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DETERMINACIÓN DE PLATA EN MUESTRAS BIOLÓGICAS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON ATOMIZACIÓN ELECTROTÉRMICA Y SOLUBILIZACIÓN CON HIDRÓXIDO DE TETRAMETILAMONIO A UTOR : A NORO L ÓPEZ , S ILVIA D IRECTOR : F ERNÁNDEZ C ASTEL , A NGÉLICA Z ARAGOZA , SEPTIEMBRE DE 2013 UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Escuela de Ingeniería y Arquitectura PROYECTO FIN DE CARRERA INGENIERÍA QUÍMICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA Mi más sincero agradecimiento a la Dra. Angélica Fernández Castel, directora de este proyecto, por el tiempo dedicado en la realización del mismo y por brindarme la posibilidad de repetir junto a ella la experiencia de un Proyecto Fin de Carrera. A todos los compañeros que han estado a mi lado estos años, “IQ’s” y “peritos”. Sin vosotros esto no habría sido lo mismo. Al grupo GEAS (Grupo de Espectroscopía Analítica y Sensores), por hacerme sentir como en casa desde el primer día. A mi familia y amigos, por su paciencia y comprensión durante todos estos maravillosos años. DETERMINACIÓN DE PLATA EN MUESTRAS BIOLÓGICAS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON ATOMIZACIÓN ELECTROTÉRMICA Y SOLUBILIZACIÓN CON HIDRÓXIDO DE TETRAMETILAMONIO RESUMEN El objetivo del presente proyecto es la determinación de plata en tejidos procedentes de ratas, a las que se les ha suministrado nanopartículas de plata por vía oral, con una ingesta controlada. En dicho estudio hay grupos control y grupos a los que se les ha proporcionado una dosis, durante diferentes periodos de tiempo. La instrumentación que se va a utilizar es la espectrometría de absorción atómica electrotérmica, que proporciona la sensibilidad necesaria para la determinación del orden de 0,1 a 1,5 mg/kg de plata, consiguiendo con ello los bajos límites de detección requeridos para poder determinar la concentración de plata en algunas de las muestras. Se trabajará con tubos de grafito pirolizados con plataforma e inyector automático para la introducción de todas las disoluciones en el espectrómetro Perkin-Elmer AAnalyst 300 con HGA 800. Se pondrá a punto el equipo, que lleva varios años sin ser utilizado y se optimizarán los parámetros instrumentales y analíticos para la determinación de plata en dichas muestras. Para validar el método, se llevará a cabo todo el procedimiento con una muestra certificada, que ponga de manifiesto la fiabilidad de los resultados obtenidos. ÍNDICE ÍNDICE INGENIERÍA QUÍMICA i INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................... 1 E SPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA ELECTROTÉRMICA ................................................................................... 2 Programa de calentamiento de la cámara ......................................................................................................... 3 Modificantes de matriz ...................................................................................................................................... 4 Interferencias ..................................................................................................................................................... 4 Lámparas de cátodo hueco ................................................................................................................................ 5 OBJETIVOS ............................................................................................................................................. 6 EXPERIMENTAL ...................................................................................................................................... 8 M ATERIALES ..................................................................................................................................................... 9 E QUIPOS .......................................................................................................................................................... 9 R EACTIVOS Y DISOLUCIONES ................................................................................................................................. 9 P UESTA EN FUNCIONAMIENTO DEL EQUIPO ........................................................................................................... 10 O PTIMIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS INSTRUMENTALES Y ANALÍTICOS DEL EQUIPO ...................................................... 12 T RATAMIENTO DE LA MUESTRA .......................................................................................................................... 16 R ESULTADOS EXPERIMENTALES ........................................................................................................................... 16 Análisis de muestras ........................................................................................................................................ 19 Heces .................................................................................................................................................... 21 Muestras certificadas ........................................................................................................................... 25 Hígados y riñones ................................................................................................................................. 28 CONCLUSIONES .................................................................................................................................... 31 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................................... 34 ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................................ 36 ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................................................. 38 ANEXOS ............................................................................................................................................... 40 A NEXO A. ....................................................................................................................................................... 41 A NEXO B. ....................................................................................................................................................... 47 INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN INGENIERÍA QUÍMICA 2 El presente proyecto se enmarca dentro de la investigación realizada por el grupo GEAS (Grupo de Espectroscopía Analítica y Sensores), que a su vez se encuentra integrado en el IUCA (Instituto Universitario de Investigación en Ciencias Ambientales de Aragón). En la investigación previa a la realización de este Proyecto Fin de Carrera, en colaboración con la Universidad de Montpellier (Francia) [1], se analizaron muestras procedentes de ratas a las que se les había suministrado colargol (polvo granulado formado por proteínas y nanopartículas de plata) con una ingesta controlada. En dicho estudio hay grupos control (T) y grupos a los que se les ha proporcionado una dosis durante diferentes periodos de tiempo (C). El análisis se realizó mediante digestión ácida y posterior determinación con ICP-MS siendo para ello necesario un tratamiento con ácido nítrico y clorhídrico, en varias etapas, que incluyen evaporación a sequedad, redisolución, centrifugación y disolución final con ácido clorhídrico o la utilización de horno microondas. Todo ello supone un largo procedimiento que conlleva riesgos de pérdidas y contaminación o la preparación de un pequeño número de muestras cada vez. Para subsanar estos problemas se propone la utilización de hidróxido de tetrametilamonio y cisteína (estabilizante de Ag(I) por formación de complejos) con el fin de solubilizar la muestra y tras agitar 24 horas llevarla a volumen final con Triton X-100. Con ello se pretende reducir de manera sustancial, la manipulación de la muestra y los problemas derivados, pudiendo llevar a cabo el procedimiento con un mayor número de muestras. La instrumentación que se va a utilizar es la espectrometría de absorción atómica electrotérmica. ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA ELECTROTÉRMICA La espectrometría de absorción atómica electrotérmica o en cámara de grafito (GFAAS), se ha convertido en los últimos años en una técnica reconocida, principalmente por su elevada sensibilidad la cual permite tomar medidas en el orden de picogramos (10 -12 g). Sin embargo, también ha adquirido cierta reputación por tratarse de una técnica que presenta cierto nivel de dificultad. Como resultado de su elevada sensibilidad, se presentan ciertos problemas tales como la contaminación por elementos externos. Los contaminantes pueden introducirse en las muestras desde distintas fuentes, como los propios modificantes empleados en el análisis, los distintos reactivos o incluso el material de laboratorio contaminado. Todo esto hace que esta técnica sea, en algunas ocasiones, poco recomendable en comparación con otras técnicas analíticas. INTRODUCCIÓN INGENIERÍA QUÍMICA 3 P ROGRAMA DE CALENTAMIENTO DE LA CÁMARA La elección tanto de las temperaturas como de las rampas y tiempos de calentamiento constituyen un paso crítico en el análisis. El programa de calentamiento de la cámara se divide normalmente en cuatro etapas las cuales se describen a continuación: • Etapa de secado: en esta etapa tiene lugar la evaporación del disolvente de tal manera que sólo quede la materia sólida en la plataforma del tubo. Si el líquido alcanza la temperatura de ebullición, salpicará las paredes del tubo dando lugar a resultados erróneos. La duración de esta etapa se elige en función del volumen de muestra introducido (se suelen tomar valores típicos de 30 segundos). • Etapa de calcinación: el objetivo de la etapa de calcinación es el de eliminar los componentes que forman la matriz de tal forma que sólo quede el analito en la superficie de la plataforma. La eliminación de estos componentes minimizará las posibles interferencias químicas que puedan tener lugar en la medida. Se suelen tomar temperaturas elevadas que se encuentren por debajo de la temperatura de volatilización del analito y tiempos en un rango de 10 a 60 segundos para esta etapa en función de la naturaleza de los componentes de la matriz. La etapa de calcinación es la más crítica en el programa de calentamiento de la cámara por tanto debe optimizarse con especial cuidado. • Etapa de atomización: una vez completada la fase de calcinación, lo único que queda en la plataforma del tubo es el analito normalmente en forma de óxido junto con otros óxidos tales como óxidos de calcio y magnesio los cuales no se han eliminado en la etapa anterior. Se calienta el tubo a la temperatura necesaria para atomizar el analito y el espectrómetro registra la señal de absorbancia. Esto constituye la etapa de atomización. Es importante que el tubo alcance la temperatura en el menor tiempo posible consiguiendo así la rápida atomización del analito generando una nube de átomos que maximiza la sensibilidad analítica. Esta etapa suele durar en torno a 2 segundos siendo raro encontrar tiempos superiores a 6 segundos cuando se utilizan medidas de áreas de pico. • Etapa de limpieza: en la última etapa del programa de calentamiento de la cámara se eliminan los residuos que puedan quedar en el tubo. La temperatura y el tiempo de esta etapa dependen de la naturaleza de la muestra aunque normalmente se suele escoger una INTRODUCCIÓN INGENIERÍA QUÍMICA 4 temperatura de 2500°C o 100°C mayor que la temperatura de atomización. Las temperaturas superiores a 2800°C podrían dañar el tubo y disminuir su tiempo de vida. M ODIFICANTES DE MATRIZ El término “modificante de matriz” se refiere al proceso de adición de un determinado reactivo a la muestra con el fin de modificar el comportamiento térmico de la matriz, o en algunos casos, el del propio analito. Existen distintos tipos de modificantes de matriz con funciones específicas tales como: • Estabilizar el analito en la etapa de calcinación permitiendo el uso de una temperatura de calcinación más elevada. • Convertir la matriz en compuestos más volátiles que permitan su fácil eliminación en la etapa de calcinación. • Retardantes del proceso de atomización del analito permitiendo la estabilización de las condiciones isotérmicas dentro del tubo de grafito, las cuales, en el caso de utilizar un tubo con plataforma, podrían dar lugar a interferencias en la fase vapor [2]. I NTERFERENCIAS Existen dos tipos de interferencias en los métodos de absorción atómica: 1. Interferencias espectrales: se producen cuando la absorción de una especie que interfiere se solapa o aparece muy próxima a la absorción del analito, siendo imposible su resolución por parte del monocromador o por la presencia de partículas procedentes de la atomización que dispersan la radiación incidente de la fuente. 2. Interferencias químicas: se deben a diversos procesos químicos que pueden ocurrir durante la atomización y que alteran las características de absorción del analito. Algunos ejemplos son la formación de compuestos de baja volatilidad, reacciones de disociación, reacciones de ionización, etc [3]. EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 11 Figura 3. Capilar mal alineado Figura 4. Capilar mal alineado Figura 5. Capilar correctamente alineado En la figura 3 el capilar está demasiado elevado, la muestra no se depositará correctamente en el tubo. En la figura 4 el capilar está demasiado bajo, la muestra no se depositará correctamente en el tubo. La figura 5 muestra la correcta alineación del capilar. Posteriormente se carga el método de análisis desde la biblioteca que proporciona el programa. Se rellenan los datos requeridos correspondientes al elemento a analizar (longitud de onda, rendija, volumen de muestra a introducir, programa de temperaturas, concentración de los patrones para las rectas de calibrado, etc.) y por último se colocan los viales con las disoluciones en el carro móvil del automuestreador, teniendo siempre en cuenta la numeración, ya que habrá que indicarla en el programa. Figura 6. Interfaz del programa AA WinLAb EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 12 Todas las medidas de absorbancia obtenidas en este proyecto se expresan en área de pico obtenida del valor medio de tres medidas consecutivas restando el valor del blanco y con corrección de ruido de fondo empleando una lámpara de deuterio. OPTIMIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS INSTRUMENTALES Y ANALÍTICOS DEL EQUIPO Como paso previo a la primera optimización del programa de calentamiento de la cámara, se realizaron varias medidas de absorbancia de una disolución de ácido nítrico al 0,2% con el fin de eliminar posibles impurezas internas en el equipo ya que llevaba varios años sin ser utilizado. Una vez realizada esta etapa, se preparó una disolución de 100 μg/L de plata (a partir de la disolución patrón de 1000 mg/L de Ag) en ácido nítrico al 0,2% para llevar a cabo la optimización del programa de calentamiento. Se seleccionaron los siguientes parámetros instrumentales y temperaturas iniciales una vez consultadas distintas fuentes bibliográficas [4-7]. Tabla 1. Parámetros instrumentales Intensidad de la lámpara (mA) 10 Longitud de onda (nm) 328,1 Rendija (nm) 0,7 Tipo de tubo Pirolizado sin plataforma Volumen de inyección (μL) 20 Tabla 2. Programa de calentamiento inicial Etapa Temperatura (°C) Rampa (s) Tiempo (s) Medida (*) 1 150 15 20 N 2 1000 15 30 N 3 1800 0 3 S 4 2500 1 3 N (*) La medida de absorbancia no se realiza en las etapas 1,2 y 4 (N). Solamente en la etapa de atomización interrumpiendo el paso de argón (S). Fijando las temperaturas de las etapas 2, 3 y 4, se probaron distintas temperaturas para la etapa 1. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 3. EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 13 Tabla 3. Resultados en función de la variación de la temperatura de calentamiento. Temperatura (°C) Absorbancia 130 0,154 150 0,196 180 0,137 200 0,141 210 0,133 230 0,129 Tomando como temperatura de calentamiento óptima 150°C y fijando los valores de temperaturas de las etapas 3 y 4, se optimizó la temperatura de la etapa 2. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 4. Tabla 4. Resultados en función de la temperatura de calcinación Temperatura (°C) Absorbancia 800 0,265 900 0,276 1000 0,254 1100 0,031 Tomando como temperatura óptima de calcinación 900°C y fijando el valor de la temperatura de la etapa 4, se optimizó la temperatura de la etapa 3. Los resultados se muestran en la tabla 5. Tabla 5. Resultados en función de la variación de la temperatura de atomización Temperatura (°C) Absorbancia 1800 0,276 1900 0,295 2000 0,347 2100 0,275 La temperatura de la etapa de limpieza se mantuvo en 2500°C al no observar interferencias en las medidas posteriores. La tabla 6 muestra los resultados finales obtenidos. EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 14 Tabla 6. Programa de calentamiento con temperaturas optimizadas Etapa Temperatura (°C) Rampa (s) Tiempo (s) Medida 1 150 15 20 N 2 900 15 30 N 3 2000 0 3 S 4 2500 1 3 N Una vez optimizadas las temperaturas del programa de calentamiento, al día siguiente se optimizaron las rampas y tiempos de las distintas etapas con el objetivo de reducir la duración del tiempo de análisis de cada muestra. Las tablas 7-11 muestran los resultados obtenidos. Tabla 7. Resultados obtenidos en función de la variación del tiempo de la etapa 1 Etapa Temperatura (°C) Rampa (s) Tiempo (s) Absorbancia 1 150 15 15 0,278 15 20 0,295 2 900 15 30 3 2000 0 3 4 2500 1 3 Tabla 8. Resultados obtenidos en función de la variación de la rampa de la etapa 1 Etapa Temperatura (°C) Rampa (s) Tiempo (s) Absorbancia 1 150 10 20 0,277 15 20 0,295 20 20 0,245 2 900 15 30 3 2000 0 3 4 2500 1 3 Tabla 9. Resultados obtenidos en función de la variación del tiempo de la etapa 2 Etapa Temperatura (°C) Rampa (s) Tiempo (s) Absorbancia 1 150 15 20 2 900 10 30 0,253 15 30 0,295 3 2000 0 3 4 2500 1 3 EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 15 Tabla 10. Resultados obtenidos en función de la variación de la rampa de la etapa 2 Etapa Temperatura (°C) Rampa (s) Tiempo (s) Absorbancia 1 150 15 20 2 900 15 25 0,275 15 30 0,295 3 2000 0 3 4 2500 1 3 Los tiempos y rampas de las etapas 3 y 4 se mantuvieron con los valores iniciales al no observarse variaciones significativas en las medidas de absorbancia. Una vez introducidos los componentes que forman la matriz de la muestra, se sustituyó el tubo de grafito pirolizado por uno nuevo con plataforma y se llevó a cabo una segunda optimización del programa de calentamiento con una disolución de 10 μg/L de plata, que se encuentra dentro del rango lineal para este elemento, al observarse interferencias junto al pico característico de la señal de absorbancia en el análisis de muestras control como muestra la siguiente figura: Figura 7. Interferencia obtenida en el análisis de muestras control Se elevó la temperatura de atomización a 2200°C, temperatura a la cual el segundo pico desaparecía. Durante el análisis de las muestras certificadas se comprobó con una tercera optimización que no existían cambios significativos en las señales de absorbancia obtenidas, por tanto se mantuvo el programa de calentamiento anteriormente seleccionado con una temperatura de atomización de 2200°C. A continuación se muestra el programa optimizado en la tabla 11. EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 16 Tabla 11. Programa de calentamiento optimizado Etapa Temperatura (°C) Rampa (s) Tiempo (s) Medida 1 150 15 20 N 2 900 15 30 N 3 2200 0 3 S 4 2500 1 3 N TRATAMIENTO DE LA MUESTRA Para el tratamiento de la muestra se preparan dos disoluciones: • Disolución de cisteína al 0,5% (w/w): disolviendo 0,25 g de cisteína en agua ultrapura hasta una masa total de disolución de 50 g. • Disolución de Tritón X-100 al 10% (w/w): disolviendo 5 g de Tritón X-100 en agua ultrapura hasta una masa total de disolución de 50 g. Se pesan aproximadamente 100 mg de muestra en un tubo de plástico y se añaden 2 mL de TMAH comercial al 25% (w/w) y 500 μL de disolución de cisteína. Se mantiene en agitación durante 24 horas y se añaden 50 μL de disolución de Tritón X-100 y 20 μL de disolución patrón de Pd de 10000 mg/L (modificante de matriz recomendado en bibliografía [8]). Finalmente se añade agua ultrapura hasta una masa total de 10 g [9-10]. RESULTADOS EXPERIMENTALES Una vez optimizado el programa de calentamiento de la cámara se preparó una recta de calibrado de concentraciones comprendidas entre 1 y 20 μg/L de plata en ácido nítrico al 0,2% (sin introducir el medio en el que se encuentra la muestra). Con los valores de las concentraciones de los patrones introducidos en el programa AA WinLab, se calculan de forma automática los volúmenes necesarios para la preparación de los distintos patrones a partir de la disolución del blanco y de una disolución de 20 μg/L de plata. La disolución del blanco está compuesta por una disolución de ácido nítrico al 0,2% y para la preparación de la disolución de 20 μg/L de plata se prepara una disolución intermedia de 1 mg/L de plata en un matraz de 10 mL a partir de la disolución patrón de 1000 mg/L de plata. El volumen que se toma de la disolución patrón de 1000 mg/L de plata se calcula de la siguiente forma: EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 17 ó ×  = ó ×  1000/ × () = 1/ × 10000 ()= 10 El volumen que habrá que tomar de dicha disolución para preparar la disolución de 20 μg/L de plata en un matraz de 10 mL se calcula de la siguiente forma: 1000/ × () = 20/ × 10000 ()= 200 A la disolución de 20 μg/L se le adicionan 20 μL de HNO 3 concentrado. Finalmente se enrasa con agua ultrapura. Con ambas disoluciones ya colocadas en los viales del carro móvil y el espectrómetro en funcionamiento, se realiza la medida de absorbancia de los distintos patrones. Los resultados obtenidos son los siguientes: Tabla 12. Datos de la recta de calibrado Concentración (μg/L) Absorbancia SD RSD (%) 1,00 0,003 5x10 -4 14,14 5,00 0,016 0,002 13,50 10,00 0,032 0,006 17,55 15,00 0,046 0,009 20,42 20,00 0,072 0,004 6,00 Blanco 0,000 0,001 103,07 Figura 8. Recta de calibrado y = 0,0035x - 0,0018 r = 0,9932 0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 0,070 0,080 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 Absorbancia Concentración (μg/L) EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 18 Límite de detección = 3 × % = 3 × 0,001 0,0035 = 0,857 / Donde: s = desviación estándar del blanco = 0,001 m = sensibilidad = pendiente de la recta de calibrado = 0,0035 L /μg Límite de cuantificación = 10 × % = 10 × 0,001 0,0035 = 2,857 / Donde: s = desviación estándar del blanco = 0,001 m = sensibilidad = pendiente de la recta de calibrado = 0,0035 L /μg Se preparó una segunda recta de calibrado, de forma análoga a la explicada anteriormente, como paso previo al análisis de muestras control para comprobar el correcto alineamiento del capilar del automuestreador tras sustituirse el antiguo por uno nuevo. Los resultados obtenidos se muestran a continuación: Tabla 13. Datos de la recta de calibrado Concentración (μg/L) Absorbancia SD RSD (%) 1,00 0,006 0,001 22,01 5,00 0,035 0,005 12,99 10,00 0,086 0,005 5,50 15,00 0,132 0,006 4,33 20,00 0,169 0,003 1,96 Blanco 0,005 9x10 -4 18,86 EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 19 Figura 9. Recta de calibrado Límite de detección = 3 × % = 3 × 0,0009 0,0088 = 0,307 / Donde: s = desviación estándar del blanco = 0,0009 m = sensibilidad = pendiente de la recta de calibrado = 0,0088 L /μg Límite de cuantificación = 10 × % = 10 × 0,0009 0,0088 = 1,023 / Donde: s = desviación estándar del blanco = 0,0009 m = sensibilidad = pendiente de la recta de calibrado = 0,0088 L /μg A NÁLISIS DE MUESTRAS En este apartado se presentarán los resultados obtenidos de los análisis de muestras certificadas y muestras procedentes de heces, riñones e hígados de ratas control y experimentales especificando las fechas de análisis. Las rectas de calibrado para el análisis de las muestras se prepararon a partir de una disolución de blanco y una disolución de 20 μg/L de plata. y = 0,0088x - 0,0045 r = 0,9984 0,000 0,030 0,060 0,090 0,120 0,150 0,180 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 Absorbancia Concentración (μg/L) EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 20 Para la preparación de la disolución de 20 μg/L de plata se prepara una disolución intermedia de 1 mg/L de plata en un matraz de 10 mL a partir de la disolución patrón de 1000 mg/L de plata. El volumen que se toma de la disolución patrón de 1000 mg/L de plata se calcula de la siguiente forma: ó ×  = ó ×  1000/ × () = 1/ × 10000 ()= 10 El volumen que habrá que tomar de dicha disolución para preparar la disolución de 20 μg/L de plata en un tubo de plástico graduado de 10 mL se calcula de la siguiente forma: 1000/ × () = 20/ × 10000 ()= 200 A la disolución de 20 μg/L de plata y a la disolución del blanco se les adicionan 2 mL de disolución comercial de TMAH (25% w/w), 500 μL de disolución de cisteína al 0,5%, 50 μL de disolución de Tritón X100 al 10% y 20 μL de disolución de Pd de 10000 mg/L para que se encuentren en el mismo medio que la muestra. Finalmente se añade agua ultrapura hasta un peso de disolución de 10 g. Una vez tratada la muestra se observó un residuo en el fondo del tubo (mayor para el caso de las heces) por lo que resultó necesaria la utilización de un equipo de ultrasonidos para la medida directa de la suspensión. Con el espectrómetro en funcionamiento, se colocan las disoluciones del blanco y la disolución de 20 μg/L de plata (preparadas siempre el día del análisis) junto con la muestra en los viales del carro móvil del automuestreador. Las muestras se agitan durante 5 segundos utilizando la sonda de ultrasonidos antes de ser introducidas al tubo de grafito y se realizan las medidas de absorbancia. Figura 10. Equipo de ultrasonidos EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 27 Tabla 22. Resultados de las concentraciones de las muestras 3 y 4 preparadas el día 21/2/2013 y 5 y 6 preparadas el día 27/2/2013 Muestra Concentración (μg/L) SD RSD (%) Concentración (μg/g) 3 (DOLT-4) (*) 9,16 0,176 1,92 0,907 ± 0,018 4 (DOLT-4) (*) 8,46 0,103 1,22 0,830 ± 0,010 5 (DOLT-4) (*) 9,92 0,250 2,52 0,875 ± 0,025 6 (DOLT-4) (*) 8,47 0,115 1,36 0,839 ± 0,011 (*)Muestras agitadas. Tabla 23. Datos de la recta de calibrado del día 22/3/2013 Recta de calibrado Concentración (μg/L) Absorbancia SD RSD (%) 1,00 0,026 0,001 3,14 3,00 0,071 0,001 1,33 5,00 0,117 0,005 4,10 10,00 0,225 0,004 2,00 15,00 0,332 0,002 0,75 Blanco 0,008 5x10 -4 5,66 Figura 16. Recta de calibrado del día 22/3/2013 Límite de detección = 3 × % = 3 × 0,0005 0,0218 = 0,069 / Donde: s = desviación estándar del blanco = 0,0005 m = sensibilidad = pendiente de la recta de calibrado = 0,0218 L /μg y = 0,0218x + 0,0056 r = 0,9998 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 Absorbancia Concentración (μg/L) EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 28 Límite de cuantificación = 10 × % = 10 × 0,0005 0,0218 = 0,229 / Donde: s = desviación estándar del blanco = 0,0005 m = sensibilidad = pendiente de la recta de calibrado = 0,0218 L /μg Tabla 24. Resultados de las medidas de las muestras 7 y 8 preparadas el día 20/3/2013 Muestra Peso de muestra (g) Absorbancia SD RSD (%) 7 (DOLT-4) 0,1044 0,211 0,002 1,02 7 (DOLT-4) 0,1044 0,204 0,001 0,49 7 (DOLT-4) 0,1044 0,214 0,002 0,88 8 (DOLT-4) 0,1011 0,205 0,002 1,00 Tabla 25. Resultados de las concentraciones de las muestras 7 y 8 preparadas el día 20/3/2013 Muestra Concentración (μg/L) SD RSD (%) Concentración (μg/g) 7 (DOLT-4)(*) 9,42 0,099 1,05 0,905 ± 0,010 7 (DOLT-4)(**) 9,10 0,046 0,50 0,874 ± 0,005 7 (DOLT-4)(***) 9,54 0,086 0,91 0,917 ± 0,009 8 (DOLT-4) 9,16 0,094 1,03 0,906 ± 0,009 (*)Sobrenadante de la muestra sin agitación. (**)Muestra agitada una vez eliminado el sobrenadante. (***) Muestra completa agitada. En el anexo A se muestran algunas de las señales obtenidas a partir del análisis de muestras certificadas (figuras 22-25). Hígados y riñones El tratamiento de las muestras de hígados y riñones es el mismo que para las heces encontrando en este caso un menor residuo. Las medidas se realizaron por duplicado siempre que la cantidad de muestra lo permitía. En las tablas y figuras que aparecen a continuación se muestran los resultados del análisis de muestras de hígados y riñones procedentes de ratas control (T) y ratas experimentales (C). EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 29 Tabla 26. Datos de la recta de calibrado del día 17/4/2013 Recta de calibrado Concentración (μg/L) Absorbancia SD RSD (%) 1,00 0,023 0,001 3,55 3,00 0,072 0,002 2,35 5,00 0,126 0,001 0,75 10,00 0,269 0,006 2,20 15,00 0,392 0,004 0,94 Blanco 0,005 0,002 44,03 Figura 17. Recta de calibrado del día 17/4/2013 Límite de detección = 3 × % = 3 × 0,002 0,0267 = 0,225 / Donde: s = desviación estándar del blanco = 0,002 m = sensibilidad = pendiente de la recta de calibrado = 0,0267 L /μg Límite de cuantificación = 10 × % = 10 × 0,002 0,0267 = 0, 750 / Donde: s = desviación estándar del blanco = 0,002 m = sensibilidad = pendiente de la recta de calibrado = 0,0267 L /μg y = 0,0267x - 0,0053 r = 0,9996 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400 0,450 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Absorbancia Concentración (μg/L) EXPERIMENTAL INGENIERÍA QUÍMICA 30 Tabla 27. Resultados de las medidas de las muestras 9-15 preparadas el día 16/4/2013 Muestra Peso de muestra (g) Absorbancia SD RSD (%) Hígados 9 (T45 2L) 0,1026 0,008 0,001 17,68 10 (T45 2L) 0,1039 0,003 0,002 77,06 11 (C45 5L) 0,1007 0,293 0,011 3,90 12 (C45 5L) 0,1018 0,266 0,029 10,80 Riñones 13 (T45 2L) 0,0600 0,004 0,001 34,02 14 (C45 4L) 0,0672 0,159 0,004 2,35 15 (C45 5L) 0,0659 0,152 0,002 1,55 Tabla 28. Resultados de las concentraciones de las muestras 9-15 preparadas el día 16/4/2013 Muestra Concentración (μg/L) SD RSD (%) Concentración (μg/g) Hígados 9 (T45 2L)(*) 0,498 0,053 10,63 0,033 ± 0,005 10 (T45 2L) (*) 0,298 0,077 25,79 0,029 ± 0,008 11 (C45 5L) 11,18 0,428 3,83 1,112 ± 0,043 12 (C45 5L) 10,17 1,077 10,59 1,002 ± 0,108 Riñones 13 (T45 2L) (*) 0,336 0,047 13,91 0,056 ± 0,005 14 (C45 4L) 6,154 0,140 2,28 0,918 ± 0,014 15 (C45 5L) 5,879 0,088 1,50 0,893 ± 0,009 (*)Las concentraciones obtenidas de las muestras 9, 10 y 13 se encuentran por debajo del límite de cuantificación. En el anexo A se muestran las señales obtenidas de algunas de las muestras procedentes de hígados y riñones (figuras 26-29). En un estudio anterior llevado a cabo con cerebro y bazo de las mismas ratas y mediante ICP-MS, se obtuvieron los siguientes resultados. Tabla 29. Resultados del análisis de muestras de cerebros y bazos mediante ICP-MS Muestra Concentración (μg/g) Cerebros T45 2L 0,041 ± 0,000 C45 4L 2,258 ± 0,007 C45 5L 2,875 ± 0,009 Bazos T45 2L 0,020 ± 0,001 C45 4L 2,757 ± 0,136 C45 5L 4,439 ± 0,184 CONCLUSIONES CONCLUSIONES INGENIERÍA QUÍMICA 32 En este proyecto se pretende determinar la concentración de plata en muestras biológicas mediante espectrometría de absorción atómica electrotérmica y solubilización en hidróxido de tetrametilamonio. A continuación se detallan las conclusiones obtenidas: - La puesta a punto realizada del espectrómetro Perkin-Elmer AAnalyst 300 con HGA 800 permite en un futuro el análisis de muestras siguiendo la misma metodología empleada en este proyecto. - El tratamiento de la muestra llevado a cabo es disolución de 100 mg de muestra en 2 mL de TMAH comercial al 25% (w/w) y 500 μL de disolución de cisteína manteniendo agitación durante 24 horas y posterior adición de 50 μL de disolución de Tritón X-100 y 20 μL de disolución patrón de Pd de 10000 mg/L añadiendo finalmente agua ultrapura hasta una masa total de 10 g. Con ello se ha conseguido determinar directamente la plata de la suspensión obtenida, sin separar previamente el residuo, introduciendo en el tubo de grafito la muestra agitada. - Los resultados obtenidos del análisis de muestras control de heces adicionando distintas concentraciones de plata muestran la presencia de plata en la muestra original en una concentración de 0,044 ± 0,037 μg/g. - Los resultados obtenidos del análisis de muestras certificadas con una concentración de plata de 0,93 ± 0,07 μg/g, ponen de manifiesto la validez del método empleado para el análisis de muestras habiéndose obtenido una concentración media de 0,911 ± 0,009 μg/g. - En las medidas realizadas a partir del sobrenadante no se observan variaciones de concentración significativas en comparación con los resultados obtenidos del análisis de la muestra completa obteniéndose una variación de 0,012 ± 0,007 μg/g en una concentración inicial de 0,917 ± 0,009. Sin embargo, se recomienda para futuros análisis mediante espectrometría de absorción atómica electrotérmica la utilización de un sistema de agitación de muestra mediante ultrasonidos como paso previo a la medida de absorbancia de la misma. - Del estudio realizado respecto a la variación de concentración de plata frente al tiempo en las muestras certificadas se observa una disminución de concentración respecto a una CONCLUSIONES INGENIERÍA QUÍMICA 33 concentración inicial de 0,911 ± 0,009 μg/g sin observarse una variación significativa entre 12 y 18 días. - Para finalizar, destacar la importancia de poder medir la suspensión que se obtiene al agitar la muestra tratada e introducida directamente en la cámara de grafito con los resultados avalados por la muestra certificada. A continuación se presenta un resumen de los resultados obtenidos, donde aparecen los valores medios y la desviación estándar calculada como la raíz cuadrada de la suma de las desviaciones estándar al cuadrado, dividido por el número de réplicas. Tabla 30. Tabla resumen de resultados de muestras control de heces HECES Muestra Fecha de preparación Fecha de análisis Concentración original (μg/L) Concentración original (μg/g) T' 30 1' 7/2/2013 8/2/2013 0,460 0,044 ± 0,037 Tabla 31. Tabla resumen de resultados de muestras certificadas MUESTRAS CERTIFICADAS Muestra Concentración experimental (μg/g) DOLT-4 0,911 ± 0,009 Tabla 32. Tabla resumen de resultados de muestras certificadas (concentración en función del tiempo) Muestra Concentración inicial Concentración t=12 días (μg/g) Variación (μg/g) 5 DOLT-4 0,911 ± 0,009 0,857 ± 0,020 0,054 ± 0,016 6 DOLT-4 Muestra Concentración inicial Concentración t=18 días (μg/g) Variación (μg/g) 3 DOLT-4 0,911 ± 0,009 0,868 ± 0,015 0,043 ± 0,012 4 DOLT-4 Tabla 33. Tabla resumen de resultados de muestras de hígados y riñones HÍGADOS Y RIÑONES Muestra Concentración (μg/g) Hígados (T45 2L) 0,031 ± 0,007 (C45 5L) 1,057 ± 0,082 Riñones (T45 2L) 0,056 ± 0,005 (C45 4L) 0,918 ± 0,014 (C45 5L) 0,893 ± 0,009 BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA INGENIERÍA QUÍMICA 35 [1] R. Ebabe Elle; S. Gaillet; J.Vidé ; C. Romain; C. Lauret; N. Rugani; J.P. Cristol; J.M. Rouanet. “Dietary exposure to silver anoparticles in Sprague-Dawley Rats: silver distribution, effects on oxidative stress and inflammation”. 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Santos; Rafael A. de Sousa; Solange Cadore; Ramon M. Barnes; Mark Tatro. “Sample preparation in alkaline media”. Spectrochimica Acta Part B 61 (2006), pp. 465-495. ÍNDICE DE TABLAS ANEXOS INGENIERÍA QUÍMICA 43 Figura 22. Señal obtenida de la muestra certificada 3 preparada el día 21/2/2013 Figura 23. Señal obtenida de la muestra certificada 4 preparada el día 21/2/2013 ANEXOS INGENIERÍA QUÍMICA 44 Figura 24. Señal obtenida de la muestra certificada 5 preparada el día 27/2/2013 Figura 25. Señal obtenida de la muestra certificada 6 preparada el día 27/2/2013 ANEXOS INGENIERÍA QUÍMICA 45 Figura 26. Señal obtenida para la muestra 10 (hígado T45 2L) Figura 27. Señal obtenida para la muestra 11 (hígado C45 5L) ANEXOS INGENIERÍA QUÍMICA 46 Figura 28. Señal obtenida para la muestra 14 (riñón C45 4L) Figura 29. Señal obtenida para la muestra 15 (riñón C45 5L) ANEXOS INGENIERÍA QUÍMICA 47 ANEXO B. ANEXOS INGENIERÍA QUÍMICA 48 ANEXOS INGENIERÍA QUÍMICA 49 ANEXOS INGENIERÍA QUÍMICA 50