Repositorio Institucional de Documentos

Resistencia a los pulsos eléctricos de alto voltaje, aplicados a diferentes temperaturas, de microorganismos patógenos en medios de diferente Ph Santiago Condón Abanto. Memoria trabajo fin de máster en iniciación a la investigación en C.T.A. Curso 2012-2013 INDICE 1.- Introducción. 1 1.1.- Mecanismo de acción de los pulsos 2 1.2.- Factores que afectan a la inactivación microbiana por pulsos eléctricos de alto voltaje. 5 1.2.1.- Parámetros de procesado. 5 1.2.2.- Características del microorganismo. 7 1.2.3.- Características del medio de tratamiento. 7 1.3.- La pasteurización de los alimentos por PEAV. 9 1.4.- Efecto de la temperatura en la inactivación por PEAV. 11 2.- Objetivo. 12 3.- Material y métodos. 13 3.1.- Medios y reactivos. 13 3.2.- Microorganismos. 13 3.2.1.- Obtención de las suspensiones microbianas. 14 3.2.2.- Curvas de crecimiento. 15 3.3.- Tratamientos de PEAV. 16 3.3.1.- Generador de pulsos. 16 3.3.2.- Cámara de tratamiento y sistema de termostatación. 18 3.3.3.- Metodología para la aplicación de los tratamientos de PEAV a diferentes temperaturas. 21 3.4.- Tratamientos térmicos. 23 3.5.- Incubación y recuento de supervivientes. 24 3.5.1.- Recuento de supervivientes. 25 3.5.2.- Evaluación del daño subletal tras los tratamientos de PEAV. 25 3.6.- Análisis estadísticos. 27 4.- Resultados y discusión. 28 4.1.- Influencia de la temperatura y del pH del medio de tratamiento en la eficacia letal de los PEAV . 31 4.2.- Influencia de la temperatura y del pH del medio de tratamiento en la aparición de daño subletal en la población microbiana tratado por PEAV. 34 4.3.- Influencia de la intensidad del campo eléctrico, tiempo de tratamiento y temperatura en la inactivación de E. coli O157:H7 y S. aureus 4459. 37 5.- Conclusiones. 45 6.- Bibliografía. 46 La demanda de los consumidores de alimentos mínimamente procesados con las características organolépticas y nutricionales similares a las del producto fresco ha hecho que la Industria Alimentaria busque alternativas a los tradicionales procesos de conservación, como el calor. Los Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje (PEAV) se han propuesto como una alternativa a los actuales tratamientos de pasteurización térmica. Sin embargo, y a pesar de las numerosas investigaciones existentes, no se han definido los parámetros de pasteruización basados en PEAV en parte deibido a que son numerosos los factores que afectan a la resistencia microbiana por PEAV, siendo el pH y la temperautra del medeio de tratamiento los más importantes. Si bien hay datos publicados sobre el efecto de ambos parámetros, apenas se ha investigado su efecto combinado en la letalidad de los tratamientos en condiciones totalmente controladas. Es por ello que el objetivo de este trabajo ha sido estudiar la influencia de la temperatura en la eficacia letal de los PEAV sobre microorganismos patógenos, en medios de laboratorio de distinto pH. Para ello, se ha trabajado en condiciones lo más controladas posible: cámara estática de electrodos paralelos y temostatados aplicando un solo pulso de 30 kV/cm. Bajo estas condiciones se ha observado que la temperatura del medio de tratamiento incrementa notablemente la sensibilidad de los microorganismos a los PEAV. La aplicación de PEAV a temperaturas subletales ha permitido determinar que microorganismos muy resistentes a temperatura ambiente y que se consideraban como referencia en los tratamientos PEAV como L. monocytogenes, resulten muy sensibles inactivando 5 ciclos logarítmicos con tan solo un pulso de 30 kV/cm en medio de pH 3,5. Por el contrario, E. coli O157:H7 y S. aureus 878 han resultado ser los microorganismos más resistente a los tratamientos a cualquier temperatura y pH investigados reduciéndose en el mejor de los casos 2 ciclos logarítmicos de sus poblaciones microbianas. La aplicación de tratamientos PEAV a diferentes temperaturas (45-55ºC), campos eléctricos (20-30 kV/cm) y tiempos de tratamiento (3 a 27 µs) han permitido incrementar la letalidad de estos microorganismos. Sin embargo, los niveles de inactivación alcanzados (3,5 ciclos logarítmicos) indican que se hace necesario definir nuevos tratamientos PEAV a temperaturas superiores a las investigadas que sean la base para diseñar tratamientos de pasteurización de alimentos. The consumer’s demand for minimally processed foods with nutritional and organoleptic characteristics similar to those of fresh products has made the food industry seek alternatives to traditional preservation processes such as heat. Pulsed Electric Fields (PEF) have been proposed as an alternative to current heat pasteurization treatments. However, despite the existing research, pasteurization treatments by PEF have not been defined probably due to PEF lethality is very influenced by different factors which limits achieving clear conclusions of the effect of PEF. pH and temperature of the treatment medium are the main factors affecting microbial PEF lethality. Although there are published data concerning their individual influence on PEF microbial inactivation, there hardly any investigation when both factors are combined. Therefore, the objective of this investigation was to study the influence of temperature on the lethal effectiveness of PEF on pathogenic microorganisms in laboratory media of different pH. Results have been obtained under the most controlled conditions as possible: static-parallel-tempered electrode treatment chamber and applying a single pulse of 30 kV/cm. Under these conditions it was observed that the temperature of the treatment greatly increases the microbial PEF sensitivity. Microorganisms, like L. monocytoogenes 4567, that were very PEF resistant at any pH at room temperature, reduced their PEF resistance when PEF were applied at sublethal temperatures. For example, 5 log10 cycles were reduced of the population of L. moncytogenes with only a pulse of 30 kV/cm applied at 55ºC in media of pH 3.5. Conversely, E. coli O157: H7 and S. aureus 878 have resulted the most PEF at any temperature and pH investigated reducing in the best case two log cycles of their microbial populations. PEF treatments applied at different temperatures (45-55° C), electric field strengths (20-30 kV/cm) and treatment times (3-27 µs) increased the lethality of these microorganisms. However, the achieved inactivation levels (3.5 log10 units) indicates that it is necessary to define new PEF treatments at temperatures above those investigated which could be consider the basis for designing food pasteurization treatments. 1 1. INTRODUCCION La tecnología de los pulsos eléctricos de alto voltaje (PEAV, o PEF del inglés “Pulsed Electric Fields”) consiste en la aplicación de pulsos de alto voltaje (kV) y corta duración (μs) a un material colocado entre dos electrodos. Estos tratamientos crean un campo eléctrico cuya intensidad depende del voltaje aplicado y de la distancia entre los electrodos. El campo eléctrico generado provoca un fenómeno denominado electroporación, que consiste en el incremento de la permeabilidad de las membranas al paso de iones y moléculas como consecuencia de la formación de poros en estas estructuras. Dependiendo de la intensidad del campo eléctrico aplicado, la viabilidad de la célula se puede mantener tras el tratamiento si los poros formados se cierran tras el tratamiento (electroporación reversible), o se pueden formar poros irreversibles, que se mantienen abiertos tras los PEAV, conduciendo a la muerte celular. La permeabilización reversible es un procedimiento utilizado de rutina en el campo de la biotecnología para introducir en el interior del citoplasma distintos componentes como oligonucleótidos, plásmidos, etc. y, más recientemente, se ha empezado a utilizar en medicina clínica para facilitar la entrada de medicamentos al interior de células tumorales (Kotnik et al.,2012). La electroporación irreversible de las membranas celulares de los tejidos animales o vegetales se está investigando con objeto de mejorar la transferencia de masa en procesos de la industria en los que la sustancia que se transfiere tiene que atravesar la membrana citoplasmática de las células como la extracción de distintos componentes intracelulares de interés, o la deshidratación (Knorr y Angersbach, 1998; Ade-Omowaye et al., 2001; Vorobiev y Lebovka, 2006). Por otro lado, la permeabilización irreversible de las membranas de las células vegetativas de los microorganismos provoca su inactivación a temperaturas inferiores a las que se utilizan en el procesado térmico de los alimentos. Por ello, los PEAV son considerados, en la actualidad, como una de las tecnologías emergentes para pasteurización de alimentos especialmente sensibles al calor como los zumos de frutas (Toepfl., 2012). 2 1.1 Mecanismo de acción de los PEAV. La membrana citoplasmática de los microorganismos actúa como una barrera semipermeable que los protege del ambiente que los rodea, por ello el mantenimiento de su integridad y funcionalidad es fundamental para garantizar su supervivencia. El incremento de la permeabilidad de la membrana citoplasmática de los microorganismos por la aplicación de PEAV ha sido demostrado por distintas técnicas como la determinación de la liberación de material intracelular mediante el incremento de la absorbancia a 260 nm (proteínas) y 280 nm (ácidos nucleicos) del medio en el que están suspendidos los microorganismos, la pérdida de la capacidad de plasmólisis de los microorganismos en un medio hipertónico o la determinación de la presencia en el interior celular de colorantes fluorescentes como el ioduro de propidio, incapaz de atravesar la membrana citoplasmática intacta (Wouters et al., 2001). Sin embargo, los mecanismos celulares involucrados en este proceso siguen sin conocerse con absoluta precisión. Cuando las células se exponen a la acción de un campo eléctrico de alto voltaje, debido a que la membrana citoplasmática no conduce la electricidad, se produce un acúmulo de iones con cargas opuestas en ciertos puntos de la membrana citoplasmática que provoca un incremento del potencial transmembrana (Teissié et al. 2002). Se considera que para que se manifieste la electroporación en estos puntos es necesario que el potencial transmembrana que, en condiciones normales, es de alrededor de 10 mV alcance valores entre 0,5 y 1 V. Al campo eléctrico externo que hay que aplicar para que se alcancen estos valores umbrales se le denomina campo eléctrico crítico. Cuando se aplican tratamientos alrededor de este campo crítico, la electroporación es reversible, mientras que la electroporación irreversible requiere la aplicación de campos eléctricos por encima del valor crítico. El potencial transmembrana generado por la aplicación de un campo eléctrico externo depende, entre otros parámetros, del campo eléctrico aplicado, pero también del tamaño de la célula siendo mayor para células de mayor tamaño. Esta dependencia explica que para la permeabilización irreversible de los microorganismos se requiere la aplicación de campos eléctricos más elevados (>10 kV/cm), que para la permeabilización de las células eucariotas de los tejidos vegetales o animales de mayor tamaño (<10 kV/cm) Este hecho tiene importantes repercusiones prácticas, ya que para 3 la inactivación microbiana, al ser necesarios campos más intensos, se requieren equipos más potentes y mayores consumos energéticos. Las teorías propuestas para explicar el mecanismo por el cual se produce la electroporación de las membranas por la aplicación de un campo eléctrico se pueden clasificar en tres grupos. Las teorías electromecánicas asumen que las fuerzas de atracción que se establecen entre los iones cargados localizados a ambos lados de la membrana como consecuencia de la aplicación de un campo eléctrico provocan la compresión de la membrana. Cuando las fuerzas de atracción son superiores a las fuerzas viscoélasticas de la propia membrana se produce la formación de poros y como consecuencia el incremento de la permeabilidad de la membrana (Zimmermann et al.. 1974). Figura 1.1. Esquema del mecanismo de permeabilización mediante PEAV según los “modelos electromecánicos”. E es el campo eléctrico aplicado y Ec es el campo eléctrico crítico. (extraído de Saldaña 2011 – Tesis Doctoral). El otro grupo de teorías propuestas para explicar el fenómeno de electroporación consideran que en condiciones normales, en ausencia de un campo eléctrico externo, se produce en las membranas la formación y cierre de poros hidrofílicos de un tamaño muy pequeño (< 1 nm) y de una vida media inferior a 1 nanosegundo como consecuencia de fluctuaciones térmicas y mecánicas. La formación de estos poros se apoya en el hecho de que se ha observado que el agua y algunos iones penetran a través de las membranas 4 a una velocidad demasiado elevada para tratarse de un fenómeno de difusión a través de una bicapa lipídica intacta. Según estas teorías, el potencial transmembrana provocado por la aplicación del campo eléctrico externo disminuye la energía que se requiere para la formación de estos poros hidrofílicos que se forman espontáneamente favoreciendo la formación de un mayor número de poros y más estables, es decir, que permanecen abiertos durante más tiempo (Weaver y Chizmadzhev, 1996). Figura 1.2. Esquema del mecanismo de permeabilización mediante PEAV según los “modelos de formación de poros hidofóbicos e hidrofílicos”. Extraido de: Cell membrane electroporation-Part1: The phenomenon. (T. Kotnik et al. 2012). Finalmente, en opinión de algunos autores (Tsong, 1991) los canales proteicos que participan en el transporte de sustancias a través de las membranas también pueden ser responsables del incremento de su permeabilidad cuando se exponen a la acción de un campo eléctrico externo. Algunos sistemas de transporte activo requieren la existencia de un potencial transmembrana inferior al potencial transmembrana crítico necesario para que se inicie la electroporación. Por lo tanto, la aplicación de un tratamiento de PEAV debería provocar la apertura de estos canales proteicos. Una vez abiertos estos canales, el paso de corriente eléctrica podría provocar la desnaturalización irreversible al aumentar la temperatura por efecto joule o por el propio efecto de la corriente eléctrica. Las teorías propuestas para explicar la electroporación de las membranas celulares se basan en experimentos realizados con sistemas modelos como liposomas o con células eucariotas rodeadas por una membrana citoplasmática. Sin embargo, en el caso de los microorganismos la membrana citoplasmática no es la única envoltura que separa el 11 de los alimentos pasteurizados haciéndose necesario diseñar nuevas estrategias basadas en esta tecnología. 1.4. Efecto de la temperatura en la inactivación por PEAV Estudios realizados por distintos autores han demostrado que la resistencia microbiana a los PEAV disminuye considerablemente al aumentar la temperatura de tratamiento incluso en rangos de temperatura que no son letales para los microorganismos (Aronsson and Ronner, 2001; Heinz et al., 2003; Fleischman et al., 2004). Esta mayor sensibilidad de los microorganismos a los PEAV al aumentar la temperatura del medio de tratamiento se ha atribuido a la modificación de la fluidez de los fosfolípidos que favorece la electroporación de la membrana. Generalmente, los estudios realizados sobre la influencia de la temperatura en la inactivación microbiana por PEAV se han realizado utilizando cámaras de tratamiento en flujo continuo. En estos estudios, se modificaba la temperatura de entrada del producto en la cámara de tratamiento y la temperatura de salida dependía de la energía específica total aplicada al producto al pasar por la cámara de tratamiento. Por lo tanto, en flujo continuo, la temperatura de tratamiento no es constante por lo que es difícil cuantificar su efecto. Recientemente, nuestro grupo de investigación ha diseñado una cámara estática de electrodos paralelos con los electrodos termostatados que permite investigar la inactivación microbiana por PEAV a distintas temperaturas en condiciones prácticamente isotérmicas (Saldaña et al., 2010). Con esta cámara de tratamiento se ha demostrado que el aumento de la temperatura de tratamiento hasta 50ºC permite conseguir niveles de inactivación superiores a 5 ciclos logarítmicos en una cepa de Salmonella Typhimurium con tiempos de tratamiento inferiores a 100 µs. Por lo tanto, la aplicación de los PEAV a temperaturas superiores a la temperatura ambiente, pero inferiores a las de los actuales tratamientos térmicos abre la posibilidad de aplicación de esta tecnología para la pasteurización de los alimentos líquidos. Sin embargo, debido a que los estudios sobre la influencia de distintos factores en la resistencia microbiana anteriormente comentados se han realizado a temperatura ambiente, se hace imprescindible para establecer las condiciones de procesado necesarias para la pasteurización de alimentos investigar su influencia cuando el tratamiento se aplica a temperaturas superiores. 12 2. OBJETIVO El objetivo de esta investigación fue explorar si las conclusiones obtenidas sobre la influencia de distintos factores en la resistencia microbiana a los PEAV cuando el tratamiento se aplica a temperatura ambiente son similares a las que se obtienen cuando el tratamiento se aplica a temperaturas superiores. Para ello, se estudió la influencia de la temperatura y el pH del medio de tratamiento en la sensibilidad a los PEAV y en la aparición de daño subletal en dos cepas pertenecientes a dos microorganismos patógenos Gram positivos (Listeria monocytogenes 5672 y Staphylococcus aureus 4459) y dos cepas pertenecientes a dos microorganismos patógenos Gram negativos (Salmonella Typhimurium 878 y Escherichia coli O157:H7) seleccionadas por su especial resistencia a los PEAV. 13 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Medios y reactivos El agar tripticasa-soja (TSA) y el caldo tripticasa-soja (TSB) fueron suministrados por la casa Oxoid (Basingtok, Hampshire, Engalnd) y se prepararon siguiendo las indicaciones del fabricante. Para los cultivos microbianos estos medios se enriquecieron con un 0,6% de extracto de levadura (TSA+YE y TSB+YE, respectivamente) suministrado por la misma casa comercial. El agua de peptona se preparó a partir de peptona de carne (Oxoid) disolviendo un 0,1% (p/v) en agua destilada. El medio selectivo de recuperación se preparó adicionando cloruro sódico (NaCl) (Panreac, Barcelona, España) a la concentración máxima no inhibitoria al medio de recuento en placa. Los tampones Mcllvaine citrato-fosfato de distinto pH se prepararon mezclando las proporciones adecuadas de soluciones acuosas de fosfato disódico anhidro (Panreac) y ácido cítrico anhidro (Panreac), según describen Dawson et al. (1974). El pH de los tampones se ajustó a 7,0 y 3,5, que se corresponde con el rango de pH en el que se encuentran la mayoría de los alimentos líquidos. Las medidas de pH se llevaron a cabo con un pH-metro con compensación automática de temperatura (modelo basic 20+, Crison Instrumental, Barcelona, España). Los tampones se diluyeron con agua destilada hasta conseguir una conductividad eléctrica de 1±0,01 mS/cm. Las medidas de conductividad se realizaron con un conductivímetro (mod. 524, Crison Instrumental, Barcelona, España) a temperatura ambiente. Todos los medios, una vez preparados, se esterilizaron 20 minutos a 121ºC en autoclave (Darlab K-400, Terrassa, Barcelona), y se almacenaron a 4±2ºC hasta su uso. 3.2. Microorganismos Para llevar a cabo esta investigación se utilizaron las cepas de Listeria monocytogenes CECT 5672, Staphylococcus aureus CECT 4459 y Salmonella entérica subsp. Entérica serovar Typhimurium CECT 878 suministradas por la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y la de Escherichia coli O157:H7 aislada por el Dr. Chapman (Chapman et al., 1993). Dichas cepas se eligieron por su especial resistencia a los tratamientos de PEAV (Saldaña et al., 2009). 14 3.2.1. Obtención de las suspensiones Las suspensiones se prepararon siguiendo las etapas que se muestran en la figura 3.1. En la tabla 3.1, se resumen los diferentes medios, temperaturas y tiempos de cultivo utilizados para cada uno de los microorganismos. Figura 3.1. Esquema del procedimiento para la obtención de las suspensiones microbianas. Para la preparación de las suspensiones se partió de los correspondientes crioviales. Las cepas congeladas se revitalizaron en primer lugar en medio de cultivo líquido (TSB+YE) y, a continuación, se sembraron en placas de TSA+YE por agotamiento en estría, se incubaron durante 24 h a las temperaturas indicadas en la tabla 3.1 y, posteriormente, se almacenaron en nevera (4±2ºC). Esta operación se realizó semanalmente para tener disponibilidad permanente de cultivo fresco. A partir de una colonia aislada de las placas de TSA+YE, se sembraron tubos de ensayo que contenían 5 ml de TSB+YE estéril y se incubaron en estufa durante 18 horas (Hotcold UL, Selecta, Abrera, España). Tras determinar la concentración celular de estos precultivos mediante recuentos microscópicos (Y-FL, Nikkon, Tokio, Japón) en cámara de Thoma (ServiQuimia, Constantí, España), se inocularon frascos con 50 ml de TSB+YE estéril atemperados a la temperatura de incubación, con un volumen suficiente para alcanzar una concentración microbiana inicial de 106 UFC/ml. Los cultivos se incubaron en estufa (Hotcold UL) con agitación orbital (Agitador vibramax 100, Heidolph Instruments, Acwabach, Alemania) a las temperaturas y tiempos indicados en Almacenamiento en criovial Revitalización nnn Aislamiento en estria Precultivo 5mL de medio líquido Recuento en cámara de thoma Incubación 106 UFC/mL en 50mL de medio líquido 15 la tabla 3.1. Para establecer los tiempos de incubación para obtener las suspensiones microbianas se elaboraron las correspondientes curvas de crecimiento. Tabla 3.1. Medios, temperatura y tiempos de cultivo de las distintas etapas de preparación de las suspensiones microbianas. TSA+YE: Agar tripticasa-soja con 0,6% de extracto de levadura. TSB+YE: Caldo tripticasa-soja con 0,6% de extracto de levadura. 3.2.2. Curvas de crecimiento Las curvas de crecimiento se elaboraron tomando 0,1ml de la suspensión contenida en los frascos de cultivo a intervalos determinados de tiempo. Tras realizar las diluciones correspondientes en agua de peptona estéril, se sembraron por duplicado alícuotas de 0,1ml en placas de TSA+YE, por homogeneización en masa. Los medios, temperaturas y tiempos de recuperación utilizados fueron los que se indican en la tabla 3.1. Las curvas de crecimiento se elaboraron representando el logaritmo decimal del número de unidades formadoras de colonias (UFC) por ml frente al tiempo de incubación, en horas (figura 3.2). Debido a que la fase de crecimiento es uno de los factores que puede influir en la inactivación a los PEAV, se estudió la resistencia de los microorganismos en distintas fases de crecimiento con objeto de establecer el tiempo de incubación necesario para obtener las células en el momento que manifestaran su máxima resistencia. Como se observa en la figura 3.2, en todos los casos, la resistencia a los PEAV fue mayor en la fase de crecimiento estacionario, manteniéndose estable hasta las 40 horas de incubación. A la vista de estos resultados, se decidió realizar la investigación con un cultivo con 24 horas de incubación para Salmonella Typhimurium 878; E. coli O157:H7 y S. aureus 4459 y con un cultivo con 30 horas de incubación para L.monocytogenes 5672 . Microorganismo Revitalización (TSB+YE) Aislamiento (TSA+YE) Precultivo (TSB+YE) cultivo (TSB+YE) E.coli O157:H7 37ºC / 24 horas 37ºC / 24 horas 37ºC / 18 horas 37ºC / 24 horas S. typhimurium 878 37ºC / 24 horas 37ºC / 24 horas 37ºC / 18 horas 37ºC / 24 horas L. monocytogenes 5672 37ºC / 24 horas 37ºC / 30 horas 37ºC / 18 horas 37ºC / 30 horas S. aurus 4459 37ºC / 24 horas 37ºC / 24 horas 37ºC / 18 horas 37ºC / 24 horas 16 L.monocytogenes 5672 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación E.coli O157:H7 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación Salmonella typhimurium 878 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación S. aureus 4459 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación Salmonella Typhimurium 878 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Timepo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación L.monocytogenes 5672 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación E.coli O157:H7 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación Salmonella typhimurium 878 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación S. aureus 4459 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación L.monocytogenes 5672 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación E.coli O157:H7 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación Salmonella typhimurium 878 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación S. aureus 4459 020 40 60 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 Tiempo incubación (h) Log UFC/mL Ciclos de inactivación Figura 3.2. Curvas de crecimiento de los cuatro microorganismos utilizados en esta investigación (). Las gráficas también muestran la resistencia a un tratamiento PEAV de referencia (30kV/cm-60 µs; pH 7) de las poblaciones microbianas a distintos tiempos de incubación (). 3.3. Tratamiento de PEAV 3.3.1. Generador de pulsos. El estudio se realizó con un generador de pulsos eléctricos suministrado por la empresa Scandinova (modulator PG, Scandinova, Uppsala, Suecia) cuyo esquema eléctrico se muestra en la figura 3.3. El equipo consta de un transformador (DCPS D10400, Scandinova) que convierte la corriente trifásica alterna de la red eléctrica (380V 16A ) en corriente continua de 1kV. Una señal eléctrica externa controla la apertura y el cierre de seis interruptores IGBT (Switch rack SR-6, Scandinova). Los pulsos de onda cuadrada de un voltaje de 1kV generados por los interruptores se amplifican por un transformador en la señal de alto voltaje deseada. 17 Figura 3.3. Configuración electrónica del equipo de PEAV. Con este circuito, el equipo es capaz de generar pulsos de onda cuadrad de 3µs de duración, de hasta 30kV de voltaje y 200A de intensidad, a una frecuencia de hasta 200Hz. El equipo está diseñado para trabajar en condiciones óptimas con una resistencia en la cámara de tratamiento de entre 100 y 170 Ω. En estas condiciones, se consigue un pulso cuadrado en el que el voltaje aumenta hasta el valor establecido a una velocidad de 47 kV/µs, y una vez transcurridos los 3 µs la velocidad de de caída es de 56 kV/µs. Sin embargo, cuando la resistencia de la cámara es menor de 100 Ω o mayor de 170 Ω la forma del pulso cambia y el control de las condiciones de tratamiento, tales como la intensidad del campo eléctrico, el tiempo de tratamiento y la energía específica, es menos preciso. La necesidad de trabajar en este rango de resistencias obliga a ajustar las dimensiones de la cámara de tratamiento en función de la conductividad de la muestra que se desee tratar. El equipo cuenta con un sistema de refrigeración con aceite dieléctrico de baja conductividad donde está sumergido el transformador. Este aceite se enfría en un intercambiador de calor por el que circula agua a temperatura ambiente. El flujo mínimo del intercambiador debe ser 9 L/min, a una presión de entre 3 y 8 bares. El control del equipo se realiza mediante un software específico diseñado por la empresa fabricante (K1-15m, Scandinova). Además, el equipo cuenta con un interruptor manual de seguridad que desconecta el circuito y permite manipular con seguridad los diferentes componentes externos. Para conocer y registrar el voltaje y la intensidad de corriente realmente aplicados, y así conocer las condiciones reales de tratamiento, el sistema se completa con una sonda 6 interruptores IGBT Circuito de conexión a tierra Pantalla táctil Osciloscopio Sonda de intensidad de corriente Sonda de alto voltaje Unidad de control Transformado r Generador de corriente continua Cámara de tratamiento 18 2,5mm 40mm Ø 16 mm de alto voltaje (P6015A, Tektronix, Wilsonville, Oregon, EE.UU.) y otra de intensidad de corriente (Stangenes Industries, Palo alto, California, EE.UU.) conectadas a un osciloscopio digital de dos canales (TDS 220, Tektronix). 3.3.2. Cámara de tratamiento y sistema de termostatación. Dados los objetivos de esta investigación, fue necesario utilizar un sistema de termostatación de la cámara de tratamiento que permitiera aplicar tratamientos a distintas temperaturas en condiciones isotérmicas. Para ello, se utilizó la cámara de tratamiento descrita por Saldaña et al. (2010) modificándose el sistema de termostatación y el procedimiento para la aplicación de los tratamientos para poder evaluar la influencia de la temperatura en el efecto letal de los PEAV en un amplio rango de trabajo. La cámara está constituida por un tubo de polietileno cerrado en sus extremos por dos cilindros de acero inoxidable de 1,6 cm de diámetro y 4 cm de longitud. La distancia entre los electrodos que junto con el voltaje aplicado determinan la intensidad del campo eléctrico es regulable, aunque en esta investigación todos los estudios se realizaron con una distancia de 2,5mm, lo que da un volumen efectivo de tratamiento de unos 0,5ml. Figura 3.4. Esquema de la cámara de tratamiento estática de electrodos paralelos termostatados. El interior de los electrodos es hueco, de manera que se pueden atemperar haciendo circular aceite dieléctrico de baja conductividad (1,4 µS/cm) a distintas temperaturas. Para termostatar el aceite dieléctrico se construyó un dispositivo que consta de un depósito pulmón conectado a un intercambiador de calor de acero inoxidable de 6mm de diámetro externo y 1mm de pared sumergidos en un baño termostático. El 19 intercambiador de calor está conectado con los electrodos mediante un tubo de polietileno de 6mm de diámetro externo y 1mm de pared. Este mismo tubo conecta la salida del electrodo con el depósito pulmón, cerrando el circuito. El aceite dieléctrico se hace circular con una bomba peristáltica (Ecoline ISM 1078B, Ismatec, Wertheim, Germany). El montaje del circuito de refrigeración se muestra en la figura 3.5. Figura 3.5. Circuito de termostatación de los electrodos. La eficacia del sistema de termostatación depende de la temperatura y del flujo de la bomba peristáltica que hace circular el aceite dieléctrico a través de los electrodos. Para establecer la temperatura y el flujo de la bomba peristáltica que se requiere para atemperar el medio de tratamiento a distintas temperaturas, se determinó la influencia del cambio de temperatura del baño entre 10 y 80ºC y el flujo de la bomba peristática entre 140 y 440 ml/min en la temperatura del medio de tratamiento . La temperatura del medio de tratamiento se midió con un termopar (Alhorn, Holzikirchen, Dinamarca), cuya precisión es de ± 0,2 ºC (-20 a +70ºC) y su velocidad de respuesta de 0,5 s. Los datos obtenidos se analizaron mediante un modelo de regresión cuadrática con la macro de Excel Essential Regression obteniéndose la ecuación 1 que permite estimar la temperatura del medio de tratamiento en el interior de la cámara en función de la temperatura del baño (T) y el caudal del aceite dieléctrico (C). 20 Tª_camarita = 7,901 + 0,05259*C + 0,593*T + 0,00513*C*T + 0,00174T20,0000402*C2*T La bondad del ajuste del modelo queda reflejada por los índices estadísticos obtenidos (R2= 0,99, R2ajustado= 0,99, Error cuadrático medio (ECM)= 0,001) así como la buena correlación entre los valores experimentales y los estimados con el modelo (Figura 3.6). Figura 3.6. Correlación entre los valores experimentales y los predichos por el modelo para estimar la temperatura del medio de tratamiento en función de la temperatura del baño y del flujo de la bomba peristática. La cámara de tratamiento termostatada junto con el nuevo sistema de termostatación diseñado (figura 3.5) permite, por un lado, aplicar los tratamientos a distintas temperaturas y, por el otro, mantener prácticamente constante la temperatura durante el tratamiento debido a que el aceite dieléctrico que circula por los electrodos retira el calor generado por efecto Joule en el medio de tratamiento como consecuencia de la aplicación de los pulsos eléctricos de alto voltaje. Por lo tanto, se trata de un dispositivo que permite evaluar el efecto de la temperatura del medio de tratamiento en condiciones casi isotérmicas. Figura 3.7. Incremento de la temperatura del medio de tratamiento tras la aplicación de pulsos a temperaturas iniciales de 20ºC (), 50ºC () y 55ºC () utilizando la cámara de electrodos termostatada. Condiciones de tratamiento: 30kV/cm, frecuencia 0,5Hz, anchura del pulso 3 µs. 020 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Valores reales Valores predichos 020 40 60 0 20 40 60 tiempo (s) Temperatura (ºC) 27 3.6. Análisis estadísticos Para investigar la influencia de la temperatura (T), en los cuatro microorganismos del estudio, y además el campo eléctrico (E), y tiempo de tratamiento (t), así como sus posibles interacciones, en la inactivación por PEAV de E. coli O157:H7 y S. aureus 4459 se utilizó un diseño experimental de composición central y los resultados fueron analizados mediante regresión múltiple aplicando el método de superficie de respuesta. Todos los experimentos se realizaron al menos por duplicado. La función de respuesta de las variables ensayadas se estableció en base a componentes lineales, cuadráticos y sus interacciones según la siguiente expresión:    k ji jiij k iiii k iii XXXXY  1 2 1 0 Donde Y es la variable de respuesta; Xi y Xj son factores independientes; β0 es la ordenada en el origen; βi son los coeficientes de las relaciones lineales; βij los coeficientes de las relaciones cuadráticas; βij los coeficientes de las relaciones de interacción; y k el número total de factores independientes. Los términos de la ecuación final obtenida fueron analizados estadísticamente en base a los valores F de cada término. A continuación se aplicó el procedimiento de regresión paso a paso hacia atrás, eliminando del modelo aquellos parámetros que no eran estadísticamente significativos (P>0,05), mediante un análisis de varianza. Los análisis estadísticos (cálculo de los parámetros R2, error cuadrático medio (ECM), factor de sesgo Bf y Af, el cálculo de los intervalos de confianza para el 95% y los análisis de varianza, así como los ajustes de los modelos, fueron llevados a cabo con los programas informáticos Excel XP (Microsoft Corporation, Seattle, Washington DF, EE.UU) y GraphPad PRISM® (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU.). El diseño de composición central, el ajuste de los modelos obtenidos a partir de este diseño, la estimación de los coeficientes y la evaluación del nivel de significancia de los modelos se llevaron a cabo mediante el software Design-Expert 6.0.6 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, EE.UU.) 28 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los objetivos tradicionales de la conservación de los alimentos han sido garantizar que los productos que llegan al consumidor sean seguros, es decir, que no vehiculen agentes que puedan causar enfermedades, y prolongar su vida útil, para que éstos puedan ser consumidos días, semanas o incluso meses después de su procesado. Sin embargo, en los últimos años, la industria alimentaria demanda sistemas de conservación que, además de cumplir con estos dos objetivos, afecten lo menos posible a las características sensoriales y nutritivas de los alimentos. Con objeto de responder a esta demanda, se están investigando distintas alternativas a los tratamientos térmicos, que, al igual que el calor, sean capaces de inactivar microorganismos, aunque durante su aplicación no se alcanzan las temperaturas que se utilizan en el procesado térmico. Con estas técnicas se pretende obtener alimentos seguros desde el punto de vista microbiológico, debido a su capacidad para inactivar a los microorganismos patógenos presentes en los alimentos, sin afectar a los compuestos termosensibles que definen la calidad de los alimentos. Los PEAV es una de las tecnologías que se están investigando para inactivar a los microorganismos presentes en los alimentos líquidos a temperaturas inferiores a las utilizadas en el procesado térmico. Como se ha comentado, los PEAV pueden causar la inactivación de las formas vegetativas de las bacterias, mohos y levaduras, pero no las formas esporuladas, por lo que las aplicaciones de esta tecnología se centran en los procesos de pasteurización. Si bien ya se comercializan zumos tratados por PEAV con el objetivo principal de prolongar su vida útil y a pesar de las numerosas investigaciones existentes, no existen datos en la literatura que demuestren que estos tratamientos permiten conseguir los 5 ciclos logarítmicos de reducción establecidos por la FDA (Toepfel., 2012). Ello posiblemente sea debido a que, además de la dificultad de comparar resultados y obtener conclusiones claras por la gran variabilidad de condiciones experimentales y equipos utilizados por los distintos autores, las condiciones de tratamiento publicadas que permiten conseguir unos niveles de inactivación adecuados de microorganismos patógenos de referencia (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7, etc.) para pasteurizar alimentos líquidos no serían viables debido a las elevadas intensidades de tratamiento PEAV requeridas (altas intensidades del campo eléctrico y numerosos pulsos) que condicionan la potencia de los equipos para su aplicación industrial, elevando en gran medida el coste económico 29 del proceso (Sampedro y col., 2011). Es por ello que, con el fin de reducir la intensidad de los tratamientos PEAV, estos se están combinando con aquellos factores que afectan en mayor medida a la resistencia microbiana a esta tecnología como lo es la temperatura del medio de tratamiento como ya se ha indicado anteriormente. Definir los tratamientos combinados más adecuados pasa a su vez por evaluar el mecanismo de inactivación de la tecnología bajo la influencia de aquellos factores de tratamiento. Ello permitirá determinar entre otros aspectos las condiciones que producen un mayor número de células dañadas subletalmente que serán más sensibles a los tratamientos combinados aumentando la eficacia letal de los PEAV. Finalmente, estos tratamientos combinados que permitan definir tratamientos de pasteurización deben estar definidos sobre los microorganismos patógenos más resistentes a los PEAV. Como ya se ha mencionado, estudios previos de Saldaña et al (Saldaña et al., 2009) han permitido identificar las cepas más resistentes a los PEAV aplicados a temperatura ambiente. Sin embargo, se desconoce si estos microorganismos pueden seguir considerándose de referencia cuando los PEAV se aplican a otras temperaturas. Este es uno de los objetivos principales de este trabajo de investigación. Previamente a abordar esta investigación y con el fin de que los resultados obtenidos del efecto de la temperatura y el pH sobre la eficacia letal de los PEAV sean fiables y reproducibles, es necesario el mayor control y uniformidad de estos durante el propio tratamiento de los PEAV. Es por ello por lo que en esta investigación se han aplicado los tratamientos en una cámara estática de electrodos paralelos que permite que la intensidad del campo eléctrico aplicado sea la más uniforme posible de todos los diseños de cámaras existentes (Han y Willcock, 2002; Álvarez, 2003). Además, se han utilizado electrodos termostatados que, como ya se ha indicado, permiten aplicar los tratamientos PEAV a distintas temperaturas y en condiciones cuasi-isotérmicas durante todo el tratamiento. A modo de ejemplo, la Figura 4.1 muestra la importancia de la temperatura sobre la resistencia de E. coli O157:H7 a un mismo tratamiento de PEAV aplicado a una temperatura inicial de 25ºC. La Figura 4.1 A muestra la letalidad de los tratamientos PEAV a 30 kV/cm utilizando una cámara con control de temperatura y la misma cámara sin termostatar los electrodos y la Figura 4.1B la evolución de la temperatura del medio de tratamiento (tampón McIlvaine de pH 7,0) tras la aplicación de PEAV en dichas cámaras. Como se observa, en el tratamiento con control de temperatura el nivel de inactivación conseguido apenas incrementó al aumentar el número de pulsos variando desde 0,6 hasta 0,8 ciclos logarítmicos; Sin embargo, 30 cuando la temperatura no se controló la letalidad incrementó con el número de pulsos al igual que la temperatura del medio alcanzando los 32ºC tras 60 µs de tratamiento. Si bien las temperaturas alcanzadas en la cámara sin control de temperatura eran subletales, los resultados indican que el incremento de la temperatura durante la aplicación de PEAV está jugando un papel importante en la letalidad de los tratamientos. A B Figura 4.1. Resistencia de E.coli O157:H7 (30 kV/cm; 0,5Hz; anchura de pulso 3 µs) en tampón Mcllvaine de pH 7,0 y conductividad de 1mS/cm en una cámara sin termostatar (●) y en una cámara termostatada (■), (A). Incremento de la temperatura del medio de tratamiento en lacámara sin termostatar (●) y en lacámara termostatada (■), (B). Debido a que el objetivo principal de esta investigación era evaluar la influencia de la temperatura sobre la eficacia letal de los PEAV toda la investigación se llevó a cabo en una cámara con electrodos termostatados, descrita en material y métodos, que nos permitió evaluar la eficacia letal de los PEAV a diferentes temperaturas. Por otro lado y con objeto de minimizar al máximo posibles efectos de la temperatura en la letalidad de los PEAV se aplicaron tratamientos de un solo pulso de duración, lo cual nos permite considerar nuestros tratamientos como casi-isotérmicos. 020 40 60 80 0 2 4 6 8 tiempo (s)  Tª (ºC) 020 40 60 80 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 tiempo (s) Ciclos de inactivación 31 4.1. Influencia de la temperatura y del pH del medio de tratamiento en la eficacia letal de los PEAV Como se ha indicado, además de la temperatura, otro de los parámetros que según los datos bibliográficos influye en mayor medida en la resistencia microbiana a los PEAV es el pH del medio de tratamiento. De forma general y cuando los PEAV se han aplicado a temperatura ambiente, las bacterias Gram-positivas son más resistentes en medios neutros y las Gram-negativas en medios ácidos. Sin embargo, no existen apenas datos del efecto del pH a distintas temperaturas desconociéndose la posible interacción de ambos parámetros en la eficacia letal de los PEAV. Resultados previos (Saldaña et al., 2009) han permitido identificar las cepas más resistentes a los PEAV aplicados a temperatura ambiente en medios de distinto pH (de 3,5 a 7,0) de cuatro microorganismos patógenos y que se han utilizado en esta investigación como microorganismos de referencia: E. coli O157:H7, Salmonella Typhimurium 878, S. aureus 4459 y L. monocytogenes 5672. Estos resultados indicaban que L. monocytogenes 5672 era el microorganismo más resistente a los PEAV a cualquiera de los pH investigados y E. coli O157:H7 también mostró una elevada resistencia a todos los pH, pero en especial en medios de pH ácido (Saldaña y col., en prensa). No obstante, se desconoce si este comportamiento se mantiene cuando los PEAV se aplican a temperaturas superiores a la ambiente que resulten subletales para los microorganismos. La figura 4.2 muestra la variación de la resistencia de los microorganismos indicados aplicando un único pulso de 3 µs de 30 kV/cm a distintas temperaturas de tratamiento (de 20 a 55ºC) en tampón McIlvaine de pH 3,5 y 7,0. Como se observa, en todos los microorganismos, la eficacia letal de los tratamientos de PEAV se incrementó con la temperatura en ambos medios de tratamiento. Sin embargo, el efecto de la temperatura fue distinto dependiendo del pH y del microorganismo. Así, en el medio de pH 7,0, apenas incrementó la letalidad en medio ciclo logarítmico al aumentar la temperatura desde los 20 hasta los 55ºC en las bacterias Gram-positivas y de 1,2 y 2,1 ciclos logarítmicos en E. coli O157:H7 y Salmonella Typhimurium respectivamente. Independientemente del grado de sensibilización de los PEAV con la temperatura, la letalidad de los microorganismos parecía que aumentaba linealmente con la temperatura. En este medio de pH neutro, las bacterias Gram-positivas resultaron más resistentes a los PEAV en todo el rango de temperatura que las Gram-negativas de 32 forma similar a lo que se había descrito en la literatura cuando los tratamientos se aplicaron a temperatura ambiente (García et al., 2011, Somolinos et al., 2009). Cuando los tratamientos se aplicaron en medio de pH 3,5 la eficacia letal de los PEAV aumentó notablemente en Salmonella Typhimurium y L. monocytogenes en los que con sólo 1 pulso de 30 kV/cm a 55ºC se alcanzaron 5 ciclos logarítmicos de inactivación de esta poblaciones microbianas, nivel considerado por la FDA (-FDA2001) como suficiente para considerar un producto pasteurizado para el patógeno de referencia en un determinado producto. Sin embargo, en E. coli O157:H7 y, especialmente, en S. aureus, la variación de la temperatura afectó en menor medida la eficacia letal de los PEAV. Así la máxima inactivación alcanzada en E. coli O157:H7 fue de 2,8 ciclos logarítmicos y en S. aureus de 1,9 ciclos. Es decir, estos microorganismos resultarían los limitantes de los tratamientos en medio de pH ácido cuando los PEAV se aplicaban en un proceso combinado a temperaturas subletales. Figura 4.2. Influencia de la temperatura en la resistencia a un tratamiento de PEAV (30kV/cm; 0,5Hz; 1 pulso) a pH 3,5 (■) y pH 7 (●) de Escherichia coli o157:H7 (A); Salmonella Typhimurium 878 (B); Staphylococcus aureus 4459 (C); y Listeria monocytogenes 5672 (D). 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 Temperatura ºC Ciclos de inactivación 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 Temperatura ºC Ciclos de inactivación 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 Temperatura ºC Ciclos de inactivación 10 20 30 40 50 60 1 2 3 4 5 Temperatura ºC Ciclos de inactivación A DC B 33 Hay que destacar que el incremento de la letalidad de los PEAV al aumentar la temperatura en el medio de pH 3,5 no fue lineal en todo el rango investigado. De forma general, se observa que entre 20 y 40ºC apenas incrementó la letalidad de los PEAV salvo en el caso de L. monocytogenes que incrementó 1,2 ciclos logarítmicos y a partir de esta temperatura, el incremento fue muy notable en todos los microorganismos, salvo en S. aureus. En este caso, la letalidad apenas varió entre 20 y 50ºC, aumentando cuando la temperatura de tratamiento fue de 55ºC. Estos resultados parecen indicar que entre 40 y 50ºC (entre 50 y 55ºC para S. aureus) hay una temperatura a partir de la cual se modifica notablemente la sensibilidad de los microorganismos a los PEAV. Esta mayor sensibilidad a partir de una determinada temperatura estaría relacionado con una modificación de la fluidez de la membrana como han apuntado algunos autores sin llegar a demostrarlo (Aronsson and Ronner, 2001; Heinz et al., 2003; Fleischman et al., 2004). Sin embargo, esta hipótesis podría confirmarse ya que otros autores (Gayán et al., 2013) en un proceso similar de aplicación de radiación ultravioleta y calor observaron que si bien la letalidad del proceso apenas variaba hasta temperaturas de 45ºC, por encima de ésta la letalidad incrementaba exponencialmente. Estos autores demostraron que este incremento de la letalidad del proceso combinado se debía a una modificación de la fluidez de la membrana que comenzaba a cambiar entre los 40 y 45ºC. Por lo tanto, se hace necesario realizar más investigaciones que permitan dilucidar el mecanismo de acción implicado en la sensibilización microbiana a los PEAV al aumentar la temperatura del medio de tratamiento. Finalmente de los resultados obtenidos se desprende que, si bien a temperatura ambiente casi no se observa efecto del pH en la resistencia microbiana a los PEAV muy probablemente debido a la escasa eficacia letal de los mismos, al incrementar la temperatura del medio de tratamiento, todos los microorganismos fueron más sensibles en medio de pH ácido. Este es un aspecto nunca antes descrito y, por tanto, su mecanismo de acción desconocido. No obstante, si la mayor eficacia letal de los PEAV al aumentar la temperatura podría estar condicionada por una mayor fluidez de la membrana cabría la posibilidad de que el pH del medio modificase el estado de las envolturas celulares condicionando a su vez la resistencia a los PEAV. Con el fin de evaluar de forma sencilla esta posibilidad, se investigó la existencia de daño subletal en la membrana citoplasmática esperando observarse resultados diferentes cuando los tratamientos se aplicaron en medio neutro o ácido. 34 4.2. Influencia de la temperatura y del pH del medio de tratamiento en la aparición de daño subletal en la población microbiana tratada por PEAV La figura 4.3 muestra los ciclos logarítmicos de daño subletal detectado en las poblaciones de los microorganismos investigados tras su tratamiento en medios de pH 7,0 y 3,5 a distintas temperaturas. De forma general, se observa que el número de células dañadas fue mayor en todos los microorganismos cuando el tratamiento se aplicó en medio ácido y al incrementar la temperatura de tratamiento. Sin ser concluyentes, estos resultados indicarían que existe una interacción entre el pH del medio y la temperatura de tratamiento que afecta a las envolturas celulares haciendo más sensibles a los tratamientos a los microorganismos en medios de pH ácido al incrementar la temperatura de tratamiento. Figura 4.3. Diferencias de daño subletal a pH 7,0 (barras grises) y pH 3,5 (barras negras) de E. coli O157:H7 (A); Salmonella Typhimurium 878 (B); S. aureus 4459 (C); y L. monocytogenes 5672 (D). 20 40 50 55 0.0 0.5 1.0 1.5 Temperatura ciclos de daño 20 40 50 55 0.0 0.5 1.0 1.5 Temperatura ciclos de daño 20 40 50 55 0.0 0.5 1.0 1.5 Temperatura ciclos de daño 20 40 50 55 0.0 0.5 1.0 1.5 Temperatura ciclos de daño A DC B 35 La existencia de un mayor número de células dañadas por los tratamientos en medios ácidos al aplicar PEAV a mayores temperaturas abre la posibilidad de diseñar procesos combinados basados en el mantenimiento durante breves periodos de tiempo a las temperaturas a las que se habrían aplicado los tratamientos PEAV con el fin de que estos microorganismos dañados acabasen muriendo incrementado de este modo la eficacia letal del proceso. Anteriormente, García et al. (2005) observaron que el almacenamiento en un medio ácido a temperatura de refrigeración durante 48 horas permitía reducir la población de E. coli O157:H7 tratada en zumo de manzana desde 1 ciclo logarítmico conseguido inmediatamente tras un tratamiento PEAV hasta los 5 ciclos logarítmicos que era un nivel de inactivación incluso superior al número de células dañadas por los tratamientos de PEAV aplicados. En el caso de esta investigación, se planteó la hipótesis de que el almacenamiento a mayor temperatura permitiría acortar ese tiempo de almacenamiento, siendo más corto cuanto más elevada fuese la temperatura de almacenamiento. Así, la figura 4.4 muestra los ciclos logarítmicos de inactivación de los microorganismos investigados durante 5 minutos de mantenimiento en el propio medio de tratamiento a las temperaturas de 45, 50 y 55ºC, tras la aplicación de 1 pulso de 30 kV/cm a las mismas temperaturas a las que luego se mantuvieron. Debido a los elevados niveles de inactivación alcanzados en medio de pH 3,5 en Salmonella Typhimurium y L. monocytogenes, este estudio se realizó únicamente en tampón de pH 7,0 para estos microorganismos. Como se observa, en todos los casos, la inactivación inicial conseguida con los tratamientos PEAV (tiempo 0 en las gráficas) aumentó durante el mantenimiento en un nivel similar al número de células dañadas detectado tras los tratamientos PEAV mostrado en la figura 4.3 cuando las temperaturas de almacenamiento eran de 45 y 50ºC. Sin embargo, no se observó que esa inactivación fuese superior a 50 que a 45ºC lo que indicaría que los microorganismos dañados morirían no por la temperatura de mantenimiento, que no era letal según los datos mostrados en la figura 3.9 de la sección de “Material y métodos”. Por el contrario, cuando el almacenamiento se realizó a 55ºC, el nivel de inactivación alcanzado tras 5 minutos fue superior a la suma de la muerte que se produciría por el calor (ver figura 3.9) y a la del número de células dañadas tras los tratamientos PEAV a 55ºC en todos los casos, salvo para S. aureus en medio de pH 3,5. Estos resultados indicarían que a 55ºC, los PEAV sensibilizarían ligeramente al posterior almacenamiento a 55ºC lo que abriría la posibilidad de diseñar un proceso combinado basado en la aplicación de PEAV a temperaturas subletales seguido de un mantenimiento a dichas temperaturas de 36 forma similar a lo que sugirió Monfort et al. (2011) al tratar huevo líquido mediante PEAV y calor. Sin embargo, en este caso, los niveles de inactivación finales conseguidos tras 5 minutos de almacenamiento así como el largo tiempo de mantenimiento que suponen 5 minutos a escala industrial en un proceso en continuo limitan la posibilidad de aplicación de este proceso combinado haciendo necesario evaluar otros procesos combinados o aplicar intensidades más elevadas de los PEAV que permitan incrementar la letalidad de los tratamientos especialmente de los microorganismos que han resultado más resistentes: E. coli O157:H7y S. aureus 4459. Figura 4.4. Efecto de los pulsos sobre la resistencia térmica posterior a pH 3,5 (A) y pH 7,0 (B) de E. coli O157:H7 (1); Salmonella Typhimurium 878 (2); S. aureus 4459 (3); y L. monocytogenes 5672 (4) a 40ºC(), 50ºC() y 55ºC(). 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 tiempo (min) Ciclos de inactivación 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 30 UFC/placa tiempo (min) Ciclos de inactivación 2B 1B 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 tiempo (min) Ciclos de inactivación 3B 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 tiempo (min) Ciclos de inactivación 4B 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 tiempo (min) Ciclos de inactivación 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 tiempo (min) Ciclos de inactivación 1A 3A 43 Design-Expert® Software Factor Coding: Actual ciclos 3.53508 0.337713 X1 = A: E X2 = B: T Actual Factor C: t = 15.00 45.00 47.00 49.00 51.00 53.00 55.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 0 1 2 3 4 C iclos inactivación Campo (kV/cm) Temperatura (ºC) A Design-Expert® Software Factor Coding: Actual ciclos 3.53508 0.337713 X1 = B: T X2 = C: t Actual Factor A: E = 25.00 3.00 9.00 15.00 21.00 27.00 45.00 47.00 49.00 51.00 53.00 55.00 0 1 2 3 4 C iclos inactivación Temperatura (ºC) Tiempo (µs) B Design-Expert® Software Factor Coding: Actual ciclos 3.53508 0.337713 X1 = A: E X2 = C: t Actual Factor B: T = 50.00 3.00 9.00 15.00 21.00 27.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 0 1 2 3 4 C iclos inactivación Campo (kV/cm) Tiempo (µs) C Figura 4.7. Diagramas de superficie elaborados a partir del modelo de inactivación para S. aureus que muestran las interacciones entre la temperatura y el campo a los 15 µs de tratamiento (A); entre el tiempo y la temperatura a 25kV/cm; y entre el tiempo y el campo a 50ºC. 44 El aumento del tiempo de tratamiento tampoco parece una estrategia adecuada pues en el caso de E. coli apenas incrementa la eficacia del tratamiento y aunque en S. aureus el incremento de este factor es más eficaz, el incremento de esta eficacia es hasta los 21 µs. Nuevos incrementos del tiempo de tratamiento no aumentan la letalidad de PEAV a distintas temperaturas como ya se ha indicado. Por lo tanto, parece que el mejor procedimiento para intentar conseguir una inactivación de al menos 5 ciclos logarítmicos en estas dos cepas microbianas especialmente resistentes a los PEAV es aumentar la temperatura por encima de los 55ºC pues, en ambos microorganismos, la eficacia aumentó linealmente con este parámetro. Considerando que el efecto de la temperatura, la intensidad del campo eléctrico y del tiempo de tratamiento es el mismo a temperaturas superiores, para conseguir los 5 ciclos logarítmicos de inactivación en E. coli O157:H7 sería necesario aplicar tratamientos de una duración de 27 µs (9 pulsos de 3 µs) a una temperatura de 61,6ºC a 30 kV/cm, de 63,4ºC a 25 kV/cm y de 65,3ºC a 20 kV/cm. En el caso de S. aureus 4459, sería necesario aplicar tratamientos de una duración de 21 µs (7 pulsos de 3 µs) a una temperatura de 60ºC a 30 kV/cm, de 64,1ºC a 25 kV/cm y de 68,3 a 20 kV/cm. La validación de estos tratamientos con la cámara de tratamiento estática de electrodos paralelos es inviable ya que en estático no se pueden aplicar tratamientos a temperaturas superiores a 55ºC en estos dos microorganismos debido a que para la aplicación de los tratamientos se requiere un tiempo de alrededor de 1,5-2 minutos en el que el efecto de la temperatura sobre el efecto letal total del tratamiento podría ser muy significativo. Es por ello que para comprobar si estas condiciones de tratamiento permiten obtener 5 reducciones decimales en la población de ambos microorganismos será necesaria la aplicación de tratamientos en flujo continuo con los que se pueden aplicar estas condiciones con tiempos de residencia en la cámara de tratamiento inferiores a 1 segundo. Si bien se hará también necesario determinar la termorresistencia de estos microorganismos, es de esperar que con este tiempo de procesado de 1 segundo, la muerte microbiana sea debida al efecto combinado de los PEAV y las temperaturas indicadas y no por efecto del calor. En el caso de validar estos tratamientos en flujo continuo sobre los microorganismos patógenos investigados que han sido seleccionados por ser los más resistentes, las condiciones de campo eléctrico, temperatura y número de pulsos indicados podrían tomarse como parámetros de procesado de referencia a la hora de pasteurizar alimentos líquidos ácidos mediante tratamientos PEAV, condiciones que como se han indicado, no han sido definidas hasta la fecha. 45 5. CONCLUSIONES  El aumento de la inactivación microbiana por PEAV al aumentar la temperatura dependió del microorganismo investigado y del pH del medio de tratamiento siendo, en términos generales, mayor la inactivación en el medio de pH 3,5.  El número de células dañadas subletalmente fue mayor a pH 3,5 y aumentó con la temperatura.  El incremento de la temperatura de tratamiento no resultó una estrategia adecuada para aumentar la letalidad de los tratamientos de PEAV a pH 7 en la mayoría de los microorganismos.  En el medio de pH 3,5, la aplicación de 1 pulso de 3 µs de una intensidad de campo eléctrico de 30 kV/cm a 55ºC permitió conseguir 5 ciclos logarítmicos de inactivación en las cepas de L. monocytogenes 5672 y Salmonella Typhimurium 878. Por lo tanto, en estas condiciones, L. monocytogenes 5672 dejo de ser la cepa más resistente a los PEAV.  A pH 3,5 El incremento de la intensidad del campo eléctrico (20-30 kV/cm), tiempo (3-27 µs) y temperatura (45-55ºC) aumentó la inactivación de E. coli O157:H7 linealmente hasta una máxima inactivación de 3,5 ciclos logarítmicos. En el caso de S. aureus 4459 , la máxima inactivación y la influencia de los factores fue similar salvo en el caso del tiempo de tratamiento cuyo efecto máximo se observo alrededor de los 21 µs.  Considerando la influencia de la intensidad del campo eléctrico, el tiempo y la temperatura sobre la inactivación de los dos microorganismos más resistentes (E. coli O157:H7 y S. aureus 4459) para conseguir una inactivación de 5 ciclos logarítmicos la estrategia más adecuada es el aumento de la temperatura. Comprobar este extremo requerirá la aplicación de tratamientos en flujo continuo. 46 6. BIBLIOGRAFIA - Ade-Omowaye B., Angersbach A, Taiwo KA, Knorr D. 2001. Use of pulsed electric field pretreatment to improve dehydration characteristics of plant based foods. Trends in Food Sci. and Technol. 12: 285-295. - Álvarez, I., Pagán, R., Condón, S., and Raso, J. 2003a. The influence of process parameters for the inactivation of Listeria monocytogenes by pulsed electric fields. Int. J. Food Microbiol. 87: 87-95. - Álvarez, I., Raso, J., Sala, F.J., and Condón, S. 2003b. Inactivation of Yersinia enterocolitica by pulsed electric fields. Food Microbiol. 20: 691-700. - Álvarez, I., Virto, R., Raso, J., and Condón, S. 2003c. Comparing predicting models for the Escherichia coli inactivation by pulsed electric fields. Innovat. Food Sci. Emerg. Technol. 4: 195-202. - Aronsson, K., and Ronner, U. 2001. Influence of pH, water activity and temperature on the inactivation of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae by pulsed electric fields. Innov. Food Sci. Emerg. Tech., 2:105-112. - Aronsson, K., Lindgren, M., Johansson, B. R., and Rönner, U. 2001. Inactivation of microorganisms using pulsed electric fields: the influence of process parameters in Escherichia coli, Listeria innocua, Leuconostoc mesenteroides and Saccharomyces cerevisiae. Innov. Food Sci. Emerg. Tech., 2:41-54. - Arroyo, C., Cebrian, G., Pagan, R.2010. Resistance of Enterobacter sakazakii to pulsed electric fields. Innov. Food Sci. Emerg. Tech. 11: 314-321 - Cebrián. G. 2009. Mecanismos de inactivación y Resistencia de Staphylococcus aureus a diferentes procesos de conservación de los alimentos. Tesis doctoral, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza. - Dutreux N, Notermans S, Góngora-Nieto MM, Barbosa-Cánovas GV, Swanson BG. 2000. Effects of combined exposure of Micrococcus luteus to nisin and pulsed electric fields. Int. J. Food Microbiol 60: 147-152. - Fleischman, G. J., Ravishankar, S., and Balasubramaniam, V. M.2004. The inactivation of Listeria monocytogenes by pulsed electric field (PEF) treatment in a static chamber, Food Microbiol., 21:91-95. - Food and Drug Administration (FDA), 2001. Hazard analysis and critical control point (HACCP) procedures for the safe and sanitary processing and importing of juice; final rule. Federal Register, 66, FR 6137-6202. - García, D., Gómez, N., Mañas, P., Condón, S., Raso, J. and Pagán, R. 2005. Occurrence of sublethal injury after pulsed electric fields depending on the microorganism, the treatment medium pH and the intensity of the treatment investigated, J. Appl. Microbiol. 2005 Journal of Food Safety, 25, 30–42; 47 - Gómez, N., García, D., Álvarez, I., Raso, J., and Condón, S., 2005, A model describing the kinetics of inactivation of Lactobacillus plantarum in a buffer system of different pH and in orange and apple juice, J. Food Eng., 70:7-14. - Grahl, T., Sitzmann, W., and Märkl, H. 1992. Killing of microorganisms in fluid media by highvoltage pulse. DECHEMA. Biotechnol. Conferences. Vol. 5. Part B. - Heinz, V., Álvarez, I., Angersbach, A., and Knorr, D. 2001. Preservation of liquid foods by high intensity pulsed electric fields - basic concepts for process design, Trends Food Sci. Tech., 12:103-111. - Heinz, V., Toepfl, S., and Knorr, D. 2003. Impact of temperature on lethality and energy efficiency of apple juice pasteurization by pulsed electric fields treatment, Innov. Food Sci. Emerg. Tech., 4:167-175. - Hülsheger, H., Potel, J., and Niemann, E. G. 1981. Killing of bacteria with electric pulses of high field strength, Radiat. Environ. Bioph., 20:53-65. - Kang Huang., Jianping Wang. 2009. Designs of pulsed electric fields treatment chambers for liquid foods pasteurization process: A review. J. Food Eng, 95: 227-239. - Knorr D, Geulen M, Grahl T, Sitzmann W. 1994. Food application of high electric field pulses. Trends in Food Sci. and Technol. 5: 71-75. - Mañas, P., Barsotti, L., and Cheftel, J. C. 2001. Microbial inactivation by pulsed electric fields in a batch treatment chamber: effects of some electrical parameters and food constituents, Innov. Food Sci. Emerg. Tech., 2:239-249. - Min S, Evrendilek GA, Zhang QH. 2007. Pulsed electric fields: processing system, microbial and enzyme inhibition, and shelf life extension of foods. IEEE Transactions on Plasma Science 35, 59-73. - Min S, Jin ZT, Min SK, Yeom H, Zhang QH, 2003. Commercial-Scale Pulsed Electric Field Processing of Orange Juice. J. Of Food Sci. 68 (4): 1265-1271. - Min S, Zhang QH, 2000. Effect of water activity on the inactivation of Enterobacter cloacae by pulsed electric field treatment. En IFT Annual Meeting. Dallas, EE.UU. - Mizuno, A., and Hori, Y. 1988. Destruction of living cells by pulsed high-voltage application, IEEE Trans. Ind. Gen. A., 24 (3):387-394. - National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods (NACMCF) 2006. Requisite scientific parameters for establishing the equivalence of alternative methods of pasteurization. Journal of Food Protection, 69, 1190-1216 - Pol IE, Mastwijk HC, Slump RA, Popa ME, Smid E J. 2001. Influence of food matrix on inactivation of Bacillus cereus by combinations of nisin, pulsed electric field treatment and carvacrol. J. of Food Protect. 64: 1012-1018. - Raso, J., Álvarez, I., Condón, S., and Sala, F. J. 2000. Predicting inactivation of Salmonella senftenberg by pulsed electric fields, Innov. Food Sci. Emerg. Tech., 1:21-30. - Reina, L. D., Jin, Z. T., Zhang, Q. H., and Youself, A. E. 1998. Inactivation of Listeria monocytogenes in milk by pulsed electric field, J. Food Protect., 61:1203-1206. 48 - Saldaña G, Puértolas E, López N, García D, Álvarez I, Raso J. 2009. Comparing the PEF resistance and occurrence of sublethal injury on different strains of Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus in media of pH 4 and 7 Innov. Food Sci. Emerg. Tech, 10: 160-165 - Saldaña G., Álvarez I., Condón S., Raso J. 2011. Microbiological aspects related to the feasibility of PEF technology for food pasteurization. Trends in Food Sci. and Technol. - Saldaña G., Puértolas E., Álvarez I., Meneses N., Knorr D., Raso J. 2010. Evaluation of a static treatment chamber to investigate kinetics of microbial inactivation by pulsed electric fields at different temperatures at quasiisothermal conditions. J. Food Eng, 100: 349-356. - Saldaña, G. 2011. criterios para la pasteurización de alimentos por pulsos eléctricos de alto voltaje. Tesis Doctoral, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza. - Saldaña, G., Álvarez, I., Condón, S. & Raso, J. 2013. Microbiological aspects related to the feasibility of PEF technology for food pasteurization, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, DOI:10.1080/10408398.2011.638995 - Sampedro. 2013. Innov. Food Sci. Emerg. Tech, 17 : 72-78 - Somilinos, M., et al., 2009. Organic acids make Escherichia coli more resistant to pulsed electric fields at acid pH, Int. J. Food Microbiol, doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2009.10.023. - Somolinos, M.; Garcia, D.; Manas, P.2008. Effect of environmental factors and cell physiological state on Pulsed Electric Fields resistance and repair capacity of various strains of Escherichia coli. Int. J. Food Microbiol 124,(3): 260-267 - Stefan Toepfel. 2012. Pulsed electric field food processing-industrial equipment design and commercial applications. Stewart Postharvest Solutions (UK) Ltd. - T. Kotnik., P. Kramar., G. Pucihar., and D. Miklavcic.2012. Cell membrane electroporation. Part 1: The phenomenon. Electrical Insulation Magazine 28 (5): 14-23. - Teissié J, Eynard N, Vernhes MC, Bénichou A, Ganeva V, Balutzov B, Cabanes P.A. 2002. Recent biotechnological developments of electropulsation. A prospective review. Bioelectrochemistry 55 (1-2): 107-112 - Tsong TY. 1991. Electroporation of cell membranes. Biophysical Journal 60: 297306. - Vorobiev E., Lebovka N.I. 2006. Extraction of Intracellular Components by Pulsed Electric Fields. En J Raso, V Heinz (Eds.), Pulsed Electric Fields Technology for the Food Industry. Fundamentals and Applications (pp. 153-193). Springer: Nueva York. - Weaver J.C., Chizmadzhev Y.A. 1996. Theory of electroporation: a review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 41: 135–160. - Wouters, P. C., Dutreux, N., Smelt, J. P. P., and Lelieveld, H. L. M. 1999 Effects of pulsed electric fields on inactivation kinetics of Listeria innocua, Appl. Environ. Microbiol., 65 (12):5354-5371. - Wouters, P., Álvarez, I., and Raso, J. 2001. Critical factors determining inactivation kinetics by pulsed electric field food processing, Trends Food Sci. Tech., 12:112-121 - Zimmermann U., Pilwat G., Riemann F. 1974. Dielectric breakdown of cell membranes. Biophysics Journal 14: 881-899. 49 50