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Centre International des Hautes Etudes Agronomiques Méditerranéennes (CIHEAM) Instituto Agronómico Mediterráneo de Zaragoza (IAMZ) T E S I S Para obtener el título de: Máster en nutrición animal 2013 PRESENTADA POR: Mohamed lamine ZAABOUNE BAJO DIRRECCION: Borja VILΆ Comité tribunal: Eficacia de la aplicación de productos ricos en galactomananos en dietas para pollos infectados o no con Salmonella Dr. Dr. Dr. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 I AGRADECIMIENTOS Me siento especialmente feliz al escribir estos agradecimientos, pues ello significa que ha llegado el momento de concluir mi tesis. Me gustaría en primer lugar agradecer sinceramente a mis directores de tesis, Joaquim Brufau y Borja Vilà por la oportunidad que me han dado para realizar este trabajo, sus consejos, enseñanzas, paciencia y confianza, todo ello para que esta tesis llegue a buen puerto. También deseo agradecer a los investigadores y personal de departamento de la nutrición animal de “Mas de Bover” y del laboratorio por su disponibilidad y ayuda para solucionar cualquier tipo de duda y/o problema, y especialmente a Anna Pérez y Candy Segarra que me abrieron el laboratorio de modo incondicional, a Alfonso Mejías y la aportación de su experiencia en cuanto al manejo a nivel de las granjas del IRTA, a Lluis Llauradó por su disponibilidad de acompañarnos para hacer visitas a unas empresas dedicadas en el sector de la nutrición animal (CESAC, matadero…etc) Al Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), por haber hecho una parte de nuestros análisis sobre la presencia de Salmonella a nivel de ciegos y la cuantificación expresión génica de los genes implicados en la respuesta inmune de los pollos. No quiero acabar sin nombrar a los compañeros de laboratorio, departamento, amigos y todas aquellas personas que me han echado una mano cuando lo he necesitado y que han contribuido a esta etapa maravillosa de mi vida. Por último, deseo de corazón dar las gracias a mis padres y mis amigos por su apoyo incondicional. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 II Índice Índice ................................................................................................................................ II Índice de las tablas .......................................................................................................... IV Indice de figuras ............................................................................................................... V ABREVIACIONES ........................................................................................................ VI Resumen ........................................................................................................................ VII Résumé ......................................................................................................................... VIII Abstract ........................................................................................................................... IX IINTRODUCCION .................................................................................................... 1 IIREVISION BIBLIOGRAFICA: .............................................................................. 3 1-la Salmonella:......................................................................................................... 3 1-1. Definicion de la bacteria Salmonella: ............................................................ 3 1-2. El reservorio de la bacteria: ............................................................................ 3 1-3. Infección de pollos por Salmonella: .............................................................. 4 1-4. Colonización y adhesión de la salmonella al epitelioma intestinal: ............... 5 1-5. Regulación de la respuesta innata: ................................................................. 6 1-5-1. Quimioquinas: ......................................................................................... 6 1-5-2.Citoquinas: ............................................................................................... 7 2-Brotes de intoxicaciones alimentarias causados por salmonella: .......................... 8 3Prevalencia Salmonella en seres humanos en la UE ............................................. 9 4-La salmonella en gallinas ponedoras: ................................................................. 11 5-La salmonella en la carne de broilers:.................................................................. 12 6-Estrategias nutricionales para combatir la salmonella: ........................................ 13 6.1Antibióticos: ................................................................................................... 13 6.2Probióticos: .................................................................................................... 15 6.3Prebióticos como alternativos a los antibióticos promotores de crecimiento: 16 aDefinición: ................................................................................................... 16 bClases de prebióticos: .................................................................................. 16 cMecanismo de acción de los prebióticos: .................................................... 17 6.4-Los galactomananos de algarroba: ................................................................ 18 III-Objetivos del trabajo: ............................................................................................ 21 IVMATERIALES: .................................................................................................. 22 1-Animales: ............................................................................................................. 22 2-La bacteria Salmonella Enteritidis: ...................................................................... 22 3-Los prebióticos: ................................................................................................... 22 3.1-Salmosan: .................................................................................................. 22 3.2-La goma de Duraió: ................................................................................... 23 4β-mannanasa: ...................................................................................................... 23 VMETODOS: ........................................................................................................... 24 1-Condiciones experimentales: ............................................................................... 24 1.1-Alojamiento: .................................................................................................. 24 1.2-Duración del ensayo: ..................................................................................... 24 1.3-Alojamiento y manejo: .................................................................................. 24 1.4-Programa de alimentación: ............................................................................ 24 2-Tratamientos y diseño experimental: ................................................................... 26 3-Desafío con Salmonella ....................................................................................... 27 4-Determinación de la presencia de Salmonella a nivel de ciegos: ........................ 27 5-Estudio inmunológico: ......................................................................................... 27 Máster en nutrición animal IAMZ 2013 III 6-Estudio del perfil de los ácidos grasos volátiles. ................................................. 29 7-Determinación de la viscosidad intestinal: .......................................................... 29 8-Controles productivos: ......................................................................................... 30 9-Análisis estadístico............................................................................................... 30 VIRESULTADOS: ................................................................................................... 32 1-Los rendimientos productivos: ............................................................................. 32 2-La viscosidad ileal................................................................................................ 37 3-Efecto de los prebióticos y la inoculación con Salmonella sobre el perfil de los ácidos grasos volátiles ............................................................................................. 38 4-Estudio bacteriológico (presencia y ausencia de Salmonella): ............................ 40 5-Estudio de la expresión génica a nivel intestinal: ................................................ 43 VIDISCUSION: ....................................................................................................... 46 VII-CONCLUSIONES ............................................................................................... 50 Referencias bibliograficas ............................................................................................... 51 Anexo 1 .......................................................................................................................... 58 Anexo 2 .......................................................................................................................... 59 Máster en nutrición animal IAMZ 2013 IV Índice de las tablas Tabla 1: Ejemplos de serotipos Salmonella enterica; sus hospederos y enfermedades. .... 9 Tabla 2: Serotipos más aislados de Salmonella reportados en los casos de salmonelosis en humanos confirmados en la UE ................................................................. 10 Tabla 3: ingredientes y composición nutricional calculada de la dieta base. ................... 25 Tabla 4: Distribución de los tratamientos según desafío con Salmonella, contenido en prebióticos (Salmosan o Duraió) y/o enzima (β-mannanasa), número de parques dedicado a cada tratamiento. ............................................................. 26 Tabla 5: los promedios y la desviación estándar de los variables de los rendimientos productivos (peso vivo a los 7 días de edad, ganancia media diaria, consumo medio diario, índice de conversión) durante el periodo entre 0 y 7 días de edad. ................................................................................................................ 32 Tabla 6: Los promedios y la desviación estándar de los parámetros productivos (peso vivo a los 29 días, ganancia media diaria, consumo medio diario, índice de conversión) durante la periodo entre 7 y 29 días de edad............................... 33 Tabla 7: los promedios y la desviación estándar de las variables de los rendimientos de producción (peso vivo a los 29 días, ganancia media diaria, consumo medio diario, índice de conversión, EPEF y las mortalidades) para todo el periodo de la prueba. .................................................................................................... 34 Tabla 8: Los promedios y la desviación estándar de las variables de los rendimientos productivos (PV a 7 días de edad, PV a 29 días de edad, GMD entre 7 a 29 días de edad) pesando los animales por separado, inoculados y los no inoculados. ...................................................................................................... 35 Tabla 9: los promedios y la desviación estándar de los variables de los rendimientos productivos (peso vivo a los 7 días de edad, peso vivo a los 29 días de edad , la ganancia media diaria durante el periodo de 07 a 29 días de edad) pesando los animales por separado, los animales inoculados y los no inoculados. ...................................................................................................... 36 Tabla 10: los promedios y la desviación estándar de la viscosidad ileal de los diferentes tratamientos..................................................................................................... 38 Tabla 11: Perfil de los ácidos grasos volátiles en µmols/g en pollos de 23 días de vida, 15 días post infección ..................................................................................... 39 Tabla 12: Análisis microbiológicos para la determinación de la Presencia/ausencia S. Enteritidis por periodos separados (4, 7 y 14 dias post inoculaciòn). ............ 41 Tabla 13: Análisis microbiológicos para la determinación de la Presencia/ausencia S. Enteritidis por todo el period del experimento. .......................................... 42 Tabla 14: La expresión génica de las citoquinas a nivel intestinal 4 días post inoculación expresada con referencia a GAPDH. .......................................... 45 Máster en nutrición animal IAMZ 2013 V Indice de figuras Figura 1:las celulas intestinales y las uniones intercelulares del epitelio intestinal. ........ 5 Figura 2: Distribución relativa de S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis, S. Newport, y S.Virchow, realizada con encuestas para manadas de broiler (F) y encuestas para canales de broiler (C) en 18 países europeos. ..................... 12 Figura 3: estructura general de los galactomananos. .......................................................... 19 Figura 4: distribución de los tratamientos. ........................................................................... 26 Máster en nutrición animal IAMZ 2013 VI ABREVIACIONES APC Antibiòticos Promotores de Crecimiento βGM β-galactomamana "β-galactomannan" CBG Carob Bean Gum. CMD Consumo Medio Diario DCs Células dendríticas “Dendritic Cells” EFSA European Food Safety Authority FOS Fructo-oligosacáridos GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GIFN o IFN-y Interferon-gamma GMD Ganancia Media Diaria IC Índice de Conversión IL Interleuquinas “Interleukins” LBG Locust Bean Gum LPS Lipopolisacáridos MHC-I complejo mayor de histocompatibilidad I Major Histocompatibility Complex I MLN Ganglio mesentérico “Mesenteric Lymph Node” MOS Manano-oligosacáridos NK Célula asesina natural “Natural Killer” PBS Phosphate Buffered Saline PCR Reacción en cadena de la polimerasa “ Polymerase Chain Reaction” PT4 Phage Type 4 RVS Rappaport-Vassiliadis TLR Receptor de tipo Toll Toll Like Receptor TM Tonelada TNF-α Factor de necrosis tumoral-α “Tumor Necrosis Factor-α” UE Unión Europea UFC Units Forming Colony Máster en nutrición animal IAMZ 2013 VII Resumen El presente trabajo estudió el efecto de galactomananos sobre la presencia de la Salmonella enterica serotipo Enteritidis y la reacción inmunitaria tras una inoculación experimental, y por el otro lado el efecto de estos productos sobre los rendimientos productivos de los pollos, viscosidad intestinal y contenido en ácidos grasos volátiles. Se utilizaron 540 pollitos Ross 308 machos de un día de vida, alojados en parques en el suelo a razón de 30 animales por parque. Había un total de 5 tratamientos: UUt (no inoculados no tratados); IUt (inoculados no tratados); ITS (inoculados y tratados con Salmosan a 1000 mg/kg de pienso); ITD (inoculados y tratados con Duraió gum a 1000 mg/kg de pienso); y ITDβ (ITD + β-mannanase). Cada tratamiento se replicó 4 veces excepto el UUt que sólo tenía 2 parques. La inoculación con Salmonella enterica var. Enteritidis se realizó a los siete días de vida con la mitad de los animales en cada parque de los tratamientos a inocular. Las variables productivas se determinaron a 7 y 29 días del estudio. La presencia de Salmonella se determinó a 4, 7 y 21 días post inoculación. La expresión génica de citoquinas se determinó a 4 días post inoculación, mientras que el contenido en ácidos grasos volátiles y la viscosidad intestinal se determinaron al final del estudio. Independientemente del tipo de tratamiento o inoculación, las variables del peso vivo, ganancia media diaria e índice de conversión no fueron diferentes significativamente (p-valor > 0.1), por lo que ni la inoculación con Salmonella ni el tipo del tratamiento perjudicaron estos rendimientos productivos. Tampoco hubo diferencias en el peso vivo de los animales inoculados y no inoculados dentro del mismo parque al final del estudio. Los valores de la viscosidad ileal no han mostrado diferencias significativas entre los tratamientos (p-valor = 0.49). La inoculación provocó una disminución de la concentración de fórmico (p-valor < 0.001), y aún más con la inclusión de Duraió sin enzima (en comparación con animales inoculados no tratados). Las concentraciones de los demás ácidos grasos volátiles no fueron distintas entre los tratamientos. Sólo el tratamiento T3 (Salmosan) disminuyó significativamente (P χ2 = 0.02) la colonizacíon de Salmonella (un pollo positive sobre un total de 28 pollos muestreados con Salmosan, y 8 pollos positivos sobre un total de 32 pollos en el grupo de los pollos inoculados no tratados). La inoculación provocó una disminución de la la expresión génica del TNF-α (p-valor = 0.007). La expresión génica de los demás citoquinas no fue distinta entre los tratamientos. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 VIII Résumé Ce travail a étudié d’une part l'effet des galactommananes sur la présence de Salmonella enterica de sérotype Enteritidis et la réponse immunitaire après une inoculation expérimentale, et d'autre part l'effet de ces produits sur les performances de croissance des poulets, la viscosité intestinale et le contenu intestianal des acides gras volatiles. Nous avons utilisé 540 poulets mâles Ross 308 d’un jour de vie, logés dans des lots dans le sol à raison de 30 animaux par lot. Il y avait un total de 5 traitements: UUt (non traité non inoculé) IUt (non traité inoculé), ITS (inoculé et traité avec Salmosan à raison de 1000 mg / kg d'aliment), ITD (inoculé et traité avec Duraió gum à 1000 mg / kg d'aliment) et ITDβ (ITD + β-mannanase). Nous avons désigné 4 lots pour traitement à l'exception du traitement UUt qui avait seulement 2 lots. L’inoculation avec Salmonella enterica var. Enteritidis a été effectuée sept jours de vie, avec la moitié des animaux dans chaque lot appartenant à un traitement destiné à l’inoculation. Les variables des performances zootechniques ont été déterminées à 7 et 29 jours de l'étude. La présence de Salmonella dans le cecum a été déterminée à 4, 7 et 21 jours après l'inoculation. L'expression des gènes des cytokines a été evaluéé à 4 jours après l'inoculation, alors que la teneur en acides gras volatils et la viscosité intestinale ont été déterminées à la fin de l'étude. Quel que soit le type de traitement ou d'inoculation, les variables de poids vif, le gain moyen quotidien et l’indice de consommation ne différaient pas significativement (p valeur> 0,1), ce qui permet de dire que ni l'inoculation avec Salmonella ni le type de traitement n’avaient perturbé ces performances zootechniques. Il n'y avait aucune différence dans le poids vif des animaux inoculés et non inoculé du même lot à la fin de l'étude. Les valeurs de la viscosité iléale n'étaient pas statistiquement différent entre les differents traitements (p = 0,49). L'inoculation a entraîné une diminution de la concentration de l'acide formique (valeur p <0,001), ainsi que l'inclusion de Duraió sans enzyme (par rapport aux animaux inoculés non traités). La concentration des autres acides gras volatils n'étaient pas différents entre les traitements. Seul le traitement T3 (Salmosan) a diminué de façon significative (Pχ2 = 0,02) la colonisation de Salmonella (un poulet positif sur un total de 28 poulets prélevés pour le Salmosan et 8 poulets positifs sur un total de 32 poulets dans le groupe des poulets inoculés non traités «T2 »). L'inoculation a entraîné une diminution de l'expression du gène TNF-α (p = 0,007), tandis que l'expression génique des autres cytokines n'était pas différente entre les traitements. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 6 replica dentro de los macrófagos tras acceder a la lámina propia y acceder al ganglio mesentérico (MLN) a través de las DCs o como bacteria libre. A partir de MLN, la Salmonella coloniza otros tejidos como el ganglio linfático, médula ósea, el hígado, el bazo, los ovarios (especialmente S.Gallinarum y S. Enteritidis). El grado y la gravedad de la colonización bacteriana, la invasión de órganos, y la persistencia es altamente relacionada con el serotipo de Salmonella, las dosis y de la edad de pollo en el momento de la infección (Zhang-Barber et al., 1999; Badia, 2012; EFSA, 2010). El patógeno se une inicialmente a la superficie de la mucosa intestinal, y esta interacción implica la unión de las fimbrias mediante las adhesinas bacterianas a los receptores en las superficies de las células epiteliales intestinales. La Salmonella enterica serovar Enteritidis produce varios tipos de adhesinas fimbrias. La afinidad específica de estas bacterias por la manosa reside en la presencia de la adhesina FimH situada sobre la extremidad de la fimbria tipo 1 de Salmonella (Badia, 2012). La resistencia contra la enfermedad clínica debida a S. enteritidis o a otros serotipos no tifoideas aumenta rápidamente con el desarrollo de la flora intestinal normal y el sistema inmunológico del pollo (EFSA, 2010). 1-5. Regulación de la respuesta innata: 1-5-1. Quimioquinas: Las quimioquinas son proteínas básicas de 70-125 aminoácidos. Se diferencian basándose en la posición de los residuos de cisteína (C) en la región N-terminal de dicha proteína, diferenciándolas en quimioquinas C, CC, CXC, y CX3C. Las quimioquinas CXC a su vez se subdividen en ELR+ y ELRsegún la presencia o la ausencia del triplete de aminoácidos Glu-Leu-Arg que preceden la primera cisteína de la secuencia de los aminoácidos de la quimioquina. Existen varios tipos de células que producen estas quimioquinas. Las quimioquinas ejercen funciones sobre una o varias clases de células mononucleares (macrófagos, DCs), eosinófilos y basófilos; los ELR+CXC actúan sobre los neutrófilos; los ELR-CXC atraen linfocito. Las quimioquinas CCL2, CCL3, y CCL20 tienen funciones protectoras contra la Salmonella pero también conducen a la destrucción tisular mediante el flujo masivo de las células inflamatorias hacia los órganos infectados (Coburn et al., 2007; Badia, 2012). Máster en nutrición animal IAMZ 2013 7 1-5-2.Citoquinas: En general la comunicación entre las células inmunitarias se hace mediante las citoquinas. Las citoquinas juegan un papel importante en la iniciación y la regulación tanto en la respuesta inmune innata como la adquirida frente a la Salmonella. Se producen por diferentes tipos de células y actúan sobre varias células. Los experimentos en cultivos celulares demuestran que la Salmonella puede provocar la síntesis de citoquinas y quimioquinas en las células epiteliales, macrófagos y las DCs (Coburn et al., 2007). Existen varios tipos de citoquinas como las interleuquinas (regulacion de la interaccion entre linfocitos y otros leucocitos), interferones, factores de necrosis tumoral, factores de crecimiento (Badia, 2012). El interferon (IFN)-y, IL-12, factor de necrosis tumoral (TNF)-α, IL-18, factor transformador del crecimiento –β y las quimioquinas CCL2 tienen funciones protectoras durante la infección por la Salmonella, mientras que IL-4 y IL-10 interfieren con las defensas del huésped. La neutralización del (IFN)-y conduce a la disminución de la destrucción de la Salmonella mientras que la neutralización del (TNF)-α resulta en un incremento de la replicación bacteriana (Coburn et al., 2007). La producción de citoquinas y quimioquinas no solamente tiene efectos beneficiosos para el huésped sino también conduce a unas repercusiones patológicas para el huésped. Las quimioquinas MCP-1, CCL2, CCL20 y CCL3 tienen funciones protectoras contra la Salmonella pero también pueden conducir a la destrucción tisular a través la activación de un flujo masivo de células inflamatorias en los órganos afectados (Coburn et al., 2007). Se diferencian tres grupos basándose a su función biológica (Badia, 2012): - mediadores y reguladores de la respuesta innata: Su secreción por los fagocitos mononucleares es la consecuencia en respuesta a los agentes infecciosos tras el reconocimiento de los patrones moleculares asociados a los patógenos o PAMPs “Pathogen Associated Molecular Patterns” (expresadas por varios agentes infecciosos) mediante los receptores de reconocimiento de patrones o PRRs “Pattern Recognition Receptor” (como los TLRs). Entre estas citoquinas están las interleuquinas (IL6 y IL1), el factor de necrosis tumoral-α (TNFα) o los interferones de tipo I (IFN, relacionados con la respuesta frente a los virus). Estas citoquinas tienen efectos sobre las células endoteliales, leucocitos, actividad proinflamatoria. Otros tipos de células pueden producir las citoquinas de este grupo. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 8 - mediadores y reguladores de la respuesta adquirida: El conocimiento específico del antígeno extraño por los linfocitos T conduce a la liberación de citoquinas por estas células como para ejemplo las citoquinas IL2, IL4, IL12 y IFNy que regulan la proliferación y la diferenciación de diversas poblaciones linfocitarias estableciendo la respuesta adquirida celular o humoral. - factores estimuladores de la hematopoyesis: Las células estromales de la médula ósea producen estas citoquinas. Tienen funciones sobre el crecimiento y la diferenciación de leucocitos inmaduros como por ejemplo el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos. Una parte de nuestro trabajo de investigación se enfoca en la evaluación de la expresión génica de determinadas citoquinas relacionadas con la repuesta innata y adquirida. 2-Brotes de intoxicaciones alimentarias causados por Salmonella: En la UE, S. Enteritidis y S. typhimurium son los serotipos más frecuentemente asociados con enfermedades humanas. Los casos de brotes en humanos causados por S. Enteritidis son comúnmente asociados con el consumo de huevos contaminados y carne de pollos, mientras que los casos de brotes causados por S. Typhimurium son en su mayoría asociados con el consumo de de carne de cerdo contaminado, carne de pollo y también carne de bovino (EFSA 2011a). Cualquier serotipo que no es adaptado para un huésped, como por ejemplo la S. Enteritidis (Tabla 1) es capaz de causar enfermedades gastrointestinales en los seres humanos, y por lo tanto debe ser considerado de potencial importancia para la salud pública (EFSA 2011b). La Salmonella tiene una tolerancia adaptativa frente a la acidez gástrica que podría promover su supervivencia en el entorno de bajo pH del estómago. Las especificidades huésped y los síntomas de las enfermedades que se producen por algunos de los miles de serotipos de Salmonella se indican en la Tabla 1 (Haraga et al., 2008). Máster en nutrición animal IAMZ 2013 9 Tabla 1: Ejemplos de serotipos Salmonella enterica; sus hospederos y enfermedades. Serotipo de Salmonella enterica La especificidad para el huésped Enfermedades y síntomas Tifoidea Typhi; Paratyphi Restringida para seres humanos Fiebre entérica: fiebre, dolor abdominal, diarrea o estreñimiento transitorio y una erupción de color salmón en el tronco No tifoidea Typhimirium; Enteritidis Amplio rango Gastroenteritis: dolor abdominal, vómitos y diarrea inflamatoria En general, estos brotes causados por salmonella en humanos se caracterizan por un cuadro clínico que puede incluir fiebre, diarreas, dolor abdominal, náuseas y vómitos (Lax et al., 1995; EFSA 2011a). El período de incubación para la manifestación de los síntomas es de 6 a 72 horas después de la ingestión del alimento o el agua contaminado. En casos no complicados, la evolución aguda de la gastroenteritis se resuelve generalmente dentro de 48 horas. Sin embargo, en algunas ocasiones la enfermedad puede durar más tiempo, con diarreas persistentes y fiebre baja durante 10-14 días. Las versiones sistémicas más graves se producen en personas vulnerables, como individuos inmunodeprimidos, los niños pequeños, los ancianos que tienen menos capacidad para iniciar la resistencia a la infección (Lax et al., 1995; ManiLópez et al., 2012). 3Prevalencia Salmonella en seres humanos en la UE En esta revisión, la salmonelosis se refiere a la salmonelosis no tifoidea que se asocia más frecuentemente con la intoxicación alimentaria. Un total de 108.614 casos confirmados de salmonelosis humana se registraron en 27 estados miembros europeos a través del sistema de vigilancia uropea en 2009. La tasa de notificación de la UE fue de 23,7 casos por cada 100.000 habitantes, que van desde 2,1 en Portugal a 100,1 casos confirmados por cada 100.000 habitantes en la República Checa. Como en años anteriores, S. Enteritidis y S. Typhimurium fueron los serotipos más frecuentes (75,6% de todos los serotipos notificados). (EFSA 2011a). Máster en nutrición animal IAMZ 2013 10 S. Enteritidis fue el serotipo predominante asociado con los brotes de Salmonella. En Europa ésto fue causado por S. enteritidis fagotipo PT4 mientras en Estados unidos los tipos más frecuentes son PT8 y PT13a (Desmidt et al., 1997). En 2009 según datos del informe EFSA, S. Enteritidis representó el 59,6% de todos los brotes causados por Salmonella, el 73,1% de las hospitalizaciones y el 66,7% de los casos de defunciones. S. Typhimurium causó el 15,7% de los brotes verificados, el 10,9% de todas las hospitalizaciones y el 33,3% de todas las muertes en 2009. Un 17,9% de los brotes verificados causados por Salmonella, no fue serotipado. (EFSA 2011b). La incidencia global de salmonelosis humana en los países europeos ha sido decreciente desde 2006 hasta 2009, que se explica principalmente por una tendencia a la baja en el número de infecciones causadas por S. Enteritidis (Tabla 2). Tabla 2: Serotipos más aislados de Salmonella reportados en los casos de salmonelosis en humanos confirmados en la UE (EFSA 2011b). Serovar 2009 2008 2007 2006 N % N % N % N % S. Enteritidis 53.382 52,3 70.091 58 81.472 64,5 90.362 71 S. Typfimirium 23.759 23,3 26.423 21,9 20.781 16,5 18.685 14,7 S. Infantis 1.616 1,6 1.317 1,1 1.13 1 1.246 1 S. Bovismorbificans 433 0,4 501 0,4 np np np np S. Hadar 507 0,5 np np 479 0,4 713 0,6 S. Virchow 736 0,7 860 0,7 1.068 0,8 1.056 0,8 S. Derbey 671 0,7 624 0,5 469 0,4 477 0,4 S. Newport 760 0,7 787 0,7 733 0,6 730 0,6 S. Stanley np np 529 0,4 589 0,5 522 0,4 S. Agona np np 636 0,5 387 0,3 367 0,3 S. Kentucky 460 0,4 497 0,4 431 0,3 357 0,3 S, Saintpaul 452 0,5 np np np np np np Other 19.225 18,8 18.495 15,3 18,562 14,7 12.79 10 Total 102.001 120.76 126.281 127.305 Unknow 6.613 6.636 9.814 17,359 np: no presentada en los datos publicados. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 11 Los datos de la Tabla 2 muestran que en los países de la unión europea en el período de 2006 a 2009, sumando S. Enteritidis y S. Typhimurium fueron encontrados al menos en el 75% de todos los casos notificados de salmonelosis humana. Hay que señalar que el número de infecciones humanas asociadas con S. Enteritidis tiene una tendencia a la baja desde el año 2006 a un ritmo creciente, con una disminución aproximada del 10% entre 2006 y 2007 a una reducción aproximada del 24% entre 2008 y 2009. Por el contrario. Los casos de infecciones causados por S. Typhimurium aumentaron alrededor del 40% entre 2006 y 2008. 4-La Salmonella en gallinas ponedoras: Las ponedoras representan el reservorio más importante de la salmonelosis humana causada por Salmonella Enteritidis a través el consumo de huevos y ovoproductos contaminados. Una revisión de la literatura indica que en los brotes que se producen en la UE relacionados con el consumo de huevos u ovoproductos, el 97% de los casos fue causado por S. Enteritidis mientras que el 2% de los casos la S. Typhimurium ha sido la agente causal. Esto está relacionado con la mayor capacidad que tenga S. Enteritidis para colonizar el epitelio reproductivo de la gallina respecto a otros serotipos (EFSA, 2010). En Dinamarca, la proporción de las manadas de ponedoras infectadas se redujo de 13,4% en 1998 al 0,4% en 2006 y eso fue de forma paralela con el número de casos de salmonelosis humana asociada al consumo de huevos contaminados que a su vez se redujo de 3.000 casos en 1997 a 100 casos en 2006 (Korsgaard et al., 2009 citado por EFSA, 2010). Los brotes causados por Salmonella Enteritidis pueden ocurrir tras el contacto con la cascara del huevo y/o el consumo del contenido interno del huevo, sin embargo el impacto de la contaminación humana con la cascara del huevo en la salud pública se considera menor en comparación con la transmisión por huevos contaminados internamente con Salmonella Enteritidis. Esto está relacionado con la persistencia en la colonización del tracto reproductivo de la gallina por este serotipo (S. Enteritidis), lo que resulta en la producción de huevos contaminados, por lo tanto las infecciones humanas se pueden reducir considerablemente mediante la prevención y el control de las infecciones por S. Enteritidis en gallinas ponedoras (EFSA, 2010). Máster en nutrición animal IAMZ 2013 12 5-La Salmonella en la carne de broilers: La carne de los pollos es muy perecedera debido a su composición nutricional enriquecida, alto pH (5,5 a 6,5) y una alta actividad agua (0,98-0,99), que favorecen la supervivencia y el crecimiento de casi cualquier microorganismo contaminante (Mani-López et al., 2012). Las industrias de la carne y el pollo de engorde se consideran como un reservorio de Salmonella muy importante en cuanto a la transmisión alimentaria. Durante muchos años, la Salmonella se ha asociado a la carne de los pollos de engorde, debido a su presencia en las heces, la suciedad de las plumas, las canales, así como la suciedad de los equipos del matadero y su papel en la contaminación de las canales durante el sacrificio de los pollos. La mayoría de las cepas de S. Enteritidis y S. Typhimurium que pueden infectar los pollos de engorde son de mayor importancia para la salud pública a través productos como los huevos, carne de cerdo, carne de bovino, productos lácteos o incluso animales de compañía que pueden presentar un riesgo mayor para la salud pública (EFSA 2011b). En la Figura 2, se presentan los resultados de la distribución de la frecuencia de los 5 serotipos mas encontrados en la salmonelosis humana en el año 2009 realizados a partir de encuestas para los diferentes países europeos tanto en granjas de pollos de engorde como en canales de broiler. Figura 2: Distribución relativa de S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis, S. Newport, y S.Virchow, realizada con encuestas para manadas de broiler (F) y encuestas para canales de broiler (C) en 18 países europeos. El número en la parte superior de cada barra representa el número total de muestras positivas en cada uno de los estudios de referencia pertinentes. (EFSA 2011b). Máster en nutrición animal IAMZ 2013 13 En el caso de España (ES) en 2009 se ha detectado 164 manadas de pollo de engorde positiva a la Salmonella en las que S. Enteritidis representa casi el 70% de los serotipos identificados y casi el 40% de las 58 canales positivas a la Salmonella, también se observa que tanto en manadas de pollos como en canales de pollos, S. Enteritidis representa el serotipo más encontrado en año 2009 en el caso de España. Por lo tanto el control de la ocurrencia de S. Enteritidis debe realizarse no sólo en las gallinas reproductoras para disminuir su transmisión vertical a las líneas de producción (gallinas ponedoras y pollos de engorde), y en gallinas ponedoras para evitar su presencia en los huevos, sino también en la reducción continua de la prevalencia de S. Enteritidis, en la producción de pollos (EFSA 2011b). 6-Estrategias nutricionales para combatir la salmonella: 6.1Antibióticos: Además de sus efectos curativos, los antibióticos también se administraban en los piensos de pollos por sus efectos promotores del crecimiento. La mayoría de los antibióticos promotores de crecimiento actuaban mediante la modificación de la flora intestinal, especialmente dirigidos a las bacterias gram-negativas que no son patógenas y que están asociadas a un peor estado de salud y unos bajos rendimientos productivos (Bedford, 2000). Estas bacterias pueden perjudicar el índice de conversión y el crecimiento de los pollos debido a la competencia de estas bacterias con el huésped para los nutrientes en el tracto intestinal, la degradación de las enzimas del huésped y la reducción de la superficie de absorción. En algunos casos, estas bacterias pueden provocar una respuesta inmune que, como efecto secundario, provoca la reducción del apetito y el catabolismo de las proteínas musculares. Uno de los mecanismos subyacentes a estos fenómenos es la producción masiva del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). Por estas razones, los antibióticos se han utilizado durante muchos años como promotores del crecimiento. Recientemente, sin embargo, surgieron preocupaciones sobre el uso de los antibióticos en el ganado por el hecho de que estaban vinculados a la aparición de múltiples bacterias resistentes a los medicamentos (Wray y Davies, 2000). En general, las mayores cantidades de los antibióticos se usaban para la profilaxis o sobretodo como promotores del crecimiento en la alimentación animal. Esto resultaba en una exposición de un gran número de animales, independientemente de su estado de Máster en nutrición animal IAMZ 2013 14 salud, a una concentración frecuentemente subterapéutica de estos antibióticos (Dupont y Steele, 1987; Franco et al., 1990). Además, estos antibióticos que se administraban a los animales eran compuestos estrechamente relacionados con los que se utilizan en la terapia humana y que estaban ejerciendo una presión selectiva sobre sus bacterias dianas desde hace unas décadas (Witte, 1998), lo que puede generar un reservorio de bacterias resistentes a los antibióticos. Las bacterias resistentes a los antibioticos en los animales amenazan el uso de los medicamentos utilizados en humanos cuando estas bacterias resistentes a los antibióticos o los genes resistentes sean incorporados en las poblaciones bacterianas del hombre (Smith et al, 2002). En un estudio realizado en Brasil (Dias de Oliveira et al., 2005), sobre la resistencia de la salmonella a diferentes antibióticos (12 antibióticos) con 91 cepas de Salmonella Enteritidis aisladas de alimentos, humanos, aves y canales de broiler, han notado una tasa de resistencia del 98% de unas cepas de S.Enteritidis aisladas desde muestras de canales de broilers y aves, y una resistencia a las sulfonamidas del 88.2% desde muestras aisladas del ser humano. También en otro estudio de Ling y Wang (2001) en Singapur encontraron una tasa de resistencia a las sulfonamidas del 75.3% de cepas de S.Enteritidis aisladas desde muestras de humano y de piensos para pollos. En otro trabajo de comparación realizado en España entre el año 1993 y el año 2006 sobre la prevalencia y la resistencia antimicrobiana de serotipos de salmonella aisladas de canales de pollos , se ha visto que la prevalencia de salmonella disminuyó del 55% de las muestras en el año 1993 al 12% de las muestras en el año 2006 con una diferencia significativa, y esto fue acompañado con que el número promedio de los antibióticos a los que las cepas de salmonella eran resistentes fue menor (P<0.05) en el año 1993 (3,98) que en año 2006 (5,00), también se observó un aumento de la incidencia de la resistencia a la cefalotina, enrofloxacina y la tetraciclina en el año 2006 respecto el año 1993 (Álvarez-Fernández et al., 2012). Entonces las disminuciones en la prevalencia de Salmonella entre 1993 y 2006 sugieren que las medidas obligatorias introducidas a lo largo de la última década en la Unión Europea para reducir la incidencia de Salmonella en pollos, aparentemente han tenido éxito. Sin embargo, el aumento en las tasas de resistencia a los antibióticos constituye una amenaza para la salud pública, debido a que los datos de este estudio demuestran que el pollo en España (el caso de noroeste de España en este estudio) es una fuente potencial de cepas de Salmonella resistentes a los antibióticos. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 15 Por lo tanto la inhibición de la Salmonella mediante los antibióticos no parece ser práctica debido a la resistencia bacteriana desarrollada por esas bacterias frente a los antibióticos y también a la toxicidad producida por los residuos de los antibióticos en la carne de los animales. 6.2-Probióticos: Los probióticos se definen como cultivos simples o mixtos de microorganismos vivos que, cuando se aplica a los animales o al hombre, afectan beneficiosamente al huésped mejorando las propiedades de la microflora indígena. Las bifidobacterias y lactobacilos son considerados como microorganismos beneficiosos, creando condiciones desfavorables para el crecimiento de patógenos, tales como Salmonella (Fernandez et al., 2002). Ellos pueden ser mezclas indefinidas de bacterias, generalmente denominados productos de exclusión competitiva (EC) (Ducatelle et al., 2001). Se refiere por “La exclusión competitiva” a la reducción de la colonización intestinal por las bacterias patógenas entéricas tales como Salmonella y Campylobacter por la microflora ya presente en el tracto gastrointestinal (Vilà et al., 2010), no necesariamente con una mejora en el rendimiento. Algunos de estos productos se pueden añadir directamente a los piensos, pero muy a menudo se administran a través del agua de bebida o por pulverización directa sobre las aves (Ducatelle et al., 2001). La mayoría de los productos usados como probióticos para piensos están compuestos de un número limitado de microorganismos: Lactobacillus spp. (principalmente L. acidophilus), Streptococcus faecium, Bacillus spp, y levaduras, especialmente las especies de Saccharomyces. Las especies de Lactobacillus y S. faecium están normalmente presentes en el tracto gastrointestinal, mientras que las especies de Bacillus y las levaduras son esporádicamente presentes en la microflora intestinal (Vilà et al., 2010). Otro enfoque reciente se basa en el uso de ciertos carbohidratos en la dieta de los pollos para reducir la colonización de Salmonella en el intestino. Como se indicó anteriormente, los receptores de los carbohidratos en las superficies de las células epiteliales intestinales aparentemente sirven como receptores para la unión de algunas bacterias patógenas. La interacción entre las lectinas de las bacterias gram-negativas y estos receptores puede ser bloqueada por ciertos carbohidratos en la alimentación animal. Se ha descrito que algunos tipos de hidratos de carbono, levaduras, y, especialmente, el residuo de manosa son efectivos en la prevención de la colonización de Salmonella (Vilà et al, 2012). Máster en nutrición animal IAMZ 2013 22 IVMATERIALES: 1-Animales: Quinientos cuarenta (540) pollitos broiler machos de un día de vida de la estirpe comercial Ross 308. 2-La bacteria Salmonella Enteritidis: La bacteria utilizada fue proporcionada por el Dr. Badiola, del Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA). El microorganismo Salmonella enterica var. Enteritidis se ha cultivado durante 18h a 37ºC en caldo de cultivo tryptic soy agar (Difco, Barcelona, Spain), suplementado con 200 μg/mL de nalidixic acid (Sigma-Aldrich, Madrid, Spain). El inóculo se ha obtenido preparando una suspensión en Phosphate Buffered Saline pH 7.2 (PBS) para una densidad óptica de 0.824 a 450 nm y una dilución posterior en PBS para ajustar la concentración del inóculo. 3-Los prebióticos: 3.1-Salmosan: El Salmosan© es una mezcla de varias gomas y otros compuestos (goma de guar, goma de xantano, pectina, goma de tragacanto, goma Arábica, algina, carragenina, goma de algarrobo, semilla de algarroba, goma de casia y harina de palmiste). Tiene 77,7% de polisacáridos no digestibles, y de estos polisacáridos el 98% son β-galactomananas (βGM). El βGM está basado en una cadena principal de manosa con enlaces β-(1→4) y de residuos de moléculas de galactosa unidas en una proporción de 1:4 galactosa: manosa. El producto comercial Salmosan© contiene menos del 1% de otros polisacáridos como la arabinosa, xilosa, fructosa, glucosa, galactosamina y fucosa. El producto fue desarrollado por el Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA) y regulado en base a la patente WO 2009/144070 A2, producido y comercializado por la empresa Industrial Tecnica Pecuaria (ITPSA, Barcelona, España), y se ha procesado industrialmente para ser soluble en el intestino por llevar la enzima β-mananasa que implica una buena difusión dentro del intestino permitiendo una eficacia mayor del producto hasta con inclusiones bajas (en orden del 0.5%) en el Máster en nutrición animal IAMZ 2013 23 pienso para llegar al efecto deseado en la inhibición de la colonización de Salmonella en el tracto digestivo (Badia, 2012). 3.2-La goma de Duraió: Es una variedad de Algarrobo. Se llama también “De Durayo”, “Duraiona” “Oraiona” el árbol se cultiva en toda la cordillera del norte (Sta. Maria, Consell y alaro) de Mallorca. La “Galactomanana” o goma de garrofin, que tiene el nombre comercial de “Locust Bean Gum” (LBG) es un polisacárido formado por la combinación de unidades de galactosa y manosa en una proporción 1:4. Se obtiene mediante la molienda del endospermo (42-46% peso semilla) de las semillas de la algarroba tras su separación de la cutícula y del germen con un rendimiento industrial de extracción alrededor del 3638% del peso de las semillas. El 88% del endospermo es bajo forma de Galactomanana, mientras que el resto está formado de proteína, celulosa y cenizas. Se disuelve bien en agua y es insoluble en la mayoría de los disolventes orgánicos con propiedades como agente espesante, estabilizante, emulsionante, y gelificante y se caracteriza por su alta viscosidad en soluciones acuosas; es capaz de absorber hasta 40 veces de su peso seco (Batlle y Tous, 1989). La Duraió se ha introducido en el pienso con una preparación que lleva 90% de goma de Duraió y 10% de un excipiente (Sipernet®) para facilitar la dispersión del Duraió dentro del pienso. 4β-mannanasa: La β-mananasa es una enzima con un peso molecular comprendido entre 50 y 53 kDa, estable a pH alcalino y con una actividad degradativa óptima a pH 7-8. Esta enzima da lugar a mono y oligosacáridos como productos de degradación. Se ha visto que el uso de la β-mananasa a concentraciones bajas induce la ruptura de la cadena principal de glucomanano de konjac proporcionando Di-, Tri-, y oligosacaridos de unidades de manosa y/o galactosa (Álvarez Manceñido, 2007). La enzima β-mananasa que hemos usado fue aportada por parte de la empresa Industrial Tecnica Pecuaria (ITPSA, Barcelona, España). En este experimento se ha usado la β-mananasa con nivel de incorporación de 0.4% en una premezcla que contiene la Duraió (90%) y sipernet (10%) (Tabla 5). Máster en nutrición animal IAMZ 2013 24 VMETODOS: 1-Condiciones experimentales: 1.1-Alojamiento: El ensayo se ha realizado en la estación experimental del IRTA “Mas de Bover”, Constantí, España. 1.2-Duración del ensayo: El ensayo ha tenido una duración de 31 días en granja. 1.3-Alojamiento y manejo: La sala ha estado iluminada por luz artificial programable, calefacción automática por pantallas de gas infraconic y ventilación forzada por depresión. El programa de temperatura se ha ajustado de acuerdo al programa habitual utilizada en la granja: 0-2 días 32-34ºC; 3-7 días 27-30ºC; disminuyendo 3ºC por semana hasta los 21ºC. El programa de luz ha sido de 24 horas durante los dos primeros días, 18 horas hasta los 7 días, y 14 horas después. La sala había sido limpiada, desinfectada y realizado un vacío sanitario antes del inicio del experimento. Se ha utilizado la yacija habitual consistente en virutas de madera. 1.4-Programa de alimentación: Todos los animales del ensayo han tenido el mismo programa de alimentación en una fase de 0 a 31 días. El pienso se ha suministrado en forma de harina. Tanto el agua como el pienso se han suministrado ad libitum. Los cinco tratamientos tienen el mismo nivel energético y proteico (isonitrogenadas e isoenergéticas). Las dietas se han formulado a base de trigo y harina de soja como componentes principales según las necesidades de los pollos recomendados por “National Research Council, 1994” mediante el programa Brill. Los productos prebióticos (Salmosan, Duraió gum) y enzimas (β-mananasa) como nuevos ingredientes con una tasa de inclusión del 0.1%, se añadieron “on top” en los tratamientos correspondientes (Tabla 5). Los piensos no han incluido coccidiostatos ni antibióticos. La composición y la composición nutricional calculada de la dieta base se detallan en la Tabla 3. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 25 Tabla 3: ingredientes y composición nutricional calculada de la dieta base. Ingredientes Cantidad (%) Trigo 31.5 Harina de soja 48% 22.8 Maiz 15.0 Cebada 15.0 Soja entera extrusionada 10.0 Manteca 1.84 Fosfato dicàlcico 1.56 Carbonato càlcico 0.90 Cloruro sódico 0.46 Corrector vitamínico-mineral1 0.30 L-Lisina 0.25 DL-methionina 0.23 L-treonina 0.08 Cloruro de colina 0.04 Etoxiquin (antioxidante) 0.02 Nutrientes calculados Materia seca * 88,9 EMAn kcal/kg 2895 Proteina bruta * 21,9 Extracto etero * 4,7 Cenizas * 5,5 Fibra bruta 3,2 Sodium 0.2 Colina 0.2 Calcium 0.9 Fósforo total 0.7 Cloruro * (%NaCl) 0,7 Fósforo no fitico 0.4 Lisina 1.3 Treonina 0.9 Methionina 0.5 Met-Cys 0.9 Triptofano 0.3 Isoleucina 0.9 Valina 1.0 Arginina 1.4 1 Corrector vitamínico-mineral proporcionado por kg de pienso: vitamina A (E-672) 13500 UI; vitamina D3 (E-671) 4800 UI; vitamina E 45 mg; vitamina B1 3 mg; vitamina B2 9 mg; vitamina B6 4.5 mg; vitamina B12 16.5 µg; vitamina K3 3 mg; Ácido Pantoténico 16.5 mg; àcido nicotínico 51 mg; àcido fólico 1.8 mg; biotina 30 µg; Fe 54 mg; I 1.2 mg; Co 0.6 mg; Cu 12 mg; Mn 90 mg; Zn 66 mg; Se 0.18 mg; Mo 1.2 mg. * Valores analizados en laboratorio. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 26 2-Tratamientos y diseño experimental: El ensayo se ha realizado en una sala con parques en suelo del IRTA. Los pollos se han distribuido totalmente al azar en 18 parques de 1.5×1.5=2.25 m2, alojando 30 animales en cada parque. El diseño experimental del ensayo ha sido un diseño aleatorio. Había un total de 5 tratamientos, con 4 parques de 30 animales cada uno, excepto el tratamiento no inoculado no tratado (UUt) que sólo tenía 2 parques según como se muestra en la tabla 4 y la figura 4. Tabla 4: Distribución de los tratamientos según desafío con Salmonella, contenido en prebióticos (Salmosan o Duraió) y/o enzima (β-mannanasa), número de parques dedicado a cada tratamiento. Código del tratamiento Desafío con Salmonella Tratamiento Numero de parques T1 U Ut 2 T2 I Ut 4 T3 I TS: Salmosan 1000 mg/kg de pienso 4 T4 I TD : Duraió gum (90% Duraió gum + 10% sipernet) 1000 mg/kg de pienso 4 T5 I TDβ : Duraió gum (90% Duraió gum + 10% sipernet) + β-mannanase (0.4%) 1000 mg/kg de pienso 4 U: No inoculados. Ut: No tratados. I: Inoculados. TD: tratamiento con Duraió. TS: tratamiento con Salmosan. TDβ: tratamiento con Duraió + β-mannanase. Figura 4: distribución de los tratamientos. T1 T3 T5 T2 T4 T5 T3 T4 T2 T1 T2 T4 T5 T3 T2 T5 T3 T4 Máster en nutrición animal IAMZ 2013 27 3-Desafío con Salmonella Los animales correspondientes a los tratamientos con desafío han sido inoculados oralmente a 7 días de edad con 1 mL de inóculo conteniendo 108 UFC (Units Forming Colony) de S. Enteritidis (phage-type 4, nalidixic acid resistant strain, field isolate, CReSAS3146). Se han inoculado solamente la mitad de los animales de cada parque, que han sido marcados para identificarlos como “seeders”. Para facilitar la transmisión horizontal de Salmonella el pienso se ha suministrado en los comederos en platos en el suelo mientras que los pollos que no fueron inoculados con Salmonella (T1), el pienso se ha suministrado en comederos colgados. 4-Determinación de la presencia de Salmonella a nivel de ciegos: A 11d, 14d y 21dia se han sacrificado 2 o 3 animales “seeders” por réplica (10 animales por tratamiento) para determinar la presencia o ausencia de Salmonella en ciegos. Los pollos fueron sacrificados por dislocación cervical. Uno de los dos ciegos de cada pollo se ha obtenido de forma aséptica, se han colocado en recipientes estériles. La recuperación de la Salmonella Enteritidis se ha realizado de acuerdo con el método estándar ISO modificado en el CReSA. Brevemente, la muestra se ha colocado en un contenedor de plástico estéril con Buffered Peptone Water (1.07228, Merck, Darmstadt, Germany) en una proporción 1:10 y ha sido homogeneizada; después de una incubación durante 18 h a 37ºC, tres alícuotas del caldo de preenriquecimiento, con un volumen total de 0.1 mL, se han inoculado en medio semisólido selectivo para la Salmonella; Rappaport-Vassiliadis (RVS) las placas RVS inoculadas se han incubado a 42ºC durante 48 h. El sistema GNI Vitek (bioMérieux, Madrid, Spain) y PCR con primers específicos se han utilizado para confirmar la presencia de Salmonella entérica serotipo Enteritidis. 5-Estudio inmunológico: Hemos estudiado el efecto in vivo de los β-galactomananos y la inoculación con Salmonella sobre el sistema inmune de la mucosa intestinal de los pollos (de los animales sacrificados a día 11 de edad que corresponde a 4 días post inoculación donde la expresión génica es máxima). Determinación de la expresión de ARNm de los genes relacionados con la respuesta inmune innata: Los genes evaluados fueron GIFN, IL-10, TNF-α. IL-2, TLR 2, MHC-I, Máster en nutrición animal IAMZ 2013 28 MHC-II y como control GAPDH (Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) (realizado en el CReSA). Las muestras se han procesado de la forma siguiente: a. Recolección de las muestras: Los animales han sido sacrificados con dislocación cervical. Se han tomado muestras de raspado de mucosa de íleon (aproximadamente 0.5 g en la zona del divertículo de Meckel) de 2 o 3 animales “seeders” por réplica (entre 8 y 12 animales por tratamiento), que han sido inmersas en 1 mL de solución conservante RNAlater (Ambion) (eppendorf+RNAlater pesados). b. Extracción de ARN: Se ha realizado una homogenización mecánica de las muestras mediante Tissue Ruptor System (Qiagen, SG Servicios Hospitalarios). La purificación de ARN Se ha realizado mediante un protocolo de extracción con fenol: cloroformo (Trizol®, Invitrogen). c. Retrotranscripción: La retrotranscripción es el método por lo cual se sintetiza el ADN complementario (ADNc) a partir del ARN previamente aislado. Para la síntesis del ADNc se ha utilizado el kit Transcriptor high fidelity cDNA synthesis kit (Roche) donde se incuba 1µg de ARN, 2 µl de dNTP , 1µl de oligodT (2.5 µM), 1.1µl de la enzima Transcriptor high fidelity reverse transcriptase (10U/µl), 4 µl de tampón per Transcriptor high fidelity reverse transcriptase 5X, 1 µl de DTT (5mM) y se completa el volumen con agua ultra-pura hasta un volumen final de 20 µl. la reacción se realiza a 45ºC durante 30 minutos y se inactiva a 85ºC durante 10 minutos. La reacción de retrotranscripcion se hizo usando un termociclador MiniCycler™ (MJ Research). Las muestras de ADNc se almacenan a -80ºC hasta el análisis. d. Cuantificación de ARNm: Para la reacción de amplificación y cuantificación se ha usado un termociclador LightCycler® 2.0 Real-Time PCR System (Roche) así como el kit Light Cycler faststart DNA master Syber green (ref. 2239264, Roche). Los “primers” para la cuantificación del mRNA de cada uno de los genes analizados, han sido diseñados mediante Oligo6 software, a partir de las secuencias disponibles en las bases de datos. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 29 6-Estudio del perfil de los ácidos grasos volátiles. A 22 días de edad, de 3 animales “seeders” por parque (12 animales por tratamiento), se ha recogido 0.5 g de contenido cecal de cada uno de los tres pollos, se han mezclado y se han diluido en la misma cantidad (1.5 ml) de agua destilada con 0.15 ml de solución conservante del 5% ácido ortofosfórico con 1% cloruro de mercurio, agitando vigorosamente. Las muestras se han conservado a -18 ºC. La preparación de la muestra, a la que posteriormente se le realizaría su análisis cromatográfico, consistió en poner en un tubo de cristal 1 ml de esta preparación previamente descongelada y homogenizada en vortex, a las que se añadieron 100 µl de solución del patrón interno (ver su preparación en anexo 1), sometiéndolas a agitación hasta conseguir una suspensión lo más homogénea posible. Posteriormente, se adicionaron 2 ml del éter etílico y 0.5 ml de HCl 37% agitando durante 1 minuto. Los tubos se centrifugaron a 3500 rpm durante 15 minutos. Para comenzar la etapa analítica se trasvasó el sobrenadante (65 µL) a un vial donde previamente se han puesto 10 µl de la solución derivatizante “MTBSTFA” (N-metilN(tert-butildimetilsilil)-trifluoracetamide), para su inyección en un cromatógrafo de gases “GC 6890” después de homogenizar y dejar reaccionar a 80ºC durante 30 minutos. La cuantificación se hizo por patrón externo utilizando los estándares descritos en el anexo 1 con sus tiempos de retención. Las condiciones del cromatógrafo están mostradas en el anexo 2. 7-Determinación de la viscosidad intestinal: A 31 días, 4 animales por parque, 16 animales por tratamiento y de cada animal se ha recogido el contenido del íleo, y se han mezclado los cuatro contenidos de cada parque en el mismo tubo, inmediatamente después de la recogida de las muestras los tubos se pusieron para el análisis tras su centrifugación con el método siguiente: Coger el contenido intestinal desde el divertículo de Merckel hasta 15 cm antes de la conjunción de los ciegos, estando el animal con intestino lleno. Poner el contenido intestinal dentro de un tubo de centrifugación de plástico. Centrifugar durante 10 min a 7000 rpm a 10ºC. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 30 Con el sobrenadante de cada tubo de centrifugación, se hacen dos lecturas tras llenar 2 tubos Eppendorf, que se mantienen en hielo hasta que se haga la lectura de la viscosidad. Hacer la lectura de cada Eppendorf en el viscosímetro Brookfield. La viscosidad se mide manteniendo las muestras en un baño termostático a 30ºC. Los valores están expresadas en cps (centipoise). 8-Controles productivos: Tanto los animales como el pienso consumido se han pesado por replica el día 7 y el día 29 del experimento para calcular los rendimientos productivos tales como la ganancia media diaria (GMD), consumo medio diario (CMD) y el índice de conversión (IC). Los animales inoculados y no inoculados de un mismo parque se pesaron por separado para determinar el efecto de la inoculación dentro del mismo tratamiento sobre estos parámetros productivos. 9-Análisis estadístico Los datos se analizaron según el diseño del experimento. Un parque se consideró como unidad experimental para las variables de rendimientos productivos, la viscosidad intestinal y los ácidos grasos volátiles, mientras que un pollo se consideró como unidad experimental para la presencia de Salmonella y expresión génica. Tanto el factor de la inoculación como el factor del tratamiento son los factores fijos del experimento. Los datos de los rendimientos productivos, viscosidad intetinal, acidos grasos volátiles y la expresión génica se sometieron al análisis de la varianza apropiado para un diseño completamente al azar, mientras que los datos de la presencia de la Salmonella en ciegos se analizaron con la prueba no paramétrica Chi-Cuadrado (x2) utilizando el programa SAS, versión 9.2 (SAS institue, Carey, NC, USA). Se utilizó un nivel de significación de α = 10% y se ha usado el test LSD de Fisher para las pruebas de significancia. Los valores promedios con las mismas superíndices indican que no hay diferencia significativa estadísticamente (p-valor > 0.1). En cambio los valores con superíndices diferentes presentan una diferencia significativa estadísticamente (p-valor ≤ 0.1). Los datos se han estudiado con anterioridad para ver la existencia de posibles valores atípicos mediante el grafico de cajas (Box-Plot). Máster en nutrición animal IAMZ 2013 31 El modelo estadístico seria: yij= µ+ αi+ εij Donde yij es la variable respuesta (ganancia de peso, consumo del alimento, viscosidad intestinal…). µ es la media general o media de la población dentro del mismo tratamiento. αi es el efecto del tratamiento “ i ” que puede ser o el efecto de la inoculación o el efecto del prebiótico y que es común a todos los individuos que recibieron ese tratamiento (efecto fijo). εij es el residuo o error aleatorio. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 38 Tabla 10: los promedios y la desviación estándar de la viscosidad ileal de los diferentes tratamientos a 31 dias de vida. Tratamientos n Viscosidad ileal (cps2) Mean D.Est3 I-Ut 4 2.9 0.74 I-Salmosan 4 4.0 1.50 I1-Duraió 4 3.6 0.75 I-Duraió-Enz 4 3.8 1.02 Total 16 3.6 1.03 P-valor 0.49 1 I: Pollos inoculados; Ut: Pollos no tratados; Enz: β-mananasa. 2 cps: Centipoise. 3 D.Est: Desviación estándar; Mean: Promedio del variable; n: numero de observaciones. Independientemente del tipo del tratamiento los valores de la viscosidad ileal no tuvieron diferencias significativas (p-valor = 0.49) aunque el tratamiento control (I-Ut) que no haya tenido ni prebióticos ni enzimas fue el tratamiento que menor viscosidad tenia (2.9 cps) respecto los tratamientos donde había galactomananos en el pienso (3.6, 3.8 y 4.0 cps). Los pollos que fueron alimentados con Salmosan son aquellos que hayan tenido numéricamente un mayor valor de viscosidad ileal (4.0 cps) respecto a los demás aunque este producto comercial lleva enzimas para aliviar el efecto de los β-galactomananas del Salmosan que dan viscosidades altas a nivel del intestino. Los pollos que recibieron el Duraió más la enzima β-mananasa, tuvieron viscosidades más altas (2.8 cps) que aquellos que fueron alimentado sólo con el Duraió (3.6 cps) aunque la diferencia no fue significativa (tabla 10). 3-Efecto de los prebióticos y la inoculación con Salmonella sobre el perfil de los ácidos grasos volátiles También en este experimento hemos estudiado el posible efecto de los prebióticos sobre la microflora intestinal y por lo tanto la producción de los ácidos grasos volátiles. Los resultados los tenemos presentados en la tabla 11. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 39 Tabla 11: Perfil de los ácidos grasos volátiles en µmols/g en pollos de 23 días de vida, 15 días post infección Tratamiento n Fórmico Acético Propiónico Isobutírico Butírico Isoválerico Válerico Láctico Succínico AGV1 Mean D.Est2 Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est U-Ut 2 9.1a 0.83 38.1 9.30 4.7 0.24 0.3 0.01 14.4 5.44 0.0 0.00 0.8 0.16 1.4 1.33 5.5 2.86 74.3 9.66 I-Ut 4 5.4b 1.10 48.6 4.79 6.6 1.83 0.6 0.09 19.1 3.78 0.1 0.09 1.2 0.19 0.8 0.34 3.0 1.95 85.3 11.09 I3-Salmosan 4 4.2bc 0.69 44.7 2.91 5.2 2.06 0.4 0.28 16.9 2.68 0.0 0.02 1.0 0.16 0.4 0.20 3.2 1.38 76.1 6.94 I-Duraió 4 3.2c 1.47 53.7 9.94 5.2 1.18 0.2 0.17 23.4 6.92 0.0 0.00 1.1 0.38 1.4 1.57 2.4 1.27 90.7 11.70 I-Dur-Enz 4 3.9bc 0.61 47.4 7.88 5.9 3.08 0.3 0.29 18.8 5.55 0.1 0.11 0.9 0.51 9.8 13.55 3.7 1.95 90.7 8.20 p-valor *** <0.001 0.19 0.79 0.30 0.30 0.65 0.47 0.28 0.40 0.13 1 AGV: Ácidos grasos volátiles (total). 2 D.Est: Desviación estándar; Mean: Promedio del variable; n: numero de observaciones. 3 I: Pollos inoculados (1 ml de 108 UFC de S. Enteritidis); U: Pollos no inoculados; Ut: Pollos no tratados; Dur: Duraió; Enz: β-mananasa. a, b Superíndices con letras diferentes indican una diferencia significativa entre los promedios (p-valor ≤ 0.1). Máster en nutrición animal IAMZ 2013 40 La inoculación de la Salmonella a los pollos hace que las concentraciones en fórmico bajen, ya que todos los tratamientos que corresponden a los pollos inoculados tuvieron concentraciones menores respecto a aquellos que no han sido inoculados con una diferencia significativa (p-valor < 0.001). Los pollos no inoculados con Salmonella (U-Ut) tuvieron un promedio de 9.1 µmols/g frente a 5.4, 4.2, 3.9 y 3.2 µmols/g de los tratamientos “I-Ut”, “I-Salmosan”, “I-Dur-Enz” y “I-Duraió” respectivamente. También el hecho de añadir el Duraió solo a la dieta sin la enzima β-mananasa en pollos inoculados con Salmonella (I-Duraió) causa una bajada de las concentraciones del fórmico (3.2 µmols/g) respecto a la dieta que no lleva Duraió en pollos inoculados con Salmonella (5.4 µmols/g) con una diferencia significativa (p-valor < 0.1). Independientemente del factor de la inoculación con Salmonella y el factor del tratamiento con prebióticos, los cinco tratamientos tuvieron valores similares en cuanto a las concentraciones de los demás ácidos grasos volátiles (p-valor > 0.1). Cabe destacar que los pollos inoculados con Salmonella y que recibieron el Duraió mas la enzima β-mananasa (I-Dur-Enz), tuvieron concentraciones altas en acido láctico (9.8 µmols/g) respecto a los otros tratamientos pero sin diferencia significativa (p-valor = 0.28) ya que eso fue con una desviación estándar de 13.55 que fue muy alta comparándola con las desviaciones de los otros tratamientos. En cuanto a los ácidos grasos volátiles en total (AGV), los pollos que no han sido ni inoculados ni alimentados con prebióticos (U-Ut), tuvieron el valor más bajo de los AGV en total (74.3 µmol/g) respecto a los otros tratamientos pero sin diferencias significativas con los otros tratamientos: “I-Ut” (85.3 µmol/g), “I-Salmosan” (76.1 µmol/g), “I-Duraió”( 90.7 µmol/g) y “I-Dur-Enz” ( 90.7 µmol/g) (tabla 11). 4-Estudio bacteriológico (presencia y ausencia de Salmonella): Tal y como se ha comentado antes en material y métodos, el muestreo para la análisis de la presencia y aunsencia de Salmonella se ha hecho en tres periodos, a 4, 7 y 14 dias post inoculación. En la tabla 12 se presenta el número de pollos positivos a la Salmonella sobre el total de los pollos analizados en cada tratamiento y el porcentaje de la infección por periodos separados. En la tabla 13 se detallan, son los mismos datos pero durante todo el periodo independientemente del dia de muestreo post inoculación. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 41 Tabla 12: Análisis microbiológicos para la determinación de la Presencia/ausencia S. Enteritidis por periodos separados (4, 7 y 14 dias post inoculaciòn). dia post inoculacion Tratamientos Presencia/ausencia Salmonella N Pollos positivos Infección (%) 4 Control negativo (T1) 10 0 0 Control positivo (T2) 12 4 33.3 Salmosan (T3) 8 1 12.5 Duraió (T4) 11 2 18.2 Duraió+Enz (T5) 9 0 0.0 P χ2 (T2 vs T3) 0.30 P χ2 (T2 vs T4) 0.42 P χ2 (T2 vs T5) 0.06 7 Control negativo (T1) 10 0 0.0 Control positivo (T2) 8 1 12.5 Salmosan (T3) 12 0 0.0 Duraió (T4) 9 1 11.1 Duraió+Enz (T5) 11 2 18.2 P χ2 (T2 vs T3) 0.22 P χ2 (T2 vs T4) 0.93 P χ2 (T2 vs T5) 0.74 14 Control negativo (T1) 10 0 0.0 Control positivo (T2) 12 3 25.0 Salmosan (T3) 8 0 0.0 Duraió (T4) 11 2 18.2 Duraió+Enz (T5) 9 2 22.2 P χ2 (T2 vs T3) 0.13 P χ2 (T2 vs T4) 0.70 P χ2 (T2 vs T5) 0.89 N: el número total de pollos analizados en cada tratamiento. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 42 Tabla 13: Análisis microbiológicos para la determinación de la Presencia/ausencia S. Enteritidis por todo el period del experimento. Tratamiento Presencia/ausencia Salmonella N positivos Infecciòn (%) 30 0 0.0 Control negativo (T1) Control positivo (T2) 32 8 25.0 Salmosan (T3) 28 1 3.6 Duraió (T4) 31 5 16.1 Duraió+Enz (T5) 29 4 13.8 P χ2 (T2 vs T3) * 0.02 P χ2 (T2 vs T4) 0.39 P χ2 (T2 vs T5) 0.28 N: el número total de pollos analizados en cada tratamiento. Las comparaciones entre tratamientos en nuestro estudio se hicieron entre el tratamiento control positivo (pollos inoculados no tratados “T2”) y los tratamientos que llevan prebiòticos (Salmosan, Duraió y Duraió+Enz “T3, T4 y T5 respectivamente”) para ver el efecto de cada tratamiento sobre la inhibicion de la colonizacion intestinal de la Salmonella. Cuando se presentan los datos por periodo separado, no se ha detectado diferencias significativas excepto el caso entre del tratamiento T5 (Duraió+Enz) y el tratamiento T2 (control positivo) en donde no tuvimos ningún pollo positivo sobre un total de 9 pollos muestrados con una diferencia significativa (P χ2 = 0.06) en 4 dias post inoculación (Tabla 12), pero cuando se presentan los datos de la presencia /ausencia de Salmonella sin tener en cuanta el dia de muestreo post inoculación, sólo el tratamiento T3 (Salmosan) disminuyó significativamente (P χ2 = 0.02) la colonizacíon (solamente con un pollo positive sobre un total de 28 pollos muestreados en el caso del tratamiento con Salmosan, y 8 pollos positivos sobre un total de 32 pollos analizados que habian sido inoculados con la Salmonella, sin recibir ningún tratamiento -control positivo “T2”) (Tabla 13). El mismo tratamiento “T3” (Salmosan) en 14 días post inoculación tenía un 0 % de infección (0 pollos positivos en total de 8 pollos muestreados) frente al control positivo que tuvo una tasa de infección del 30 % (3 pollos positivos en total de 12 pollos muestrados) (P χ2 = 0.13) (Tabla 12). En los pollos que no han sido ni inoculados ni tratados (control negativo), no se ha observado ningúno positivo a la Salmonella en los pollos analizados en todos los periodos (Tabla 12) porque estaban Máster en nutrición animal IAMZ 2013 43 bien aislados de los pollos que fueron inoculados con la Salmonella, lo que quiere decir que no se ha transmitido la Salmonella a estos pollos a partir de los pollos inoculados que estaban a su lado (T3) (ver figura 4). Todos los tratamientos que llevan prebioticos (T3, T4 y T5) previnieron la colonización intestinal por parte de la S.Enteritidis mostrando una numéricamente menor tasa de infecciòn (% infección) respecto el control positivo (T2) (Tabla 12 y 13) excepto el caso del tratamiento 5 (Duraió+Enz) en 7 dias post inoculación que tuvo un 20 % de infección mientras que el control negativo tuvo un 10 % de infección, teniendo en cuenta que el nùmero total de los pollos muestrados en estos dos tratamientos no ha sido el mismo por un error de muestreo (un total de 11 pollos muestrados del T5 mientras que el control positivo tenia solamente un total de 8 pollos muestrados) (Tabla 12). 5-Estudio de la expresión génica a nivel intestinal: La expresión génica de las citoquinas relacionadas con la respuesta inmune a nivel intestinal está presentada respecto a la expresión génica de GAPDH (Gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa) como referencia, que no cambia su expresión génica en cualquier infección. Los datos de la expresión génica de GIFN, IL-10, TNF-α. IL-2, TLR 2, MHC-I y MHC-II por cada tratamiento se presentan en la tabla 14. La expresión génica de todas las citoquinas a nivel del intestino no marcó diferencias significativas entre los tratamientos excepto para la expresión del factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) que disminuyó en los pollos inoculados con Salmonella (un 64% de disminución T2 vs. T1) y en los inoculados del tratamiento con la Duraió (un 66% de disminución T4 vs. T1) (p-valor = 0.007) y sin diferencias significativas en relación al tratamiento con Salmosan “T3” y el tratamiento de Duraió+enz “T5” (39% reducción vs. T1) en ambos casos. Cabe destacar que las observaciones de la expresión génica del TNF-α con el tratamiento Duraió fueron más agrupadas al tener una desviación estándar más pequeña que los demás tratamientos. Se notó que el hecho de infectar los pollos con la Salmonella hace bajar numérica pero no significativamente la expresión génica del interferon gamma (GIFN; 38% disminución), el interleukin 2 (IL-2; 48% disminución), el complejo mayor de histocompatibilidad I y II (MHC-I y MHC-II; 14% y 20% de disminución respectivamente) y en menor medida el receptor de tipo Toll 2 (TLR 2; 12% disminución). Cabe notar que en el caso del TLR2, GIFN y IL-2, las observaciones de los animales infectados tanto tratados como no tratados, y en especial Máster en nutrición animal IAMZ 2013 44 el tratamiento con Duraió, tuvieron valores más agrupados que los no infectados. Esta respuesta más agrupada también se observó con TNF-α pero sólo en los tratamientos T2 (Control Positivo) y sobretodo con tratamiento T4 (Duraió). La expresión génica del interleukin 10 (IL-10) aumentó con la infección (T2, T3, T4 y T5) (145%, 201%, 271% y 136% de incremento respectivamente) aunque sin alcanzar la significancia (p-valor = 0.17). Como se ha comentado anteriormente, no hubo diferencias significativas en cuanto a la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC-II) pero se puede decir que la aportación de la β-mananasa al Duraió “T5” aumenta la expresión génica del MHC-II (1.479) respecto los demás tratamientos, también la Salmosan “T3” que lleva la β-mananasa en su composición tuvo una expresión alta del MHC-II (1.410) pero eso fue con una desviación estándar superior frente a los demás tratamientos (1.5309 vs. 0.4568, 0.6057, 0.8805 y 0.7702) (tabla 14). Máster en nutrición animal IAMZ 2013 45 Tabla 14: La expresión génica de las citoquinas a nivel intestinal 4 días post inoculación expresada con referencia a GAPDH. Tratamiento n GIFN IL2 IL10 TNFa TLR2 MHCI MHCII Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est Mean D.Est 5 1.239 0.8395 1.120 0.6019 1.091 0.5053 1.050a 0.3266 1.361 1.2153 1.102 0.4432 1.061 0.4568 Control negativo (T1) Control positivo (T2) 7 0.771 0.3748 0.575 0.2466 1.583 1.0554 0.376b 0.1543 1.203 0.8419 0.953 0.6384 0.850 0.6057 Salmosan (T3) 4 0.854 0.4625 0.849 0.5007 2.198 1.4784 0.645ab 0.4246 0.934 0.4914 0.565 0.1274 1.410 1.5309 Duraió (T4) 4 0.616 0.3337 0.590 0.1752 2.955 1.6295 0.360b 0.0361 0.607 0.0715 0.713 0.2635 1.043 0.8805 Duraió+Enz (T5) 4 0.688 0.5061 0.644 0.3438 1.485 0.8033 0.638ab 0.3961 0.801 0.3431 0.705 0.4747 1.479 0.7702 P-valor 0.44 0.19 0.17 ** 0.007 0.58 0.43 0.76 Máster en nutrición animal IAMZ 2013 46 VIDISCUSION: Los rendimientos productivos de los pollos no fueron afectados por la presencia de los galactomananos (Duraió y Salmosan) en el pienso con concentraciones del 0.1%, igual de lo que se demostró en otro experimento (Vilà et al., 2012), en donde los galactomananos de algarrobo no perjudicaron ni la ganancia media diaria ni la índice de conversión con concentraciones del 2.5% de los galactomananos de algarrobo en el pienso en pollos de 19 dias de vida, pero sí que afectó estos rendimientos productivos al 10% de inclusión en el pienso y esto fue asociado a una diminución significativa de la digestibilidad de los nutrientes. También de acuerdo con los resultados obtenidos por Biggs et al (2007), que no vieron efectos negativos de manano-oligosacaridos sobre los rendimientos productivos a concentraciones del 0.4% en pollos a 7 y 21 dias de edad. Resultados en desacuerdo con los que obtuvieron Lee et al. (2003) donde los galactomananos de guar perjudicaron significativamente el crecimiento de los pollos a concentraciones del 2.5% y del 5% que fue acompañado con un incremento significativo en la viscosidad intestinal respecto los pollos que no tuvieron galactomananos del guar en el pienso. Esto se puede explicar de un lado por las inclusiones bajas del Duraió y Salmosan que hemos utilizado en nuestro experimento (0.1%) que quizás no hayan llegado a niveles críticos para causar viscosidades altas que puedan perjudicar la digestibilidad a nivel del intestino ya que las viscosidades intestinales de que hemos tenido en nuestro experimento con los pollos alimentados con galactomananos (Salmosan o Duraió) sí que fueron altas numéricamente respecto a la dieta control (sin prebióticos) pero sin diferencia significativa (p-valor = 0.49), por otro lado, la determinación de la viscosidad del contenido ileal en nuestro experimento se hizo con pollos de 31 días de edad mientras que en el experimento de Lee et al. (2003) se hacía con pollos a 21 días de edad teniendo en cuenta que los pollos de mayor edad tienen más capacidad de contrarrestar la viscosidad intestinal producida por los galactomananos por disponer un aparato digestivo más desarrollado con mayor actividad enzimática (Almirall et al., 1995). La inoculación con S. Enteritidis no tenía ningún efecto significativo sobre los rendimientos productivos de los pollos en cuanto al peso final de los pollos y la ganancia media diaria donde los valores fueron similares tanto para los pollos inoculados como los no inoculados , resultados similares a los que tuvieron Vilà et al. (2012) con broiler en un periodo entre 1 y 19 días de edad. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 47 Las concentraciones de ácidos grasos volátiles que se encuentran en pollos sanos de 15 días de vida provocaron la desaparición de Salmonella en incubaciones in vitro, mientras que los niveles de ácidos grasos volátiles de pollos más jóvenes disminuyeron su presencia pero no eliminaron totalmente la Salmonella (van der Wielen et al, 2001). Con la inclusión de prebióticos en el pienso se esperaba un incremento en los niveles de ácidos grasos volátiles (Faber et al, 2012) que disminuyera consecuentemente la presencia de Salmonella. Sin embargo, este incremento no se observó, por lo que el efecto prebiótico de los productos no fue suficiente para modificar la microbiota intestinal 15 días post infección en comparación con los animales infectados no tratados. Por otro lado, la infección con Salmonella incrementó numéricamente la concentración de acético, butírico y ácidos grasos volátiles totales, en contraste con los resultados obtenidos por Faber et al (2012) donde se disminuyó la concentración de estos ácidos por la infección con Salmonella. Además, las concentraciones de estos ácidos fueron muy inferiores en nuestro estudio. Tal y como se ha comentado previamente en la revisión bibliográfica, en el caso de la Salmonella está ampliamente aceptado que el mecanisimo de la inhibición de la adhesión reside en la presencia de los residuos de manosa en los prebióticos, a las cuales se une la fimbria tipo 1 que se expresa por la mayoría de las cepas patógenas intestinales de la Salmonella como por ejemplo la S. Enteritidis. De hecho en nuestro trabajo los tratamientos que llevaron prebióticos (galactomananos) en el pienso tuvieron numéricamente una menor tasa de infección respecto el control positivo (excepto el T5 a 7 días post inoculación) aunque solamente se alcanzó la significancia en el caso del T3 (Salmosan, p-valor = 0.02). Hay que destacar un factor muy importante acerca de la tasa de infección, es que los pollos inoculados del control positivo no han tenido tasas de infección altas como se esperaba (alrededor del 70%) sino que la tasa de infección no ha sobrepasado el 34% en todos los periodos (4, 7 y 14 días post inoculación); este hecho dificulta que las tasas de infección observadas con los tratamientos de prebióticos lleguen a ser significativamente menores respecto el control positivo. Las buenas condiciones higiénicas que han tenido estos animales durante la prueba quizás ayudaron a estabilizar su microflora y a eliminar la Salmonella inoculada experimentalmente. Sin embargo, en varios estudios anteriores se detectaron tasas de infección con pollos inoculados no tratados del orden del 67% a 19 días post inoculación con S. Enteritidis (Vilà et al., 2012), del 100% a 7 días post inoculación con S. Typhimurium (Buhari et Máster en nutrición animal IAMZ 2013 54 Fukata, T.K., Sasai, K., Miyamoto, T., Baba, E. (1999). Inhibitory effect of competitive exclusion and fructo-oligosaccharide, single and in combination, on Salmonella colonisation of chicks. Journal of Food Protection., 62: 229– 233. Gaggìa, F., Mattarelli, P., Biavati, B. (2010). Probiotics and prebiotics in animal feeding for safe food production. Int J Food Microbiol , 141: S15-S28. Gast, R.K. (2007). Serotype-Specific and Serotype-Independent Strategies for Preharvest Control of Food-Borne Salmonella in Poultry. Avian Dis., 51:817– 828. Gibson, G.R. and Roberfroid, M.B. (1995). Dietary modulation of the humain colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J. 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Preparación de la Solución de los patrones de referencia (A, B, C y D): aSe pesan una cantidad de 0.5-1.6 g aproximadamente (depende del estándar) en un matraz de 50 ml y luego se porta el volumen a 50 ml con agua. bSe hace mezclas entre los diferentes estándares para preparar las diferentes soluciones de referencia como se está demostrado en la tabla siguiente: peso patron (g) NaOH 5M (ml) H2O ml PM g/mol Tiempo retención A (ml) B (ml) C (ml) D (ml) Fòrmico 1,5814 50 46,03 2,693 4 8 16 20 Acètico 1,5355 50 60,05 2,831 4 8 16 20 Propionico 0,7465 50 74,08 3,446 10 15 5 2,5 Isobutírico 0,8298 50 88,11 3,562 2,5 15 10 5 Butírico 0,85 1,5 50 88,11 4,201 2,5 5 10 15 Isovalèrico 0,5087 1,5 50 102,14 4,599 10 15 5 2,5 Valèrico 0,5112 1,5 50 102,13 5,311 10 15 5 2,5 4-metil-valerico 6,026 Làctico 0,5014 50 90,08 9,02 15 2,5 5 10 Succínico 0,5999 50 118,09 15,547 10 5 2,5 15 volumen (ml) 100 100 100 100 c - Se preparan cuatro tubos cada uno lleva 1 ml de un patrón de referencia. dLos tubos de la solución del patrón de referencia se proceden como si fueran muestras. Máster en nutrición animal IAMZ 2013 59 Anexo 2 Parametros Condiciones Tipo de cromatografo Cromatógrafo de gases GC 6890. Horno Temperatura inicial: 60 °C De 60 °C a 148 °C acumulando 6 °C /min, de 148 °C hasta 220 °C incremento de temperatura de 35 °C /min, se mantiene fija a 220 °C durante 4 minutos. Tiempo: 20.72 minutos Inyector Modo : Split La relación Split: 25:1 Flujo Split: 30 ml/min Temperatura inicial: 250 °C Presión: 14.40 psi Flujo total: 33.9 ml/min Tipo de gas portador: Helium Detector (FID) Temperatura : 250 °C Flujo del hidrogeno : 43 ml/min Flujo del aire : 400 ml/min Flujo de nitrógeno: 23 mL/min Columna (DB23 AGILENT) Dimensiones : 30.0 m x 251.0 µm x 0.25 µm Temperatura máxima: 260 °C