Repositorio Institucional de Documentos

“ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA INCLUSIÓN DE DIFERENTES NIVELES DE VITAMINA E EN LA DIETA DE CORDEROS DE RAZA RASA ARAGONESA EN LA EXPRESIÓN DE GENES EN YEYUNO MEDIANTE LA METODOLOGÍA DEL GEN CANDIDATO” BELÉN GARCÍA MANRIQUE DIRECTOR: DR. JORGE H. CALVO LACOSTA PONENTE: DRA. MARÍA ITURRALDE NAVARRO MÁSTER EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR Septiembre 2013 Trabajo Fin De Máster ESTE TRABAJO HA SIDO FINANCIADO A TRAVÉS DE UN PROYECTO DEL PROGRAMA DE RECURSOS Y TECNOLOGÍA AGRARIAS (RTA) DEL INIA PERTENECIENTE AL MINISTERIO DE ECONOMÍA Y COMPETITIVIDAD (INIA RTA2012-0041) Y A LOS FONDOS PARA EL DESARROLLO REGIONAL DE LA COMUNIDAD EUROPEA (FEADER), Y AL DEPARTAMENTO DE INDUSTRIA E INNOVACIÓN DEL GOBIERNO DE ARAGÓN ENTIDAD FINANCIERA DEL GRUPO CONSOLIDADO DE INVESTIGACIÓN RECONOCIDO POR EL GOBIERNO DE ARAGÓN “ALIMENTACIÓN Y GENÉTICA MOLECULAR APLICADA A LA CALIDAD Y SEGURIDAD DE LOS PRODUCTOS AGROALIMENTARIOS EN RUMIANTES (A-49)”. AGRADECIMIENTOS. En primer lugar quiero dar las gracias a las personas más importantes en mi vida, a mis padres y hermanas que, aunque no me entendiesen cuando les explicaba en qué consistía todo esto, nunca dejaron de escucharme. Gracias a mi director de Trabajo Fin de Máster, Jorge Hugo Calvo Lacosta, por acogerme en su equipo estos últimos años de mi vida y enseñarme, ya que gracias a él, a Laura y, por supuesto, a Pilar, no sabría casi nada de lo que sé ahora mismo. Gracias a todo el equipo que trabaja en la unidad de Tecnología en Producción Animal en el Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria del Gobierno de Aragón (CITA), pero especialmente GRACIAS al equipo del laboratorio de Genética Molecular. ÍNDICE RESUMEN. .................................................................................................................................. 1 1. INTRODUCCIÓN. .................................................................................................................... 3 1.1. GENERALIDADES. ....................................................................................................... 3 1.2. LA VITAMINA E. .......................................................................................................... 5 1.3. METABOLISMO DE LA VITAMINA E. .......................................................................... 8 1.4. GENES IMPLICADOS EN EL METABOLISMO DE LA VITAMINA E. ........................... 12 1.4.1. LPL. ...................................................................................................................... 12 1.4.2. APOE. ................................................................................................................... 13 1.4.3. ABCA1................................................................................................................... 14 1.4.4. SCARB1 y PDZK1. .................................................................................................. 15 1.4.5. NPC1L1. ................................................................................................................. 16 1.4.6. TTPA. ................................................................................................................... 16 1.4.7. CYP4F2. ................................................................................................................ 17 1.4.8. PPARA y PPARG. .................................................................................................. 17 1.4.9. SREBF1. ................................................................................................................ 19 1.4.10. CEBPB................................................................................................................... 19 1.5. LA GENÓMICA NUTRICIONAL. ................................................................................. 20 2. OBJETIVO. ......................................................................................................................... 23 3. MATERIAL Y MÉTODOS. ................................................................................................... 25 3.1. MATERIAL ANIMAL .................................................................................................. 25 3.1.1. Diseño experimental. ........................................................................................ 25 3.1.2. Sacrificio y toma de muestras. ......................................................................... 26 3.2. EXTRACCIÓN DE mRNA. ........................................................................................... 27 3.3. SÍNTESIS DE DNA COMPLEMENTARIO (CDNA). ..................................................... 29 3.4. DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD DEL CDNA SINTETIZADO. ............................... 30 3.5. ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA. .......................................................................... 31 3.5.1. Diseño y optimización de cebadores. ............................................................... 31 3.5.2. Comprobación de la identidad génica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). ............................................................................................................. 34 3.6. PCR A TIEMPO REAL. ................................................................................................ 35 3.7. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICOS Y ESTADÍSTICOS. .................................................... 37 3.7.1. Análisis bioinformáticos. ................................................................................... 37 3.7.2. Análisis estadísticos........................................................................................... 37 3.7.2.1. Contenido de αtocoferol. ............................................................................ 37 3.7.2.2. Expresión génica. ........................................................................................... 38 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.......................................................................................... 41 4.1. CONTENIDO DE αTOCOFEROL EN MÚSCULO. ...................................................... 41 4.2. COMPROBACIÓN DE LA IDENTIDAD GÉNICA Y DE LA EXPRESIÓN TISULAR ESPECÍFICA. .......................................................................................................................... 42 4.3. ELECCIÓN DE LOS MEJORES GENES DE REFERENCIA PARA NORMALIZAR LOS RESULTADOS. ...................................................................................................................... 43 4.4. ESTUDIO DEL EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN DE α-TOCOFEROL EN LA EXPRESIÓN DE GENES RELACIONADOS CON EL METABOLISMO DE LA VITAMINA E MEDIANTE RT-QPCR. ........................................................................................................... 44 5. CONCLUSIONES. ............................................................................................................... 53 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ................................................................................. 55 1 RESUMEN. En el presente trabajo se ha estudiado la interacción gen-alimentación en corderos de la raza Rasa Aragonesa, de peso ternasco a partir de tejido intestinal procedente del yeyuno de estos animales. Se estudió la expresión diferencial de genes implicados en la captación, transporte y eliminación de α-tocoferol (SCARB1, ABCA1, NPC1L, LPL, TTPA, APOE, CYP4F2), así como de genes que codifican factores de regulación de los mismos (PDKZ1, PPARG, PPARA, SREBP1 and CEBPB) en el intestino delgado (yeyuno), en 58 animales agrupados según los diferentes días de finalización con concentrado suplementado con vitamina E (concentrado + 500 dl-αtocoferol acetato/kg durante 0 (T), 7-14 (VE10d), 18-25 (VE20d) y, 29-36 (VE30d) días antes del sacrificio), así como 8 de ellos alimentados con alfalfa en pastoreo. La Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa a tiempo real ha sido la técnica elegida para el análisis de expresión diferencial de estos genes. Previo a la PCR a tiempo real se estudió la expresión tisular específica de cada gen mediante PCR convencional en el músculo Longissimus dorsi, grasa subcutánea, hígado, y tres partes diferenciadas de intestino delgado (duodeno, íleon y yeyuno) con diferente actividad en la absorción de grasas y vitamina E. En yeyuno han amplificado todos los genes excepto PDKZ1 que no amplificó en ninguna muestra analizada, y TTPA que sólo amplificó en 25 de todas las muestras analizadas. El gen más estable bajo los distintos tratamientos analizados en este estudio fue el gen candidato APOE, seguido del gen de referencia (GR), RPL19. Ninguno de los tres GR testados fue más estable que APOE, por lo que la normalización de APOE se realizó con RPL19, un gen menos estable, y asumiendo que podíamos estar cometiendo un error en la estima de la expresión génica. En cuanto a la expresión de los genes candidatos, se obtuvo que LPL y SCARB1 podrían estar regulados mediante un mecanismo de retroalimentación negativa (“feedback”) del α-tocoferol sobre su expresión. Dichos genes muestran una regulación de la expresión génica mediada por α-tocoferol a corto plazo, que produce un incremento en su expresión cuando se suplementa vitamina E durante pocos días, seguido 8 1.3. METABOLISMO DE LA VITAMINA E. La absorción de la vitamina E es relativamente pobre, se ingiere unida a los lípidos de la dieta y sólo el 20-40 % de la dosis ingerida es absorbida, dependiendo esta absorción de la capacidad de digerir y absorber las grasas. Al ser una vitamina liposoluble, su absorción depende en gran medida de la funcionalidad biliar y pancreática, y de la composición de la dieta, de forma que las dietas ricas en triglicéridos de cadena media aumentan su absorción, mientras que las dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados la disminuyen. La vitamina E es transportada por lipoproteínas por lo que su concentración plasmática depende en gran medida de los niveles de lípidos plasmáticos, siendo posteriormente el tocoferol circulante acumulado lentamente por los tejidos. En este sentido, el incremento de la eficacia de la absorción, transporte y acumulación de la misma supondría un incremento de la cantidad de vitamina E depositada en el músculo y, por lo tanto, sería necesario una menor dosis de vitamina E y/o menor tiempo de ingesta de pienso con vitamina E para llegar a la misma concentración en el músculo, con el consiguiente ahorro económico. Para la absorción intestinal de la vitamina E se requiere la presencia de ácidos biliares, ésta es absorbida por los enterocitos y después es secretada en forma de quilomicrones al sistema linfático y estos son transportados al sistema circulatorio. También se ha demostrado que puede ser secretada junto a HDL (Lipoproteínas de alta densidad). Los quilomicrones se forman en el intestino. Contienen ApoA1 (Apolipoproteína A1) y A2 y la ApoB48. Su componente lipídico son los triglicéridos y el colesterol de la dieta (1/3 del colesterol que se absorbe) y por el colesterol proveniente de la bilis (2/3 restantes). Se absorben por vía linfática y en circulación reciben ApoC y E desde las HDL. En la pared vascular de los tejidos son hidrolizados por la lipoproteína lipasa periférica (LPL), liberando ácidos grasos y glicerol, vitaminas y otros metabolitos liposolubles. En este sentido, parte de los tocoferoles presentes en los quilomicrones son transferidos a estos tejidos extrahepáticos. Estos son captados a nivel tisular, originándose partículas denominadas remanentes de quilomicrones, con un contenido proporcional menor de triglicéridos. Estos transfieren ApoC y entregan ApoA1 a las HDL y son captados por los receptores hepáticos B48: E, en donde continúan su catabolismo por acción de la lipoproteína lipasa hepática (LPL). En el hígado, por acción de la "proteína transferidora de α-tocoferol" (α-TTP), una 9 parte sustancial del α-tocoferol es incorporado a las VLDL (Lipoproteínas de muy baja densidad) nacientes, mientras que el resto, junto a las otras formas de vitamina E, es eliminado por la bilis, tras ser metabolizadas (ω-hidroxilación) por un miembro de la familia citocromo P450, el CYP4F2, que permitirá la formación de metabolitos polares que serán excretados por la orina. Al tener el α -tocoferol un transportador específico es la forma de la vitamina E que menos se elimina. La importancia de α-TTP la muestra que un defecto genético es responsable de inducir una severa deficiencia de vitamina E caracterizada por una enfermedad neurodegenerativa, ataxia con deficiencia de vitamina E. α-TTP juega un rol esencial en el mantenimiento de las concentraciones de α-tocoferol en el plasma y tejidos. El mecanismo exacto por el cual α-TTPA regula el tráfico intracelular tanto como la secreción de α-tocoferol al plasma y VLDL no se conoce del todo. Una hipótesis es que α-TTP facilita la secreción de α-tocoferol asociado a VLDL a través de la ruta mediada por el aparato de Golgi. Sin embargo, estudios con sustancias inhibidoras de α-TTPA han visto que no está acoplada la secreción de VLDL a la de α-tocoferol. Otros estudios muestran que la vitamina E no es secretada por células del hepatocito mediante una ruta dependiente del aparato de Golgi. Demostrando que el α-tocoferol llega a los orgánulos vesiculares intracelulares donde se colocaliza con α-TTP antes de ser transportado a la membrana plasmática de una manera dependiente de α-TTP, y que la secreción de α-tocoferol desde los hepatocitos es inhibida por un metabolito inhibidor de varios transportadores de vitamina E, como el ABCA1. Una vez secretadas a la circulación, las VLDL son convertidas en IDL (Lipoproteínas de densidad intermedia) y LDL (Lipoproteínas de baja densidad) por acción de la LPL, y compuestos de superficie (incluyendo el α-tocoferol) son transferidos a las HDL. Sin embargo, la mayor parte de vitamina que alcanza el hígado es en forma de quilomicrones remanentes. Las VLDL se forman en el hígado. Su síntesis está regulada por la formación de ApoB100 y por los triglicéridos sintetizados en el hígado. Contienen ApoB100, C y E, y en circulación reciben ApoC y E desde las HDL. Al igual que los quilomicrones son hidrolizadas en tejidos extrahepáticos por el sistema LPL. Un 70%, son rápidamente captadas como remanentes de VLDL por los receptores hepáticos ApoB100: E y otra parte sigue hidrolizando sus triglicéridos y pierde ApoE, transformándose en LDL. Las LDL son el producto del catabolismo de las VLDL, y contienen sólo ApoB100 y son ricas en colesterol libre y 10 esterificado. Son principalmente captadas a nivel hepático por los receptores B100: E en competencia con las IDL y por los receptores periféricos B100. Los receptores la internalizan y permiten su catabolismo celular, liberando colesterol libre que inhibe a la hidroximetilglutaril-CoA reductasa (HMGCoAR), enzima clave para la síntesis de colesterol. El colesterol libre reduce la síntesis de receptores y estimula la acil colesterol acil transferasa (ACAT) que lo esterifica. De esta forma se regula la concentración del colesterol a nivel celular. Aproximadamente, 20-30% de las LDL son captadas por receptores inespecíficos de los macrófagos (Scavenger Receptor SR-A (SCARB1)). Finalmente, las HDL son fundamentales en el transporte reverso del colesterol desde los tejidos hacia el hígado, único órgano capaz de excretarlo (vía biliar). Sintetizadas por el intestino e hígado. Su forma naciente (HDLn) es una bilámina de fosfolípidos y ApoA. Interactúa con los sistemas transportadores transmembrana de colesterol (ATP Binding Cassette – ABCA1 y G1/G4). El colesterol libre en la superficie de la molécula es esterificado e internalizado por acción de la lecitina colesterol acil transferasa (LCAT), dejando nuevos sitios para captar más colesterol u otras sustancias liposolubles, transformándose en partículas esféricas HDL3 y luego HDL2. El colesterol captado por las HDL puede dirigirse hacia el hígado para su excreción por la bilis por acción de la proteína transportadora de esteres de colesterol (CEPT), que transfiere el colesterol esterificado hacia las VLDL y LDL que lo entregan así a través de receptores B100: E o por captación selectiva a través del receptor Scavenger SR-B1 (SCARB1). La HDL no es catabolizada y vuelve a la periferia para captar más colesterol. Los receptores SR-B1 se encuentran distribuidos por todos los tejidos del organismo. ABCA1 inicia la formación de HDL maduro facilitando la lipidación de apolipoproteína A-I. En un estudio se obtuvo una evidencia directa de que ABCA1 está envuelto en la secreción de α-tocoferol desde los hepatocitos (Shichiri et al. 2010). Como se ha indicado con anterioridad, SR-BI (SCARB1; Scavenger receptor) juega un rol esencial en el metabolismo de HDL facilitando el transporte de colesterol libre y esterificado y otros lípidos entre células. SR-BI altera el colesterol de la membrana plasmática y la organización de lípidos de forma que facilita el flujo de colesterol y/o inicia eventos de señalización. Además 11 SR-BI interactúa con moléculas señalizadoras y activa rutas envueltas en ateroprotección. Otros estudios sugieren que HDL media en la ateroprotección, siendo el transporte reverso de colesterol (RCT) el mecanismo mejor estudiado. RCT consiste en la eliminación de colesterol de membrana desde las células, incluyendo macrófagos en la pared arterial, y su transporte al hígado para la biosíntesis de acido biliar, excreción o reciclado de nuevas lipoproteínas o a tejidos esteroidogénicos para la producción de hormonas esteroides. El primer paso en la ruta RCT envuelve la lipidación de apoA-I por ABCA1 llevando por último a la formación de partículas esféricas que aceptan colesterol adicional y fosfolípidos por otros transportadores. Este proceso secuencial de lipidación conlleva la eliminación neta de colesterol desde células periféricas y lleva a la formación de ésteres de colesterol enriquecidos con partículas de HDL, siendo el ligando preferido de SR-BI. Aparte del rol en la ruta RCT, HDL también tiene propiedades antiinflamatorias, antitrombóticas y antioxidantes y promueve la reparación endotelial, además muchas de estas acciones ateroprotectivas de HDL parecen ser mediadas por interacciones con SR-BI (Trigatti et al. 2011). Dado que el vehículo de transporte en el plasma de la vitamina E y carotenoides son las lipoproteínas, es razonable plantear la hipótesis de que el estado de estos micronutrientes en el plasma está gobernado por proteínas envueltas en el metabolismo de las lipoproteínas, como las apolipoproteínas (apoB, apoE, apoA-IV, apoC-III, etc.), lipoproteinlipasa (LPL), lipasa hepática, proteína transferidora de fosfolípidos, proteína transferidora de ésteres de colesterol y lecitina colesterol acil transferasa. Igualmente, se ha demostrado que además de los transportadores ABCA1 y SR-BI existen otros transportadores como el “Niemann-Pick C1-like1” que se ha encontrado relacionado con el transporte a nivel intestinal de partículas liposolubles, y por lo tanto de α-tocopherol, o el transportador “multidrug resistance ATP binding cassette (ABC)”. 12 1.4. GENES IMPLICADOS EN EL METABOLISMO DE LA VITAMINA E. A continuación, haremos una breve revisión sobre algunos genes y enzimas involucrados en el metabolismo del vitamina E que se han estudiados en este trabajo. 1.4.1. LPL. La lipoproteína lipasa es una proteína que cataliza la hidrólisis de triglicéridos captados por la glándula mamaria, músculo, tejido graso, y otros, liberando selectivamente los AG, así como la transferencia de tocoferoles presentes en los quilomicrones a tejidos extrahepáticos. El gen ovino se localiza en el cromosoma Oar2, y tiene 22973 pares de bases (pb) y 10 exones (GenBank acc. nº NW_004080165). El cDNA ha sido aislado en ovino por Edwards et al. (1993) (GenBank acc. NM_001009394, X68308 y AF228667). En bovino se ha visto que existe una regulación compleja a nivel transcripcional, posttranscripcional y post-translacional en el que intervienen factores nutricionales y hormonales. En esta especie, LPL ha sido objeto de extensos estudios en el tejido adiposo y glándula mamaria. La actividad y los niveles de mRNA de LPL son mayores en los músculos oxidativos, el tejido adiposo y corazón, mientras que en intestino delgado, riñón, bazo, pulmones y glándula adrenales presenta una actividad muy baja (Hocquette et al., 1998). En ovino, la actividad y los niveles de expresión de LPL en el tejido adiposo perirrenal y músculo cardíaco están sobre regulados a nivel transcripcional por la insulina (Bonnet et al., 2000), peso al nacimiento, sexo (Muhlhausler et al., 2008), por el crecimiento y por la ingesta de niveles altos de energía (Andersen et al., 1996; Yong et al., 2008). Varios SNPs descritos en zona promotora, exones e intrones, afectan a la actividad del promotor, la estructura y la función de la enzima, interfiriendo en la expresión del gen (Yang et al., 1995; Nicklas et al., 2000; Yang et al., 2004; Torigoe et al., 2008; Yang et al., 2009). Variaciones en el gen de LPL se han descritos en bovino, caprino (Tank y Pomp, 1994; Badaoui et al., 2007). Algunas de estas variaciones se han asociado con la cantidad de la grasa en la leche en cabras siendo interesante por su papel en la hidrólisis de los triglicéridos, a partir de quilomicrones y VDLs 13 (Badaoui et al., 2007). Asimismo, controlando la liberación de AG, LPL puede afectar el contenido de grasa en leche o en la carne (Badaoui et al., 2007; Hocquette et al., 1999). 1.4.2. APOE. La Apolipoproteína E (APOE) es una proteína de 34 kDa que transporta colesterol y otros lípidos en plasma, y en otros tejidos, como el sistema nervioso central uniéndose a los receptores de superficie de APOE. En la periferia, transporta VLDL de síntesis hepática, quilomicrones sintetizados en intestino, y sus remanentes, así como una subclase de HDL, actuando como un ligando para la captación de estas partículas mediante receptores específicos. Es el principal componente de las apolipoproteínas en los quilomicrones. En cerebro, es sintetizada por astrocitos y microglía. Para que la APOE sea estable tiene que asociarse con lípidos, ya que ratones "knockout" para el gen ABCA1 (responsable de la unión de lípidos a APOE) tienen una marcada reducción de la expresión de APOE en cerebro. El gen ovino se localiza en el cromosoma Oar14, y tiene 2687 pb y 4 exones (GenBank acc. nº NW_004080177), produciendo un mRNA de 1154 pb. (GenBank acc. nº NW_004080177). Diferentes polimorfismos de APOE en humana se han asociado a la enfermedad de Alzheimer y a enfermedades cardiovasculares, encontrándose que ratones transgénicos para ApoE4 se asocian a una menor retención de vitamina E en tejidos periféricos, produciendo una alteración del metabolismo de las lipoproteínas (Huebbe et al., 2010). En ovino, Komatsu et al. (1998) caracterizaron el gen APOE, encontrándolo altamente expresado en tejido adiposo en humanos y ratones, siendo el estado nutricional un regulador de su expresión (Huang et al., 2007). Estos autores describieron que la obesidad produce una reducción de la expresión de este gen, mientras que el ayuno y la pérdida de peso la incrementaban en modelos murinos. APOE se encuentra regulado por ABCA1 (Wahrle et al., 2004), y el receptor Scavenger clase B tipo 1 (SCARB1: Huang y Mazzone, 2004) ambos objeto de este estudio. En un estudio reciente polimorfismos de este gen se asocian con un mayor contenido de α-tocoferol en el plasma en humanos (Borel et al., 2007). 14 1.4.3. ABCA1. Esta proteína pertenece a la familia de proteínas ABC (ATPbinding cassette), que utilizan ATP para generar la energía necesaria para transportar metabolitos a través de membranas. Está formada por 2 mitades con estructura similar (Fitzgerald et al., 2001), siendo las estructuras tetraméricas de esta proteína la estructura funcional mínima requerida para la lipidación de partículas de apoA-I. La función más conocida de ABCA1 es la de promover el flujo de colesterol y fosfolípidos a través de membranas, así como la formación de HDLs En este sentido, ratones “knockout” para ABCA1 mostraron bajos niveles de APOE, y de la secreción de APOE en astrocitos y células de la microglía (Wahrle et al., 2004). Oman et al. (2001) y Shichiri et al. (2010) obtienen evidencias de que ABCA1 es un transportador de membrana de α-tocopherol en los tejidos periféricos. En concreto, Reboul et al. (2009) demostraron que ABCA1 es responsable de la absorción intestinal de tocoferol unido a HDL, y de la regulación del contenido de vitamina E en plasma. En 2010, Schichiri et al. demostraron su implicación en el transporte vitamina E en hígado. El gen ovino se localiza en el cromosoma Oar2, y tiene 114838 pb y 50 exones (GenBank acc. nº NW_004080165), produciendo un mRNA de 10664 pb. (GenBank acc. nº NW_004080165). La expresión de ABCA1 está regulada por una red transcripcional altamente sofisticada, mediada en parte por diversos grupos de factores de transcripción. Aunque hay evidencia de que la regulación de la expresión de ABCA1 en el adipocito es específica de tejido, se sabe poco sobre su función. Le Lay et al. (2003) encontraron que ABCA1 se veía inducido durante la diferenciación de pre-adipocitos 3T3-L1. Esta inducción no causó cambios en el contenido total de colesterol en la célula, pero sí en su distribución intracelular durante el proceso de diferenciación. Esto sugiere que el adipocito tiene poca capacidad para eliminar el colesterol y, que probablemente funcione como una molécula de señalización. En humana, múltiples estudios han buscado asociaciones de SNPs de ABCA1 con los niveles de HDL-C y/o la presencia de aterosclerosis, encontrando que los SNPs del gen ABCA1 contribuyen a la variación de los niveles de HDL y apoA-I en las poblaciones estudiadas. Sin embargo, los SNPs que se asocian a menores niveles de HDL tienen una frecuencia muy baja (< 1%) en las poblaciones estudiadas (Cohen et al., 2004). 15 1.4.4. SCARB1 y PDZK1. Receptor Scavenger clase B tipo 1 (SCARB1) es una proteína transportadora que interactúa con HDL y LDL, así como con la vitamina E (Reboul et al. 2006, Witt et al., 2000, Reaven et al. 1998). Estos estudios demostraron que la absorción de la vitamina E no es sólo un proceso de difusión pasiva sino que esta mediado por transportadores, siendo el más importante el Scavenger receptor clase B tipo I. La proteína SR-BI/SCARB1 tiene 509 aminoácidos con dos dominios hidrofóbicos que abarcan la membrana flanqueados por un grande y pesado dominio extracelular N-glicosilado. Tiene dos colas citoplasmáticas cortas de 10 y 40 aminoácidos que corresponden a los extremos N y C terminal, respectivamente. Los 4 residuos terminales del extremo C-terminal de SR-BI interactúan con una proteína adaptadora, la “PDZ domain containing 1” (PDZK1), una proteína citosólica que se ha demostrado que es importante para la estabilidad de SR-BI en los hepatocitos del hígado. Se ha sugerido que los niveles de vitamina E regulan la expresión de este gen mediante el estudio en células HepG2 (Sporstol et al., 2005). Además, se ha demostrado una regulación post-transcripcional del gen mediada por α-tocoferol (Landes et al., 2003). El gen ovino se localiza en el cromosoma Oar17, y tiene 94216 pb y 13 exones (GenBank acc. nº NW_004080180), produciendo un mRNA de 2698 pb. (GenBank acc. nº NW_004080180). Diversos polimorfismos del gen se han asociado con un mayor contenido de α-tocoferol y carotenos en plasma humano (Borel et al., 2007), degeneración macular asociada a la edad (Zerbib et al., 2009) o enfermedades cardiovasculares. Mediante un análisis de asociación de genoma completo (GWAS) se identificaron tres regiones asociadas a contenido de α-tocoferol en plasma humano: una cercana a APOA4, APOA4, y APOC3, otra a CYP4F2 y la última a SCARB1. En hígado, la expresión de SCARB1 está regulada por PDZK1. Fenske et al. (2008) demostraron que la sobreexpresión de PDZK1 inhibe la expresión de SCARB1. En ratones “knockout” para PDZK1 se promueve la arterioesclerosis temprana, probablemente por la reducción de la actividad de SCARB1 (Kocher et al., 2003). Igualmente, en humana se ha demostrado que polimorfismos del gen se asocian con el riesgo a padecer síndrome metabólico en hombres y mujeres obesas (Junyent et al., 2009). El gen ovino se localiza en el 16 cromosoma Oar1, y tiene 37712 pb y 9 exones (GenBank acc. nº NW_004080164), produciendo un mRNA de 2068 pb. (GenBank acc. nº NW_004080164). 1.4.5. NPC1L1. La absorción intestinal de colesterol y esteroles es un proceso complejo en el que intervienen distintas enzimas y transportadores, como la proteína NPC1L1 (Niemann-Pick C1-Like 1). En humanos, se encuentra localizada normalmente en compartimientos intracelulares, desplazándose a la membrana plasmática del enterocito en función de la disponibilidad de colesterol. Diversos estudios han demostrado la influencia de variantes genéticas de NPC1L1 sobre la concentración del colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (cLDL) en respuesta a la inhibición de la absorción por ezetimiba (Simon et al., 2005). Narushima et al. (2008) demostraron su implicación en la captación de α -tocoferol. Se ha descrito una regulación de la expresión de NPC1L1 a través de la proteína de membrana CD36, relacionada con la captación de AG y degradación de lipoproteínas (Silverstein y Febbraio, 2009), siendo a su vez la expresión de CD36 regulada por αtocoferol (Ricciarelli et al., 2000). El gen ovino se localiza en el cromosoma Oar4, y tiene 21127 pb y 19 exones (GenBank acc. nº NW_004080167), produciendo un mRNA de 4002 pb. (GenBank acc. nº NW_004080167). Por otra parte, recientemente se ha observado que hay una asociación entre los polimorfismos de NPC1L1 y la variación en la absorción intestinal de colesterol, α-tocoferol, esteroles y la concentración plasmática de LDL-c en población normolipémica (Cohen et al., 2006; Yamanashi et al., 2009). 1.4.6. TTPA. La función de la proteína transferidora de α-tocoferol (TTPA) es mantener los niveles plasmáticos de α-tocoferol, transfiriéndolo desde los hepatocitos a las lipoproteínas circulantes. Mutaciones en este gen producen ataxia con deficiencia en vitamina E, que es un desorden autosómico recesivo caracterizado por bajos niveles de vitamina E en plasma y una neurodegeneración progresiva (Ouahchi et al. 1995). Se expresa en hígado, pulmones, bazo, riñón, glándula adrenal, cerebro, útero y placenta (Gohil et al., 2004; Hosomi et al., 1998; Kaempf-Rotzoll et al., 2003). El gen ovino se localiza en el cromosoma Oar9, y tiene 38351 pb y 5 exones (GenBank acc. nº NW_004080167), produciendo un mRNA de 1098 pb (GenBank acc. nº HQ268507). Luo et al. (2012) caracterizaron el gen en ovino mostrando 17 que la expresión de TTPA en hígado aumentaba en ovejas sometidas a bajos niveles de α - tocoferol. 1.4.7. CYP4F2. Citocromo P450 4F2 (CYP4F2) cataliza la ω-hidroxilación de la cadena lateral de los tocoferoles y tocotrienoles, convirtiéndolos en metabolitos polares para poder ser eliminados por la urea. Bardowell et al. (2010) mostraron que diferentes mutaciones de este gen producían una alteración en la actividad enzimática y el metabolismo de la vitamina E en células de insectos que expresaban el gen humano. El gen ovino se localiza en el cromosoma Oar5, y tiene 23421 pb y 12 exones (GenBank acc. nº NW_004080168), produciendo un mRNA de 2350 pb (GenBank acc. nº NW_004080168). En un análisis de asociación de genoma completo (GWAS) se identificó una región asociada al contenido de α -tocoferol en plasma, pudiendo de esta manera contribuir a parte de la varianza de este carácter. 1.4.8. PPARA y PPARG. Los receptores activados por proliferadores peroxisomales (PPAR) son factores de transcripción que pertenecen a una superfamilia de receptores de esteroides nucleares. Se han identificado 3 isoformas: PPARα, PPARβ, llamado δ también, y PPARγ. PPARα se expresa predominantemente en el tejido adiposo marrón e hígado, luego en riñón, corazón y músculo esquelético. PPARβ se expresa en muchos tejidos, pero presenta los niveles más altos en intestino, riñón y corazón. Mientras PPARγ se expresa principalmente en el tejido adiposo y menos en colon, retina y sistema inmune (Desvergene y Wahli, 1999; Kersten et al., 2000). A nivel molecular los PPAR funcionan como otros receptores nucleares. Primero se unen a los elementos específicos en el promotor de los genes diana en forma de heterodímeros con el receptor X retinoide (RXR). Posteriormente activan la transcripción de genes como respuesta de unión de los ligandos a los receptores (Kliewer et al., 1992; Clarke et al., 2000; Kersten et al., 2000). Los AG palmítico, oleico, y varios AGPI son ligandos potentes de los PPAR y ejercen su efecto en la expresión de genes a través de los PPAR. En general los PPAR son más sensibles a los AG de cadena larga, (18-22 átomos de carbono, n-6 y n3), comparado con los saturados y los monoinsaturados (Krey et al., 1997; Kliewer et al., 1997; Forman et al., 1997) Los genes diana de PPARα son un grupo homogéneo que 25 3. MATERIAL Y MÉTODOS. 3.1. MATERIAL ANIMAL Para realizar el ensayo se utilizó las instalaciones del Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria (CITA) del Gobierno de Aragón en Montañana (Zaragoza), 41° 3´N, 0° 47 ´W; altitud 225m. Durante el ensayo los animales fueron estabulados en parques hasta el sacrificio, el cual se realizaba en el matadero experimental que el CITA posee. Los análisis genéticos se realizaron en laboratorio de Genética molecular animal del CITA. 3.1.1. Diseño experimental. El material animal estudiado ha constado de 58 corderos machos de raza Rasa Aragonesa sacrificados a los 22-24 kilogramos de Peso Vivo (PV) (peso Ternasco de Aragón). Todos ellos procedían de una cubrición controlada de un rebaño de 120 ovejas. Tras 40-45 días de lactación los corderos fueron destetados y distribuidos en 4 tratamientos teniendo en cuenta los días que habían ingerido vitamina E, y el peso y la edad. También se estudió un grupo de corderos alimentados en praderas de alfalfa: - Tratamiento 1 (Alfalfa, A): Los corderos (n=8) y las madres estaban en praderas de alfalfa hasta el sacrificio. Los corderos disponían de concentrado y no fueron destetados. Análisis realizados sobre el contenido de dl-α-tocoferol mostraron que la alfalfa tenía 11.5 mg ± 1.6 mg/kg de MS de alfalfa. - Tratamiento 2 (Testigo, T): Corderos estabulados (n=12), disponían de concentrado ad libitum. Los corderos fueron cebados con pienso de cebo estándar, sin adicionar vitamina E. - Tratamiento 3 (VE10d): Los corderos (n=13) tomaron pienso de cebo control que contenía 500 mg/kg de dl-α-tocoferol acetato en el pienso durante los últimos 7 a 14 días previos al sacrificio. - Tratamiento 4 (VE20d): Los corderos (n=14) tomaron pienso de cebo control que contenía 500 mg/kg de dl-α-tocoferol acetato en el pienso durante los últimos 18 a 25 días previos al sacrificio. 26 - Tratamiento 5 (VE30d): Los corderos (n=11) tomaron pienso de cebo control que contenía 500 mg/kg de dl-α-tocoferol acetato en el pienso durante los últimos 29 a 36 días previos al sacrificio. En la Tabla 1 se puede ver la composición química del concentrado y la alfalfa. Tabla 1. Composición química del concentrado y de la alfalfa de los corderos. MS* CZ PB NDF ADF ADL Testigo 89,75 5,21 17,2 17,59 4,55 0,34 Pienso Vit E 89,92 5,43 18,18 19,56 5,28 0,52 Alfalfa 95,78 10,22 15,42 32,56 20,43 3,55 *Valor medio del contenido en materia seca (MS), cenizas (CZ), proteína bruta (PB), fibra neutro detergente (NDF), fibra ácido detergente (ADF), y lignina ácido detergente (ADL) como % sobre materia seca del concentrado y la alfalfa 3.1.2. Sacrificio y toma de muestras. Semanalmente se pesaron los animales a primera hora de la mañana con una balanza electrónica (precisión ± 100 g). La ganancia media diaria (GMD, en g) se calculó por regresión lineal del peso vivo sobre el tiempo. Cuando los corderos alcanzaron los 22-24 kg PV se sacrificaron en el matadero experimental que el CITA posee en Zaragoza, siguiendo la normativa de la Indicación Geográfica Protegida del Ternasco de Aragón (Regulación (EC) Nº. 1107/96), que exige que los animales deben alcanzar los 22-24 kg de PV y tener menos de 90 días de edad. Los sacrificios fueron organizados semanalmente por grupos de animales según el peso final establecido. Se realizó respetando la normativa sobre protección de animales en el momento del sacrificio (Directiva 93/119/CE, RD 54/1995), supervisados por el Comité sobre bienestar animal del Centro (protocolo número 2009-01_MJT). Tras el sacrificio se aislaron muestras de: músculo Longissimus dorsi; hígado; ganglios linfáticos mesentéricos; grasa subcutánea a la altura de las vértebras Atlas y Axis, y tres partes diferenciadas de intestino delgado (duodeno, íleon y yeyuno) con diferente actividad en la absorción de grasas y vitamina E. Éstas fueron inmediatamente envueltas en papel de aluminio debidamente identificado e introducidas en nitrógeno líquido para, posteriormente, almacenarlas a -80° C para la posterior extracción de los ácidos nucleicos. 27 Este material animal se basa en grupos con valores extremos para el contenido de vitamina E en la carne, estando este contenido significativamente correlacionado con los valores de oxidación lipídica y pigmentos hemáticos (Ripoll et al., 2013). Es por ello que, el material animal generado resulta idóneo para la búsqueda de genes diferencialmente expresados en función del sistema de alimentación y del diferente contenido de vitamina E, y para permitirnos dilucidar los mecanismos bioquímicos relacionados con el metabolismo de la vitamina E en rumiantes, y su diferente contenido final en músculo. La detección de genes sobre o bajo-expresados asociados a una cantidad de vitamina E y a una dieta determinada nos permitirá determinar genes candidatos sobre los que buscar mutaciones individuales que puedan afectar a parte de la varianza del carácter en estudio. 3.2. EXTRACCIÓN DE mRNA. El RNA total celular se extrajo y se purificó a partir del reactivo TRIREAGENT y el kit “RNeasy ® Lipid Tissue Mini kit” (QIAGEN). El protocolo está descrito a continuación. Se realizó la extracción de las 58 muestras de yeyuno. Igualmente para testar la especificidad tisular de la amplificación se llevó a cabo la extracción de RNA y de muestras de los músculos Longissimus dorsi, hígado, duodeno, íleon y grasa subcutánea de 3 animales de cada tratamiento (15 por tejido; n= 75). - Protocolo de extracción del RNA. Este método se basa en el uso de una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina para lisar las células. Posteriormente la muestra se separa en dos fases acuosa y orgánica, seguida por la extracción y precipitación de RNA total con cloroformo e isopropanol, respectivamente, a partir de la fase acuosa. El tejido se disgregó y se homogenizó utilizando el homogeneizador OMNITIP. Se siguió el siguiente protocolo de extracción: o Sin dejar descongelar el tejido, se añadieron 750 μl de TRI-REAGENT (QiAzol Lysis Reagent) para, posteriormente, disgregar el tejido animal con la ayuda del homogeneizador OMNITIP (International GLH) para romper las estructuras celulares y liberar el RNA. A partir de este último paso, toda manipulación del homogenizado 28 que contiene el RNA extraído se realiza en campana vitrina de gases modelo BURDINOLA ST 1500. El tubo con el homogenizado se mantuvo a temperatura ambiente sobre la gradilla durante 5 minutos aproximadamente. o Se añadieron 200 μl de cloroformo a cada homogenizado para separar las fases obtenidas tras la lisis celular y se agitó cada tubo mediante un agitador vórtex. Se colocó cada tubo a temperatura ambiente durante 2-3 minutos para facilitar dicha separación. o Se centrifugó a 12000 gx, a una temperatura de 4°C, durante 15 minutos en la centrífuga 5810R de Eppendorf. Tras este paso el resultado de la centrifugación son tres fases completamente diferenciadas: la fase superior de color acuoso contiene el RNA; una interfase de color blanco, y una fase inferior de color rojo que constituye la fase orgánica. (Para considerar una centrifugación correcta, el volumen de fase acuosa debe superar los 200 μl). o Se transfirió la fase acuosa, a un nuevo tubo eppendorf de 1’5 ml, en 600 μl de etanol al 70 % y se agitó cada tubo. o Posteriormente, se traspasaron 700 μl de cada tubo a la columna RNeasy mini colocada en un tubo de 2 ml y se centrifugó a 8000 gx a temperatura ambiente durante 1 minuto. A partir de esta última centrifugación (incluida ésta) todas las siguientes fueron realizadas en la centrífuga Biofuge 3 de Heraeaus Instruments. o Tras este primer paso por la columna RNeasy mini, se descartó el eluido y se repitió el paso anterior utilizando el resto de la muestra, descartando de nuevo el eluido. o Posteriormente, y manteniendo el tubo eppendorf colector, se adicionaron 700 μl de buffer RW1 a la columna y se centrifugó a 8000 gx a temperatura ambiente (20°C aproximadamente), durante 1 minuto para limpiar la membrana, descartándose el eluido. o Se añadieron a la columna 500 μl de buffer RPE a la columna y se centrifugó a 8000 gx, a temperatura ambiente durante 1 minuto y se descartó el eluido. Se añadieron de nuevo 500 μl de buffer RPE y se repitió la misma centrifugación, durante 2 minutos (esta centrifugación más larga favorece el secado de la membrana eliminando restos de etanol que pudieran interferir posteriormente). 29 o Se colocó la columna en un nuevo tubo eppendorf de 1’5 ml y se añadieron 35 μl de agua libre de RNAsas directamente en el centro de la columna para obtener el eluido de RNA final. Se centrifugó 1 minuto a 8000 gx. o Finalmente, todos los tubos eppendorf fueron congelados a -80°C. Después de la extracción, se determinó la cantidad y la pureza del mRNA con el nanoespectrofotómetro (Implegene) mediante la cuantificación de la densidad óptica a 260 y 280 nanómetros respectivamente. La presencia de proteínas y otros inhibidores se estimó a partir de los ratios de absorbancia 260/280 y 260/230 considerando valores aceptables de [1.8 ± 0.2]. Todos los tubos eppendorf fueron congelados a -80°C hasta la síntesis de cDNA. Los valores correspondientes a la concentración de RNA en el eluido nos indicaron qué volumen de cada muestra debe ser considerado para que 1 µg de RNA sea retrotranscrito a DNA complementario (cDNA). 3.3. SÍNTESIS DE DNA COMPLEMENTARIO (CDNA). Es muy importante que las muestras de RNA sean mantenidas en frío durante todo el proceso La síntesis de cDNA se llevo a cabo tras el tratamiento con DNAsa (DEOXYRIBONUCLEASE I, AMPLICICATION GRADE), para eliminar el ADN que pudiese haber en la muestra y posterior utilización del kit SuperScript III FirstStrand SuperMix (Invitrogen) (B). Tratamiento de la muestra de RNA con DNAsa I: o Se añadió en un tubo de 0’5 ml libre de RNAsas:  1 g de RNA (de muestra)  1 l de DNAsa I buffer de reacción 10X  1l de DNAsa I, Amplicication Grade (1U/l)  agua DEPC hasta 10 l de volumen final. El agua DEPC es agua tratada con dietilpirocarbonato al 0.1% (v/v en agua ultrapura). Durante la preparación de la solución de 0,1 % DEPC, esta se mezcla vigorosamente durante 1 minuto, se incuba a temperatura ambiente 30 durante toda la noche en la campana de extracción, y se autoclava la solución antes de su uso para inactivar el DEPC. o Incubación a temperatura ambiente 15 minutos. o Inactivación de DNAsa I: 1 l de EDTA 25 mM. o Incubación a 65° C, 10 minutos en el termociclador BIOMETRA T 3000. Síntesis de cDNA - kit SuperScript III FirstStrand SuperMix (Invitrogen): o Se preparó el mezcla de reacción trabajando en frío (hielo), añadiendo en un tubo libre de RNAsas de 0.5 ml:  10 μl de buffer 2x RT reaction mix  2 μl de enzima RT mix,  7 μl de mRNA (más de 1 μg)  Agua libre de RNAsas (DEPC) hasta completar 20 μl de volumen final. o Incubación: 25° C 10 minutos; 50°C 30 minutos y, 85° C durante 5 minutos. o Se añadió 1 μl de RNAsa H (en baño de hielo) e incubar a 37° C durante 20 minutos. Se almacenó el cDNA a -20° C. 3.4. DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD DEL CDNA SINTETIZADO. Se realizó una PCR convencional del gen de beta actina (ACTB) de expresión constitutiva en todos los tipos celulares. La amplificación se realizó en un volumen final de 25 μl conteniendo 5 pmol de cada uno de los cebadores (F-5´GGACCTGACGGACTACCTCATG3´ y R5´GGCCATCTCCTGCTCGAAGT-3´), 200 nM dNTPs, 2mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0.1% Triton X-100 y 0.5 U Taq polymerasa (Biotools). La amplificación se realizó en el termociclador Biometra T3000. Se realizaron 35 ciclos de amplificación con un paso de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, de hibridación a 60° C durante 30 segundos, y de extensión a 72° C durante 30 segundos. Los productos de amplificación de 136 pb fueron verificados en geles de agarosa al 2 % teñido con SYBRsafe, compuesto fluorescente similar al Bromuro de etidio pero menos citotóxico. La visualización de los geles se realizó en un 31 analizador de imágenes BiORAD modelo Gel Doc XR+ equipado con una pantalla de conversión XcitaBlue y con el software ImageLab vs. 4.0. La cantidad y la calidad del mismo fueron determinadas en un nanoespectrofotómetro (Implegene) mediante la cuantificación de la densidad óptica a 260 y 280 nm. Como en el caso del RNA la presencia proteínas y otros inhibidores de la PCR se estimaron a partir de los ratios de absorbancia 260/280 y 260/230 considerando valores aceptables de 1.8±0.2 y de 2.0±0.2, respectivamente. La relación óptima 260/ 280 es 1.82.0 3.5. ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA. Los genes analizados en este trabajo se han elegido por su relación con la variabilidad de contenido de vitamina E en suero en estudios en humana, o por su relación con las rutas metabólicas de la vitamina E. Igualmente se han seleccionado genes codificadores de factores de transcripción que pueden regular la expresión de los genes relacionados con el metabolismo de la vitamina E. Los genes inicialmente incluidos en el estudio fueron: SCARB1 (Scavenger receptor clase B tipo 1), PDZK1 (“PDZ domain containing 1”), CYP4F2 (polipéptido 2 del citocromo P450 familia 4, subfamilia F), ABCA1 (ATP-binding cassette A1), APOE (Apolipoproteína E), NPC1L1 (Niemann-Pick C1-like1), LPL (Lipoproteína lipasa), SREBP1 (Sterol regulatory element-binding protein I), PPARA (peroxisome proliferator-activated receptor alpha), PPARG (peroxisome proliferator-activated receptor gamma), CEBPB (CCAAT/enhancer binding protein B), y TTPA (Transportador de alpha tocopherol). Para normalizar los resultados de expresión se eligieron 3 genes de expresión constitutiva: RPL37 (proteína ribosomal 37), RPL19 (proteína ribosomal 19), y B2M (microglobulina B2). 3.5.1. Diseño y optimización de cebadores. Los cebadores se diseñaron utilizando el programa Primer3 vs. 4.0 (http://primer3.ut.ee/). Cuando fue posible los cebadores fueron diseñados en la unión exónexón, o en exones diferentes con el fin de poder evitar la amplificación de DNA genómico. Los cebadores diseñados amplifican secuencias entre 80160 pb, ya que ha sido descrita una máxima eficiencia de la amplificación para este tamaño. Para los genes TTPA, NPC1L1, ABCA1, APOE, PDZK1 y SCARB1, de los cuales no existía secuencia de cDNA en las 32 base de datos GenBank, se obtuvo la secuencia de cDNA de bovino del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), y se realizó un estudio de identidad con el genoma ovino versión 3.1 mediante la herramienta BLAST (http://www.livestockgenomics.csiro.au/blast/). De esta forma se identificó la región genómica y cromosoma dónde están situados los genes, y se obtuvo la secuencia ovina de los mismos a través del genoma ovino (http://www.livestockgenomics.csiro.au/sheep/oar3.1.php) o del Genbank. Una vez identificados los exones se utilizó la herramienta PRIMER3 para el diseño de los cebadores. - Cebadores de genes de expresión constitutiva o genes de referencia (GRs): Los genes de expresión constitutiva se consideran un grupo de genes que se expresan en todas las células del organismo y codifican proteínas que son esenciales para el funcionamiento general de las células y son conocidos como “housekeeping genes”. Para obtener una medida precisa de la expresión de un gen es esencial normalizar los resultados del PCR a tiempo real en relación a la expresión fija de un gen de referencia, de tal forma que ésta no se vea afectada por las condiciones experimentales. Aunque la normalización con referencia a la expresión constitutiva de un gen “housekeeping” sea el método más común, no hay un gen de referencia universal que sea constante en todas las situaciones experimentales. Para normalizar los resultados de expresión de los genes de interés hemos testado la estabilidad de 3 genes de expresión constitutiva mediante modelos mixtos (Serrano et al., 2011) para seleccionar el mejor candidato para nuestras condiciones experimentales. Los cebadores de los genes de expresión constitutiva, el tamaño de amplicón y las condiciones de la RT-qPCR están descritos en la tabla 2. Tabla 2. La secuencia de los cebadores de los genes de expresión constitutiva y las condiciones de amplificación por PCR TiempoReal. Genes Cebadores forward y reverse Amplicón pb Condiciones de PCR TH nM B2M F-5´ACGCTGAGTTCACTCCCAAC-3´ R-5´GGTGCTGCTTAGAGGTCTCG-3´ 109 59 600 600 RPL19 F-5´CAACTCCCGCCAGCAGAT-3´ R-5´CCGGGAATGGACATGTCACA-3´ 76 60 200 200 RPL37 F-5´GAAGTCGACCTGTGGCAAGT-3´ R-5´CTCATTCGACCAGTCCCAGT-3´ 105 60 200 200 TH: temperatura de hibridación; nM: concentración de cebadores en nano molar; F: cebador forward y R: cebador reverse. 33 - Cebadores de genes diana: La secuencia de los cebadores, tamaño del fragmento amplificado, temperatura de hibridación y concentración de cebadores para los genes relacionados con el metabolismo de la vitamina E aparecen en la Tabla 3. El número de GenBank y la zona amplificada con los cebadores de los genes estudiados está mostrado en la tabla 4. Tabla 3. La secuencia de los cebadores de los genes y las condiciones de amplificación para qPCR GENES Cebadores Forward y Reverse Amplicón pb Condiciones qPCR TH nM NPC1L1 F-5´GCCAATAATTTTCCATGCTG-3´ R-5´GTGGAAGGATGTCTGGGAAA-3´ 131 60 600 600 ABCA1 F-5´GGTTCAGGTGTCTTGGCAGT-3´ R-5´AGGGTTCGACCCTGCTATTC-3´ 94 60 900 900 CYP4F2 F-5´TGCAGAAATGCGTCTTCAGT -3´ R-5´GCAGGAAGATCTGCTGGTTC -3´ 117 60 200 200 APOE F-5´GACGCTGTCTGACCAGGTG-3´ R-5´TCACCTCCTTCATGGTCTCC-3´ 92 60 600 600 SCARB1 F-5´GCAAGACTGTAGGGTTCCAAA-3´ R-5´GCTCAGACTTTGGGACTGGT-3´ 134 60 600 600 LPL F5´AATGAAGAGATGAACGGAACG-3´ R´- 5GCACTTTCCAACCAGGATGT-3´ 119 60 900 900 PPARA F-5´TGCCAAGATCTGAAAAAGCA-3´ R-5´CCTCTTGGCCAGAGACTTGA-3´ 101 60 600 600 TTPA* F-5´GCCAATAATTTTCCATGCTG-3´ R-5´GTGGAAGGATGTCTGGGAAA-3´ 131 56 900 900 PDKZ1* F-5´GCCAATAATTTTCCATGCTG-3´ R-5´GTGGAAGGATGTCTGGGAAA-3´ 78 60 --- PPARG F-5´CTTGCTGTGGGGATGTCTC-3´ R-5´GGTCAGCAGACTCTGGGTTC-3´ 121 60 600 600 SREBF1 F-5´CTGCTATGCAGGCAGCAC3´ R-5´GGTTGATGGGCAGCTTGT3´ 99 60 200 200 CEBPB F-5´GACAAGCACAGCGACGAGT-3´ R-5´GTGCTGCGTCTCCAGGTT-3´ 102 59 600 600 *Estos genes no fue posible amplificarlos mediante PCR a tiempo real en muestras de yeyuno. . (TH: temperatura de hibridación; nM: concentración de cebadores en nano molar; F: cebador forward y R: cebador reverse). 41 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 4.1. CONTENIDO DE α-TOCOFEROL EN MÚSCULO. Los datos del contenido de α -tocoferol en músculo (Longissimus dorsi) de las muestras de los animales contempladas en este trabajo provienen del proyecto INIA RTA2009-00091-C02-01, y los resultados están reflejados en el trabajo de Ripoll et al. (2013), en el cual existían diferencias significativas de contenido de α -tocoferol entre los diferentes grupos, con excepción del grupo A y VE10d, que presentaron contenido similar. Sin embargo, en ese trabajo se analizaron 64 muestras de músculo, y en este se han analizado 58 muestras, ya que de 6 muestras no se obtuvo muestra para extraer el RNA y realizar los estudios de cuantificación de la expresión. Por este motivo, se reanalizaron los datos de contenido de α -tocoferol en músculo con los 58 animales contemplados en este estudio, encontrando resultados similares a los descritos por Ripoll et al. (2013). Es decir, se encontraron diferencias significativas en el contenido de α -tocoferol entre los diferentes grupos, con excepción del grupo A y VE10d (Tabla 5). El peso al sacrificio y edad al sacrificio no fueron significativos en el modelo, mientras que el contenido de α -tocoferol resultó significativo (P<0.0001). Tabla 5. Contenido de α -tocoferol en el músculo Longissimus thoracis en mg /kg de músculo. Diferentes superíndices indican P<0.05. T A VE10D VE20D VE30D α-tocoferol 0.183 ± 0.120a 0.646 ± 0.164b 0.890 ± 0.124b 1.531 ± 0.117c 2.058 ± 0.162d No se pudo analizar el contenido de α-tocoferol en yeyuno ya que no se disponía de muestra. Sin embargo, diversos autores han mostrado que la acumulación de α -tocoferol es mayor en tejido adiposo que en músculo esquelético (Lee, Waller, Melton, & Saxton, 2006; Liu, Lanari, & Schaefer, 1995), dependiendo de la dosis y el tiempo de suplementación (Alvarez et al., 2008; Lee et al., 2006). Estos mismos autores, relacionan el contenido final de α-tocoferol en músculo con el contenido en suero, que depende de su correcta absorción en intestino, mediada en gran medida por algunos de los transportadores estudiados en este trabajo. Nuestros resultados confirmaron que los grupos establecidos en función de los días 42 de consumo de vitamina E eran homogéneos, y existían diferencias de contenido final de α - tocoferol entre tratamientos. 4.2. COMPROBACIÓN DE LA IDENTIDAD GÉNICA Y DE LA EXPRESIÓN TISULAR ESPECÍFICA. Previo a la cuantificación mediante RT-qPCR, se estudió la expresión tisular de los genes analizados mediante PCR convencional. En la tabla 6 se pueden observar los resultados de la amplificación. En total, se analizaron 15 muestras por tejido (n= 90). Tras la PCR convencional se comprobó, mediante secuenciación de 5 animales por tejido, la identidad del fragmento amplificado. En todos los casos este presentó una identidad del 100 % con el gen correspondiente en relación al genoma ovino (el nº de acceso al GenBank para cada gen estudiado aparece en la información específica para cada gen del apartado 2.4) Tabla 6. Expresión tisular de los genes candidatos analizados en este estudio. Tejido Gen M. Longissimus dorsi Duodeno Yeyuno Íleon Hígado Grasa subcutánea SCARB1 X X X X X X CYP4F2 --- X X X X --- ABCA1 X X X X X X APOE X X X X X X NPC1L1 --- --- X X X --- LPL X X X X X X PPARA X X X X X X PPARG X X X X X X CEBPB X X X X X X TTPA X --- X1 --- X X SREBP1 X X X X X X PDKZ1 --- --- --- --- X --- SCARB1 (Scavenger receptor clase B tipo 1), CYP4F2 (polipéptido 2 del citocromo P450 familia 4, subfamilia F), ABCA1 (ATP-binding cassette A1), APOE (Apolipoproteína E), NPC1L1 (Niemann-Pick C1-like1), LPL (Lipoproteína lipasa), PPARA (peroxisome proliferator-activated receptor alpha), PPARG (peroxisome proliferator-activated receptor gamma), CEBPB (CCAAT/enhancer binding protein B), TTPA (Transportador de alpha tocopherol) , SREBP1 (Sterol regulatory element-binding protein I), y PDZK1 (PDZ domain containing 1). 1Este gen no amplificó en todas las muestras. 43 4.3. ELECCIÓN DE LOS MEJORES GENES DE REFERENCIA PARA NORMALIZAR LOS RESULTADOS. El uso de modelos matemáticos adecuados para estimar la estabilidad de la expresión de los genes bajo diferentes condiciones es un punto crítico. GeNorm (Vandesompele et al., 2002) y Normfinder (Andersen et al., 2004) son dos de los programas más utilizados para determinar GRs. El primero considera que todas las muestras proceden de un solo grupo y, por tanto, la estima de la estabilidad de la expresión se basa exclusivamente en las varianzas de la expresión entre los genes. El Normfinder permite estimar las varianzas de expresión de los genes entre y dentro de grupos y calcula la estabilidad combinando ambas fuentes de información. Sin embargo, NormFinder estima la varianza entre grupos por las diferencias en los niveles de expresión de éstos, asumiendo que el promedio de expresión de los genes es independiente del grupo y que el promedio de las variaciones entre grupos es cero. Esta última suposición requiere que se seleccionen los genes candidatos de un grupo del que a priori no se esperen diferencias de expresión entre grupos, lo cual es una incógnita en los casos donde se estudia la expresión de genes bajo nuevas circunstancias. Estas restricciones no son realistas y restan flexibilidad al modelo en el que la interacción entre genes y el ambiente se suponen parte de los mecanismos de regulación de la expresión génica. Recientemente, Serrano et al. (2011) usan la metodología de modelos mixtos para elegir los GRs más estables y normalizar los resultados de la PCR tiempo real. Esta metodología permite una selección más precisa de los GRs, y es la metodología que nosotros hemos utilizado. Por otra parte, a la hora de elegir los GRs es importante testar la estabilidad tanto de los GRs como los genes candidatos (GCs) como describe Salces-Ortiz et al. (2013). De esta manera evitaremos elegir GRs menos estables que los GCs para normalizar los resultados. La normalización de nuestros GCs por GRs menos estables podría producir un error en la estima de la expresión génica de los diferentes tratamientos. En la tabla 7 se muestra la estabilidad de todos los genes analizados en términos de error cuadrático medio (ECM). 44 Tabla 7. Error cuadrático medio (ECM) de todos los genes estudiados. Gen ECM APOE 2.6373 RPL19 2.7228 RPL37 3.0190 SREPB1 3.5903 CEBPB 3.7788 ABCA1 3.7792 PPARA 3.9020 PPARG 4.6395 B2M 4.8228 LPL 4.8468 CYP4F2 5.6206 SCARB1 5.6833 NPC1L1 6.0600 El gen más estable bajo los distintos tratamientos analizados en este estudio fue el gen candidato APOE (2.6373), seguido de un GR, RPL19 (2.7228). Se decidió normalizar los resultados de expresión de todos los genes con el gen RPL19, el cuál era menos estable que APOE. Ninguno de los tres GR testados fue más estable que APOE, por lo que la normalización de APOE se realizó con RPL19, un gen menos estable, y asumiendo que podíamos estar cometiendo un error en la estima de la expresión génica. 4.4. ESTUDIO DEL EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN DE α-TOCOFEROL EN LA EXPRESIÓN DE GENES RELACIONADOS CON EL METABOLISMO DE LA VITAMINA E MEDIANTE RT-QPCR. Los genes SCARB1, ABCA1, LPL, APOE, NPC1L1, CYP4F2, PPARG, PPARA, SREBP1, y CEBPB amplificaron en todas las muestras de yeyuno, mientras que TTPA amplificó en 25 muestras y no se consideró para los estudios de expresión. PDKZ1 sólo amplificó en hígado. Estos dos genes no se cuantificaron mediante PCR a tiempo real en yeyuno. En la Figura 1, se pueden ver la distribución de los valores de Ct sin corregir por los diferentes efectos del modelo, es decir sin normalizar. 45 Figura 1. Distribución de los valores Ct para los GRs y genes candidatos. Las cajas muestran el rango de valores Ct para cada gen, la línea central la mediana, y las barras la desviación estándar de la media. En la Figura se observa que B2M es el gen que más se expresa, ya que tiene el Ct más bajo (Ct= 17.02892), mientras que ABCA1 presenta los niveles de expresión más bajos (Ct= 29.35077363). Finalmente el gen CEBPB es el que presenta la variabilidad más elevada pudiendo indicar a priori un mayor efecto de los tratamientos en la expresión del gen. El modelo descrito en el apartado 3.7.2. fue el que mejor BIC (criterio de información bayesiana) mostró. Los efectos fijos tratamiento (P<0.0001), gen (P<0.0001), peso al sacrificio (P<0.0001), y edad al sacrificio (P=0.0228) resultaron significativos, mientras que el efecto placa (P=0.1793) y tratamiento x gen (P=0.3925) no lo fueron. Esto muestra que utilizar diferentes placas para analizar todas las muestras de cada gen no tuvo influencia en la expresión de los mismos. Se encontraron diferencias significativas en la expresión de los genes LPL y SCARB1, así como tendencias en estos genes y ABCA1 entre diferentes tratamientos (Figura 2). Hay que destacar que en todos los casos el intervalo de confianza fue muy grande. 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 Ciclo de Cuantificación (Ct) 46 Figura 2. Log2 del “fold change” (FC) para los contrastes para grupos alternativos con el sistema de alimentación por gen. Sólo se indican contrastes significativos. **P<0.05, *P<0.1. Las barras indican el intervalo de confianza al 95% (FCup-FClow). 1 10 100 ABCA1 (VE20d-A) LPL (VE10d-A) LPL (VE30d-A) LPL (VE10d-VE20d) SCARB1 (VE20d-A) SCARB1 (VE20d-30d) SCARB1 (VE20d-10d) Log 2 (FC) ** * * ** ** * ** 47 El análisis cluster (Figura 3) mostró varios clusters principales de acuerdo con el sistema de alimentación. El primer cluster incluyó el tratamiento 4 (VE20d) que mostró una mayor expresión de los genes que el resto de tratamientos. Figura 3. Resultados de análisis Cluster agrupados según de la expresión de genes, el tipo de alimentación en yeyuno. El gen LPL mostró una expresión relativa de 8.39 y 4.72-veces más alta en el tratamiento VE10d que en los tratamientos A (P<0.05) y VE20d (P<0.05), respectivamente. .Además, una tendencia fue también observada en el contraste entre, VE30d y A (P=0.096), donde la expresión del grupo de VE30d fue 4.38-veces más alta que el grupo A (Tabla 8). El gen ABCA1 también muestra una tendencia en el contraste VE20d y A (P=0.0985), dónde la expresión de VE20d fue 3.99-veces mayor que en el grupo A. Finalmente, el gen SCARB1, presentó una aumento en su expresión de 7.03 y 6.82veces en los animales 48 correspondientes al sistema VE20d con respecto a los del sistema A (P<0.05).y VE10d (P<0.05), respectivamente. Igualmente, SCARB1 mostró una expresión relativa de 4.53-veces más alta en el tratamiento VE20d que en el tratamiento VE30d (P= 0.074). Con respecto al resto de genes y sistemas analizados no se observaron diferencias significativas en cuanto a su expresión diferencial. La vitamina E ingerida por la dieta es captada por las células intestinales y secretada en los quilomicrones que son catabolizados por la LPL, siendo músculo y tejidos grasos los sitios de mayor expresión de LPL. Goti et al. (2002) mostraron que el contenido de αtocoferol en el cerebro de ratones knockout LPL fue inferior que en ratones control, sugiriendo el transporte de α-tocoferol asociado a lipoproteínas y quilomicrones por parte de LPL. En este trabajo, la adición de α-tocoferol en los grupos de animales alimentados con concentrado con VE produce una sobreexpresión de LPL en los primeros días de consumo de pienso (VE10D). Aunque los resultados no son significativos se observa que la expresión de VE10D es 2.80 y 1.92 veces mayor que los grupos T y VE30d, respectivamente. Este efecto, fue encontrado para los genes ABCA1, LPL, y SCARB1 en músculo y grasa subcutánea para el mismo modelo animal utilizado en este trabajo en yeyuno (González-Calvo et al., 2013), y podría explicarse como una regulación por un mecanismo de retroalimentación (“feedback”) negativo del α-tocoferol sobre la expresión de este gen. Kawahara et al. (2008) y Lobo et al. (2010) describieron un efecto de retroalimentación negativa de la vitamina D sobre la expresión del gen PTH, y de la vitamina A sobre los genes BCMO1 y SCARB1. Además, las rutas metabólicas encargadas de la síntesis y captación de una gran variedad de moléculas esenciales y cofactores de vitaminas en bacterias están regulados mediante retroalimentación negativa (Lai, 2003). Finalmente, SCARB1 ha sido relacionado con la captación a nivel intestinal de α-tocoferol, y Major et al. (2011) encontraron una asociación significativa entre un SNP del gen SCARB1 (rs11057830) y los niveles plasmáticos de αtocoferol en humanos. En nuestro estudio se observa un efecto similar al encontrado para LPL pero con una expresión mayor en los animales del tratamiento VE20d, para posteriormente volver a disminuir la expresión en los animales del tratamiento VE30D. 49 En nuestro estudio, es destacable la menor expresión de los genes en los animales alimentados con alfalfa (Figura 3), siendo las diferencias significativas entre tratamientos para los genes LPL (VE10d-A) y SCARB1 (VE20d-A), y encontrando tendencias para LPL (VE30d-A) y ABCA1 (VE20d-A) (Figura 3). Mengual et al. (2011) en un trabajo en el que estudiaban el efecto de la adición de β-carotenos sobre el transcriptoma de ratones salvajes (“wild type”) y ratones knockout para BCMO1 describieron un efecto de disminución de la expresión de un 87% de los genes en el grupo en ratones salvajes que se les había adicionado β -carotenos con respecto a los que no. Además, este mismo efecto fue encontrado en el gen LPL por estos mismos autores, siendo esto consistente con lo encontrado en nuestro trabajo. En nuestro estudio, la menor expresión de los diferentes genes fue encontrada en el tratamiento 1, grupo A, que continuamente pastaban alfalfa que es rica en carotenos y vitamina E, sugiriendo un posible efecto de inhibición de la expresión en los animales alimentados con alfalfa mediado por los carotenos. Los resultados de esta Tesis máster demuestran que el α-tocoferol no es solo un antioxidante, sino que actúa también como regulador de la expresión génica , ya sea bien a través de factores nucleares y de transcripción (Eggermont, 2006) o mediante la activación directa de los genes. En este proyecto se ha realizado una primera aproximación a la detección de genes diferencialmente expresados en yeyuno de ovino asociados a la inclusión de diferentes niveles de vitamina E en la dieta mediante la metodología de gen candidato. 56 Colomer, F., Morand Fehr, P., Kirton, A.H., Delfa, R. y Sierra, I.1988. Métodos normalizados para el estudio de los caracteres cuantitativos y cualitativos de las canales caprinas y ovinas. MAPA. Cuadernos INIA, 17, 41 pp. Debusk RM, Fogarty CP, Ordovas JM, Kornman KS. Nutritional Genomics in Practice: Where Do We Begin? J Am Diet Assoc. 2005.105: 589-598. Dufrasne I., Marche C., Clinquart A., Hornick J.L., Van Eenaeme C., Istasse L., 2000. Effects of dietary vitamin E supplementation on performance and meat characteristics in fattening bulls from Belgian Blue breed. Livest. Prod. Sci, 65:197-201. Eggermont E. 2006. Recent advances in vitamin E metabolism and deficiency. Eur J Pediatr, 165(7):429-34. Enser, M., K. G. Hallett, B. Hewett, G. A. 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