M pH = 8,0) (Carlo Erba), Persulfato amónico (APS) 10% (p/v) (Bio-Rad) disuelto en agua desionizada, N,N,N,N’-tetrametilendiamina (TEMED) 0,1 % (Bio-Rad). 51" Tabla 3.10.: Reactivos para polimerización de PAA al 6%. REACTIVO CANTIDAD (mL) dH2O estéril 34,5 Acrilamida/BisAcrilamida 30% (37,5:1) 14,6 TBE 10x 5,5 APS 10 % 0,3 TEMED 0,1 % 0,03 Volúmenes de reactivos para 1 gel de 55 mL. Una vez polimerizado el gel se sumergió en una célula de electroforesis vertical Protean® II xi Cell (Bio-Rad) con TBE 1x como tampón de electroforesis. Se cargó en cada uno de los pocillos una mezcla de 15 µL del producto de cDNA específico de gen GLA (véase apartado 3.11.4. de este mismo capítulo) y 5 µL de tampón de carga (Xylene Cyanol). Se conectó a la fuente de alimentación y se sometió un proceso de electroforesis durante 3 horas a 46 mA. Finalizado el proceso de electroforesis se sumergió el gel en una mezcla de 500 mL de tampón TBE 1x (diluido en agua desionizada) con 1mL de disolución de Bromuro de Etidio (0,5 µg/mL), y se dejó teñir durante 20 minutos con agitación por balanceo dentro de campana extractora. El resultado se visualizó revelando el gel en el tansiluminador Gel Doc™ 2000, comparando el patrón de bandas de los pacientes con el patrón de bandas de individuos sanos control, mediante análisis con el software Multi-Analyst® v1.0 (Bio-Rad). 3.12. Análisis estadístico El análisis estadístico se desarrolló con el programa informático IBM SPSS Statistics 18.0 (IBM®) tomando como nivel significativo estadístico los valores de p≤0,05. Los test no paramétricos empleados para estudiar nuestra muestra fueron la prueba de Mann-Whitney y de Kolmogorov-Smirnov. Las pruebas empleadas para los estudios de comparación de variables ordinales en nuestra muestra fueron Chi-cuadrado de Pearson, Chi-cuadrado de Pearson con corrección por continuidad y el Estadístico exacto de Fisher. 52" El análisis de la asociación de las variantes nucleotídicas se realizó mediante tablas de contingencia y pruebas de contraste de hipótesis comparando, por sexos, las frecuencias alélicas y genotípicas de cada una de las variantes de nuestra muestra respecto a las mismas en una población control. Como población control se recurrió a datos de frecuencias alélicas y genotípicas de nuestras variantes de interés en población Europea, recogidas en bases de datos de grandes proyectos de secuenciación: Proyecto 1000 Genomas y Proyecto de Secuenciación de Exomas (ESP) del Instituto nacional para el corazón, pulmón y la sangre (NHLIB) de Estados Unidos (ver enlaces) 53" RESULTADOS Y DISCUSIÓN 54" 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Características de la muestra de estudio Finalizado el período de reclutamiento, el número de pacientes de los que se obtuvieron muestras viables para el diagnóstico bioquímico y genético, quedó establecido en 374 y 73 controles. Consideramos los principales índices descriptivos de nuestra muestra la edad y IMC delos centros participantes (Tabla 4.1). Tabla 4.1.: Características de los pacientes con MHVI distribuidos por centros participantes. CENTRO MUJERES VARONES TOTAL H. G.U. de Alicante Edad (años) 67±15 59±17 61,6±16,90 IMC (Kg/m2) 32,6± 6,36 28,6±4,00 30,1±5,24 n 22 54 76 H. U. Puerta de Hierro Edad (años) 53±3 53±3 53±3 IMC (Kg/m2) 26,5±6,20 27,5±4,53 27,11±5,24 n 26 45 71 C. H. U. Santiago de Compostela Edad (años) 58 59 59±1 IMC (Kg/m2) - 21,22 21,2±1,00 n 1 1 2 Universidad de Murcia Edad (años) 64±3 64±3 64±3 IMC (Kg/m2) 29,1±5,80 29,4±4,55 29,3±4,99 n 32 60 92 . 55" Tabla 4.1. Continuación. CENTRO MUJERES VARONES TOTAL H. U. Virgen de la Arrixaca Edad (años) 70±1 71±1 71±1 IMC (Kg/m2) 27,1±3,93 29±4,47 28,4±4,32 n 11 25 36 H. Son Llatzer Edad (años) 76±1 75±2 75±2 IMC (Kg/m2) 30,4 28,9±3,69 29,2±3,27 n 15 27 42 H. U. G. de Elche Edad (años) 79 79±1 79±1 IMC (Kg/m2) - - - n 6 14 20 H. U. de Donostia Edad (años) 85±3 84±3 84±3 IMC (Kg/m2) 26,7±3,22 26,9±2,41 28,9±2,71 n 12 24 36 Los datos se expresan como valor medio ± desviación estándar. n = nº pacientes. IMC: índice de masa corporal. La contribución de cada uno de los centros al estudio no fue equitativa como se refleja en la tabla anterior. El análisis estadístico con las pruebas no paramétricas de Mann-Whitney y Kolmogorov-Smirnov no mostró diferencias significativas (p≤0,05) en el conjunto de pacientes de la muestra ni en la distribución de pacientes por centro de procedencia. Se comparó la edad de los pacientes con la distribución de éstos por sexos y el IMC de los pacientes con la distribución de éstos por sexos. 62" La confirmación, de la identificación de estas variantes se obtuvo mediante nueva reacción de PCR, purificación de ésta y nueva resecuenciación (véanse los apartados 3.9.1. a 3.9.3. de Materiales y Metodología) o bien mediante análisis de restricción (véase el apartado 3.9.4. de Materiales y Metodología) cuyo resultado se ilustra en la Figura 4.2. Figura 4.2.: Electroforésis en gel al 3% de agarosa de alta resolución para identificación de variantes en el gen GLA mediante RFLP’S. Gel 1: identificación de c.-125 t>g con MspI. Línea 1 Marcador de peso molecular (PM) <2000 pb; Línea 2 Heterozigoto (tg); Línea 3 Control homozigoto (tt); Línea 4 Control negativo. Gel 2: identificación de c.-34 c>t con SacII. Línea 1 Marcador de peso molecular (PM) <2000 pb; Línea 2 Heterozigoto (ct); Línea 3 Control homozigoto (cc); Línea 4 Control negativo . Gel 3: identificación de c.-30 g>a con SacII. Línea 1 Marcador de peso molecular (PM) <2000 pb; Línea 2 Heterozigoto (ga); Línea 3 Control homozigoto (gg); Línea 4 Control negativo. Gel 4: identificación de c.-192 C>T (p.I64=) con SfaNI. Línea 1 Marcador de peso molecular (PM) <2000 pb; Línea 2 Heterozigoto (CT); Línea 3 Control homozigoto (CC); Línea 4 Control negativo. 63" 4.4.1. Descripción de variantes nucleotídicas identificadas La variante correspondiente al cambio c.376 A>G (p.S126G), identificada en hemizigósis en un paciente varón de 39 años, ha sido descrita con anterioridad en series clínicas de cribado de la EF relacionadas con afectación renal e Ictus (8,9), por lo que la consideramos variante de carácter patológico y compatible con la EF. Identificamos una serie de variantes nuevas, no descritas previamente: • La variante en zona promotora c.-34 c>t fue identificada en heterozigósis en una paciente mujer de 55 años. Esta variante se localizó en un dominio CpG sujeto a regulación epigenética (10-12) y podría comprometer la regulación de la expresión génica tipo Trans por factores de transcripción, por lo que realizamos un análisis bioinformático de la región circundante en busca de alteraciones (véase el apartado 3.10. de Materiales y Metodología) del patrón normal de unión de factores de transcripción (véase el apartado 4.5.1.. de este mismo capítulo) como primera aproximación para caracterizar la variante. • La variante c.192 C>T (p.I64=) fue identificada en heterozigósis en una mujer de 82 años. Esta variante genera una mutación silente en la secuencia aminoacídica, sin embargo el cambio se encuentra a 2 pb del extremo 3’ del exón 1 del gen GLA y por tanto cerca de la junta donora de ayuste “splicing”. Esta variante podría comprometer el patrón normal de procesamiento del pre-mRNA del gen GLA generando un tránscrito no fisiológico que acabaría siendo degradado. El resultado del predictor de patogenicidad MutationTaster (véase apartado 3.11.1. de Materiales y Metodología) indicó una probabilidad de considerar la variante como patológica de 1 sobre 1. El resultado de la herramienta SPNSS mostró una pérdida completa de fortaleza en el sitio donor de ayuste pasando de 0,94 sobre 1 a desaparecer. En base a estas evidencias se siguió caracterizando la variante como mostraremos en el apartado 4.5.3 de este mismo capítulo. 64" • La variante c.640-25 A>G fue identificada en heterozigósis en una mujer de 72 años. La variante se localiza en el Intrón 4, a 23pb de la secuencia aceptora conservada de ayuste normal del exón 3 y exón 4. El resultado del predictor de patogenicidad MutationTaster indicó una probabilidad de considerar la variante como polimórfica de 0,999 sobre 1; teniendo en cuenta este hecho la clasificamos como no causal de enfermedad, finalizando así su caracterización. Se identifican una serie de variantes, que aunque recogidas como polimórficas en la base de datos dbSNP (ver enlaces), su contribución al fenotipo de la EF está en entredicho por los diferentes grupos de trabajo (véase apartado 1.3.1 de Introducción). Entre ellas destacan el cambio c.-30 a>g que produce un incremento de los niveles en plasma de la enzima, por desregulación de su expresión (13,14), y el cambio c.937 G>T (p.D313Y) que genera un alelo de pseudodeficiencia (15-17). Ambas variantes alteran la actividad catalítica de la enzima (una por incremento de expresión, la otra por reducción del 25 % de la actividad intracelular) pero no existe un criterio unificado respecto a su carácter patogénico en el desarrollo de la EF. El resto de variantes que se identificaron, se recogían como variantes polimórficas en la base de datos dbSNP (ver enlaces). Finalmente se observó que determinados pacientes presentaban una serie de variantes en zonas no codificantes, que están asociadas entre sí, y que ocurren en patrones haplotípicos que referiremos en adelante como Haplotipos Complejos Intrónicos (HCI). En algunos pacientes no solo se observó un solo tipo de HCI, si no una combinación de dos. Mediante la ampliación de regiones de resecuenciación se pudo afirmar que el HCI Tipo III está caracterizado por 4 variantes y no por 3 como indicaban estudios previos (18). El estudio y caracterización de estos haplotipos se desarrollará en el apartado 4.6. de este mismo capítulo. 65" 4.4.2. Análisis de asociación de l variantes identificadas y la EF. En los estudios de asociación de alelos y genotipos ligados al sexo, las mujeres presentan 3 genotipos posibles (silvestre/silvestre, silvestre/mutado y mutado/mutado), pudiendo calcularse frecuencias genotípicas y frecuencias alélicas, comportándose como un alelo autosómico a la hora realizar el análisis. El caso de los varones es diferente, ya que al presentar sólo 2 genotipos posibles (silvestre y mutado) la frecuencia genotípica coincidirá con la alélica, variando la manera habitual de realizar el análisis. El análisis de la asociación de las variantes recogidas en la Tabla 4.5. (véase apartado 4.4. de este mismo capítulo) sólo pudo llevarse a cabo en aquellas en las que existen datos de frecuencias alélicas y genotípicas en individuos control, por lo que las nuevas variantes identificadas por nuestro grupo( c.-34 c>t; c.192 C>T (p.I64=); c.640-25 A>G) quedan excluídas de este análisis. La asociación genotípica y/o alélica de variantes, de pacientes con MHVI en nuestra muestra, con la EF se recoge en las Tablas 4.6. y 4.7. El estudio de equilibrio poblacional (según Ley de Hardy-Weinberg) y de haplotipos no se ha realizado todavía. 66" Tabla 4.6.: Análisis de asociación genotípica y alélica en mujeres con MHVI y la EF. VARIANTE SNP ASOCIACIÓN GENOTÍPICA ASOCIACIÓN ALÉLICA c.-125 t>g rs185255090 0,383 0,383 c.-105 a>g rs3027583 NC NC c.-30 g>a rs3027584 0,577 0,576 c.-12 g>a rs3027585 0,86 0,382 c.-10 c>t rs2071225 0,057 2 ¥ 0,026 2 † c.194+17 A>G rs2071226 0,383 0,383 c.376-81_77delCAGCC rs201869175 0,479 0,279 c.376 A>G (p.S126G) rs149391489 0,904 0,904 c.548-125 C>G rs2071396 0,039 3 † 0,042 3 † c.639+68 A>G rs3027589 0,083 3 ¥ 0,087 3 ¥ c.640-16 A>G rs2071397 0,860 0,787 c.937 G>T (p.D313Y) rs28935490 0,033 3 † 0,033 3 † c.945 C>T (p.D315=) rs151208856 NC NC c.1000-22 C>T rs2071228 0,333 0,397 1 Test de chi-Cuadrado; 2 Test de chi-Cuadradro con corrección por continuidad; 3 Estadístico Exacto de Fisher con significación exacta unilateral.; ¥ 0,1 <p <0,05; † p <0,05; ‡ p <0,01. NC: no es posible calcularlo. En el grupo de las mujeres parece haber una asociación estadísticamente significativa entre el genotipo GT (Odds Ratio = 2,222) y también entre el alelo G (Odds Ratio = 2,197), con el MHVI que padecen. Resulta llamativo el riesgo de padecer en mujeres MHVI con esta variante tan polémica en la EF. Algunas de las variantes de los HCI Tipo I y Tipo III parecen tener una relación estadística con la MHVI en diferente grado de significación. Sería interesante contar con datos de frecuencias alélicas y genotípicas de las variantes recogidas en la Tabla 4.5. (véase el apartado 4.5. de este mismo capítulo) en población de península ibérica para establecer estudios de asociación más homogéneos. 67" Tabla 4.7.: Análisis de asociación genotípica y alélica en varones con MHVI y la EF. VARIANTE SNP ASOCIACIÓN GENOTÍPICA/ALÉLICA c.-125 t>g rs185255090 NC c.-105 a>g rs3027583 NC c.-30 g>a rs3027584 0,444 c.-12 g>a rs3027585 0,008 3 ‡ c.-10 c>t rs2071225 0,282 c.194+17 A>G rs2071226 NC c.376-81_77delCAGCC rs201869175 0,068 3 ¥ c.376 A>G (p.S126G) rs149391489 0,207 c.548-125 C>G rs2071396 0,005 3 ‡ c.639+68 A>G rs3027589 0,018 3 † c.640-16 A>G rs2071397 0,844 c.937 G>T (p.D313Y) rs28935490 NC c.945 C>T (p.D315=) rs151208856 0,089 3 ¥ c.1000-22 C>T rs2071228 0,071 3 ¥ 1 Test de chi-Cuadrado; 2 Test de chi-Cuadradro con corrección por continuidad; 3 Estadístico Exacto de Fisher con significación exacta unilateral.; ¥ 0,1 <p <0,05; † p <0,05; ‡ p <0,01. NC: no es posible calcularlo. En el grupo de los varones parece haber una asociación estadística, en varios grados de significación, en todas las variantes del HCI Tipo III y la MHVI observada en ellos. Al igual que en el grupo de las mujeres, sería interesante contar con datos de frecuencias alélicas y genotípicas de las variantes recogidas en la Tabla 4.5.(véase el apartado 4.5. de este mismo capítulo) en población de península ibérica para establecer estudios de asociación más homogéneos. 68" 4.5. Caracterización de las nuevas variantes nucleotídica 4.5.1. Búsqueda de sitios de unión de factores de transcripción a la zona promotora circundante a la variante c.-34 c>t El análisis realizado con MatInspector (véase apartado 3.13.1 de Materiales y Metodología) de la región circundante a la variante c.-34 c>t, comparando la variante silvestre con la variante alternativa, indicó la creación de un sitio potencial de unión al factor de transcripción (TF) E2F-myc cuando la región promotora contiene la variante alternativa. El TF y su secuencia consenso se resume en la Tabla 4.6. Tabla 4.8.: Factores de transcripción que potencialmente se unen a la secuencia consenso circundante a la variante c.-34 c>t. FAMILIA DESCRIPCIÓN SEC. CONSENSO E2F-myc Activador/regulador del ciclo celular tactcGCGGaaatttat t: variante alternativa; Secuencia consenso TF en letras mayúsculas. El TF E2F se encuentra implicado en procesos de activación y/o regulación del oncogen MYC, siendo necesaria la unión de E2F al promotor de MYC para que éste se exprese bajo un estímulo mitógeno (19). Teniendo en cuenta las características de este TF, consideramos su posible implicación en la EF como poco probable, más si cabe que el paciente el que se identificó era una mujer, pudiendo expresarse de manera diferencial en unas líneas celulares o en otras (mosaicismo) dependiendo de la activación del cromosoma X en cada línea celular.(4) Para poder confirmar estos resultados preliminares “in silico” sería necesario realizar ensayos de geles de retardo o “Electrophoretic Mobility Shift Assay” (EMSA) y comprobar el grado de afinidad de un extracto de proteínas nucleares con un oligonucleótido sintético que contenga la variante silvestre y otro oligonucleótido sintético que contenga la variante alternativa responsable del cambio c.-34c>t. 69" 4.5.2. Análisis enzimático de las variantes c.-34 c>t y c.192 C>T (p.I64=) El análisis enzimático se realizó en muestras de plasma y en concentrado de leucocitos (véase apartado 3.8.2. y 3.8.3. de Materiales y Metodología) Solo se pudo conseguir muestra de plasma y leucocitos del paciente c.-34 c>t, por lo que se determinó que su actividad enzimática en plasma fue de 27 nmol/mL plasma/h (138% respecto a individuos control del mismo sexo) y en extracto celular de leucocitos fue de 47,8 nmol/mg prot./h (94,4 % respecto a individuos control del mismo sexo). Teniendo en cuenta estos resultados de actividad, la paciente portadora de la variante c.-34 c>t no podemos concluir que sea compatible con la EF. Requiriendo realizarle otro tipo de determinaciones. 4.5.3. Caracterización mediante separación de fragmentos por electroforesis en geles de PAA al 6% de la variante c.192 C>T (p.I64=) Para la caracterización electroforética (véase desde apartado 3.11.2 a 3.11.5 de Materiales y Metodología) se comparó el patrón electroforético del cDNA del gen GLA de nuestro paciente respecto al de dos individuos control sanos de su mismo sexo. (Figura 4.3.) No se observaron diferencias en cuanto al patrón de fragmentos separados electroforéticamente. El hecho de no encontrar un patrón de bandas correspondiente a un evento de ayuste alternativo, como se determinó bioinformaticamente en el apartado 4.4. 1. se deba probablemente a que al tratarse de una mujer, y debido al fenómeno de Lyonización, se esté expresando en la paciente el alelo silvestre en la línea celular estudiada (leucocitos). 70" Figura 4.3.: Caracterización electroforética en gel de PAA al 6% del cDNA de GLA de la variante c.192 C>T (p.I64=). Para asegurarnos bien de que el mosaicismo es la causa de esta aparente normalidad, sería fundamental contar con datos de valor de actividad enzimática en plasma y extracto de leucocitos, en fibroblastos y otros tejidos como biopsia cardíaca.También analizar perfiles de inactivación de cromosoma X (20), así niveles plasmáticos y de orina de Gb3 y Lyso-Gb3; hechos que no han sido posible en este estudio debido a la no autorización por parte de la paciente. 4.6. Haplotipos Complejos Intrónicos (HCI) identificados y combinaciones de éstos. Descripción y estudios complementarios. En los pacientes analizados en nuestra muestra, aparecían tres HCI (ver Tabla 4.9) bien diferenciados y también algunas combinaciones de ellos. Estos HCI se heredan juntos, distribuyéndose tanto en varones como en mujeres (ver Tabla 4.10.). El HCI más frecuente en la muestra es el Tipo II (38%) seguido del Tipo I (24%). 71" Tabla 4.9.: Haplotipos Complejos Intrónicos (HCI) de nuestra muestra. TIPO HCI VARIANTES REFERENCIA SNP LOCALIZACIÓN HCI Tipo I c.-10 c>t rs2071225 PROMOTOR c.376-81_77delCAGCC rs201869175 INTRÓN 2 c.640-16 A>G rs2071397 INTRÓN 4 c.1000-22 C>T rs2071228 INTRÓN 6 HCI Tipo II c.376-81_77delCAGCC rs201869175 INTRÓN 2 c.640-16 A>G rs2071397 INTRÓN 4 c.1000-22 C>T rs2071228 INTRÓN 6 HCI Tipo III c.-12 g>a rs3027585 PROMOTOR c.548-125 C>G rs2071396 INTRÓN 3 c.639+68 A>G rs3027589 INTRÓN 4 c.1000-22 C>T rs2071228 INTRÓN 6 El análisis estadístico con prueba de Chi-cuadrado de Pearson no mostró asociación estadísticamente significativa (p = 0,105) entre el tipo de HCI o combinación de éstos y el sexo de los pacientes. Tabla 4.10.: Distribución de HCI y combinaciones de éstos en nuestra muestra. TIPO HCI MUJERES VARONES TOTAL n % n % n % HCI I 4 8 8 16 12 24 HCI II 15 3 4 12,5 19 38 HCI III 9 18 6 12 15 3 HCI I + II 2 4 0 NC 2 4 HCI I + III 1 2 0 NC 1 2 HCI II + III 1 2 0 NC 1 2 Total 32 18 50 n = nº de pacientes analizados; NC = no calculado La distribución de HCI y combinaciones de éstos, según sexos de nuestra muestra se ilustró en la Figura 4.4.. 78" 5. CONCLUSIONES El análisis de los resultados obtenidos en este estudio nos permite concluir que: I. El cribado enzimático mediante gota de sangre seca (DBS) en papel de filtro tipo FTA es una herramienta útil para el diagnóstico de Enfermedad de Fabry, pero requiere una estricta normalización en la cantidad de sangre depositada en ésta. II. Todo resultado, derivado del cribado mediante DBS, considerado como anómalo requiere a posteriori realizar la confirmación de valores de actividad enzimática de α-Galactosidasa A en muestras de plasma y/o leucocitos. III. El análisis del gen GLA a partir de gota de sangre seca (DBS) en papel de filtro tipo FTA es una metodología eficaz para realizar el análisis de este gen con resultados similares a los obtenidos en DNA procedente muestras de sangre periférica. IV. Se han identificado 17 variantes en el gen GLA en la muestra estudiada de pacientes reclutados según criterios de miocardiopatía hipertrófica de ventrículo izquierdo (MHVI); 3 de ellas no habían sido descritas con anterioridad, otra de las variantes c.376 A>G (p.S126G) ha sido asociada previamente a Enfermedad de Fabry. V. Las frecuencias alélicas de las variantes c.-12 a>g; c.-10 c>t; c.37681_77delCAGCC; c.548-125 C>G; c.639+68 A>G; c.937 G>T (p.D313Y); c.945 C>T (p.D315=) y c.1000-22 C>T han resultado ser estadísticamente significativas en la muestra de pacientes con MHVI frente la población control cuyos datos han sido extraídos de las bases de datos Proyecto 1000 Genomas y NHLBI-ESP. VI. Se han identificado 3 haplotipos complejos Intrónicos (HCI) que sugieren estar asociados a la MHVI observada en la muestra. 79" BIBLIOGRAFÍA ( 80" 1) Pompen AWM, Ruiter M, Wyers HJG. Angiokeratoma Corporis Diffusum (Universale) Fabry, as a Sign of an Unknown Internal Disease - 2 Autopsy Reports. Acta Med Scand 1947 1947;128(3):234-255. (2) BACH G, ROSENMANN E, KARNI A, COHEN T. Pseudodeficiency of Alpha-Galactosidase-a. Clin Genet 1982;21(1):59-64. (3) Kornreich R, Desnick RJ, Bishop DF. Nucleotide-Sequence of the Human Alpha-Galactosidase-a Gene. Nucleic Acids Res 1989 APR 25 1989;17(8):3301-3302. (4) Ioannou Y, Zeidner K, Gordon R, Desnick R. Fabry disease: Preclinical studies demonstrate the effectiveness of alpha-galactosidase A replacement in enzyme-deficient mice. Am J Hum Genet 2001 JAN;68(1):14-25. (5) Lee K, Jin X, Zhang K, Copertino L, Andrews L, Baker-Malcolm J, et al. A biochemical and pharmacological comparison of enzyme replacement therapies for the glycolipid storage disorder Fabry disease. Glycobiology 2003 APR;13(4):305-313. (6) Desnick RJ, Ioannou YA, Eng CM. a-galactosidase a deficiency: Fabry disease 2001. (7) Poorthuis BJ, Wevers RA, Kleijer WJ, Groener JE, de Jong JG, van Weely S, et al. The frequency of lysosomal storage diseases in The Netherlands. Hum Genet 1999 Jul-Aug;105(1-2):151-156. (8) Meikle PJ, Hopwood JJ, Clague AE, Carey WF. Prevalence of lysosomal storage disorders. Jama-Journal of the American Medical Association 1999 JAN 20 1999;281(3):249-254. (9) Spada M, Pagliardini S, Yasuda M, Tukel T, Thiagarajan G, Sakuraba H, et al. High incidence of later-onset fabry disease revealed by newborn screening. Am J Hum Genet 2006 Jul;79(1):31-40. (10) Hwu WL, Chien YH, Lee NC, Chiang SC, Dobrovolny R, Huang AC, et al. Newborn screening for Fabry disease in Taiwan reveals a high incidence of the later-onset GLA mutation c.936+919G>A (IVS4+919G>A). Hum Mutat 2009 Oct;30(10):1397-1405. (11) Bishop DF, Kornreich R, Desnick RJ. Structural organization of the human alpha-galactosidase A gene: further evidence for the absence of a 3' untranslated region. Proc Natl Acad Sci U S A 1988 Jun;85(11):3903-3907. (12) Germain DP. General aspects of X-linked diseases. In: Mehta A, Beck M, Sunder-Plassmann G, editors. Fabry Disease: Perspectives from 5 Years of FOS Oxford: Oxford PharmaGenesis; 2006. 81" (13) Lai L, Whitehair O, Wu M, O'Meara M, Lien Y. Analysis of splice-site mutations of the alpha-galactosidase A gene in Fabry disease. Clin Genet 2003 JUN;63(6):476-482. (14) Ishii S, Nakao S, Minamikawa-Tachino R, Desnick RJ, Fan JQ. Alternative splicing in the alpha-galactosidase A gene: Increased exon inclusion results in the Fabry cardiac phenotype. Am J Hum Genet 2002 APR 2002;70(4):9941002. (15) Filoni C, Caciotti A, Carraresi L, Donati MA, Mignani R, Parini R, et al. Unbalanced GLA mRNAs ratio quantified by real-time PCR in Fabry patients' fibroblasts results in Fabry disease. Eur J Hum Genet 2008 Nov;16(11):13111317. (16) Valbuena C, Carvalho E, Bustorff M, Ganhao M, Relvas S, Nogueira R, et al. Kidney biopsy findings in heterozygous Fabry disease females with early nephropathy. Virchows Archiv 2008 OCT 2008;453(4):329-338. (17) Tanislav C, Kaps M, Rolfs A, Boettcher T, Lackner K, Paschke E, et al. Frequency of Fabry disease in patients with small-fibre neuropathy of unknown aetiology: a pilot study. European Journal of Neurology 2011 APR 2011;18(4):631-636. (18) Bono C, Nuzzo D, Albeggiani G, Zizzo C, Francofonte D, Iemolo F, et al. Genetic screening of Fabry patients with EcoTILLING and HRM technology. BMC research notes 2011 2011 Sep 06;4:323-323. (19) Pisani A, Imbriaco M, Zizzo C, Albeggiani G, Colomba P, Alessandro R, et al. A classical phenotype of Anderson-Fabry disease in a female patient with intronic mutations of the GLA gene: a case report. Bmc Cardiovascular Disorders 2012 JUN 8 2012;12:39. (20) Saifudeen Z, Desnick RJ, Ehrlich M. A mutation in the 5' untranslated region of the human alpha-galactosidase A gene in high-activity variants inhibits specific protein binding. FEBS Lett 1995 Sep 4;371(2):181-184. (21) Fitzmaurice TF, Desnick RJ, Bishop DF. Human alpha-galactosidase A: high plasma activity expressed by the -30G-->A allele. J Inherit Metab Dis 1997 Sep;20(5):643-657. (22) Eng CM, Resnick-Silverman LA, Niehaus DJ, Astrin KH, Desnick RJ. Nature and frequency of mutations in the alpha-galactosidase A gene that cause Fabry disease. Am J Hum Genet 1993 Dec;53(6):1186-1197. (23) Froissart R, Guffon N, Vanier MT, Desnick RJ, Maire I. Fabry disease: D313Y is an alpha-galactosidase A sequence variant that causes pseudodeficient activity in plasma. Mol Genet Metab 2003 Nov;80(3):307-314. 82" (24) Yasuda M, Shabbeer J, Benson SD, Maire I, Burnett RM, Desnick RJ. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat 2003 Dec;22(6):486-492. (25) Germain DP. Fabry disease. Orphanet J Rare Dis 2010 Nov 22;5:30-11725-30. (26) Handa Y, Yotsumoto S, Isobe E, Sai Y, Yoshii N, Nakao S, et al. A case of symptomatic heterozygous female Fabry's disease without detectable mutation in the alpha-galactosidase gene. Dermatology 2000 2000;200(3):262-265. (27) Kampmann C, Baehner F, Whybra C, Martin C, Wiethoff CM, Ries M, et al. Cardiac manifestations of Anderson-Fabry disease in heterozygous females. J Am Coll Cardiol 2002 Nov 6;40(9):1668-1674. (28) Chimenti C, Pieroni M, Morgante E, Antuzzi D, Russo A, Russo M, et al. Prevalence of Fabry disease in female patients with late-onset hypertrophic cardiomyopathy. Circulation 2004 AUG 31;110(9):1047-1053. (29) Wilcox WR, Oliveira JP, Hopkin RJ, Ortiz A, Banikazemi M, FeldtRasmussen U, et al. Females with Fabry disease frequently have major organ involvement: Lessons from the Fabry Registry. Mol Genet Metab 2008 FEB;93(2):112-128. (30) LYON MF. Sex chromatin and gene action in the mammalian Xchromosome. Am J Hum Genet 1962 Jun;14:135-148. (31) Garman SC, Garboczi DN. The molecular defect leading to Fabry disease: Structure of human alpha-galactosidase. J Mol Biol 2004 MAR 19 2004;337(2):319-335. (32) Desnick RJ, Ioannou YA, Eng ME. Fabry Disease: A-Galactosidase a Deficiency. 8th ed.: McGraw-Hill; 2001. (33) Schiffmann R, Warnock DG, Banikazemi M, Bultas J, Linthorst GE, Packman S, et al. Fabry disease: progression of nephropathy, and prevalence of cardiac and cerebrovascular events before enzyme replacement therapy. Nephrol Dial Transplant 2009 Jul;24(7):2102-2111. (34) Linhart A, Palecek T, Bultas J, Ferguson JJ, Hrudova J, Karetova D, et al. New insights in cardiac structural changes in patients with Fabry's disease. Am Heart J 2000 Jun;139(6):1101-1108. (35) Beck M. Fabry Disease: Perspectives form 5 Years of FOS. In: Mehta A, Beck M, Sunder-Plassmann G, editors. . 2006th ed. Oxford: Oxford PharmaGenesis; 2006. 83" (36) Desnick RJ, Allen KY, Desnick SJ, Raman MK, Bernlohr RW, Krivit W. Fabrys Disease - Enzymatic Diagnosis of Hemizygotes and Heterozygotes - Alpha-Galactosidase Activities in Plasma, Serum, Urine, and Leukocytes. J Lab Clin Med 1973 1973;81(2):157-171. (37) MAYES J, SCHEERER J, SIFERS R, DONALDSON M. Differential Assay for Lysosomal Alpha-Galactosidases in Human-Tissues and its Application to Fabrys-Disease. Clin Chim Acta 1981;112(2):247-251. (38) Schirinzi A, Centra M, Prattichizzo C, Gigante M, De Fabritiis M, Giancaspro V, et al. Identification of GLA gene deletions in Fabry patients by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Mol Genet Metab 2008 Jul;94(3):382-385. (39) Yoshimitsu M, Higuchi K, Miyata M, Devine S, Mattman A, Sirrs S, et al. Identification of novel mutations in the alpha-galactosidase A gene in patients with Fabry disease: pitfalls of mutation analyses in patients with low alphagalactosidase A activity. J Cardiol 2011 May;57(3):345-353. (40) Poorthuis BJ, Groener JE, Ottenhoff R, Wijburg FA, Hollak CE, Aerts JM. Elevated globotriaosylsphingosine as a hallmark of Fabry disease. Chem Phys Lipids 2008 8;154, Supplement(0):S19-S20. (41) Nakao S, Takenaka T, Maeda M, Kodama C, Tanaka A, Tahara M, et al. An atypical variant of Fabry's disease in men with left ventricular hypertrophy. N Engl J Med 1995 Aug 3;333(5):288-293. (42) Sachdev B, Takenaka T, Teraguchi H, Tei C, Lee P, McKenna WJ, et al. Prevalence of Anderson-Fabry disease in male patients with late onset hypertrophic cardiomyopathy. Circulation 2002 Mar 26;105(12):1407-1411. (43) Monserrat L, Gimeno-Blanes JR, Marin F, Hermida-Prieto M, GarciaHonrubia A, Perez I, et al. Prevalence of fabry disease in a cohort of 508 unrelated patients with hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol 2007 Dec 18;50(25):2399-2403. (44) Lang RM, Bierig M, Devereux RB, Flachskampf FA, Foster E, Pellikka PA, et al. Recommendations for chamber quantification: a report from the American Society of Echocardiography's Guidelines and Standards Committee and the Chamber Quantification Writing Group, developed in conjunction with the European Association of Echocardiography, a branch of the European Society of Cardiology. J Am Soc Echocardiogr 2005 Dec;18(12):1440-1463. (45) Chamoles NA, Blanco M, Gaggioli D. Fabry disease: enzymatic diagnosis in dried blood spots on filter paper. Clinica Chimica Acta 2001 6;308(1–2):195196. (46) Civallero G, Michelin K, de Mari J, Viapiana M, Burin M, Coelho JC, et al. Twelve different enzyme assays on dried-blood filter paper samples for 84" detection of patients with selected inherited lysosomal storage diseases. Clin Chim Acta 2006 Oct;372(1-2):98-102. (47) De Schoenmakere G, Poppe B, Wuyts B, Claes K, Cassiman D, Maes B, et al. Two-tier approach for the detection of alpha-galactosidase A deficiency in kidney transplant recipients. Nephrol Dial Transplant 2008 Dec;23(12):40444048. (48) Gal A, Hughes DA, Winchester B. Toward a consensus in the laboratory diagnostics of Fabry disease - recommendations of a European expert group. J Inherit Metab Dis 2011 Apr;34(2):509-514. (49) Hagege AA, Caudron E, Damy T, Roudaut R, Millaire A, EtchecoparChevreuil C, et al. Screening patients with hypertrophic cardiomyopathy for Fabry disease using a filter-paper test: the FOCUS study. Heart 2011 Jan;97(2):131-136. (50) Olivova P, van der Veen K, Cullen E, Rose M, Zhang XK, Sims KB, et al. Effect of sample collection on alpha-galactosidase A enzyme activity measurements in dried blood spots on filter paper. Clin Chim Acta 2009 May;403(1-2):159-162. (51) Elbin CS, Olivova P, Marashio CA, Cooper SK, Cullen E, Keutzer JM, et al. The effect of preparation, storage and shipping of dried blood spots on the activity of five lysosomal enzymes. Clin Chim Acta 2011 Jun 11;412(1314):1207-1212. (52) Gervas-Arruga J. Estudio funcional de variantes en el genGLA: Implicación en la heterogeneidad clínica de la Enfermedad de Fabry y en su tratamiento.Universidad de Zaragoza; 2012. (53) Linhart A, Palecek T, Bultas J, Ferguson J, Hrudova J, Karetova D, et al. New insights in cardiac structural changes in patients with Fabry's disease. Am Heart J 2000 JUN;139(6):1101-1108. (54) Linthorst GE, Vedder AC, Aerts JMFG, Hollak CEM. Screening for Fabry disease using whole blood spots fails to identify one-third of female carriers. Clinica Chimica Acta 2005 3;353(1–2):201-203. (55) Brouns R, Thijs V, Eyskens F, Van den Broeck M, Belachew S, Van Broeckhoven C, et al. Belgian Fabry study: prevalence of Fabry disease in a cohort of 1000 young patients with cerebrovascular disease. Stroke 2010 May;41(5):863-868. (56) Branton MH, Schiffmann R, Sabnis SG, Murray GJ, Quirk JM, Altarescu G, et al. Natural history of Fabry renal disease: influence of alpha-galactosidase A activity and genetic mutations on clinical course. Medicine (Baltimore) 2002 Mar;81(2):122-138. 85" (57) Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev 2002 JAN 1 2002;16(1):6-21. (58) Rakyan VK, Beck S. Epigenetic variation and inheritance in mammals. Curr Opin Genet Dev 2006 DEC 2006;16(6):573-577. (59) Whitelaw NC, Whitelaw E. How lifetimes shape epigenotype within and across generations. Hum Mol Genet 2006 OCT 15 2006;15:R131-R137. (60) Oswald F, Lovec H, Moroy T, Lipp M. E2F-dependent regulation of human MYC: trans-activation by cyclins D1 and A overrides tumour suppressor protein functions. Oncogene 1994 Jul;9(7):2029-2036.