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Trabajo Fin de Máster EFECTO DEL GENOTIPO MITOCONDRIAL SOBRE LA COMPOSICIÓN DEL PLASMALEMA NEURONAL, LA SINAPTOGENÉSIS Y LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Autor/es Alba Pesini Martín Director/es Eduardo Ruiz Pesini Julio Montoya Villaroya Facultad de Veterinaria 2013 I ABREVIATURAS Aß: Proteína β-amiloide ACh: Acetilcolina AD: Enfermedad de Alzheimer BSA: Albúmina sérica bovina CI, CIII y CIV: Complejos I, III, y IV CDP-colina: 5’ - citidina difosfato colina CNS: Sistema nervioso central CNTF: Factor Neurotrófico Ciliar CTP: Citidina trifosfato D: Células diferenciadas DAG: Diacilglicerol DHO: Dihidroorotato DHODH: Enzima dihidroorotato deshidrogenasa DMHA: Dimetil-hexil-amina DMSO: Dimetilsulfóxido EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético ETC: Cadena de transporte de electrones FBS: Suero fetal bovino Glc : Glucosa MNGIE: Encefalopatía neurogastrointestinal mitocondrial MS: Espectrometría de masas mtDNA: DNA mitocondrial NaN3: Azida sódica II nDNA: DNA nuclear OXPHOS: Sistema de fosforilación oxidativa PBS: Tampón fosfato salino PBS-T: Tampón fosfato salino con Tween PC: Fosfatidilcolina Q: Coenzima Q RA: Ácido Retinoico ROS: Especies de oxígeno reactivas SD: Células sin diferenciar TH: Tirosina hidroxilasa U: Uridina UMP: Uridina monofosfato UPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento UTP: Uridina trifosfato VAChT: Transportador vesicular de acetilcolina ρ0: Células rho0 III RESUMEN La enfermedad de Alzheimer (AD) se define como un proceso neurodegenerativo del sistema nervioso central (CNS). Esta patología se caracteriza por la pérdida de memoria, cambios de comportamiento y confusión, dejando a los pacientes completamente inválidos. Este tipo de procesos mentales dependen del correcto funcionamiento de las redes neuronales. En el caso del AD son las neuronas colinérgicas las que se ven afectadas. Las conexiones neuronales vienen dadas por la correcta sinaptogénesis, y para ello necesitan la producción de neuritas, elongaciones de la membrana plásmatica de la propia célula. Los principales compuestos de la membrana celular son los fosfátidos. Este tipo de molécula necesita para su formación la participación del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la enzima dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH). La combinación de ambos factores da lugar al nucleósido de pirimidina, uridina, precursor de los fosfátidos. Un fallo en la cadena respiratoria de la mitocondria produciría como consecuencia el de la DHODH y una disminución de los niveles de uridina celulares. Se ha observado en diferentes estudios que la administración de uridina y compuestos relacionados (CDP-colina, CTP, UTP) producían una mejoría en pacientes de AD. El estudio de la inhibición de estos dos factores, el sistema OXPHOS y la DHODH, podría explicar el papel de la mitocondria en la formación de la membrana celular y las conexiones neuronales que se ven dañadas con la AD. IV ABSTRACT Alzheimer's disease (AD) is defined as a neurodegenerative disorder of the central nervous system (CNS). This disease is characterized by memory loss, behaviour changes and confusion, leaving patients completely invalid. This type of mental processes depends on the proper function of neural networks. Cholinergic neurons are affected in AD. Neuronal connections depend on a correct synaptogenesis, and to that end, they need the production of neurites, which consist in elongation of the plasma membrane of the cell itself. The main compounds of the cell membrane are phosphatides. These molecules require from a correct OXPHOS system and dihidroorotate dehydrogenase (DHODH) activity. The combination of these factors leads to the pyrimidine nucleoside production, uridine, a precursor of phosphatides. A failure in the mitochondrial respiratory chain would produce the inhibition of DHODH and would decrease cellular uridine levels. It has been observed that the administration of uridine and related compounds (CDP-choline, CTP, UTP) produced an improvement in AD patients. The study of these two factors inhibition, OXPHOS system and the DHODH, could explain the role of mitochondria in the cell membrane formation and neuronal connections that are damaged in AD. V ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN……………………………………………......………………… 1 1. Enfermedad de Alzheimer………………………………………………......…….... 1 2. Papel del sistema OXPHOS en la enfermedad de Alzheimer……………......…….. 2 3. Papel del sistema OXPHOS en la neuritogénesis…………………………......……. 7 3.1. Formación de la membrana celular……………………………………….....….. 7 3.2. Uridina y la enzima dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH)……........……… 9 II. OBJETIVOS………………………………………………………....….………... 11 III. METODOLOGÍA………………………………………………….....…………. 12 1. Líneas celulares………………………………………………………....………… 12 2. Medios de cultivo………………………………………………………....………. 12 3. Condiciones de cultivo celular…………………………………………....………. 12 4. Reactivos…………………………………………………………….……....…….. 13 5. Procedimientos de cultivo celular………………………………………….....…… 13 6. Diferenciación neuronal de la línea SH-SY5Y…………………………….....…… 13 -Diferenciación neuronal............................................................................................. 13 -Células SH-SY5Y con uridina y azida sódica........................................................... 14 -Diferenciación a neurona colinérgica........................................................................ 14 7. Diferenciación celular de la línea NT2..................................................................... 15 8. Análisis de la viabilidad celular en presencia de azida sódica................................. 15 9. Detección de proteínas por citometría de flujo......................................................... 16 VI 10. Análisis de proteínas mediante Western Blot........................................................... 17 -Extracción de proteínas totales de células de cultivo................................................ 17 -Cuantificación de proteínas por espectofotometría. Método de Bradford................ 17 -Preparado de las muestras para la carga en el gel..................................................... 18 -Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS................................................... 19 -Transferencia a membrana PVDF............................................................................. 20 -Análisis de proteínas por inmunotrasferencia. Western-blot..................................... 20 11. Análisis de proteínas por microscopía de fluorescencia......................................... 21 12. Determinación de orotato, dihidroorotato (DHO), UMP, UDP Y UTP de fibroblastos..................................................................................................................... 23 -Separación cromatográfica........................................................................................ 23 -Método de separación................................................................................................ 24 -Método de detección.................................................................................................. 24 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................ 25 1. Diferenciación neuronal de la línea SH-SY5Y......................................................... 25 -Diferenciación a fenotipo morfológico neuronal...................................................... 25 -Viabilidad neuronal................................................................................................... 27 2. Análisis de la formación de neuritas en presencia o ausencia de uridina................. 29 3. Análisis de la formación de neuritas en presencia o ausencia de uridina y/o azida sódica.............................................................................................................................. 31 -Viabilidad celular en presencia de azida sódica........................................................ 31 VII 4. Diferenciación de la línea SH-SY5Y a neurona colinérgica...................................... 34 -Análisis de la morfología neuronal........................................................................... 34 -Análisis de marcadores neuronales........................................................................... 35 -Análisis de marcadores colinérgicos......................................................................... 36 -Comprobación de la diferenciación de tipo colinérgico............................................ 37 5. Diferenciación de la línea NT2 a neurona colinérgica............................................. 39 -Análisis de la morfología neuronal........................................................................... 39 -Análisis de marcadores neuronales........................................................................... 40 -Análisis de marcadores colinérgicos......................................................................... 40 -Comprobación de la diferenciación de tipo colinérgico............................................ 41 6. Extracción de orotato, DHO, UMP, UDP y UTP de fibroblastos............................ 43 V. CONCLUSIONES................................................................................................... 46 VI. REFERENCIAS..................................................................................................... 47 I. INTRODUCCIÓN 1 I. INTRODUCCIÓN 1. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER La enfermedad de Alzheimer (AD) es un síndrome neurodegenerativo progresivo del sistema nervioso central (CNS) [1]. Se caracteriza principalmente por la pérdida de memoria, la apatía y la depresión, que son los primeros síntomas, y posteriormente también pueden aparecer alteraciones en el juicio, cambios de comportamiento, desorientación y confusión, y dificultad para tragar, hablar y caminar, lo que convierte a los enfermos en personas totalmente dependientes [2]. La AD es hoy en día la causa más común de demencia, ocupando entre un 60 y un 70% de los casos. A nivel mundial, casi 35,6 millones de personas padecen demencia, cifra que se duplicará en el 2030 (65,7 millones) y triplicará para el 2050 (115,4 millones). El tratamiento y el cuidado de personas con demencia cuesta actualmente al mundo más de 604 mil millones de dólares al año (Organización Mundial de la Salud). La AD es una de las mayores causas de muerte, siendo la sexta en Estados Unidos [2]. Se han identificado varias características patológicas en la AD, entre las que se incluyen la aparición de placas causadas por la agregación de un fragmento de la proteína β-amiloide (Aß) y ovillos neurofibrilares asociados con la fosforilación irregular de la proteína tau [1]. Uno de los hallazgos más consistente en la AD es la degeneración de las neuronas colinérgicas (y la disminución de los niveles de acetilcolina, ACh) del cerebro anterior basal, que ofrecen una amplia inervación para el hipocampo y la corteza cerebral [3]. I. INTRODUCCIÓN 8 Al tratar células con uridina se vio que los niveles intracelulares de CTP, UTP y CDP-colina aumentaban [19]. También se observó que el tratamiento con uridina extracelular aumentaba el crecimiento de neuritas y de sus ramificaciones en células diferenciadas y mostraban una mejora significativa en el número de neuritas al compararlas con células diferenciadas en ausencia de uridina. Se advirtió que el tratamiento, en estas mismas células diferenciadas, con uridina mejoraba la expresión de los neurofilamentos 70 (70 kD) y M (145 kD) en comparación con células sin tratamiento. Estas proteínas de neurofilamentos forman parte de la composición de las neuritas, por lo que un aumento de éstas significaría un aumento en el número de neuritas [18]. Diferentes estudios han demostrado que el tratamiento de animales simultáneamente con precursores de fosfátido presentes en la sangre y de formación endógena (uridina y colina) o derivados de alimentos (colina y ácidos grasos omega-3), puede tener varios efectos: aumento de fosfátidos en el cerebro, proteínas sinápticas, crecimiento de neuritas, y formación de espinas dendríticas [20]. Este tratamiento también mejora la cognición y la liberación de algunos neurotransmisores del cerebro en los animales [21, 22]. Apoyando esta idea se realizó otro estudio en el que se trataba ratones modelos de la enfermedad de Alzheimer con PN401. Esta substancia es un neuroprotector y se trata de un profármaco de uridina. En el estudio se vio una significativa mejoría en comparación con los ratones no tratados. Asimismo se determinó que la uridina (dependiendo de la dosis) protegía a las células de la hipoxia química, disminuía la formación de especies de oxígeno reactivo y de los daños en el mtDNA debidos al peróxido de hidrógeno [23]. Por otra parte, la administración de los precursores fosfatídicos (junto con nutrientes adicionales de apoyo) mejora significativamente la cognición en un período inicial en los pacientes con AD leve [24]. I. INTRODUCCIÓN 9 3.2. Uridina y la enzima dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH) La uridina es una pirimidina. Las pirimidinas tienen dos vías a través de las cuales se sintetizan: la vía de síntesis de novo y la vía de recuperación. La enzima DHODH (dihidroorotato deshidrogenasa) cataliza el cuarto paso en la biosíntesis de novo. Esta enzima convierte el dihidroorotato (DHO) en orotato, este se convierte en uridina monofosfato (UMP) y este a su vez en uridina trifosfato (UTP). La DHODH es la única enzima en esta ruta de biosíntesis de pirimidina que se encuentra en la membrana interna de la mitocondria. El resto de enzimas se encuentran en el citosol. DHODH cataliza la oxidación de DHO en orotato mediante la transferencia de electrones a la ubiquinona, molécula de la cadena respiratoria. Por lo tanto DHODH se apoya en la ubiquinona, formando de este modo un enlace funcional entre la cadena respiratoria mitocondrial y la biosíntesis de pirimidina (Figura 4). Figura 4. Relación entre la enzima DHODH y el sistema OXPHOS e implicación de ambos elementos en la síntesis de fosfatidilcolina. I. INTRODUCCIÓN 10 La inhibición del C III produce una inhibición de la enzima DHODH, y esto provocó una disminución en la producción de pirimidinas [25, 26]. Esta conexión entre la enzima DHODH y el sistema OXPHOS suscitó la posibilidad de que el déficit observado en el C IV pudiera disminuir el flujo electrónico de la cadena respiratoria y con ello el correcto funcionamiento de la DHODH, con lo que se vería afectado la síntesis de orotato, UTP y CTP, afectando así la producción de la fosfocolina y demás componentes de la membrana celular que forman parte de las dendritas de una neurona. II. OBJETIVOS 11 II. OBJETIVOS La AD es una enfermedad mental en la que, entre otros muchos signos, se produce un fallo en las conexiones neuronales (sobre todo de neuronas colinérgicas). Nuestra hipótesis sería que esta carencia podría ser consecuencia de una falta de síntesis de membrana plasmática debido a una deficiencia en el sistema OXPHOS de la mitocondria que resultaría en la ausencia de pirimidinas en el medio, imprescindibles para una correcta neuritogénesis. Los objetivos propuestos para este trabajo fin de máster para comprobar nuestra hipótesis serían:  Cultivo y diferenciación a neuronas colinérgicas de líneas celulares tumorales humanas. o Línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y o Línea celular de teratocarcinoma NT2  Estudio del efecto de la inhibición del C III y C IV de la cadena respiratoria sobre los niveles de DHO, orotato y nucleótidos de pirimidina.  Análisis del papel del sistema OXPHOS sobre el número y longitud de neuritas de las neuronas colinérgicas y sobre los niveles de proteínas del citoesqueleto que contribuyen a la producción de estas neuritas. III. MATERIAL Y MÉTODOS 12 III. MATERIAL Y MÉTODOS 1. LÍNEAS CELULARES Se utilizaron dos líneas celulares diferentes. Por un lado se trabajó con células de neuroblastoma SH-SY5Y, y por el otro con la línea celular de teratocarcinoma NT2. 2. MEDIOS DE CULTIVO  Suero fetal bovino (FBS) (GIBCO) 500 ml  Suero dializado (GIBCO) 500ml  Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium: High glucose (25mM) (SIGMA) 500 ml  Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium: Low glucose (5 mM) (SIGMA) 500 ml 3. CONDICIONES DE CULTIVO CELULAR El cultivo celular se realizó en placas de 150 y 100 cm2, y en placas de 12 y 6 pocillos (TPP). El material de vidrio se esterilizó previamente en un autoclave (Raypa®) y las disoluciones agregadas al cultivo fueron filtradas con filtros de 0,22 µm (TPP). Las manipulaciones se llevaron a cabo en una campana de flujo laminar vertical (Holten LaminiAir HB 2448) y bajo condiciones estériles. El medio se cambió cada 2-3 días y las células se cultivaron en un incubador a 37ºC y con un 5% de CO2 (modelo DHD AutoFlow Incubator de Nuaire). Ambas líneas celulares, tanto en mantenimiento como en proceso de diferenciación, fueron cultivas en ausencia de antibióticos. III. MATERIAL Y MÉTODOS 13 4. REACTIVOS  Ácido Retinoico (RA) (Sigma)  Colesterol (Sigma)  Uridina (Sigma)  Fluoro-deoxyuridine (Sigma)  Cytosine arabinoside (Sigma)  Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF) (Invitrogen)  Azida Sódica (NaN3) (Sigma) 5. PROCEDIMIENTOS DE CULTIVO CELULAR Tanto para las células SH-SY5Y como para las NT2 lo primero que se hizo fue crear un pool de células para poder trabajar con ellas a lo largo del proyecto. Las células se cultivaban en medio rico en glucosa suplementado con 10% de FBS. Cuando las células llegaban a un 80% de confluencia se doblaban. Para ello se tripsinizaban, añadiendo 2 mL de tripsina al 0,25% y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 0,53 mM. Tras la tripsinización se le adicionaba una cantidad de medio mayor (4 mL) a la añadida de tripsina, se recogían, centrifugaban 5 min a 1400 rpm (Beckman Coulter Allegra™ X – 22, rotor S x 4250) y resuspendían en el medio requerido para su distribución en varias placas. En el caso de la congelación el pellet celular se resuspendió en medio suplementado con un 20% de FBS y un 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma). 6. DIFERENCIACIÓN NEURONAL DE LA LÍNEA SH-SY5Y -Diferenciación neuronal Para obtener una diferenciación neuronal general las células se sembraron en placas de 100 cm2 a una cantidad de aproximadamente 250.000 células por placa. Se trataron con medio DMEM (de alta y baja glucosa) con 10% de FBS o 10% de Suero Dializado y ácido retinoico 10 µM durante una semana. III. MATERIAL Y MÉTODOS 14 -Células SH-SY5Y con Uridina y Azida Sódica Tras haber conseguido la diferenciación neuronal de las SH-SY5Y, éstas fueron sometidas a diferentes tratamientos con uridina y/o azida sódica (Sigma). Las células se cultivaron durante una semana con diferentes tratamientos:  200 µM Uridina  1 µM Azida Sódica  5 µM Azida Sódica  10 µM Azida Sódica  200 µM Uridina y 1 µM Azida Sódica  200 µM Uridina y 5 µM Azida Sódica  200 µM Uridina y 10 µM Azida Sódica -Diferenciación a neurona colinérgica Las células se sembraron en placas de 100 cm2 con una densidad de 250.000 células por placa. Para la diferenciación se siguió un protocolo previamente descrito [27]. Las células se trataron con RA a una concentración de 10 µM durante una semana. Posteriormente se levantaron con tripsina para ser sembradas de nuevo pero esta vez en placas con matrigel. Estas placas deben ser preparadas con anterioridad, tanto el gel, ECMgel (Sigma), como todo el material empleado (falcons, puntas, pipetas y placas) debe estar a una temperatura de aproximadamente 4ºC. Tras la elaboración del gel, se dejó que alcanzara paulatinamente una temperatura de 37ºC y una vez llegada a ella se sembraron las células. Sobre las placas con matrigel las células se cultivaron durante otra semana más con un medio que contenía, además del RA a 10 µM, colesterol a una concentración de 10 µg/ml (Sigma). III. MATERIAL Y MÉTODOS 15 7. DIFERENCIACIÓN CELULAR DE LA LÍNEA NT2 Para la diferenciación de las NT2 de nuevo se usó un protocolo ya existente en el que se buscaba una diferenciación a neurona de tipo colinérgica [28]. Las células se sembraron en placas de 150 cm2 con una densidad de 400.000 células por placa. Se cultivaron con medio de glucosa alta suplementado con FBS al 10% y RA 10 µM durante un mes. Cumplido el mes se realizó una tripsinización selectiva y las células se sembraron en placas de 100 cm2 con poly-D-lysina (Becton Dickinson) en una concentración de entre 1 y 2 millones de células por placa. Tras la siembra en poly-Dlysina, las células fueron cultivadas durante una semana con medio de alta glucosa y 10% FBS al que se le añadió los inhibidores mitóticos uridina (10 µM), cytosinearabinoside (1 µM) y fluoro-deoxyuridine (10 µM), además del factor CNTF (20 ng/ml). 8. ANÁLISIS DE LA VIABILIDAD CELULAR EN PRESENCIA DE AZIDA SÓDICA Para ver el efecto de la droga sobre la viabilidad celular, cultivamos a lo largo de 5 días la línea celular SH-SY5Y con azida sódica (NaN3). Se siembran 10.000 células por pocillo en varias placas de 12 pocillos con diferentes concentraciones de NaN3 (1 µM, 5 µM y 10 µM), además de unos pocillos de control sin la droga. Cada 24 horas se recoge una placa. A las células recogidas (tratamiento con trypLE™ Express, gibco® Life Technologies) se les realiza un contaje (Contess™ automated cell counter de Invitrogen™) y con los datos recogidos a lo largo de toda la semana se realiza la curva de viabilidad. III. MATERIAL Y MÉTODOS 16 9. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS POR CITOMETRÍA DE FLUJO Tras la diferenciación, se tripsinizaron y recogieron las células. Se lavaron con PBS y fijaron con formaldehido al 4% durante 15 minutos a 4ºC. Una vez fijadas se volvieron a lavar con tampón fosfato salino (PBS) y se centrifugaron 5 minutos a 4500 rpm (centrifuga Eppendorf modelo 5415R, rotor F45-24-11). El pellet celular se resuspendió en 100 µL de saponina al 0,1%, BSA al 5% y el anticuerpo primario y se dejó incubar a 4ºC durante toda la noche. Los anticuerpos primarios empleados fueron anti-beta-III-tubulina, anti-transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) y antitirosina hidroxilasa (TH) (Tabla 1). Después de la incubación se lavó con PBS y se centrifugó (5 min a 4500 rpm). Se añadió el anticuerpo secundario de igual modo que el primario, con 100 µL de saponina al 0,1% y BSA al 5%. En este caso la incubación fue de 1 hora a temperatura ambiente y protegido de la luz. Tras la incubación las muestras fueron de nuevo lavadas con PBS, centrifugadas (5 min a 4500 rpm) y resuspendidas en PBS para analizarlas. El anticuerpo secundario que se utilizo fue Alexa fluor 488 (Tabla 1) que se excita a 488 nm y emite a 530 nm por lo que el canal que se empleo fue el canal FL1 del citómetro. Tabla 1. Anticuerpos primarios y secundarios utilizados en citometría de flujo Anticuerpo Tipo Características Dilución Proveedor Anti-Beta-IIITubulina Ac. 1º Policlonal conejo 1µg/ml Abcam AntiTransportador vesicular de acetilcolina (VChaT) Ac. 1º Policlonal conejo 1:100 Abcam Anti-Tirosina Hidroxilasa (TH) Ac. 1º Policlonal conejo 1:200 Sigma Alexa Fluor 488 Ac. 2º Policlonal cabra 1:1000 Sigma III. MATERIAL Y MÉTODOS 17 10. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS MEDIANTE WESTERN BLOT -Extracción de proteínas totales de células en cultivo Tras someter las células a diferentes tratamientos, se tripsinizaron y recogieron. Las muestras se centrifugaron a 1400 rpm durante 5 minutos (Beckman Coulter Allegra™ X – 22, rotor S x 4250). El pellet celular obtenido se lavó con 1 ml de PBS y se volvió a centrifugar. El nuevo pellet se resuspendió en tampón de lisis RIPA: 50 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, 0,5% deoxicolato de sodio, 5 mM EDTA y 1% de Tritón X100. Para favorecer la acción del detergente en la rotura de las membranas celulares se incubaron en una noria giratoria 15 minutos a 4ºC y para eliminar los restos celulares se centrifugaron también a 4ºC, a 13000 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante que quedó se congeló a -80ºC hasta su uso. -Cuantificación de proteínas por espectofotometría. Método de Bradford La cuantificación de proteínas es una etapa previa a la carga de las mismas en gel. Con ella obtenemos la cantidad de proteínas totales presentes en un homogenado celular. Cuantificamos las proteínas presentes en la muestra por un método colorimétrico basado en la realización de una recta patrón con una concentración de proteína conocida. Se utilizó la albúmina sérica bovina (BSA) y se trabajó con una absorbancia de 595 nm (Figura 5). Figura 5. Representación gráfica de una determinación de proteínas por el método de Bradford. Recta de calibrado: concentraciones de BSA frente a absorbacia a 595 nm. III. MATERIAL Y MÉTODOS 24 -Método de separación: -Por gradiente a un flujo de 0.4 ml/min. Se usa como solvente A (orgánico): DMHA 5mM + acetonitrilo 50% (v/v); solvente B (acuoso): DMHA 5mM ajustdo a pH 7 con ácido fórmico. -El método de separación empieza con 100% de B. De 0 a 4,7 min pasa de 100% a 20% de B (de 0% a 80% de A. De 4,7 a 4,8 min pasa de 20% a 100% de B. De 4,8 a 6,1 min (fin) isocrático con 100% de B. -Método de detección Espectrometría de masas en tándem Equipo: Acquity UPLC-Xevo™ TQ Mass Spectrometer (Waters) Método de detección: Multiple Reaction Monitoring con electrospray negativo. Las condiciones de ionización para cada componente son las siguientes (Tabla 6): Compuesto m/z ión padre m/z ión hijo Voltaje de cono (V) Energía de colisión (eV) Ác. orótico 154,48 41,97 14 20 DHO 156,55 113,02 20 10 UMP 322,78 96,95 26 18 UDP 402,71 158,9 28 30 UTP 482,71 158,91 34 32 Tabla 6. Condiciones de ionización IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. DIFERENCIACIÓN NEURONAL DE LA LÍNEA SH-SY5Y -Diferenciación a fenotipo morfológico neuronal Para realizar los experimentos de este proyecto necesitamos trabajar con células diferenciadas a neuronas. La principal característica que distingue las células sin diferenciar de las neuronas consiste en la producción de neuritas. Se considera neurita cualquier expansión del soma de una neurona, ya sea una dendrita o un axón (Figura 6). Figura 6. A y B. Células indiferenciadas si la formación de neuritas. C y D. Células diferenciadas a neuronas con la formación de neuritas (señalas con las flechas rojas). IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 26 Para obtener una diferenciación neuronal las células se trataron tan solo con RA a una concentración de 10 µM. Se estudió también si la cantidad de glucosa o de uridina en el medio influía a la hora de obtener una diferenciación morfológica. En el caso de la glucosa, las células se cultivaron con dos medios diferentes: de alta y de baja concentración de glucosa (25 y 5 mM). Y para la uridina, el medio se suplemento con un 10% de FBS (que contiene uridina) o suero dializado (sin uridina). Con los cuatro tipos de tratamiento se observa que las células obtenían un fenotipo neuronal, es decir, mostraban neuritas (Figura 7). Figura 7. Células tratadas con RA. A. Células en medio con glucosa 5 mM y FBS. B. Células en medio con glucosa 5 mM y suero dializado. C. Celulas en medio con glucosa 25 mM y FBS. D. Células en medio con glucosa 25 mM y suero dializado. Las células, a una concentración fisiológica de glucosa (5 mM) pueden usar la vía de novo de síntesis de pirimidinas y formar neuritas durante la diferenciación a neurona. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 27 -Viabilidad neuronal Una vez diferenciadas en las cuatro condiciones, las células se mantuvieron en cultivo durante una semana para ver durante cuánto tiempo permanecían diferenciadas. Con el tiempo en cultivo, las células van perdiendo progresivamente su morfología neuronal produciéndose el acortamiento y desaparición de neuritas. Las células se mantienen bien diferenciadas hasta los 5 días. Después, las neuritas van disminuyendo hasta que en el día 10 post-diferenciación a pesar de que sigue habiendo células diferenciadas la mayor parte de las células se han despegado y perdido en los cambios de medio (Figura 8). Figura 8. Viabilidad neuronal. A. Células en medio 5 mM de glucosa y FBS a los 2 dias (A1), 5 días (A2), 7 días (A3) y 11 días (A4). B. Células en medio 5 mM de glucosa y suero dializado. C. Células en medio 25 mM de glucosa y FBS. D. Células en medio 25 mM y suero dializado. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 28 Tras estos dos análisis deducimos que el uso de medio de baja glucosa y con suero dializado no supone un impedimento para la diferenciación neuronal, por lo que para el resto de pruebas donde sea necesaria la utilización de células con morfología neuronal utilizamos este tipo de medio. Ya que de esta manera no le administramos glucosa en exceso y la concentación se acerca más a la fisiológica (4 – 8 mM). En el caso de la uridina, al no añadirla al medio, provocamos que la única vía de obtención de pirimidinas necesarias para la formación de la membrana celular sea por la síntesis de novo. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 29 2. ÁNALISIS DE LA FORMACIÓN DE NEURITAS EN PRESENCIA O AUSENCIA DE URIDINA Para estudiar con más exactitud si la presencia o ausencia de uridina tenía repercusión a la hora de la síntesis de neuritas fue necesaria la utilización de un marcador. Se empleó como tal la proteína del Neurofilamento M ya que forma parte del citoesqueleto y su cantidad esta correlacionada con la cantidad de neuritas sintetizadas [18]. Diferenciamos células a neurona creciéndolas con suero dializado o suero dializado con uridina (10 µM) (figura 9). Figura 9. Expresión del Neurofilamento M y la β - actina. A. Western blot. B. Intensidad de las bandas de Neurofilamento M normalizadas con la β - actina. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 30 Como se observa en la figura 9, comprobamos que la diferenciación celular va acompañada de un aumento del Neurofimalento M, ya que las células diferenciadas tienen más membrana plasmática, y por lo tanto más Neurofilamento M. Además, se puede apreciar como existe un aumento en la producción de Neurofilamento M en las células diferenciadas a las que se les añade una dosis de uridina. Esto indica que la administración de uridina mejora la producción de neuritas, lo que en consecuencia provoca una mejora de las conexiones neuronales. De esta manera se podría explicar el porqué del efecto positivo de los tratamientos con uridina y derivados en pacientes con Alzheimer. Por último, también se observa que cultivar las células con diferente concentración de glucosa en el medio afecta a la diferenciación. Las células con medio 5 mM de Glucosa se diferencian más que las células con 25 mM de Glucosa. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 31 3. ÁNALISIS DE LA FORMACIÓN DE NEURITAS EN PRESENCIA O AUSENCIA DE URIDINA Y/O AZIDA SÓDICA La síntesis de los fosfátidos de las neuritas depende de la presencia de uridina. Al no haber uridina en el medio las células tienen que sintetizarla de novo lo cual implica a la DHODH y el sistema OXPHOS. Para observar las consecuencias ante un fallo en esta conexión tratamos las células diferenciadas con azida sódica, un inhibidor del C IV. -Viabilidad celular en presencia de azida sódica Antes de realizar el tratamiento con azida sódica a las células, debemos asegurarnos que las dosis escogidas no son letales para éstas ya que en ese caso los cambios en la cantidad de Neurofilamento M que queremos estudiar se deberían a las muertes producidas. Para asegurarnos de ello realizamos una curva de viabilidad con las diferentes concentraciones de NaN3 utilizadas (1 µM, 5 µM y 10 µM). Realizando un conteo celular a lo largo de 6 días, observamos que la población celular va aumentando día a día con cualquiera de las tres concentraciones (Figura 10). Lo cual indica las dosis escogidas no son letales para las células. Figura 10. Curva de viabilidad de las células SH-SY5Y con concentraciones 1 µM, 5 µM y 10 µM de NaN3. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 32 Cultivamos las células diferenciadas con las tres concentraciones distintas de NaN3, 1 µM, 5 µM y 10 µM, y una segunda tanda con el mismo tratamiento más una dosis de uridina. Al realizar el Western-Blot (Figura 11) observamos como las células diferenciadas cultivadas con NaN3 tienen menos concentración de Neurofilamento M que las diferenciadas sin NaN3, es decir, menos neuritas. Esto podría explicarse debido a que la cadena respiratoria hubiera sido inhibida (por la inhibición del C IV), lo que provocaría que el flujo de electrones a través del sistema OXPHOS se detuviera y por lo tanto la DHODH no podría funcionar dejando de producirse uridina y en consecuencia los fosfátidos de las neuritas. Figura 11. Expresión del Neurofilamento M y la β - actina. A. Western blot. B. Intensidad de las bandas de Neurofilamento M normalizadas con la β – actina: Células cultivadas sin y con NaN3. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 33 De nuevo, también se puede apreciar un aumento en la producción de Neurofilamento M en las células diferenciadas tratadas uridina (Figura 12). Figura 12. Expresión del Neurofilamento M y la β - actina. Intensidad de las bandas de Neurofilamento M normalizadas con la β – actina: Células cultivadas con NaN3 y con y sin uridina. Al realizar esta prueba, observamos que entre las tres concentraciones de azida no hay diferencias en la producción de Neurofilamento M. Lo que si se aprecia es que cuanto mayor es la concentración de azida sódica utilizada, aumenta más la síntesis de Neurofilamento M en las células con uridina, es decir, mayor es la mejoría obtenida del tratamiento con uridina. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 40 -Análisis de marcadores neuronales De nuevo, los cambios morfológicos no son suficientes para confirmar la diferenciación a neurona. Por lo tanto, al igual que con las células SH-SY5Y, realizamos un marcaje con β – III – Tubulina en citometría de flujo. Los datos de citometría nos muestran que ha habido una diferenciación a neurona. Se puede observar como la expresión del marcador aumenta en las células diferenciadas con respecto a las no diferenciadas (Figura 19). Figura 19. Expresión de la β – III – Tubulina en células sin diferenciar (SD) y células diferenciadas (D) en citometría de flujo. -Análisis de marcadores colinérgicos A continuación, analizamos si se trata de una neurona diferenciada hacia tipo colinérgico marcando las muestras con VAChT. En citometría se ve un gran aumento de la intensidad de fluorescencia en las células diferenciadas en contraste con las sin diferenciar y en microscopía de fluorescencia vemos como todas las células expresan el marcador (Figura 20). IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 41 Figura 20. A. Expresión de VAChT en células sin diferenciar (SD) y células diferenciadas (D) en citometría de flujo. B. Expresión del VAChT (en verde) en células diferenciadas por microscopía de fluorescencia. -Comprobación de la diferenciación de tipo colinérgico Con los datos anteriores podríamos apuntar que las células se han diferenciado a neurona colinérgicas pero para corroborarlo realizamos el marcaje con TH. Al pasar las muestras por citometría observamos que las células diferenciadas tienen más intensidad de fluorescencia que las no diferenciadas (aunque no tan marcado como en el caso del VAChT). Y al ver las células diferenciadas por microscopía de fluorescencia se aprecia que la mayoría de estas muestran el marcador (Figura 21). IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 42 Figura 21. A. Expresión de TH en células sin diferenciar (SD) y células diferenciadas (D) en citometría de flujo. B. Expresión del TH (en rojo) en células diferenciadas por microscopía de fluorescencia. Con todos estos datos podemos concluir que realizando este protocolo la línea celular NT2 se diferencia a neurona, pero no podemos asegurar que lo haga hacia ningún tipo neuronal en concreto ya que expresa los marcadores tanto de neurona colinérgica como dopaminérgica. Por lo que debemos seguir poniendo a punto el protocolo. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 43 6. EXTRACCIÓN DE OROTATO, DHO, UMP, UDP y UTP DE FIBROBLASTOS Con el fin de poder observar las consecuencias producidas al inhibir la cadena respiratoria del sistema OXPHOS, y por lo tanto la inhibición de la enzima DHODH, se estudió la forma de analizar los niveles de las moléculas participantes en la reacción de la DHODH (DHO y orotato) y las producidas a partir de ella (UMP, UDP y UTP). En la Unidad de Patologia Mitocondrial y Neuromuscular del Hospital Universitario Vall d'Hebron, Javier Torres Torronteras y Ramón Martí Seves pusieron a punto el protocolo para medir DHO, Orotato, UMP, UDP y UTP mediante cromatografía. Primero se trabajó con un multiestándar para determinar los tiempos para cada molécula. Al pasar el multiestándar 1 µM acuoso con los 5 compuestos se pudo observar claramente en sus correspondientes transiciones, a los siguientes tiempos de retención: Orotato (1.98 min), DHO (1.83 min); UMP (2.77 min); UDP (3.40 min); UTP (3.77 min) (Figura 22 y 23). Figura 22. Cromatogramas del multiestándar de Orotato y Dihidrorotato. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 44 Figura 23. Cromatogramas del multiestándar de UDP, UMP y UTP. Una vez conocidos los tiempos, se analizan los compuestos en un extracto acuoso de una línea de fibroblastos. Los mono-, diy trifosfatos de uridina se detectan bien, mientras que orotato y dihidroorotato no se pueden detectar en sus transiciones correspondientes, lo cual puede deberse a que se transforman muy rápido en el medio convirtiéndose en fosfatos de uridina (Figura 24). IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 45 Figura 24. Cromatogramas de la línea de fibroblastos de orotato, dihidroorotato, UDP, UMP y UTP. Una vez determinados los tiempos de cada molécula y confirmado cuales son posibles medir en células de cultivo, el siguiente paso sería observar las posibles variaciones en células diferenciadas a neuronas con el sistema OXPHOS y la DHODH inhibidos. V. CONCLUSIONES 46 V. CONCLUSIONES  Se consiguió la correcta diferenciación a neurona de tipo colinérgico con la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y, mientras que en la línea celular de teratocarcinoma NT2 se obtuvo una diferenciación a neurona sin poder determinar con exactitud a que fenotipo correspondía.  Se puso a punto la técnica para poder medir los niveles celulares de los nucleótidos de pirimidina mediante cromatografía. El siguiente paso será medir estos niveles en diferentes condiciones de inhibición del C III y C IV de la cadena respiratoria.  Se determinó las distintas concentraciones de neurofilamento M. o Se observó la mayor producción de esta proteína en células diferenciadas, debido a una mayor producción de membrana plasmática necesaria para la síntesis de neuritas. o Se vio como la síntesis de membrana disminuía al inhibir la actividad del sistema OXPHOS y la DHODH con azida sódica. o Se demostró que el tratamiento con uridina mejoraba la producción de neuritogénesis y de esta manera, las conexiones neuronales. De esta manera, a partir de ahora podremos estudiar con más detalle las posibles consecuencias de un fallo del sistema OXPHOS en la neuritogénesis, proceso de vital importancia para la prevención de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer. VI. REFERENCIAS 47 VI. REFERENCIAS 1. Todd J. Eckroat, Abdelrahman S. 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