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Efecto de diferentes niveles de fitasa microbiana en dos diferentes dietas una a base de trigo y la otra a base de centeno en presencia o no de fitasa endógena Tesis de Master IAMZ 2012-2013 Realizado por: Mustapha BOUDA Dirigida por: Dra. Anna María PEREZ VENDRELL Zaragoza, 2013 I Agradecimiento Llegado este momento quiero agradecer a todas aquellas personas que me han ayudado y apoyado directa e indirectamente para la realización de esta tesis. Agradezco en primer lugar a Dios, después a mis directores de tesis; Joaquim Brufau y Anna María Perez Vendrell, por la oportunidad que me han dado para realizar este trabajo, sus consejos, enseñanzas, paciencia y confianza, todo ello para que esta tesis llegue a buen puerto. También deseo agradecer a los investigadores y personal de departamento de la nutrición animal de “Mas de Bover” y del laboratorio por su disponibilidad y ayuda para solucionar cualquier tipo de duda y/o problema. Al personal de las granjas del IRTA especialmente Alfonso Mejias y la aportación de su experiencia en cuanto al manejo, a Lluis Llauradó por su disponibilidad de acompañarnos para hacer visitas a unas empresas dedicadas en el sector de la nutrición animal (CESAC, matadero…etc) No quiero acabar sin nombrar a los compañeros de laboratorio, departamento, amigos y todas aquellas personas que me han echado una mano cuando lo he necesitado y que han contribuido a esta etapa maravillosa de mi vida. Por último, deseo de corazón dar las gracias a mi familia y a mis amigos por su apoyo incondicional. II Índice Resumen ........................................................................................................................................ IX Abstract ......................................................................................................................................... XI Résumé ....................................................................................................................................... XIII IRevisión bibliográfica .................................................................................................................. 1 I.1. Introducción: ......................................................................................................................... 1 I.2. El fosforo: ............................................................................................................................. 2 I.2.1-Estrategias para reducir la emisión de fosforo en pollos de engorde: ............................. 3 I.2.1.1-Alimentación multifase: ........................................................................................... 4 I.2.1.2-Selección de las materias primas: ........................................................................... 4 I.2.1.3Valorización del fosforo fitico por la adición de aditivos: ..................................... 4 I.3. Requerimientos del fosforo: .................................................................................................. 5 I.4. El calcio: ............................................................................................................................... 6 I.5. EL fitato: ............................................................................................................................... 7 I.5. Aspectos negativos del fitato : ............................................................................................. 8 I.5.1-Iones minerales: ............................................................................................................. 8 I.5.2. Efecto en la disponibilidad de proteína y aminoácidos: ................................................ 9 I.5.3. Efecto en la digestibilidad de la energia : ................................................................... 10 I.6. La fitasa: ............................................................................................................................. 11 I.6.1. Fitasa de las plantas: ................................................................................................... 12 I.6.2. Fitasa microbiana: ....................................................................................................... 12 I.6.3. Fitasa de la microflora intestinal: ............................................................................... 13 I.6.4. Fitasa derivada de la mucosa del intestino delgado: .................................................. 13 I.7. Función catalítica: ............................................................................................................... 13 I.8. Características de la fitasa: .................................................................................................. 15 I.8.1. pH y temperatura optima: ............................................................................................ 15 I.8.2. Termoestabilidad: ........................................................................................................ 15 I.8.3. Resistencia a la proteólisis: ......................................................................................... 15 I.9. Beneficios nutricionales de la fitasa: .................................................................................. 16 I.9.1. Parámetros productivos: ............................................................................................... 16 I.9.2. Disponibilidad de proteínas y aminoácidos: ................................................................ 17 I.9.3.Factores influyen el efecto de la fitasa en la utilización de proteína y aminoácidos: ... 18 I.9.3.1. Elección de marcador inerte: ............................................................................... 18 I.9.3.2. Factores de alimentación: ..................................................................................... 18 I.9.3.3. Las cuestiones relativas a los protocolos experimentales: ................................... 19 III I.9.3.4. Factores de animales: ........................................................................................... 19 I.9.4. Utilización de la energía: ............................................................................................. 19 I.9.4.1. Fitasa y energía derivada de la grasa, proteína y almidón: ................................. 20 I.9.5. Disponibilidad del fosforo y el calcio: ......................................................................... 20 I.9.6. Disponibilidad de otros minerales: .............................................................................. 21 III-Material y métodos: ................................................................................................................. 24 III.1. Métodos analíticos: .......................................................................................................... 24 III.2. Animales experimentales: ................................................................................................ 25 III.3. Dietas basales: .................................................................................................................. 25 III.4. Tratamientos experimentales:........................................................................................... 27 III.5. Preparación de muestras: .................................................................................................. 27 III.6. Parámetros productivos: ................................................................................................... 28 III.7. Actividad fitasa: ............................................................................................................... 28 III.8. Viscosidad intestinal: ....................................................................................................... 28 III.9. Composición mineral del plasma: .................................................................................... 28 III.10. Cenizas de los dedos y las tibias: ................................................................................... 28 III.11. Balance proteico, energético y mineral: ......................................................................... 29 III.11.1. Energía metabolizable retención fecal aparente de minerales: .............................. 29 III.11.2. Digestibilidad ileal de proteína: ............................................................................. 30 III.12. Análisis estadística: ........................................................................................................ 30 IV-Resultados: ............................................................................................................................... 31 IV.1. Parámetros productivos y viscosidad intestinal: .............................................................. 33 aExperimento 1: .................................................................................................................. 33 bExperimento 2: .................................................................................................................. 35 IV.2. Valores energéticos y digestibilidad ileal aparente de la proteína: .................................. 38 aExperimento 1: .................................................................................................................. 38 bExperimento 2: .................................................................................................................. 40 IV.3. Composición mineral del plasma y la composición de los dedos: .................................. 42 aExperimento 1: .................................................................................................................. 42 bExperimento 2: .................................................................................................................. 43 IV.4. Excreción de los minerales y retención aparente del fosforo total y del calcio en las dietas experimentales:.......................................................................................................................... 49 aExperimento 1: .................................................................................................................. 49 bExperimento 2: .................................................................................................................. 53 IV.5. Ingesta de los minerales: .................................................................................................. 57 aExperimento 1: .................................................................................................................. 57 IV bExperimento 2: .................................................................................................................. 59 V. Discusión: ................................................................................................................................. 61 VI. Conclusiones: .......................................................................................................................... 67 VIIBibliografía:........................................................................................................................... 68 V Índice de tablas Tabla 1: Media ponderada (y rango) de las concentraciones de P total y de PP, y proporción de PP al P total, en ingredientes base de piensos para aves. ................................................................ 9 Tabla 2 : Las interacciones negativas del fitato y los nutrientes en los alimentos ....................... 10 Tabla 3: Características generales de la fitasa de diversas fuentes. .............................................. 14 Tabla 4: Composición de las dietas basales. ................................................................................ 26 Tabla 5: Tratamientos experimentales. ......................................................................................... 27 Tabla 6: la actividad fitasa encontrada en las dietas experimentales............................................ 31 Tabla 7: análisis proximales de les dietas experimentales. .......................................................... 32 Tabla 8: parámetros productivos y viscosidad intestinal de 1 a 21 días en dietas a base de centeno (análisis jerárquico) ....................................................................................................................... 33 Tabla 9: Parámetros productivos y viscosidad intestinal de 1 a 21 días en dietas a base de centeno (análisis factorial) ............................................................................................................ 34 Tabla 10: parámetros productivos y viscosidad intestinal de 1 a 21 días en dietas a base de trigo (análisis jerárquico). ...................................................................................................................... 36 Tabla 11: Parámetros productivos y viscosidad intestinal de 1 a 21 días en dietas a base de trigo (análisis factorial). ......................................................................................................................... 37 Tabla 12: Valores energéticos de las dietas experimentales a base de centeno, y digestibilidad ileal aparente de la proteína (análisis jerárquico). ......................................................................... 39 Tabla 13: valores energéticos de las dietas experimentales a base de centeno, y digestibilidad ileal aparente de la proteína (análisis factorial). ............................................................................ 39 Tabla 14: Valores energéticos de las dietas experimentales a base de trigo, y digestibilidad ileal aparente de la proteína (análisis jerárquico). ................................................................................. 40 Tabla 15: Valores energéticos de las dietas experimentales a base de trigo, y digestibilidad ileal aparente de la proteína (análisis factorial). .................................................................................... 41 Tabla 16: Composición mineral de la plasma, y composición de los dedos y tibias del ensayo 1 (análisis jerárquico). ...................................................................................................................... 45 Tabla 17: Composición mineral de la plasma, y composición de los dedos y tibias del ensayo 1 (análisis factorial). ......................................................................................................................... 46 Tabla 18: Composición mineral de la plasma, y composición de los dedos del ensayo 2 (análisis jerárquico). .................................................................................................................................... 47 Tabla 19: Composición mineral de la plasma, y composición de los dedos y tibias del ensayo 2 (análisis factorial). ......................................................................................................................... 48 Tabla 20: excreción de los minerales y retención aparente del fosforo total y del calcio en las dietas experimentales a base de centeno (análisis jerárquico). ...................................................... 51 VI Tabla 21: excreción de los minerales y retención aparente del fosforo total y del calcio en las dietas experimentales a base de centeno (análisis factorial). ........................................................ 52 Tabla 22: excreción de los minerales y retención aparente del fosforo total y del calcio en las dietas experimentales a base de trigo (análisis jerárquico). .......................................................... 54 Tabla 23: excreción de los minerales y retención aparente del fosforo total y del calcio en las dietas experimentales a base de trigo (análisis factorial). ............................................................. 55 Tabla 24: ingesta de los minerales de las dietas experimentales a base de centeno (análisis jerárquico). .................................................................................................................................... 58 Tabla 25: ingesta de los minerales de las dietas experimentales a base de centeno (análisis factorial). ..................................................................................................................................... 599 Tabla 26: ingesta de los minerales de las dietas experimentales a base de trigo (análisis jerárquico). .................................................................................................................................... 60 Tabla 27: ingesta de los minerales de las dietas experimentales a base de trigo (análisis factorial) ....................................................................................................................................................... 61 VII Índice de figuras Figura 1: Estructura del ácido fitico . ............................................................................................. 8 Figura 2: actividad catalítica de la fitasa sobre el ácido fitico ..................................................... 14 VIII Nomenclatura %: Porcentaje HAPC: Maíz con alto contenido de A. Ficuum: Aspergillus Ficuum fósforo disponible A. Fumigatus: Aspergillus Fumigatus IC: Índice de Conversión A. Penicillium: AspergillusPenicillium IU: unidad internacional A. Niger: Aspergillus Niger Kcal: Kilocaloría AOAC: Association of Oficial Kg: Kilogramo Analytical Chemistry L: Litro ATP: AdenosinTrifosfato m2: metro cuadrado BED: Balance Electrolítico Dietético mg: miligramo ºC: Grados centígrados ml: mililitro Ca: Calcio MS: Materia Seca CaCO3: Oxido de Titanio N: Nitrógeno CMD: Consumo Medio Diario Na: Sodio CN: Control Negativo NH3: Amoniaco CP: Control Positivo NRC: National Research Council cps: centipoise P: Fósforo Cu: Cobre PB: Proteína Bruta d: días pH: Potencial de iones hidrógeno DE: Desviación Estándar Pi: Fósforo inorgánico dl: decilitro PNP: Fósforo no fitico EMA: Energía Metabolizable Aparente PP: Fósforo Fitico EMAn: Energía Metabolizable Aparente ppm: Partes por millón Corregida por Nitrógeno P-valor: Probabilidad Err.Es: Error Estándar rpm: Revoluciones por minuto Fe: Hierro T: Tratamiento FTU: Unidad fitasa TiO2: Oxido de titanio g: gramos U: Unidad fitasa GMD: Ganancia Media Diaria UE: Unión Europea ug: Microgramo Zn: Zinc 1 IRevisión bibliográfica I.1. Introducción: En los últimos años, y debido a un aumento de las producciones intensivas de cerdos y aves en el marco de la UE, se han desarrollado muchos estudios intentando minimizar el impacto contaminante del exceso de nitrógeno (N) y fósforo (P) que las deyecciones de estos animales producen en el medio ambiente. El fósforo es un mineral imprescindible para el crecimiento de los animales, debido a su influencia en el ciclo energético, en la formación de huesos y como regulador de la ingesta (EMFEMA 2002). El fósforo presente en los vegetales (base de la alimentación de las aves) se encuentra básicamente formando el ácido fítico, muy poco asimilable por los monogástricos. Estos últimos no producen la enzima fitasa que hidroliza el fitato y libera el fósforo a nivel intestinal. Por tal motivo, se suplementan las dietas con fósforo inorgánico (Pi), a menudo en exceso, que en parte revierte al medio ambiente, dando lugar a problemas medioambientales en áreas de gran concentración de producciones intensivas de animales (Juanpere et al. 2005). Asimismo, se ha descrito que el fitato se liga a minerales como Zinc (Zn), Magnesio (Mg), Calcio (Ca), Sodio (Na) y También disminuye la actividad de la pepsina y es capaz a ligarse a proteasas endógenas, como la tripsina y la quimotripsina en el tracto gastrointestinal con lo cual se disminuye la digestibilidad de la proteína y los aminoácidos (Selle et al. 2000). En la última década se ha estudiado el efecto que la incorporación de la enzima fitasa produce en el aumento de la biodisponibilidad del fósforo fitico (PP) (Pérez-Vendrell et al. 2001), con lo que se reduce la cantidad de fósforo inorgánico añadido a las dietas y, por tanto, la disminución del fósforo excretado. Se ha descrito que la incorporación de este enzima produce además mejoras de la disponibilidad de otros minerales (Ca, Zn, Cu, hierro (Fe), etc.) (Selle. 2007), pero dependientes del nivel del calcio y de vitamina D3 (Selle.H.P.2009). También se han descrito mejoras en la digestibilidad de la proteína y los aminoácidos (Singh et al. 2008). Las fitasas son enzimas capaces de extraer el fósforo a partir del fitato y se encuentran presentes en plantas o son sintetizadas por microorganismos, e incluso algunos tejidos animales. Las fitasas vegetales (endógenas) tienen una importancia práctica relativa en la 2 alimentación de los animales. De hecho, son sensibles a los tratamientos térmicos aplicados en la fabricación de los alimentos (granulación) y poca actividad en pH ácido (Beckers et al.2009).Las fitasas microbianas son sintetizadas por bacterias, levaduras y hongos. Gracias a los avances en la ingeniería genética y la presión de algunas legislaciones sobre la liberación del fósforo en el medio ambiente, las fitasas comerciales, procedentes en su mayoría de hongos (Aspergillus Níger y lycci Peniophora), se han revelado muy útiles en los años 90 en la alimentación de aves y cerdos. En la actualidad, se incluyen al menos 500 unidades / kg de pienso, en la mayoría de los regímenes de cerdos y aves de corral (Selle. 2007). I.2. El fosforo: El fósforo es un elemento nutritivo esencial para los animales y las plantas, y naturalmente esta presentado en el medio ambiente. La actividad humana está ligada a unas aumentaciones de las concentraciones del fósforo acuáticas y terrestres. Esta acumulación del fósforo es nociva para el medio ambiente, y puede causar daños irreversibles. Las fuentes de contaminación del medio ambiente por diferentes desechos se pueden clasificar en tres grandes categorías, que son, respectivamente, las relacionadas con desechos industriales, urbanos y agrícolas. El sector de la agricultura es cada vez más considerado como un actor clave en la contaminación del agua, aire y suelo por el fósforo, nitrógeno y amoniaco (NH3). En efecto, con el fin de cumplir los requisitos de cultivos de alto rendimiento, los agricultores han recurrido a la utilización creciente de los fertilizantes minerales u orgánicos que vienen de las granjas de animales (aves y cerdos, bovino) (Mellef. J et al, 2010). Los fertilizantes orgánicos que vienen de las granjas de animales, llevan muchos elementos nutritivos, principalmente el nitrógeno e el fósforo, la acumulación de este elemento en el suelo puede llevar consecuencias negativas para el medio ambiente. Los efectos negativos del aporte excesivo del fósforo en los distintos ecosistemas se caracterizan por un alto grado de eutrofización de lagos y ríos (Mellef. J et al, 2010). Teniendo en cuenta su baja solubilidad, el fósforo tiende a asociarse con las partículas del suelo, facilitando así la erosión y la contaminación de las aguas superficiales (Souchere.V. 2003). La lixiviación del fósforo de las tierras agrícolas a los ríos y lagos, permite en presencia de nitrógeno, el crecimiento de las algas y plantas acuáticas. Este es 3 la causa del empobrecimiento del agua en oxígeno y la mortalidad de los peces (Mellef. J et al, 2010). Como se ha establecido que el exceso de los elementos nutritivos era perjudicial para el medio ambiente, muchos países han establecido leyes y regulaciones para reducir y limitar la eliminación del fósforo en el entorno. En particular, para reducir la emisión del fósforo y la contaminación del agua, el estado de Maryland (EE.UU) ha introducido una legislación para mejorar la calidad del agua (Water Quality Improvement Act, 1998), que afirma que todos los alimentos de monogástricos deben incluir fitasa para reducir la incorporación del fósforo inorgánico, además hay técnicas de alimentación que se han puesto en práctica en las granjas de aves para controlar o reducir las emisiones del fósforo (Mellef. J et al, 2010). I.2.1-Estrategias para reducir la emisión de fosforo en pollos de engorde: En muchas zonas, la alimentación de los pollos de engorde se compone principalmente de maíz y harina de soja. Sin embargo, los dos tercios del fósforo de estas plantas encuentra en forma de ácido fitico, que es poco disponible para los animales monogástricos. La importancia del fósforo en la formación ósea y en el metabolismo de la energía de las aves, hace que sea necesaria la adición de este elemento en forma inorgánica a los piensos (Mellef. J et al, 2010). Las diferentes formas de fósforo inorgánico comúnmente utilizados en la alimentación de pollo son fosfato bicálcico (18,7% P), fosfato monocálcico (21% P) y fosfatos desfluorados (18% P) (Mellef. J et al, 2010). Además de disponer de diferentes fuentes de fósforo orgánicos e inorgánicos, las nutricionistas utilizan grandes márgenes de seguridad para la proporción del fósforo con el fin de evitar desequilibrios y deterioro del rendimiento relacionados con la deficiencia de este elemento (Mellef. J et al, 2010). Por lo tanto, cuando la ingesta del fósforo es superior a las necesidades de las aves, el exceso, es principalmente en forma de fosforo fitico será rechazada en el estiércol. Se han implementado varios enfoques dietéticos para reducir los aportes de fósforo inorgánico en la alimentación de pollos, sin perjudicar el rendimiento de los animales y, al mismo tiempo, reducir los riesgos ambientales. 4 I.2.1.1-Alimentación multifase: Sabiendo que las necesidades de las aves disminuyen con la edad y el estado fisiológico, el uso de varias dietas sucesivas durante el crecimiento en la misma granja permite satisfacer las necesidades reales de los animales y evitar los excesos (Mellef. J et al, 2010). Los requerimientos del fósforo en pollos de engorde disminuyen a partir de tres a cuatro semanas de edad, por lo tanto se puede utilizar concentraciones más bajas de fosforo que las recomendadas por el National Research Council (NRC.1994), el paso a programas alimentarios con cuatro o incluso cinco fases reduce aún más el consumo del fósforo (Angel et al. 2005). I.2.1.2-Selección de las materias primas: La elección de las materias primas debe ser dirigida a los ingredientes altamente digestibles y con bajo contenido en fitato. El uso de maíz con alto contenido de fósforo disponible (HAPC) que contiene menos del 50% de fitato que las dietas basadas en maíz estándar, es otro enfoque para reducir el nivel del fósforo en los alimentos. En efecto, la HAPC es un maíz genéticamente modificado para que contenga 0,27% de fósforo total con 0,17% de fósforo disponible, en comparación con el maíz convencional con la misma tasa de fósforo total, pero sólo con 0,03% de fósforo disponible (Waldroup, 2000). I.2.1.3Valorización del fosforo fitico por la adición de aditivos: Las investigaciones recientes sugieren que las recomendaciones del NRC (1994) del fosforo no fitico (PNP) para pollos de engorde superan los requisitos (Angel et al. 2005). Los aditivos para piensos tales como la fitasa, la vitamina D3 y el ácido cítrico mostraron una disminución de la suplementación del fósforo inorgánico, mediante la mejora de la utilización del fósforo fítico de las dietas (Powers. W. 2008). Debido a esta mejora de la digestibilidad del fósforo por efecto de la fitasa, el fósforo no fítico en las dietas de las aves se puede reducirse en 0,10 a 0,20 puntos porcentuales sin ningún efecto significativo en el rendimiento (Woyengo. 2011). Los metabolitos de la vitamina D3 tales como la 25-hidroxicolecalciferol, la 1αhidroxicolicalciferol y 1,25-dihidroxicolecalciferol, incrementan la disponibilidad del fosforo fitico, cuando se utilizan solo o en combinación con la fitasa. La inclusión de 500 U/kg de fitasa microbiana a base de Aspergillus Ficum y 70ug/kg de 25hidroxicolecalciferol, fue equivalente a 0.09% de PNP (Angel et al. 2005) 5 El ácido cítrico es otro aditivo que ha mostrado una mejora en la utilización del fósforo en los pollos. Como se ha reportado por Ebrahimnezhad et al. (2011), la adición de 2.5% y 5% de ácido cítrico en dietas deficientes en fósforo a base de maíz y harina de soja, aumentó la digestibilidad del fósforo y mejoró a 20% el contenido de las tibias en este mineral. La tasa de hidrólisis del fósforo fítico depende fuertemente de la cantidad de fitasa añadida, de las concentraciones del fósforo no fítico, el calcio, la vitamina D3 y de la relación Ca: P (Quian et al, 1997) (Narcy et al. 2009). I.3. Requerimientos del fosforo: El fósforo es esencial para el mantenimiento y el funcionamiento normal del cuerpo. Está presente en muchos órganos y tejidos, en donde su función es muy variable (estructural en el hueso como la hidroxiapatita y las membranas celulares, regulador en otros tejidos y órganos) (EMFEMA. 2002). Aproximadamente el 80% de fósforo del cuerpo se encuentra en el esqueleto, el restante 20% está contenido en los nucleótidos, tales como ATP, ácidos nucleicos, fosfolípidos y otros compuestos fosforilados necesarios para el metabolismo (Narcy et al. 2009). Una deficiencia de fósforo puede causar una reducción en la mineralización ósea y por lo tanto una disminución de la resistencia ósea. Además, una deficiencia de fósforo reduce el consumo de alimentos, lo que conduce a una reducción en la ganancia de peso de los animales (Saxena, 1996). Debido a que el fósforo es crucial para la integridad del esqueleto y el rendimiento del crecimiento, los nutricionistas tienden a incorporar niveles de fósforo moderadamente excesivos en la alimentación de aves para garantizar un margen de seguridad (Waldroup, 1999). Sin embargo, como el fósforo excretado está en función del fósforo total, las dietas actuales de aves deberán contener la mínima cantidad de fósforo que permita correctamente sostener la producción, en reconocimiento de los problemas ecológicos. En consecuencia, la validez de las recomendaciones estándar para los niveles de fósforo dietético ha convertido en objeto de revisión (Mellef. J et al, 2010). Recientemente los requerimientos de fósforo fueron revisados por (Angel, 2009). La recomendación de fósforo no fítico del NRC (1994) para pollos de engorda está basada en los expertos publicadas entre 1952 y 1983. Sin embargo, las aves comerciales actuales 6 son muy diferentes a las que se encontraban disponibles antes de 1983, debido en parte a la selección genética, pero también a los cambios en el manejo alimenticio (Selle et al. 2007).Las estirpes comerciales actuales son más eficientes en la utilización de nutrientes, y las dietas comerciales son formuladas de una manera más adecuada para cubrir el rápido crecimiento de los pollos (Narcy et al. 2009). Por ejemplo, el NRC (1994) recomienda un rango en los requerimientos para PNP de 4,5 g/ kg (0-3 semanas), 3,5 g/ kg (3-6 semanas) a 3,0 g/ kg (6-8 semanas) en las dietas de pollos de engorde. A partir de un estudio detallado de los pollos (0-21 días), Waldroup et al. (2000) afirmó que sobre la base de cenizas de las tibias, el requisito de PNP es de 3,9 g /kg para las dietas basadas en maíz normal, y que se reduce a 2,9 g/kg con la suplementación 800 FTU/kg fitasa. Para las dietas a base de maíz alto en fosfato disponible, los requisitos correspondientes son 3,7 y 3,2 g PNP/kg. La definición exacta de las necesidades de fósforo en las aves es inherentemente difícil y se ha complicado más por la introducción de fitasas microbianas. Por otra parte, hay que señalar que estas recomendaciones dependen de los niveles recomendados de Ca que juega un papel importante en la disponibilidad del fósforo (Narcy et al. 2009). I.4. El calcio: Un mineral muy íntimamente ligado al fósforo es el calcio. Normalmente, los dos minerales se estudian conjuntamente ya que van unidos tanto en los alimentos como en el metabolismo del organismo. El calcio es el elemento mineral más abundante en el organismo animal. El 99% de la cantidad total se encuentra en los huesos y los dientes. El resto se encuentra en los fluidos y los tejidos blandos del organismo (Juanpere.J. 2006). El calcio aparece como un ión libre, unido a las proteínas del suero y formando complejos con ácidos orgánicos e inorgánicos. El calcio ionizado es esencial para diferentes funciones como la conducción de corrientes nerviosas y el mantenimiento de la contracción y relajación muscular, incluido el músculo cardíaco. Puede actuar como activador o estabilizador de algunas enzimas y es preciso para la coagulación normal de la sangre. La principal fuente del calcio es el carbonato cálcico (CaCO3), otras fuentes importantes son las harinas animales (Juanpere.J. 2006). 7 Los cerdos y aves parecen ser tolerantes a dietas con cocientes elevados de Ca: P. El cociente óptimo para estos animales varía entre 1:1 y 2:1, siendo bien tolerados cocientes inferiores a estos y mal tolerados cocientes superiores a 3:1(Dieckmann y col., 2002). La deficiencia de calcio en pollos de engorde tiene como síntomas más habituales la disminución del consumo de pienso, un crecimiento pobre, morbosidad, deformidades de los huesos, aumento de la velocidad metabólica basal y una susceptibilidad aumentada a tener hemorragias internas (Saxena, 1996 ). I.5. EL fitato: El ácido fítico se encuentra naturalmente en los alimentos de origen vegetal como fitato, donde sirve como la forma de almacenamiento de fósforo. El descubrimiento de la molécula de ácido fítico data de 1855-1856, cuando Hartig aisló pequeñas partículas desprovistas de almidón en semillas de algunas plantas. En 1872, Pfeffer caracterizó estas partículas más ampliamente comprobando que eran partículas de superficie lisa, forma esférica, libres de nitrógeno y sugirió que eran una combinación de fósforo y carbohidratos (Frontela Saseta et al. 2007). El ácido fitico es el principal antinutriente presente en los cereales. Se sabe que se halla presente a altas concentraciones en granos de cereales y en legumbres (1-2 %), y puede inhibir de forma significativa la absorción de minerales mediante la formación de complejos insolubles con minerales de interés nutricional, como el hierro, el calcio y el zinc (Hurrell et al., 1992), impidiendo su absorción y alterándose de este modo la homeostasis mineral. Los seis grupos fosfato en la molécula de ácido fítico, le otorgan una elevada capacidad quelante de cationes divalentes (Figura 1). 8 Figura 1: Estructura del ácido fitico (Leeson, S.2005). El ácido fítico (mio-inositol hexafosfato; IP6) es en las plantas el mayor depósito de fósforo de que éstas disponen, ya que del fósforo total presente en las plantas, un 6090% se encuentra en forma de fitato (Cheryan, 1980). Es sintetizado a partir de glucosa 6-P, y se localiza en los granos y semillas de cereales, legumbres y oleaginosas; encontrándose también en el polen, tubérculos, frutas y otros vegetales (Frontela Saseta et al. 2007). Las variaciones en el contenido de ácido fítico que se producen como consecuencia de las condiciones, localización y año de cultivo, aplicación de fertilizantes y variedad del cultivo se ha comprobado en distintos cereales y legumbres (Steiner et al. 2007). Un resumen de los estudios para el contenido en el ácido fitico de los ingredientes principales de la alimentación se muestra en la (Tabla 1). I.5. Aspectos negativos del fitato : La Tabla 2 presenta una visión general sobre los impactos negativos del fitato sobre los diferentes nutrientes y su modo de acción. I.5.1-Iones minerales: El ácido fitico puede reducir la absorción, de minerales y por consiguiente su disponibilidad para los animales, lo que podría explicar en parte la reducción de los parámetros productivos por parte del ácido fitico (Woyengo. 2013). 9 Tabla 1: Media ponderada (y rango) de las concentraciones de P total y de PP, y proporción de PP al P total, en ingredientes base de piensos para aves (Selle et al, 2007). a: rango de los valores. Se ha encontrado que la digestibilidad del fósforo fítico en aves es mas baja que 10% (Cowieson et al. 2006), el fósforo no absorbido se elimina via heces lo que puede dar lugar a la contaminación del medio ambiente. El ácido fítico también puede reducir la digestibilidad de otros minerales debido a que en su estado natural en las plantas, forma un complejo con minerales en globoides dentro de cuerpos proteicos. Además, debido a sus cargasnegativa en condiciones de pH ácido, neutro y básico, el acido fitico puede formar complejos en todas las condiciones de pH en el tracto gastro-intestinal, reduciendo de ese modo la biodisponibilidad de los cationes, especialmente cationes divalentes, que forman complejos insolubles con acido fitico en condiciones de pH intestinal bajo (Woyengo. 2011). I.5.2. Efecto en la disponibilidad de proteína y aminoácidos: Un mecanismo por lo cual el acido fitico puede afectar negativamente la digestibilidad de aminoacidos antes la ingestión de la dieta ha sido propuesto. El acido fitico en el estado natural forma complejos con aminoácidos, minimizando la disponibilidad y la digestibilidad de estos nutrientes. Los grupos amino terminales de las proteínas y los grupos amino libres de aminoacidos poseen cargas positivas a pH por debajo del punto isoeléctrico (pH < 5). En consecuencia, a pH ácido en el pro-ventrículo y ventrículo de aves, el acido fitico puede interactuar con la proteína directamente y formar enlaces electrostáticos, reduciendo así la disponibilidad de proteínas. Porotra parte, las proteinas poseen unacarga negativa neta a pH por encima del punto isoelictrico pero por debajo de 10 pH 10. Por lo tanto, en el intestino delgado, donde el pH está en el intervalo de 5 a 10, acido fitico puede unirse con la proteína a través de cationes multivalentes para formar un complejo de fitato-mineral-proteína que es resistente a la hidrólisis enzimática. Además, las enzimas endógenas proteolíticas, como cualquier otra proteína, pueden ser ligados por el acido fitico, tanto en el estómago como en el intestino delgado, lo que reduce su capacidad para digerir las proteínas alimentarias (Woyengo. 2011). I.5.3. Efecto en la digestibilidad de la energia : La unión directa de moléculas generadoras de energía, tales como hidratos de carbono, lípidos y proteínas con el acido fitico pueden reducir la digestibilidad de la energía. El ácido fítico también puede reducir indirectamente la digestibilidad de la energia por su unión con las enzimas endogenaso con cofactores metalicos de las enzimas implicadas en la hidrolisis de las moleculas generadoras de energia, y por el aumento de la secreción endógena de Na, que está implicado en la absorción de la glucosa y amino acidos en el tracto gastro-intestinal (Woyengo. 2011). Tabla 2 : Las interacciones negativas del fitato y los nutrientes en los alimentos (Kumar.V. 2010). Nutrientes Modo de acción Iones minerales (zinc, hierro,calcio,magnesio, manganeso y cobre) Formación de complejos fitato-minerales que conduce a la disminución de la disponibilidad de los minerales Proteinas Formación de un complejo no especifico proteina-fitato que no se hidroliza fácilmente por enzimas proteoliticas Carbohidratos La formación de complejos de carbohidratosfitato implica que los carbohidratos sean menos degradables. La inhibición de la actividad de la amilasa por formacion de un complejo con iones Ca, disminuye la degradación de los carbohidratos. Lípidos La formación del complejo 'lipofitina', puede dar lugar a jabones metálicos en la luz intestinal, dando como resultado la baja disponibilidad de lípidos 17 Es probable que los altos niveles de las especificaciones nutricionales empleadas en el ensayo puedan acomodar a las propiedades anti-nutritivas de las concentraciones del fitato en la dieta y observar una respuesta negativa a la suplementación de fitasa (Selle. 2007). I.9.2. Disponibilidad de proteínas y aminoácidos: Durante la última década, una serie de grupos en Australia, Europa y América del Norte han investigado los efectos de la adición de fitasa en la digestibilidad de los aminoácidos y del nitrógeno en dietas para cerdos y aves. El ácido fítico interfiere en la digestibilidad y disponibilidad de las proteínas, y su efecto depende de las características del complejo ácido fítico-proteína formado, el cuál varía en función del tipo de proteína, del pH y de la temperatura. Existen discordancias en los resultados obtenidos sobre la interacción entre el ácido fítico y las proteínas; éstas podrían estar debidas a la distinta naturaleza de las proteínas presentes en los alimentos, mientras que otros autores han atribuido este efecto negativo a la capacidad que presenta el ácido fítico de inhibir enzimas digestivas con actividad proteolítica (Frontela Saseta. 2007). La medida en que la fitasa genera mejoras en la digestibilidad de la proteína y aminoácidos en aves de corral es variable y el tema sigue siendo controvertido. La variabilidad observada parece provenir de un número de factores que incluyen:  la elección de marcador inerte utilizado en los ensayos de digestibilidad.  Diferencias entre los tipos de ingredientes.  los niveles dietéticos de Ca y PNP, y algunas pruebas sugiere que el balance electrolítico dietético (BED) puede estar implicado. Otros factores que probablemente afectan son: la edad de las aves, la digestibilidad inherente de los aminoácidos de la dieta, las fuentes y concentraciones de fitato en la dieta, y el nivel de inclusión y el tipo de fitasa añadida (Selle. 2007). Como se ha mencionado, el ácido fitico inhibe la digestibilidad y la disponibilidad de la proteína y los aminoácidos en ciertas condiciones, como ocurre en las aves al pH acido del proventrículo. Como la fitasa exógena es principalmente activa en el buche, se deduce que la fitasa impide parcialmente la formación de complejos de fitato-proteína por la hidrólisis previa del fitato (Selle. 2007). 18 Varios estudios han demostrado que las mejoras en el crecimiento después de la adición de fitasa en dietas bajas en fósforo, puede ser consistente con una mejora de la disponibilidad de proteína. Ravindran et al. (2000) examinaron los efectos de la adición de fitasa en la digestibilidad de aminoácidos de las dietas de pollos de engorde basado en una mezcla de trigo y sorgo con dos niveles de fósforo disponible. La fitasa incrementó la digestibilidad de los aminoácidos evaluados, pero los efectos fueron más pronunciados en las dietas bajas en fósforo. Se ha concluido que, la adición de fitasa mejoró la utilización de proteínas en las aves por inactivación de las propiedades anti-nutritivas de ácido fítico. Por lo tanto, estos datos apoyan la hipótesis de que la fitasa tiene un efecto positivo en la disponibilidad de proteínas en aves. En contraste con estas diversas respuestas positivas, algunos autores encontraron que la fitasa adicionada a las dietas de pollos no tuvo efectos positivos sobre la digestibilidad de la proteína y los aminoácidos (Augspurger y Baker, 2004). I.9.3.Factores influyen el efecto de la fitasa en la utilización de proteína y aminoácidos: I.9.3.1. Elección de marcador inerte: Se ha demostrado de manera concluyente, que las respuestas de digestibilidad de los aminoácidos a la fitasa son más pronunciadas cuando se utiliza el óxido de titanio como marcador inerte en comparación con el óxido crómico. Por lo tanto, la recomendación de Jagger et al. (1992) que el óxido de titanio se debe preferir a óxido crómico como marcador en estudios de digestibilidad de nutrientes asume importancia. El óxido crómico puede no distribuirse uniformemente en la digesta a lo largo del tracto gastrointestinal. Una limitación adicional al óxido crómico como marcador dietético es la pobre repetibilidad y la variabilidad de sus métodos analíticos. Por otra parte, es posible que los resultados variables con óxido crómico pueden estar relacionadas con problemas analíticos generados por la presencia del fósforo y otros minerales en muestras de digesta (Selle. 2007). I.9.3.2. Factores de alimentación: En la categoría de los factores de alimentación, la concentración y la fuente del fitato, la calidad de las proteínas, y las concentraciones de cationes divalentes, vitamina D y quelantes minerales en la dieta, pueden afectar la respuesta de la proteína y los aminoácidos a la fitasa microbiana. Se ha encontrado que en dietas bajas en fósforo, la 19 digestibilidad de los aminoácidos aumentaba por la adición de fitasa (Ravindran et al. 2000). Hay consenso en que el calcio tiene un efecto negativo sobre la eficacia de la fitasa debido a la formación del complejo fitato-Ca que deja al sustrato menos accesible a la actividad de la fitasa (Selle. 2006). Se acepta que los complejos de Ca-fitato se forman principalmente en el intestino delgado donde tienen una influencia negativa considerable sobre la eficacia de la fitasa de la mucosa. Sin embargo, las fitasas exógenas son activas principalmente en segmentos más proximales del intestino, donde los niveles de pH son más bajos y, por tanto su eficacia no debería estar influenciada por los complejos de Ca-fitato en el intestino delgado. Sin embargo, hay datos que indiquen que se producen las interacciones de calcio y fitato también en condiciones ácidas con la formación de especies de Ca-fitato soluble e insoluble, lo que podría afectar negativamente a la eficacia de fitasa exógena (Selle. 2009). I.9.3.3. Las cuestiones relativas a los protocolos experimentales: Las respuestas a la adición de fitasa también pueden depender del procesamiento de la dieta y del punto y el método de toma de muestras (especialmente en los cerdos con respecto a la canulación ileal o métodos de sacrificio) (Adeola. 2003). I.9.3.4. Factores de animales: La genética y el sexo, la edad de los animales son factores que probablemente repercuten en la respuesta, en relación con el tiempo de tránsito gastrointestinal y pH, así como la regulación de la actividad fitasa por la luz intestinal. Hasta que varios de estos factores se cuantifiquen adecuadamente, la información esencial relativa a cuándo y cuánto respuesta que se puede esperar será difícil a alcanzar (Adeola. 2003). I.9.4. Utilización de la energía: La posibilidad de que la fitasa afecte positivamente la utilización de la energía en las aves de corral tiene implicaciones prácticas considerables. Como se ha descrito anteriormente, el fitato tiene un efecto negativo sobre la utilización de la energía. La adición de fitasa ha producido una mejora de la utilización de la energía en muchos estudios, sobre todo en los pollos de engorde (Selle. 2007). Ravindran et al. (2000) observaron que la adición de una fitasa (400 U / kg de dieta) aumentó el valor de la energía metabolizable aparente (EMA) un 5,34% en las dietas bajas en PNP (0,23%) y una 4% en dietas con valor normal del PNP (0,45%). 20 Se sugiere que el efecto positivo de la fitasa sobre la utilización de la energía está relacionado con el aumento de digestibilidad de la grasa, la proteína y almidón (Selle. 2007). I.9.4.1. Fitasa y energía derivada de la grasa, proteína y almidón: Hay una evidencia de la interacción entre el fitato y los lípidos en el maíz y se ha sugerido que estas lipofitinas son complejos de Mg/Ca-fitato, lípidos y péptidos. Por lo tanto, parece posible que el complejo fitato-Ca y lípidos puede estar involucrado en la formación de jabones metálicos en el intestino de las aves, que son los principales limitantes sobre la utilización de la energía derivada de lípidos. Se ha encontrado que el sebo bovino reduce la utilización del fósforo fítico en pollos jóvenes y aumenta el porcentaje de grasa excretada como ácidos grasos de jabón. Se ha descrito que la adición de fitasa puede hidrolizar parcialmente el fitato en la parte proximal del intestino de los pollos, y por tanto puede prevenir la formación del complejo Ca-fitato y lípidos y dejar a la grasa más disponible con lo que aumenta la digestibilidad de la misma en el intestino por la adición de fitasa. La mejora de la digestibilidad de los aminoácidos también conduciría a aumentar la utilización de la energía (Selle. 2007). Se ha sugerido que el fitato puede unirse al almidón directamente o indirectamente a través la proteína asociada con el almidón, pero hay pocos ensayos in vitro que apoyen la existencia de este complejo fitato-almidón. Sin embargo, el fitato es un factor inhibidor de la enzima α-amilasa, y este efecto se ha corroborado por varios estudios, según la revisión de Selle et al. (2000). Martin et al. (1998) encontraron que la adición de fitasa redujo la actividad del alfa-amilasa en el intestino delgado de los patos, pero no está claro que la inhibición de la actividad de amilasa por el fitato en el tracto gastrointestinal limite la digestión del almidón. Parece que la inhibición de la actividad de la amilasa por el fitato puede impedir la digestión del almidón, cual sería contrarrestado con la fitasa, pero es posible que este efecto sea marginal (Selle. 2007). I.9.5. Disponibilidad del fosforo y el calcio: La suplementación de fitasa ha demostrado producir una mejora en la digestibilidad del fósforo en aves, reduciéndose el fósforo no fítico en las dietas de aves en 0,10 a 0,20 puntos porcentuales sin ningún efecto significativo en el rendimiento (Woyengo. 2011). 21 Las mejoras en la disponibilidad del fósforo que resulta con la adición de fitasa, generalmente, se sitúan en el rango de 20 a 40%. La cantidad de fósforo liberado por la fitasa microbiana depende de la concentración y la fuente de la fitasa añadida, del nivel de fósforo fítico y calcio de la dieta y del contenido de vitamina D3 (Singh. P.K. 2008). Ahmad et al. (2000) observaron que la adición de fitasa a una dieta baja en fósforo aumentó la retención de este último en un 20,4% y 12,73% en comparación con el control negativo (dieta baja en P) y el control positivo (dieta con P normal) suplementadas con fitasa, respectivamente. Ravindran et al. (2000) observaron que la suplementación de una fitasa (800 U / kg) aumentó la digestibilidad del P en 40,3, 58,9 y 44,1% en dietas con contenido bajo (0,29%), medio (0,37%) y alto (0,44%) en PP, basadas en trigo, sorgo y harina de soja. La mejora en la disponibilidad del fósforo permite una reducción de éste en la dieta. Esencialmente, las fitasas exógenas aumentan la absorción del calcio en el intestino delgado por la hidrólisis parcial del fitato a ésteres inferiores en los segmentos más proximales del intestino. Los ésteres inferiores tienen una capacidad reducida para quelar el calcio, por lo tanto, disminuye la formación del complejo Ca-fitato tan insoluble y aumenta la disponibilidad del calcio (Selle. P.H. 2009). El porcentaje de cenizas del hueso es un parámetro sensible y fiable para la determinación de la utilización de fósforo fítico y se considera más preciso que la ganancia de peso. Los estudios de meta análisis de Narcy et al. (2009) mostraron un efecto positivo de la adición de fitasa (500 U / kg) sobre las cenizas de las tibias en función de los niveles de PNP. I.9.6. Disponibilidad de otros minerales: El ácido fitico tiene una gran capacidad quelante para formar una variedad de complejos con diferentes caciones (Ca, Zn, Mg, Mn, Cu, Fe), convirtiéndolos en biológicamente no disponibles. Varios estudios han demostrado un efecto positivo da la fitasa sobre la disponibilidad de los minerales por la hidrólisis del fitato. Se ha descrito que el zinc es el mineral que tiene la unión más fuerte con el fitato frente a los otros minerales (Singh. P.K. 2008). Mohanna y Nys (1999) demostraron que la adición de fitasa microbiana (800 U / kg en una dieta a base de maíz y harina de soja) aumentó la disponibilidad de zinc y posibilitó una reducción del zinc a 14 mg / kg en dietas de pollos de engorde. En otros ensayos, se ha descrito que la adición de fitasa sola no tiene efecto sobre la 22 retención del zinc en pollos, pero esta retención mejora con la adición de vitamina D3 (Singh. P.K. 2008).Viveros et al. (2002) mostraron que la suplementación de una fitasa a dietas deficientes en fósforo mejora la utilización de P, Ca, Mg y Zn en pollos de engorde. Hay varios estudios que han demostrado el efecto positivo de la fitasa sobre la retención del hierro (Fe) en pollos. Paik et al. (2000) han encontrado que la disminución de los niveles del fósforo no fítico en dietas de pollos aumenta el nivel de hierro en el plasma, y que la adición de la fitasa microbiana aumentó más el nivel plasmático de Fe. Um et al. (2000) mostraron que la adición de fitasa a una dieta deficiente en fósforo no fítico a base de maíz y harina de soja mejora la utilización del hierro en pollos de engorde. Por el contrario, en el ensayo de Biehl et al (1997) no se encontró ningún efecto positivo sobre la biodisponibilidad de hierro en dietas a base de harina de soja. En lo que se refiere al cobre (Cu) hay varios estudios que muestran que la adición de fitasa mejora la retención del Cu (Um et al. 2000, Lan et al. 2002), en contra al estudio de Biehl et al (1997), en el que los autores observaron que la adición de la fitasa no tuvo ningún efecto positivo sobre la retención de Cu. 23 IIObjetivos: En el proyecto actual se han estudiado los efectos de la adición de fitasa microbiana a dos diferentes tipos de dieta produce en su valor nutricional, en los rendimientos productivos de las aves, así como en la reducción del impacto ambiental del fósforo excretado. Evaluar el efecto de la dosis no-convencional de la fitasa microbiana sobre la digestibilidad del fósforo, y en un intento de ver algún efecto adverso de la tolerancia de esta enzima. Confirmar el papel de la fitasa endógena presente en determinadas materias primas en los procesos de absorción y metabolismo mineral y en la productividad de las aves, así como el efecto diferenciado de la fitasa microbiana en dietas ricas en polisacáridos no amiláceos NSP. 24 III-Material y métodos: Se realizaron dos experimentaos, ambos con el mismo diseño experimental pero distintos en el cereal de base de las dietas. En el primer ensayo se utilizó centeno y en el segundo se empleó trigo. Los procedimientos experimentales fueron iguales por lo que se describen conjuntamente. III.1. Métodos analíticos: Los métodos utilizados para evaluar la composición de las dietas, contenidos intestinales, excretas y huesos procedentes de los ensayos de describen a continuación:  Materia seca, por desecación de las muestras en una estufa durante 4 horas 1ª 103ºC (método AOAC nº 925.09, 2000).  Proteína bruta (N x 6,25) mediante método Dumas, con el analizador de nitrógeno Leco FP-528 (Leco, St. Joseph, MI) (método AOAC nº 968.06, 2000).  Fósforo total, por colorimetría mediante reacción con vanadomolibdato amónico (método AOAC nº 965.17, 2000).  Calcio, por espectrometría de absorción atómica tras calcinación de las muestras a 550ºC durante 5 horas (método AOAC nº 968.08, 2000).  Titanio, mediante método descrito por Short et al. (1996).  Actividad fitasa, mediante método de Engelen (1994). Este método colorimétrico se basa en la determinación del fósforo inorgánico, liberado en la hidrólisis del fitato sódico a pH 5,5. Una unidad fitasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol por minuto de fosforo inorgánico de ácido fitico a pH 5.5 y 37ºC.  Fibra bruta, mediante analizador de fibra Ankom basado en la tecnología de bolsas de filtración.  Extracto etéreo, mediante extracción en continuo con sistema automático Buchi B-811 (método AOAC nº 920.39, 2000).  Cenizas, mediante calcinación en horno mufla a 550ºC hasta peso constante (método AOAC nº 942.05, 2000).  Energía bruta, mediante calorímetro adiabático IKA C-2000 (Norma DIN 51900). Viscosidad intestinal. Las muestras de contenido intestinal se centrifugaron a 10000 rpm durante 5 minutos a 15ºC, y la viscosidad se midió en el sobrenadante 25  mediante un viscosímetro Brookfiled a 30ºC. Los dos experimentos se llevaron a cabo en la finca experimental del Centro IRTA de Mas Bover, Ctra.. Reus a El Morell, km. 3,8, 43120 Constantí (España). III.2. Animales experimentales: Se utilizaron en cada ensayo, doscientos ochenta y ocho pollos machos de la estirpe Ross 308. Los pollitos se asignaron a 48 jaulas (réplicas) ubicadas en dos baterías Petersime, con nido con calentamiento eléctrico. Cada réplica consistió en 6 animales. La superficie de cada jaula es de 0.376 m2, de modo que la densidad de población es de 16 aves/m2. Las baterías se encuentran en una habitación provista de ventilación forzada. Se aplicó el programa de la iluminación estándar de la granja, y fue de 23 horas en los 4 primeros días, 20 horas de 4 a 10 días, posteriormente 18 horas hasta el final del ensayo. La temperatura se ajustó entre 30-35ºC en la primera semana de la prueba y disminuyó 2 grados cada semana. El pienso y el agua se proporcionaron a los animales ad libitum. La duración de los dos ensayos fue de 21 días. La limpieza profiláctica, la desinfección y la vacunación se llevó a cabo de acuerdo con la práctica habitual. Las aves se vacunaron contra la bronquitis infecciosa en la incubadora. III.3. Dietas basales: Se utilizó un solo tipo de dieta en cada ensayo durante todo el experimento. Los alimentos experimentales se mezclaron en la fábrica de piensos perteneciente al departamento de Nutrición Monogástricos del IRTA de Mas Bover. Todos los ingredientes, excepto la grasa, sal, fosfato bicálcico, carbonato cálcico, el corrector vitamínico-mineral y el enzima, se molieron con un molino de martillos de 40 HP hasta un tamaño de partícula de 3 mm. La mezcladora tiene una capacidad de 500 l y el tiempo de mezcla fue de 6 minutos. Los aminoácidos, el corrector vitamínico-mineral y el enzima se mezclaron previamente con una alícuota de 1º kg de harina de soja 48%, en una mezcladora pequeña, y luego añadidos a la mezcladora de 500 l. Los cálculos de los nutrientes y la composición de las dietas basales se muestran en la Tabla 4. Las materias primas principales utilizadas en los dos ensayos fueron; centeno (Ensayo 1) y trigo (Ensayo 2), harina de soja 48% y soja extrusionada. También se incluyó 0,5% de óxido de titanio en las dietas de los dos ensayos como marcador de digestibilidad. 26 Tabla 4: Composición de las dietas basales. (%) Dieta a base de centeno Dieta a base de trigo Ingrediente P normal P bajo P normal P bajo Centeno 55.470 58.138 - - Trigo - - 60.613 63.610 Harina de soja 48% 18.970 20.979 27.327 29.722 Soja extrusionada 17.844 14.518 4.137 0.088 Manteca de cerdo 4.000 4.000 4.000 4.000 DL-metionina 0.273 0.274 0.242 0.242 L-lisina HCl 0.054 0.063 0.130 0.144 Carbonato-cálcico 1.028 0.721 1.015 0.709 Fosfato dicálcico 1.629 0.572 1.702 0.650 Sal 0.319 0.321 0.434 0.436 Cloruro de colina 50% 0.008 0.015 - - Minerales y vitaminas1 0.400 0.400 0.400 0.400 Composición calculada Energía metabolizable (Kcal/kg) 3000 3000 3000 3000 Proteína bruta (%) 21.50 21.50 21.50 21.50 Fibra bruta (%) 2.82 2.84 2.80 2.81 Grasa bruta (%) 8.68 8.05 6.42 5.77 Cenizas (%) 5.71 4.35 5.79 4.42 Lisina (%) 1.20 1.20 1.20 1.20 Met + Cys (%) 0.92 0.92 0.92 0.92 Calcio (%) 0.90 0.54 0.90 0.54 Fósforo total (%) 0.65 0.48 0.68 0.50 Fósforo inorgánico (%) 0.45 0.27 0.45 0.27 Fitasa endógena - - 353.13 370.68 1Corrector vitaminico-mineral:Vitamina A, 12000 IU; Vitamina D3, 2400 IU; Vitamina E, 30 mg; Vitamina K3, 3 mg; Vitamina B1, 2.2 mg, Vitamina B2, 8.0 mg; Vitamina B6, 5.0 mg; Vitamina B12, 11.0 g; Acidofólico, 1.5 mg; Biotina, 150 g; Pantotenato de calcio, 25 mg; Acido nicotínico, 65 mg; Etoxiquina, 150 mg; (para centeno: Fe, 40 mg; Zn, 20 mg, para trigo: Fe, 80 mg; Zn, 40 mg) Cu, 8 mg ;Mn, 60 mg, Se, 0.15 mg, I, 0.33 mg. Cabe mencionar que la cantidad utilizada del Fe y Zn de la dieta a base de centeno fue la mitad que en el caso del trigo, para comprobar si las cantidades más bajas ya cumplían con los requerimientos, y por tanto no hacía falta a ofrecer valores superiores. 33 IV.1. Parámetros productivos y viscosidad intestinal: aExperimento 1: A los 21 días de edad hubo diferencias significativas (p < 0.05) entre los tratamientos en cuanto el peso vivo, la ganancia media diaria, el consumo medio diario, el índice de conversión y la viscosidad intestinal (Tabla 8). Los animales alimentados con T8 presentaron mejor peso vivo, ganancia media diaria, consumo medio diario y viscosidad intestinal pero peor índice de conversión (1.488g/g). Los animales alimentados con las dietas control positivo a base de centeno no tratado presentaron mejor índice de conversión (1.369g/g) que los demás. Tabla 8: parámetros productivos y viscosidad intestinal de 1 a 21 días en dietas a base de centeno (análisis jerárquico) Tratamiento Centeno P inorgánico Fitasa añadida (U/kg) Peso final (g) GMD (g/d) CMD (g/d) IC(g/g) viscosidad intestinal (cps) T-1 No tratado 0.45 % - 579.9b 25.4b 35.6bc 1.396c 20.22bc T-2 No tratado 0.27 % - 568.0b 24.3b 34.4c 1.463b 24.97ab T-3 No tratado 0.27 % 500 561.8b 24.6b 34.4c 1.433abc 29.95a T-4 No tratado 0.27 % 5000 605.4b 26.6b 36.5bc 1.401bc 20.3bc T-5 Autoclavado 0.45 % - 564.0b 24.7b 36.9bc 1.497a 13.92cd T-6 Autoclavado 0,27% - 559.0b 24,4b 35.9bc 1,467a 17.37cd T-7 Autoclavado 0.27 % 500 602.4b 26.5b 39.0b 1.468a 12.56d T-8 Autoclavado 0.27 % 5000 669.4a 29.7a 42.8a 1.488a 12.95d Err.Es 15.68 0.77 1.18 0.021 2.21 P-valor 0.0006 0.0004 0.0003 0.0073 0.0001 Contrastes (P-valor) Nivel P: 0.45% vs 0.27% (T1+T5 vs T2+T6) 0.6012 0.3702 0.3763 0.3679 0.0664 No tratado v Autoclavado (T1 a T4 vs T5 a T8) 0.0905 0.0556 0.0003 0.0005 0.0001 Sin fitasa vs. Fitasa (T2+T6 vs T3+4+T7+T8) 0.0025 0.0007 0.0075 0.3330 0.1062 Dosis: 500 ppm vs 5000 ppm (T3+T7 vs T4+T8) 0.0018 0.0023 0.0211 0.7693 0.2648 a, b, c d:las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05). GMD: Ganancia Media Diaria, CMD: Consumo Medio Diario, IC: Índice de Conversión. En contrastes lineales, en cuanto el tipo del cereal (no tratado vs autoclavado) no hay diferencias significativas entre tratamientos en el peso final y la ganancia media diaria, mientras que hay diferencias muy significativas entre tratamientos en cuanto al consumo medio diario (p<0.0003), índice de conversión (p<0.0005) y la viscosidad 34 intestinal (p<0.0001). Sin embargo, en el análisis factorial (Tabla 9), el tratamiento por calor del centeno mejoró los parámetros productivos y la viscosidad intestinal, salvo el índice de conversión donde presento el peor valor. También en los contrastes lineales, se encontraron diferencias significativas en cuanto a la presencia de enzima fitasa microbiano exógeno, con pesos superiores en presencia de la enzima, así como también se encontraron por el efecto de la dosis. De igual forma, se encontraron la misma tendencia en cuanto a la ganancia media diaria, y el consumo medio diario teniendo en cuenta que estos valores son el cociente del peso final entre los días de duración del ensayo y el cociente del consumo total entre los días del ensayo, respectivamente. Con estos valores se obtienen los valores del índice do conversión. El valor más bajo (mejor índice de conversión), corresponde a las dietas control positivo con centeno no tratado (1.369 g/g), mientras que los índices de conversión de todas las dietas de centeno autoclavado presentaron peores valores. Tabla 9: Parámetros productivos y viscosidad intestinal de 1 a 21 días en dietas a base de centeno (análisis factorial) Tratamiento Centeno P inorgánico Fitasa añadida (U/g) Peso final (g) GMD (g/d) CMD (g/d) IC(g/g) viscosidad intestinal (cps) T-2 No tratado 0.27 - 568.0 24.3 34.4 1.463 24.97 T-3 No tratado 0.27 500 561.8 24.6 34.4 1.433 26.95 T-4 No tratado 0.27 5000 605.4 26.6 36.6 1.401 20.30 T-6 Autoclavado 0.27 - 559.0 24.4 35.9 1.467 17.37 T-7 Autoclavado 0.27 500 602.4 26.5 39.0 1.468 12.56 T-8 Autoclavado 0.27 5000 669.4 29.7 42.8 1.488 12.95 Fitasa, U/kg 0 563.13b 24.41b 35.26b 1.465 21.17a 500 583.98b 25.67b 36.95b 1.452 20.41ab 5000 634.49a 28.08a 40.00a 1.444 16.29b P-valor 0.0002 0.0001 0.0029 0.6265 0.1297 DE 11.22 0.56 0.85 0.016 1.58 Centeno No tratado 580.09b 25.25b 35.17b 1.432b 24.29a Autoclavado 606.84a 26.76a 39.27a 1.475a 14.39b P-valor 0.0204 0.0112 0.0003 0.0282 0.0001 DE 9.30 0.45 0.73 0.013 1.27 Interacción Fitasa*Centeno P-valor 0.0814 0.1813 0.1471 0.1739 0.1181 a, b:las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05). GMD: Ganancia Media Diaria, CMD: Consumo Medio Diario, IC: Índice de Conversión. 35 Los contrastes lineales confirman estos resultados, donde la adición de la fitasa microbiana teniendo en cuenta a sus niveles produjeron mejoras significativas en los parámetros productivos (p < 0.05), salvo el índice de conversión. Así mismo, se confirman estos resultados en los análisis factoriales, (Tabla 9) salvo que en este caso, el efecto del tratamiento del centeno (autoclave) produjo diferencias significativas en todos los parámetros productivos. La viscosidad intestinal se vio afectada significativamente (P<0.05) por los tratamientos experimentales. Los contrastes lineales muestran que el proceso de autoclave del centeno, fue el único factor determinante (P<0.0001). Estos resultados se confirman mediante los análisis factoriales (Tabla 9), donde se observó una reducción de la viscosidad intestinal cuando los animales ingirieron las dietas con centeno Autoclavado (14,39 vs 24,29). La creciente adición de fitasa produjo una ligera disminución de la viscosidad, que no llegó a ser significativa estadísticamente. bExperimento 2: Los animales alimentados con dietas controles positivos son los que tuvieron un peso vivo más elevado, con mejor ganancia media diaria, respecto a los otros animales (Tabla 10).Todos los animales alimentados con dietas deficientes en fosforo mostraron un crecimiento menor de los anteriores, aunque similares entre ellos, excepto en el caso de los animales que ingirieron dietas control negativo y sin fitasa, que todavía tuvieron un peso más bajo. En los contrastes lineales, se encontraron diferencias significativas en cuanto a la presencia de enzima fitasa microbiano exógeno (P<0.002), con pesos superiores en presencia de la enzima, así como también se encontraron por el efecto de la autoclave. (P<0.01). Proporcionalmente, se encontraron los mismos resultados en cuanto a la ganancia media diaria. No se encontraron diferencias significativas del consumo medio diario entre tratamientos, a pesar de que la presencia de la fitasa pareció aumentar la ingesta según el estudio del contraste lineal de las dietas con presencia de fitasa microbiana a las que no tienen (P <0.05). Contrariamente, no se observaron diferencias de consumo entre los tratamientos en los Análisis factoriales (Tabla 11). 36 Tabla 10: parámetros productivos y viscosidad intestinal de 1 a 21 días en dietas a base de trigo (análisis jerárquico). Tratamiento Trigo P inorgánico Fitasa añadida (U/kg) Peso final (g) GMD (g/d) CMD (g/d) IC (g/g) Viscosidad intestinal (cps) T-1 No tratado 0.45 % - 790.6a 35.5a 48.46 1.353d 3.37 T-2 No tratado 0.27 % - 716.5b 32.0b 46.88 1.464c 2.62 T-3 No tratado 0.27 % 500 742.8b 33.2b 47.61 1.431c 2.70 T-4 No tratado 0.27 % 5000 749.5b 33.6b 47.89 1.438c 2.69 T-5 Autoclavado 0.45 % - 794.4a 35.7a 49.46 1.390d 3.41 T-6 Autoclavado 0,27% - 667.8c 29.7c 45.74 1.537a 3.27 T-7 Autoclavado 0.27 % 500 708.9b 31.6b 48.45 1.532ab 3.21 T-8 Autoclavado 0.27 % 5000 729.1b 32.6b 48.62 1.500b 2.60 Err.Es 13,6 0.64 0.81 0.012 0.28 P-valor <0.0001 <0.0001 0.1624 <0.001 0.0971 Contrastes (P-valor) Nivel P: 0.45% vs 0.27% (T1+T5 vs T2+T6) 0.0052 0.001 0.0001 0.001 0.0770 No tratado vs Autoclavado (T1 a T4 vs T5 a T8) 0.0139 0.019 0.6696 0.001 0.1224 Sin fitasa vs. Fitasa (T2+T6 vs T3+4+T7+T8) 0.0024 0.004 0.0153 0.027 0.5057 Dosis: 500 ppm vs 5000 ppm (T3+T7 vs T4+T8) 0.3302 0.324 0.7170 0.325 0.2213 a, b, c d:las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05). GMD: Ganancia Media Diaria, CMD: Consumo Medio Diario, IC: Índice de Conversión. El mejor índice de conversión se obtuvo con dietas control positivo con trigo no tratado (1.353 g/g), mientras que los peores valores fueron con las dietas deficientes en fósforo con trigo pasado por autoclave, ya sea con o sin enzima exógena. En los contrastes, se confirmaron estos resultados, por un lado, la adición de fitasa microbiana produjo mejoras significativas en todos los parámetros (P <0.05), originados con independencia del nivel de fitasa incorporado a la dieta, pues no se observaron diferencias entre la presencia de 500 o 5000 U/ Kg de fitasa. Por otra parte, los mejores resultados en los parámetros productivos excepto el consumo medio diario se obtuvieron con el trigo sin tratar (P< 0.001). Los valores de viscosidad intestinal medidos fueron bajos, y no se observaron diferencias significativas en los valores de la viscosidad intestinal entre los tratamientos individuales. Sin embargo, en el análisis factorial de los datos (Tabla 11), sin incluir los controles positivos, se obtuvo que el proceso de autoclave del trigo afectó la viscosidad intestinal (P<0,05), presentando una viscosidad más elevada los tratamientos con trigo autoclavado. 37 Tabla 11: Parámetros productivos y viscosidad intestinal de 1 a 21 días en dietas a base de trigo (análisis factorial). Tratamiento Trigo P inorgánico Fitasa añadida (U/g) Peso final (g) GMD (g/d) CMD (g/d) IC(g/g) Viscosidad intestinal (cps) T-2 No tratado 0.27 - 716.5 32.0 46.9 1.464 2.62 T-3 No tratado 0.27 500 742.8 33.3 47.6 1.431 2.70 T-4 No tratado 0.27 5000 749.6 33.6 47.9 1.438 2.69 T-6 Autoclavado 0.27 - 667.8 29.7 46.4 1.537 3.27 T-7 Autoclavado 0.27 500 709.0 31.7 48.5 1.532 3.22 T-8 Autoclavado 0.27 5000 729.2 32.6 48.6 1.500 2.66 Fitasa, U/kg 0 691.0b 30.8b 46.6 1.500a 2.95 500 725.9ab 32.5ab 48.0 1.482ab 2.96 5000 739.4a 33.1a 48.3 1.466b 2.64 P-valor 0.0121 0.0122 0.2394 0.0413 0.239 DE 11.3 0.5 0.7 0.01 0.15 Trigo No tratado 736.3a 33.0a 47.4 1.444b 2.67b Autoclavado 701.2b 31.3b 47.9 1.522a 3.02a P-valor 0.0075 0.0076 0.5704 0.0001 0.0464 DE 8.9 0.4 0.6 0.007 0.12 Interacción Fitasa*Trigo P-valor 0.601 0.602 0.718 0.277 0.174 a, b:las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05). GMD: Ganancia Media Diaria, CMD: Consumo Medio Diario, IC: Índice de Conversión. Como comparación entre los dos ensayos, se ve que los animales alimentados con dietas a base de trigo presentaron valores mayores en cuanto al peso vivo, ganancia media diaria y consumo medio diario frente los animales alimentados con dietas a base de centeno. Las dietas controles positivos presentaron mejor índices de conversión en los dos ensayos. Los animales alimentados con centeno tratado no tuvieron diferencias en el peso final y la ganancia media diaria, que es el contrario en el caso del trigo. En cuanto al índice de conversión, el tratamiento de los cereales en general empeoró los resultados. En los dos ensayos, la adición de la fitasa mejoró los diferentes parámetros productivos, salvo que en el caso del trigo, donde no afectó el consumo medio diario. En cuanto el nivel de la fitasa (evaluado por el contraste lineal 500 vs 5000 U/kg), los animales alimentados con dietas a base de centeno, y un nivel de fitasa de 5000 U/Kg, presentaron diferencias significativas en el peso final, la ganancia media diaria y el consumo medio diario. Sin embargo no se observó un efecto dosis de fitasa, en los parámetros productivos de los animales alimentados con las dietas a base de trigo. 38 Los animales del ensayo 1 (centeno) presentaron una viscosidad intestinal mucho más alta que los animales del ensayo 2 (trigo). El efecto de la autoclave fue positivo en el ensayo 1 donde se redujo la viscosidad intestinal frente el ensayo 2 donde se observó el efecto contrario, mientras que la fitasa no tuvo efectos en ninguno de los dos ensayos. IV.2. Valores energéticos y digestibilidad ileal aparente de la proteína: aExperimento 1: En la Tabla 12 se muestran los valores de la EMA y EMAn. Los valores son muy similares, y no se ve diferencias significativas entre tratamientos. En contrastes lineales el tratamiento del centeno mediante autoclave mejoró el valor energético de las dietas (p < 0.05) respecto al no tratado, excepto el control positivo (T1), en que los valores fueron iguales. La adición de la fitasa, teniendo en cuenta sus niveles, no afectó los valores de energía e independientemente de que el cereal sea tratado o no tratado. Los resultados de EMAn siguieron la misma pauta, y por tanto, y el tratamiento del centeno mejoró la energía de las dietas, mientras que la fitasa no tuvo ningún efecto. Estos valores se confirmaron en los análisis factoriales (Tabla 13). El proceso de autoclave incrementó alrededor de un 2% el valor energético. Merece mención resaltar que, a pesar que las dietas se formularon para contener 3000 Kcal/kg de EMAn, los valores realmente determinados oscilaron entre 2694 y 2801, inferiores por tanto a los valores esperados. Esto puede ser debido a la concentración de polisacáridos no amiláceos en las dietas procedentes del centeno (2,21% de b-glucanos y 5,46% de arabinoxilanos), que resultan factores antinutritivos. No hubo diferencias significativas en la digestibilidad de la proteína entre los tratamiento, ya sea el centeno tratado o no, con o sin fitasa exógena teniendo en cuenta sus niveles. De igual modo, no se observaron diferencias significativas en la evaluación estadística por contrastes lineales y mediante los análisis factoriales 39 Tabla 12: Valores energéticos de las dietas experimentales a base de centeno, y digestibilidad ileal aparente de la proteína (análisis jerárquico). Tratamiento Centeno P inorgánica Fitasa añadida (U/g) EMA (Kcal/kg) EMAn (Kcal/kg) Digestibilidad ileal de proteína (%) T-1 No tratado 0.45 % - 2940 2751 77.60 T-2 No tratado 0.27 % - 2872 2694 78.07 T-3 No tratado 0.27 % 500 2864 2680 77.35 T-4 No tratado 0.27 % 5000 2876 2693 79.00 T-5 Autoclavado 0.45 % - 2976 2801 76.35 T-6 Autoclavado 0.27 % - 2913 2734 77.03 T-7 Autoclavado 0.27 % 500 2973 2793 78.47 T-8 Autoclavado 0.27 % 5000 2921 2756 76.68 Err.Es. 39.9 45.3 1.00 P-valor 0.2871 0.3532 0.5748 Contraste (P-valor) Nivel P: 0.45% vs 0.27% (T1+T5 vs T2+T6) 0.0960 0.1315 0.5782 No tratado vs. Autoclavado (T1 a T4 vs T5 a T8) 0.0411 0.0329 0.2336 Sin fitasa vs. Fitasa (T2+T6 vs T3+4+T7+T8) 0.6319 0.6599 0.7135 Dosis: 500 ppm vs 5000 ppm (T3+T7 vs T4+T8) 0.6136 0.7907 0.9294 EMA: energía metabolizable aparente. EMAn: energía metabolizable aparente corregida por nitrógeno. Tabla 13: valores energéticos de las dietas experimentales a base de centeno, y digestibilidad ileal aparente de la proteína (análisis factorial). Tratamiento Centeno P inorgánico Fitasa añadida (U/g) EMA (Kcal/kg) EMAn (Kcal/kg) Digestibilidad ileal de proteína (%) T-2 No tratado 0.27 - 2872 2694 78.07 T-3 No tratado 0.27 500 2864 2680 77.35 T-4 No tratado 0.27 5000 2876 2693 79.00 T-6 Autoclavado 0.27 - 2913 2734 77.03 T-7 Autoclavado 0.27 500 2973 2793 78.47 T-8 Autoclavado 0.27 5000 2921 2756 76.68 Fitasa, U/kg 0 2895 2718 77.55 500 2914 2743 77.91 5000 2899 2724 77.84 P-valor 0.7115 0.8283 0.9215 DE 24.2 27.3 0.66 Centeno No tratado 2871 b 2689 b 78.14 Autoclavado 2934 a 2759 a 77.39 P-valor 0.0237 0.0254 0.3388 DE 19.2 22.3 0.54 Interacción Fitasa*Centeno P-valor 0.5315 0.5918 0.1828 a, b:las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05).EMA: energía metabolizable aparente. EMAn: energía metabolizable aparente corregida por nitrógeno. 40 bExperimento 2: En la Tabla 14 se muestran los valores de la EMA y EMAn. Los mejores valores se corresponden con las dietas con 5000 U/ kg de fitasa exógena, tanto con trigo no tratado como con trigo autoclavado (3672 y 3663 Kcal/kg, respectivamente), mientras que los valores más bajos corresponden a las dietas de trigo no tratado y niveles deficientes en fósforo, sin o con 500 U/kg de fitasa (3579 y 3571 Kcal/kg, respectivamente) (P<0.04). Una situación similar, se encontró con la EMAn, coincidiendo que el valor más alto obtuvo con T4 y T8 (3484 y 3491 Kcal/kg, respectivamente), y el valor más bajo es del T3 (3387 Kcal/kg) (P<0,02).En la evaluación de los contrastes lineales, se obtuvieron resultados significativos los estudios referentes al tratamiento de trigo sobre la EMAn (P<0.02) (con valores energéticos más elevados cuando el trigo se pasó por autoclave) y la inclusión de 500 o 5000 U/kg de fitasa microbiana en ambos parámetros es decir la EMA y la EMAn (con valores más elevados con 5000 U/kg de fitasa) (P<0,005). Estos resultados se confirmaron en los análisis factoriales (Tabla 15), excepto que el tratamiento del trigo no afectó los valores de la EMA. Tabla 14: Valores energéticos de las dietas experimentales a base de trigo, y digestibilidad ileal aparente de la proteína (análisis jerárquico). Tratamiento Trigo P inorgánico Fitasa añadida (U/g) EMA (Kcal/kg) EMAn (Kcal/kg) Digestibilidad ileal de proteína (%) T-1 No tratado 0.45 % - 3624 ab 3431 abc 82,54 b T-2 No tratado 0.27 % - 3579 b 3399 bc 81,95 b T-3 No tratado 0.27 % 500 3571 b 3387 c 82,03 b T-4 No tratado 0.27 % 5000 3672 a 3484 a 84,59 a T-5 Autoclavado 0.45 % - 3618 ab 3428 abc 82,98 ab T-6 Autoclavado 0.27 % - 3623 ab 3452 abc 82,71 b T-7 Autoclavado 0.27 % 500 3632 ab 3460 ab 82,55 b T-8 Autoclavado 0.27 % 5000 3663 a 3491 a 83,7 ab Err.Es 22,27 21,57 0,54 P-valor 0.0299 0.0137 0.0315 Contrastes (P-valor) Nivel P: 0.45% vs 0.27% (T1+T5 vs T2+T6) 0.3910 0.8585 0.4456 No tratado vs. Autoclavado (T1 a T4 vs T5 a T8) 0.0901 0.0179 0.7776 Sin fitasa vs. Fitasa (T2+T6 vs T3+4+T7+T8) 0.1010 0.1316 0.0809 Dosis: 500 ppm vs 5000 ppm (T3+T7 vs T4+T8) 0.0049 0.0054 0.0027 a, b, c:las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05). EMA: energía metabolizable aparente. EMAn: energía metabolizable aparente corregida por nitrógeno. En la evaluación factorial de los valores de energía metabolizable, se observó que la fitasa incorporada a 5000 U/kg aumentó significativamente el valor energético de la dieta, tanto de EMA (P<0.003), como EMAn (P<0.004). 41 Trigo con valores de EMAn superiores al esperado 3400 vs 3000. Trigo de buena calidad, sustrato difícil para ver efecto enzimas. Las dietas con niveles bajos en fosforo, y con 5000 U/kg de fitasa, son las que produjeron mejor digestibilidad ileal de la proteína (84.6% y 83,7%, con trigo no tratado o autoclavado, respectivamente). En los análisis de contrastes, no se obtuvieron diferencias significativas en la digestibilidad ileal de la proteína, ni por el tratamiento del trigo ni por la adición de fitasa microbiana, mientras que la inclusión de 5000 U / kg de fitasa produjo un aumento en la digestibilidad ileal de proteínas respecto a la inclusión de 500 unidades. Tabla 15: Valores energéticos de las dietas experimentales a base de trigo, y digestibilidad ileal aparente de la proteína (análisis factorial). Tratamiento trigo P inorgánico Fitasa añadida (U/g) EMA (Kcal/kg) EMAn (Kcal/kg) Digestibilidad ileal de proteína (%) T-2 No tratado 0.27 - 3579 3400 81,85 T-3 No tratado 0.27 500 3571 3388 82,03 T-4 No tratado 0.27 5000 3672 3484 84,59 T-6 Autoclavado 0.27 - 3623 3452 82,71 T-7 Autoclavado 0.27 500 3632 3461 82,55 T-8 Autoclavado 0.27 5000 3664 3491 83,7 Fitasa, U/kg 0 3602b 3426b 82.29 b 500 3602b 3424b 82.27 b 5000 3668a 3488a 84.19 a P-valor 0,003 0,004 0.0057 DE 16 15 0.43 Trigo No tratado 3608 3424b 82.86 Autoclavado 3640 3468a 82.99 P-valor 0,079 0,015 0.7954 DE 13 12 0.36 Interacción Fitasa*Trigo P-valor 0,256 0,275 0.3585 a, b:las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05). EMA: energía metabolizable aparente. EMAn: energía metabolizable aparente corregida por nitrógeno. Comparando los dos ensayos, el tratamiento del centeno con autoclave mejoró los valores de los dos parámetros (es decir la EMA y la EMAn), sin embargo en el caso del trigo mejoró sólo la EMAn. En el caso de la adición de la fitasa microbiana incluso la dosis, no tuvo efectos sobre los dos parámetros en las dietas a base de centeno ya sea tratado o no tratado, pero en dietas a base de trigo las dosis más alta de fitasa 42 microbiana han mejorado los valores de la EMA y la EMAn ya sea el trigo tratado o no tratado. La digestibilidad ileal de la proteína, no se ha afectado en las dietas a base de centeno, ya sea tratado o no, con o sin fitasa microbiana, mientras que en las dietas a base de trigo la inclusión de 5000 U / kg de fitasa produjo un aumento en la digestibilidad ileal de proteínas respecto a la inclusión de 500 unidades, que se observa tanto en el contraste lineal, como en el análisis factorial (84,2% vs 82, %, P<0.006). IV.3. Composición mineral del plasma y la composición de los dedos: aExperimento 1: Los datos de la composición mineral del plasma de los animales utilizados en el ensayo se exponen en la Tabla 16. En el caso de la medida del fosforo no fitico, se observa que los animales alimentados con dietas control negativo presentaron menores concentraciones en la sangre, que los animales alimentados con dietas control negativo y con 5000 U/kg de fitasa microbiana (6.26 y 5.47 mg/dl por T2 y T6 frente 8.45 y 8.68 mg/dl para T4 y T8, respectivamente). La adición de la fitasa microbiana aumentó significativamente su concentración (p < 0.001). En los contrastes lineales, la adición de la fitasa incrementó significativamente la concentración del fósforo no fitico en la sangre (P<0.001), mientras que el tratamiento del centeno por autoclave disminuyo su concentración (p<0.01); estos efectos se confirmaron en los análisis factoriales, donde también hubo una interacción significativa (p < 0.05) entre el centeno y la fitasa microbiana (Tabla 17). Se observa que los animales alimentados con dietas control positivo (T1. T5), presentaron mayor concentración del calcio en la sangre de los demás. La disminución de la concentración del fósforo total en las dietas experimentales, disminuyó significativamente la concentración del calcio en la sangre (p < 0.01). En los contrastes lineales no se ve efecto sobre la retención del calcio en dietas a base de centeno tratado o no tratado, con o sin fitasa ni el efecto de la dosis. Al contrario, en los análisis factoriales, el tratamiento del centeno mejoro la concentración del calcio en la sangre, mientras que la fitasa no tuvo efecto. 49 En cuanto al calcio, sus valores plasmáticos fueron más altos en los pollos que ingirieron dietas a base de centeno que en los animales que ingirieron dietas a base de trigo; el tratamiento del trigo no afectó los valores del calcio, pero en el caso del centeno sí que aumentó la concentración de este mineral en la sangre. Las concentraciones del zinc fueron ligeramente más bajas en la sangre de los pollos alimentados con dietas a base de centeno frente a los pollos que ingirieron dietas a base de trigo, y en este último, la adición de dosis altas en fitasa microbiana disminuyó su concentración. En referencia al hierro no se ve diferencias de sus concentraciones en la sangre de los pollos en los dos ensayos, ya sea el cereal tratado o no tratado, con o sin fitasa exógena. No se observan diferencias en la concentración de las cenizas de los dedos comparando los dos ensayos. Además, en ambos casos se dieron las concentraciones más altas en las dietas control positivo. La adición creciente de la fitasa exógena aumentó las concentraciones de las cenizas de los dedos, ya fuera el cereal, trigo o centeno. Sin embargo, el tratamiento de este último en autoclave disminuyó las concentraciones de las cenizas pero no las afectó en el caso del trigo. IV.4. Excreción de los minerales y retención aparente del fosforo total y del calcio en las dietas experimentales: aExperimento 1: La cantidad de minerales en las excretas y la retención aparente del fósforo total y el calcio se muestran en la Tabla 20. El porcentaje de fósforo total en la excreta muestra claramente un cierto paralelismo con la reducción de fósforo total producida en la formulación de los piensos. La cantidad es más alta en las dietas control positivo (0.65% por T-1 y 0.64% por T-5), y en el resto de las seis dietas la cantidad se mantiene entre 0.1 y 0.2%, pero ni por la adición de fitasa microbiana ni por el tratamiento del centeno se encontraron diferencias significativas, así pues no se encontraron diferencias en la excreción del fosforo excepto en el caso del T-8 donde el centeno tratado por autoclave y con 5000 U/kg de fitasa microbiano dio cantidad más baja respecto el control negativo con centeno tratado. En el caso de la retención del fosforo total, la cantidad fue más baja en las dietas control positivo (62.97% por T-1 y 64.07% por T-5). Mientras en el resto de los seis tratamientos se mejoró la retención del fosforo, pero ni 50 por la adición de fitasa ni por tratamiento del centeno se encontraron diferencias significativas. En los análisis factoriales (Tabla 21) se confirmaron estos resultados, donde la fitasa y el tratamiento del centeno no tuvieron efectos sobre la excreción y la retención del fosforo total. El nivel del calcio en las excretas está relacionada directamente con su inclusión en las dietas, como ocurre en el caso del fosforo. Las excretas correspondientes a los animales que ingirieron los controles positivos con centeno sin tratar (1.40% Ca) y con centeno pasado por autoclave (1.36% Ca) se encontró que eran los que tenían más calcio, mientras que las excretas correspondientes a los animales que ingirieron las otras dietas presentaron valores más bajos, aproximadamente del 40%. En los contrastes lineales hubo diferencias significativas por la adición de la fitasa microbiana (p < 0.05), disminuyendo el porcentaje del calcio en las excretas, sin tener cuenta al tipo del centeno (tratado o no tratado) y a la dosis de la fitasa. En donde en los análisis factoriales (Tabla 21), se ve claramente el efecto de la fitasa microbiana. Pero, en cuanto a la retención aparente del calcio los resultados fueron justo al contrario en las concentraciones del mineral en las excreta, ya que las retenciones de las dietas con controles positivos (48.92 % por T-1 y 45.59 % por T -5) dieron valores más bajos que las retenciones de las otras dietas. En el estudio de los contrastes, y los análisis factoriales, ni la adición de fitasa microbiana ni el tratamiento del centeno ni el nivel de fitasa dieron resultados estadísticamente significativos. También se evaluaron las concentraciones del hierro y el zinc en las excretas. Las excretas correspondientes a los animales que comieron los controles positivos con centeno sin tratar (134 ppm)y con centeno pasado por autoclave (140 ppm),se encontró que eran los que tenían más zinc, mientras que las excretas correspondientes a los animales que comieron las otras dietas presentaron valores más bajos. En el estudio de los contrastes, y los análisis factoriales, ni la adición de fitasa microbiana ni el tratamiento del centeno ni el nivel de fitasa dieron resultados estadísticamente significativos. La reducción de la cantidad del fosforo fitico en las dietas muestra un cierta tendencia a aumentar la retención del zinc. Los animales alimentados con dieta control positivo con centeno pasado por autoclave mostraron valores más bajos (9.37 %). En los contrastes lineales no se obtuvieron diferencias significativas en cuanto el tratamiento del centeno, pero sí que se con la adición de la fitasa exógena incluso el efecto de la dosis, donde disminuyeron la retención del zinc. 51 Tabla 20: excreción de los minerales y retención aparente del fosforo total y del calcio en las dietas experimentales a base de centeno (análisis jerárquico). Tratamiento Centeno P inorgánico Fitasa añadida (U/g) P total en excretas (%/MS) P total retenido (%) Ca en excretas (%/MS) Ca retenido (%) Zn en excretas (ppm) Zn retenido (%) Fe en excretas (ppm) Fe retenido (%) T-1 No tratado 0.45 % - 0.65 a 62.97 b 1.40 a 48.92 c 134 ab 21.81 abc 178 c 73.85 a T-2 No tratado 0.27 % - 0.22 bc 78.32 a 0.57 b 63.22 ab 123 b 27.87 a 191 bc 60.84 b T-3 No tratado 0.27 % 500 0.18 bc 83.00 a 0.50 b 66.24 ab 124 b 19.53 bc 217 abc 56.65 b T-4 No tratado 0.27 % 5000 0.19 bc 82.33 a 0.51 b 61.94 b 125 b 16.26 cd 215 abc 56.12 b T-5 Autoclavado 0.45 % - 0.64 a 64.07 b 1.36 a 45.59 c 140 a 9.37 d 226 abc 57.64 b T-6 Autoclavado 0.27 % - 0.27 b 77.33 a 0.61 b 64.01ab 129 b 28.24 a 202 bc 59.14 b T-7 Autoclavado 0.27 % 500 0.24 bc 79.57 a 0.53 b 69.95 a 128 b 26.56 ab 240 ab 53.21 b T-8 Autoclavado 0.27 % 5000 0.16 c 84.73 a 0.47 b 68.50 ab 126 b 14.41 cd 256 a 54.37 b Err.Es. 0.03 2.69 0.07 2.37 3.9 2.93 16.3 3.03 P-valor 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0731 0.0001 0.0190 0.0007 Contraste (P-valor) Nivel P: 0.45% vs 0.27% (T1+T5 vs T2+T6) 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0074 0.0001 0.7144 0.0466 No tratado vs. Autoclavado (T1 a T4 vs T5 a T8) 0.4796 0.9686 0.9818 0.1991 0.1113 0.2320 0.0076 0.0076 Sin fitasa vs. Fitasa (T2+T6 vs T3+4+T7+T8) 0.0628 0.0603 0.0484 0.1120 0.8923 0.0009 0.0123 0.0588 Dosis: 500 ppm vs 5000 ppm (T3+T7 vs T4+T8) 0.3160 0.3685 0.5005 0.1816 0.8609 0.0040 0.6708 0.9220 a, b, c, d: las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05). 52 Tabla 21: excreción de los minerales y retención aparente del fosforo total y del calcio en las dietas experimentales a base de centeno (análisis factorial). Tratamiento Centeno P inorgánico Fitasa añadida (U/g) P total en excretas (%/MS) P total retenido (%) Ca en excretas (%/MS) Ca retenido (%) Zn en excretas (ppm) Zn retenido (%) Fe en excretas (ppm) Fe retenido (%) T-2 No tratado 0.27 - 0.22 78.32 0.57 63.22 123 27.87 191 60.84 T-3 No tratado 0.27 500 0.18 83.00 0.50 66.24 124 19.53 217 56.65 T-4 No tratado 0.27 5000 0.19 82.33 0.51 61.94 125 16.26 215 56.12 T-6 Autoclavado 0.27 - 0.27 77.33 0.61 64.01 129 28.24 202 59.14 T-7 Autoclavado 0.27 500 0.24 79.57 0.53 69.95 128 26.56 240 53.21 T-8 Autoclavado 0.27 5000 0.16 84.73 0.47 68.50 126 14.41 256 54.37 Fitasa, U/kg 0 0.24 77.78 0.59 a 63.65 b 126 28.09 a 197 b 59.91 500 0.20 81.28 0.52 b 68.10 a 126 23.36 a 228 ab 55.09 5000 0.18 83.53 0.48 b 65.22 ab 125 15.34 b 238 a 55.25 P-valor 0.1698 0.1882 0.0142 0.0381 0.9747 0.0003 0.0589 0.1974 DE 0.02 2.24 0.03 1.23 2.7 1.9 11.7 2.2 Centeno No tratado 0.19 81.39 0.52 63.83 b 124 20.45 209 57.79 Autoclavado 0.22 80.54 0.53 67.49 a 128 23.07 233 55.80 P-valor 0.4003 0.8794 0.8035 0.0115 0.2424 0.4763 0.0749 0.3839 DE 0.02 1.80 0.02 1.00 2.2 1.6 9.7 1.8 Interacción Fitasa*Centeno P-valor 0.3929 0.6223 0.4362 0.2481 0.7707 0.3074 0.6602 0.9515 a, b:las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05). 53 En cuanto la concentración del hierro en las excretas hubo diferencias significativas entre tratamientos (p < 0.05). Donde los animales alimentados con dietas control positivo (T-1), dieron concentración más baja (178 ppm), mientras que los animales que ingirieron dietas a base de centeno tratado y con 5000 U/kg de fitasa microbiana son los que dieron concentración más alta (256 ppm). En los contrastes lineales se obtuvieron diferencias significativas en cuanto el tratamiento del centeno y la adición de la fitasa, aumentando ligeramente en los dos casos la concentración de este mineral en las excretas, mientras que en los análisis factoriales los dos factores no tuvieron efectos. Por la retención del hierro, las concentraciones fueron más altas (73.85 ppm) cuando los pollos que ingirieron dietas control positivo sin pasar el trigo por autoclave. Sin embargo los otros tratamientos presentaron valores bajos y similares. El tratamiento del trigo dio diferencias significativas (p <0.01), mientras que la adición y el nivel de la fitasa no tuvieron diferencias significativas por la retención del hierro. Los análisis factoriales (Tabla 21) nos confirmaron estos resultados excepto que el tratamiento del trigo no afecto la retención del hierro. bExperimento 2: La cantidad de minerales en las excretas y la retención aparente del fósforo total y el calcio se muestran en la Tabla 22. Los pollos que ingirieron dietas controles positivos presentaron porcentajes más altos del fosforo total en las excretas (0.99% por T-1 y 0.95% por T-5), y en el resto de las seis dietas no hubo diferencias en la cantidad del fosforo en excretas y se mantiene entre 0.4 y 0.5%, pero ni por la adición de fitasa microbiana ni por el tratamiento del trigo ni por la dosis de la fitasa se encontraron diferencias significativas. Se observaron diferencias significativas en la retención del fosforo total entre los tratamientos (p < 0.01). En las dietas con trigo no tratado, la adición de 5000 U/kg de fitasa microbiana mejoro significamente los resultados tanto respecto al control positivo como al control negativo. No hubo diferencias entre los resultados dependiendo a la dosis añadida. Por otra parte, en las dietas con trigo pasado por autoclave, la reducción del fosforo no fitico de las dietas beneficia la retención del fósforo total, aumentándolo en torno de 10%, cantidad que sólo se mejoró numéricamente al añadir la fitasa microbiana (Tabla 23), mientras que el tratamiento del trigo no tuvo efecto sobre la retención del fosforo total. 54 Tabla 22: excreción de los minerales y retención aparente del fosforo total y del calcio en las dietas experimentales a base de trigo (análisis jerárquico). Tratamiento Trigo Fosforo inorgánico Fitasa añadida (U/g) P total en excretas (%/MS) P total retenido (%) Ca en excretas (%/MS) Ca retenido (%) Zn en excretas (ppm) Fe en excretas (ppm) T-1 No tratado 0.45 % - 0,99a 55,2c 2,24a 32,72d 244,68 747,85a T-2 No tratado 0.27 % - 0,48b 66,15b 1,02c 56,78a 217,58 696,55ab T-3 No tratado 0.27 % 500 0,46b 70,98ab 1,02c 51,55b 226,87 648b T-4 No tratado 0.27 % 5000 0,41b 75,48a 1.01c 52,49ab 231,65 658,82b T-5 Autoclavado 0.45 % - 0,95a 60,14c 2,14b 41,41c 218,78 739,3a T-6 Autoclavado 0.27 % - 0,49b 70,2ab 1.05c 52,81ab 233,75 676,58ab T-7 Autoclavado 0.27 % 500 0,49b 70,6ab 1.03c 49,1b 223,1 739,92a T-8 Autoclavado 0.27 % 5000 0,48b 71,3ab 0,97c 49,24b 233,18 731,3a Err.Es. 0,03 1,84 0,04 1,76 7,57 24,83 P-valor <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0,162 0,0055 Contrastes (P-valor) Nivel P: 0.45% vs 0.27% (T1+T5 vs T2+T6) <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 0.3849 0.0124 No tratado vs. Autoclavado (T1 a T4 vs T5 a T8) 0.2614 0.9246 0.9268 0.0025 0.4036 0.0134 Sin fitasa vs. Fitasa (T2+T6 vs T3+4+T7+T8) 0.4652 0.0478 0.3263 0.0126 0.6060 0.6882 Dosis: 500 ppm vs 5000 ppm (T3+T7 vs T4+T8) 0.3742 0.2482 0.2562 0.6976 0.2766 0.9613 a, b, c, d: las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05). 55 Tabla 23: excreción de los minerales y retención aparente del fosforo total y del calcio en las dietas experimentales a base de trigo (análisis factorial). Tratamiento Trigo Fosforo inorgánico Fitasa añadida (U/g) P total en excretas (%/MS) P total retenido (%) Ca en excretas (%/MS) Ca retenido (%) Zn en excretas (ppm) Fe en excretas (ppm) T-2 No tratado 0.27 - 0,48 66,15 1.02 56,78 217,58 696.6 T-3 No tratado 0.27 500 0,46 70,98 1.02 51,55 226,87 648,0 T-4 No tratado 0.27 5000 0,41 75,48 1.01 52,49 231,65 658.8 T-6 Autoclavado 0.27 - 0,49 70,2 1.05 52,81 233,75 676.6 T-7 Autoclavado 0.27 500 0,49 70,6 1.03 49,1 223,1 739.9 T-8 Autoclavado 0.27 5000 0,48 71,3 0.97 49,24 233,18 731.3 Fitasa, U/kg 0 0,48 68,17 10,3 54,83a 225,7 688,6 500 0,48 70,79 10,2 50,33b 225,0 689,8 5000 0,44 73,39 0,99 50,86b 232,4 691,0 P-valor 0,3906 0,0515 0,265 0,027 0,5148 0,662 DE 0,02 1,42 0,02 1,22 5 10,6 Trigo No tratado 0,45 70,89 1,01 53,61a 225,4 668,3b Autoclavado 0,48 70,7 1,01 50,40b 230,0 717,8a P-valor 0,183 0,9175 0,9115 0,0267 0,4265 0,0012 DE 0,02 1,16 0,02 0,98 4 8,9 Interacción Fitasa*Trigo P-valor 0,5513 0,1454 0,5207 0,909 0,356 0,0009 a, b:las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05). 56 El nivel del calcio en las excretas está relacionada directamente con su inclusión en las dietas, como ocurre en el caso del fosforo. Las excretas correspondientes a los animales que ingirieron los controles positivo con trigo sin tratar (2.42% Ca) y con trigo pasado por autoclave (2.14% Ca) se encontró que eran los que tenían más calcio, mientras que las excretas correspondientes a los animales que ingirieron las otras dietas se encontró que presentaban valores más bajos, aproximadamente del 50%.Tanto en el estudio de los contrastes como en los análisis factoriales, ni la adición de fitasa microbiana ni el tratamiento del trigo ni el nivel de fitasa dieron resultados estadísticamente significativos. En cuanto a la retención aparente del calcio las dietas control positivo (32.72% para T-1 y 41.41% para T-5) dieron valores más bajos que las retenciones de las otras dietas, donde se observa que el valor más alto de todos obtuvo por la dieta control negativo y con trigo sin tratar (56.78%).Por lo tanto, en las contrastes lineales, se ha visto que la adición de fitasa microbiana exógena produjo diferencias significativas (p<0.0126), con una disminución de la retención, siendo el valor más alto cuando no hay enzima exógena, por otra parte, también se obtuvieron resultados estadísticamente significativos con una mayor retención cuando se utilizó dietas con trigo no tratado que cuando el trigo pasado por autoclave (53.61% en presencia de fitasa endógena y 50.4% sin fitasa endógena).Los resultados que obtuvieron en las contrastes lineales, se confirmaron por los análisis factoriales (Tabla 23), de modo que la adición de la fitasa microbiana o el tratamiento por autoclave del trigo disminuyo la retención del calcio (p<0.027). En cuanto la concentración del zinc en las excretas, no hubo diferencias significativas entre tratamientos. Tanto en las contrastes lineales como los análisis factoriales, ni la adición de la fitasa microbiana, ni el tratamiento del trigo, ni la dosis de la fitasa afecto la cantidad del zinc en las excretas, solo que en los análisis factoriales (Tabla 23), se puede decir que el tratamiento del trigo por autoclave aumento ligeramente la concentración de este micromineral. En el caso del hierro, se ve que hubo diferencias significativas entre tratamientos (p<0,005). La reducción de la concentración del fosforo en las dietas tuvo tendencia a disminuir la cantidad del hierro en las excertas, mientras que las concentraciones más bajos fueron correspondientes a las dietas control negativo, con fitasa exógena y con trigo no tratado (648 ppm para T-3 y 658,8 ppm para T-4). En contrastes lineales, la 57 adición de la fitasa microbiana no afecto la concentración del hierro en excretas, pero sí que se obtuvieron diferencias al analizar el tratamiento del trigo por autoclave (p<0,013). Los análisis factoriales (Tabla 23) nos confirmaron estos resultados donde el tratamiento de trigo aumento la concentración de este mineral en las excretas (717,8 ppm) frente (668,3 ppm) con trigo no tratado, mientras que la adición de la fitasa no afecto las concentraciones de este mineral en las excretas. En los dos ensayos, la disminución del nivel del P de las dietas, muestra una aumentación de la retención del P y Ca y una disminución de sus concentraciones en las excretas. La adición de la fitasa microbiana a las dietas bajas en P produjo un mejoramiento de los valores del Ca sin afectar el P en las dietas a base de centeno, mientras que disminuyo la retención del Ca y produjo un ligero mejoramiento en la retención del P en las dietas a base de trigo. El tratamiento de los cereales por autoclave mejoro la retención del Ca en la dietas a base de centeno, lo que es el contrario con las dietas a base de trigo donde lo empeoro, sin embargo no tuvo efecto sobre las concentraciones del P. la disminución del nivel del P en las dietas a base de centeno disminuyo la excreción del Zn y no afecto la excreción del Fe, mientras que en las dietas a base de trigo, disminuyo la excreción del Fe sin afectar el Zn. La adición de la fitasa microbiana, no afecto las concentraciones del Zn y Fe en las excretas en los dos ensayos. Sin embargo el tratamiento del trigo aumento la excreción de Fe y no tuvo efecto sobre los dos minerales en las dietas a base de centeno. IV.5. Ingesta de los minerales: aExperimento 1: La Tabla 24, muestra la ingesta de los minerales de las dietas experimentales. La disminución de la concentración del PNP en las dietas experimentales redujo la ingesta del P total y del Ca. La ingesta del P mejoró con la adición de la fitasa microbiana, ya sea el centeno tratado o no tratado (p<0.026).Tanto en los contrastes lineales como en los análisis factoriales (Tabla 25), la adición de la fitasa microbiana y el tratamiento del centeno por autoclave produjeron una mejora de la ingesta del fósforo. La reducción de la concentración del fósforo en las dietas, disminuyó la ingesta del calcio, que no se vió afectada por la adición de la fitasa microbiana, mientras que el tratamiento del centeno por autoclave, mejoró la ingesta de este mineral. En ambas Tablas (24 y 25), la adición 58 de la fitasa microbiana no afectó la ingesta del calcio pero sí se vio incrementada por el tratamiento del centeno. Tabla 24: ingesta de los minerales de las dietas experimentales a base de centeno (análisis jerárquico). Tratamiento Centeno P inorgánico Fitasa añadida (U/g) P total (mg) Ca (mg) Zn (mg) Fe (mg) T-1 No tratado 0.45 % - 220.70a 338.20a 2.13abc 7.90a T-2 No tratado 0.27 % - 127.58e 196.50de 2.10bc 6.27bc T-3 No tratado 0.27 % 500 130.96de 189.52de 1.96c 6.40bc T-4 No tratado 0.27 % 5000 142.68cde 175.60e 1.97c 6.55bc T-5 Autoclavado 0.45 % - 221.80a 310.53b 1.96c 6.72bc T-6 Autoclavado 0.27 % - 147.30cd 211.95dc 2.26ab 6.25c T-7 Autoclavado 0.27 % 500 156.06bc 234.13c 2.34a 6.98b T-8 Autoclavado 0.27 % 5000 167.15b 222.83c 2.23ab 7.80a Err.Es. 5.6 8,05 0,07 0,21 P-valor < 0,0001 <0,0001 0,0012 < 0,0001 Contraste (P-valor) Nivel P: 0.45% vs 0.27% (T1+T5 vs T2+T6) <.0001 <.0001 0.0617 <.0001 No tratado vs.Autoclavado (T1 a T4 vs T5 a T8) 0.0001 0.0018 0.0038 0.3254 Sin fitasa vs. Fitasa (T2+T6 vs T3+4+T7+T8) 0.0259 0.8603 0.3717 0.0015 Dosis: 500 ppm vs 5000 ppm (T3+T7 vs T4+T8) 0.0593 0.1440 0.4947 0.0410 a, b, c, d, e:las medias dentro de una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0.05). Referente a la ingesta de Zn y Fe, hubo diferencias significativas entre tratamientos. La disminución de la concentración del PNP en las dietas experimentales, redujo la ingesta del Fe sin afectar la del Zn. La adición de la fitasa microbiana mejoró la ingesta de Fe sólo en las dietas con centeno autoclavado, en donde las dosis altas dieron valores de ingesta más elevados (6.98 mg para T-7 y 7.80 para T-8) y no afectó la del Zn. En la evaluación por contrastes lineales, el tratamiento del centeno aumentó la ingesta del Zn (p<0.0038) y no tuvo efecto sobre la ingesta del Fe. Sin embargo, la adición de la fitasa exógena aumentó sólo la ingesta del Fe, sobre todo con dosis más altas (p<0.041). En los análisis factoriales (Tabla 25) se observó que la adición creciente de la fitasa microbiana aumentó sólo la ingesta del Fe, sin afectar la del Zn, mientras que el tratamiento del centeno por autoclave mejoró tanto la ingesta del Zn como la del Fe. 65 en P, aumentaba los valores plasmáticos de estos minerales, y la disminución de nivel de PNP en las dietas experimentales aumentó la concentración plasmática de Fe. La disminución del nivel de PNP en las dietas experimentales, tiende a bajar las concentraciones de las cenizas de los dedos, mientras que la adición creciente de la fitasa microbiana aumentó sus valores. Estos resultados coinciden con las encontrados por Cowieson et al. (2006) y Lan et al. (2002). Ambos parámetros (niveles plasmáticos de P y porcentaje de cenizas en hueso) han demostrado ser buenos biomarcadores de la disponibilidad del P de la dieta. En los dos experimentos, la adición de la fitasa microbiana incrementó la retención del P hasta un 5% pero las mejoras fueron solo numéricamente distintas, y solo se observaron mejoras significativas en la retención del fósforo de las dietas de trigo no tratado. En el caso del calcio, la adición de fitasa redujo la cantidad de calcio en las excretas, lo que modificó los valores de retención de este elemento, de forma similar la descrita por tal como se ha observado en la bibliografía (Pérez-Vendrell el al. 2001, Cowieson et al. 2006), la disminución de la concentración del fósforo en las dietas produce un aumento de la retención aparente del fósforo total y del calcio y la adición de la fitasa microbiana aumenta más la retención de estos minerales, de forma marginal. En nuestros ensayos, y aparentemente tiene mayor importancia la disminución del fósforo de las dietas que la adición de la fitasa exógena. Por otra parte la adición de la fitasa microbiana a la dietas a base de centeno aumentó la retención del calcio sobre todo cuando se usó un centeno tratado por autoclave; esta mejora puede explicarse por la desactivación de la fitasa endógena que puede bajar la unión del calcio con el ácido fitico con la defosforilacion de este último (Woyengo et al. 2008). Se espera que la adición de la fitasa microbiana aumente la disponibilidad del calcio por la liberación de este mineral ligado con el ácido fitico. Sin embargo, la suplementación de la fitasa microbiana a las dietas a base de trigo redujo la retención del calcio, que no está de acuerdo con los resultados obtenidos por (Lan et al. 2002 y Juanpere et al. 2004). Una causa que puede justificar esta diversidad de resultados podría ser la menor relación Ca:P. En este ensayo se estableció una relación 2:1, a partir de estudios realizados por otros investigadores (Dieckmann y col., 2002), los cuales indican que los mejores resultados tanto en parámetros productivos como en retención mineral se obtienen cuando la relación se encuentra entre 1:1 y 2:1. Cuando la relación de Ca:P es superior a estos valores, el efecto del enzima es más evidente. 66 Está bien documentado que la adición de la fitasa microbiana reduce la excreción del fósforo y el calcio (Paik el al. 2000 y Cowieson et al. 2004). En nuestros dos ensayos la disminución del nivel del fósforo en las dietas redujo la excreción del fósforo y el calcio. La adición de la fitasa exógena no produjo modificaciones significativas, pero mantuvo la excreción de estos dos minerales más baja que los controles positivos, excepto en las dietas a base de centeno donde la fitasa microbiana redujo más la excreción del calcio. Esto sugiere que aunque el fósforo fitico se hidrolizó, liberando el fosfato, los pollos no retuvieron los fosfatos liberados o el turnover del fósforo incrementó, o debido a la actividad de los fosfatasas endógenas de los pollos que pueden hidrolizar el ácido fítico(Cowieson et al. 2004). La adición de la fitasa microbiana a las dietas a base de centeno o a base de trigo no disminuyó la excreción del zinc y del hierro, incluso el tratamiento del trigo tuvo un efecto negativo y aumentó la excreción del hierro, coincidiendo con los resultados obtenidos por (Um et al. 2000). La ingesta de los minerales está bien relacionada con la ingesta global de las dietas. Es conocido que la disminución de la concentración del fósforo en las dietas experimentales produce una disminución de la ingesta del pienso (Saxena, 1996). En estos dos ensayos, se ha observado que la reducción del PNP en las dietas, disminuyó la ingesta del fósforo y del calcio, ya sea el cereal tratado o no tratado por autoclave. La adición de la fitasa microbiana mejoró la ingesta del fósforo en los dos ensayos, sin tener efecto sobre la ingesta del calcio en la dietas a base de centeno, pero en las dietas a base de trigo tuvo un efecto negativo sobre la ingestión del calcio, donde los animales que comieron dietas sin fitasa microbiana, ingirieron más calcio que las que tenían fitasa microbiana. (Pirgozliev et al. 2008), reportaron asimismo, que la adición de fitasa microbiana a dietas a base de maíz y harina de soja, aumentó la ingesta del fósforo un 14% respecto al control negativo, mientras que no afectó la ingesta del calcio y del zinc. El tratamiento por autoclave de los dos cereales, produjo un aumento de la ingesta del fósforo y del zinc, pero redujo la ingesta del calcio. 67 VI. Conclusiones: 1La actividad de la fitasa endógena del centeno es más alta que la del trigo. Esta actividad fitasica se puede eliminar por el tratamiento térmico por autoclave, a temperaturas superiores de 100ºC en un periodo de tiempo entre 10 y 15 minutos. 2 - En ambos casos, la deficiencia de fósforo produjo una disminución significativa del crecimiento de los animales, que fue paliada por la incorporación del enzima. La utilización de fitasa (y mejor a niveles altos) en dietas para pollos formuladas con bajos niveles de fosforo inorgánico, permite mantener e incluso mejorar el crecimiento de los animales y su productividad. 3La utilización de una dosis elevada (5000 U/kg) de fitasa microbiana, produjo mejores resultados de los parámetros productivos y digestibilidad de nutrientes, disminuyendo la viscosidad intestinal y aumentando los valores de la energía con respecto a las dosis habituales de fitasa microbiana; no mostrando ningún efecto adverso de la dosis de tolerancia a esta enzima. 4La adición de fitasa incrementa la retención mineral, y reduce en mas de un 50% la excreción de fosforo y calcio, a través de las deyecciones al medio ambiente. 5 - El nivel de P en sangre y/o el porcentaje de cenizas en dedos se han identificado como buenos indicadores del fosforo disponible de las dietas en pollos de carne en crecimiento. 6La viscosidad intestinal producida por las dietas a base de centeno es mucho más alta que la del trigo. 7El proceso de autoclave utilizado para evaluar la importancia de la fitasa endógena de los cereales, no ha sido un buen procedimiento ya que, además de inactivar el enzima, modifica otros aspectos del cereal, como la estructura del almidón o la relación de carbohidratos solubles/insolubles. Ello dificulta obtener conclusiones del papel de la fitasa endógena en los parámetros productivos o de retención de minerales. 68 VIIBibliografía: Adeola. O and Sands. J. S. 2003. Does supplemental dietary microbial phytase improve amino acid utilization? A perspective that it does not.J. Anim. Sci. 81. 78–85. Ahmad, T., Rassol, S., Sarwar, M., Haq, A. and Hasan, Z. 2000. Effect of microbial phytase produced from a fungus Aspergillus niger on bioavailability of phosphorus and calcium in broiler chicken. Animal Feed Science and Technology 83: 103-114. Angel, R., Tamim, N. M., Applegate, T. J. Dhandu, A. S. and Ellestad, L. E. 2002. Phytic acid chemistery : Influence on phytin-phosphorus availability and phytase efficacy. J. Appl. Poult. Res. 11 : 471-480. Angel, R., Saylor, W.W., Dhandu, A.S., Powers, W., Applegate, T.J., 2005. Effects of dietary phosphorus, phytase and 25-hydroxycholecalciferol on performance on broiler chickens grown in floor pens. Poult. Sci. 84:1031–1044. 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