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ÍNDICE 1 Trabajo Fin de Máster SEGREGACIÓN FAMILIAR DE MUTACIONES EN LOS GENES LPL, LMF1 Y APOA5 EN SUJETOS CON HIPERTRIGLICERIDEMIAS PRIMARIAS ITZIAR LAMIQUIZ MONEO DIRECTORES: DRA. ISABEL DE CASTROORÓS DR. FERNANDO CIVEIRA MURILLO MASTER EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR SEPTIEMBRE 2013 ÍNDICE 2 ÍNDICE ABREVIATURAS pág. 7 INTRODUCCIÓN pág. 9 1. Metabolismo lipídico pág. 9 1.1 Metabolismo de las lipoproteínas pág. 10 1.1.1 Metabolismo de los quilomicrones pág. 10 1.1.2 Metabolismo de las VLDL pág. 13 1.1.3 Metabolismo de las LDL pág. 15 1.1.4 Metabolismo de las HDL pág. 15 1.2 Metabolismo de los Triglicéridos pág. 17 2. Dislipidemias pág. 19 2.1 Hipertrigliceridemia pág. 19 2.2 Fenotipo de la Hipertrigliceridemia pág. 20 2.3 Hipertrigliceridemia y riesgo cardiovascular pág. 21 3. Variantes genéticas asociadas a la Hipertrigliceridemia pág. 22 3.1 Lipoprotein lipasa y triglicéridos pág. 22 3.2 Apolipoproteina AV y los triglicéridos pág. 24 3.3 Factor de la maduración de la Lipasa y los triglicéridos pág. 25 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS pág. 28 MATERIALES Y MÉTODOS pág. 29 1. Descripción de la población de estudio pág. 29 2. Obtención de la muestra pág. 29 3. Obtención del DNA genómico pág. 29 4. Análisis de la concentración y la pureza pág. 29 5. Amplificación por PCR de los genes de estudio pág. 30 5.1 Gen LPL pág. 31 5.2 Gen LMF1 pág. 33 5.3 Gen APOA5 pág. 36 6. Purificación del producto de PCR mediante ExoSap-IT(USB) pág. 38 7. Reacción de secuenciación pág. 38 8. Análisis bioinformático pág. 40 9. Extracción del RNA pág. 40 ÍNDICE 3 10. Obtención del cDNA pág. 41 11. Diseño de los cebadores para la amplificación del cDNA pág. 42 12. Amplificación del cDNA pág. 43 13. Análisis estadístico pág. 43 RESULTADOS pág. 45 1. Características de la población de estudio pág. 45 2. Identificación de las variantes genéticas en el gen LPL pág. 45 2.1 Variantes no comunes del gen LPL pág. 45 2.2 Estudio de las frecuencias genotípicas y alélicas de las variantes comunes del gen LPL pág. 47 2.3 Análisis bioinformático de las variantes en el gen LPL pág. 48 2.4 Análisis funcional de la mutación en la posición c.1018+2 pág. 51 2.4.1 Extracción de RNA pág. 51 2.4.2 Obtención de cDNA pág. 52 2.5 Estudio de la segregación familiar de las mutaciones en LPL pág. 53 3. Identificación de las variantes en el gen LMF1 pág. 54 3.1 Análisis bioinformático de las variantes en el gen LMF1 pág. 56 4. Identificación de las variantes en el gen APOA5 pág. 58 4.1 Análisis bioinformático de las variantes en el gen APOA5 pág. 58 DISCUSIÓN pág. 61 CONCLUSIONES pág. 63 BIBLIOGRAFÍA pág. 64 ÍNDICE 4 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS Figuras INTRODUCCIÓN 1.1 Lipoproteína pág. 10 1.2 Metabolismo de los quilomicrones pág. 11 1.3 Lipólisis periférica de los TG pág. 12 1.4 Aclaramiento hepático de los remanentes pág. 13 1.5 Síntesis hepática de las VLDL pág. 14 1.6 Síntesis y maduración de las partículas de HDL pág. 16 1.7 Catabolismo de HDL hepático pág. 17 1.8 Metabolismo de los TG pág. 19 1.9 Estructura de la lipoprotein lipasa pág. 23 1.10 Papel del Lmf1 en el ensamblaje y maduración de la LpL pág. 26 1.11 Estructura de Lmf1 pág. 27 RESULTADOS 4.1 Esquema del ayuste de LpL pág. 51 4.2 Visualización del gel del producto de PCR del fragmento exón 5-3’UTR del cDNA del gen LPL pág. 52 4.3 Segregación familiar de la mutación c.1018+2G>A pág. 53 4.4 Segregación familiar de la mutación p.Gln133X pág. 53 Tablas INTRODUCCIÓN 1.1 Clasificación de Fredrickson de las dislipemias primarias pág. 21 MATERIAL Y MÉTODOS 3.1 Cantidades y concentraciones de los reactivos utilizados en la reacción de PCR de LPL pág. 31 3.2 Cebadores para la amplificación del gen LPL pág. 32 ÍNDICE 5 3.3 Cantidades y concentraciones de los reactivos utilizados en la reacción de PCR de LMF1 pág. 33 3.4 Cebadores para la amplificación del gen LMF1 pág. 35 3.5 Cantidades y concentraciones de los reactivos utilizados en la reacción de PCR de APOA5 pág. 36 3.6 Cebadores para la amplificación del gen APOA5 pág. 37 3.7 Cantidades de los reactivos en la reacción de secuenciación pág. 38 3.8 Cantidades y concentraciones para la reacción de cDNA pág. 42 3.9 Secuencia y características de los cebadores empleados para la amplificación del fragmento que contiene la mutación c.1018+2G>A pág.42 3.10 Cantidades y concentraciones de los reactivos de la PCR para la amplificación de cDNA pág. 43 RESULTADOS 4.1 Características de la población de estudio pág. 46 4.2 Frecuencias de las variantes raras en el gen LPL encontradas en los sujetos de estudio pág. 47 4.3 Frecuencias genotípicas de las variantes comunes del gen LPL encontrados en sujetos con HTG del estudio pág. 48 4.4 Frecuencias alélicas de los SNPs identificadas en el gen LPL en la población HTG y los 1000 Genomas de la población europea pág. 49 4.5 Análisis bioinformático de las variantes encontradas en el gen LPL pág. 50 4.6 Características del RNA obtenido pág. 52 4.7 Frecuencias de las variantes raras en el gen LMF encontradas en los sujetos de estudio pág. 54 4.8 Frecuencias genotípicas de las variantes comunes del gen LMF1 encontrados en sujetos con HTG del estudio pág. 55 4.9 Frecuencias alélicas de los SNPs identificadas en el gen LMF1 en la población HTG ÍNDICE 6 y los 1000 Genomas de la población europea pág. 56 4.10 Análisis bioinformático de las variantes encontradas en el gen LMF1 pág. 57 4.11 Frecuencias genotípicas de los SNPs del gen APOA5 encontradas en los sujetos del estudio pág. 59 4.12 Frecuencias alélicas de los SNPs identificadas en el gen APOA5 en la población HTG y los 1000 Genomas de la población europea pág. 59 4.13 Análisis bioinformático de las variantes encontradas en el gen APOA5 pág. 60 ABREVIATURAS 7 ABREVIATURAS 2MG: 2 monoacilglicerol AGL: Ácidos Grasos Libres Apo: Apoliproteína APOA5: Gen de la apolipoproteína A-V AVC: Accidente Vascular Cerebral CETP: Proteína transferidora de ésteres de colesterol COP II: Proteína Coatomere II dNTP´s: Desoxirribonucleótidos trifosfato DGAT: Enzima acil-CoA diacilglicerol aciltransferasa ECP: Enfermedad Coronaria Prematura ECV: Enfermedad cardiovascular FL: Fosfolípidos GPIHBP1: glucosil-fosfatidil-inositol anclado a la lipoproteína de alta densidad unida a una proteína 1 HDL: Lipoproteína de elevada densidad IDL: Lipoproteína de densidad intermedia IMC: Índice de Masa Corporal Kb: Kilobases LH: Lipasa hepática LDL: Lipoproteína de baja densidad LMF1: Factor de maduración de la lipasa 1 LPL: Lipoproteína lipasa MTP: proteína microsomal Triglyceride Transfer Protein ABREVIATURAS 8 PDI: proteína disulfito isomerasa PLTP: proteína transferidora de fosfolípidos. QM: Quilomicrón QMr: Quilomicrón remanente RE: Retículo Endoplasmático SNP: polimorfismo de un solo nucleótido TG: triglicéridos TRLs: lipoproteínas ricas en triglicéridos VLDL: lipoproteína de muy baja densidad INTRODUCCIÓN 9 INTRODUCCIÓN En la actualidad, las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en los países desarrollados y se considera que seguirá siendo en el futuro. La Organización Mundial de la Salud registró que en el año 2008 murieron por esta causa 17,3 millones de personas, representando un 30% de todas las muertes registradas en el mundo. Se calcula que en 2030 morirán cerca de 23,3 millones de personas por ECV, sobre todo por cardiopatías e ictus y se prevé que sigan siendo la principal causa de muerte. Una de las principales causas de las enfermedades cardiovasculares es la alteración del metabolismo lipídico, produciendo acumulación de lípidos a nivel arterial y la formación de placa de ateroma, causantes de cardiopatía isquémica y otros accidentes cardiovasculares 1. Los lípidos plasmáticos son aportados por la dieta mediante absorción intestinal y por la síntesis endógena a nivel hepático. En el torrente sanguíneo, son transportados a lugares de modificación y almacenamiento. El metabolismo lipídico está finamente regulado para mantener el aporte entre las fuentes de aporte y las vías de eliminación (vías metabólicas y de excreción). La alteración de cualquiera de los mecanismos que mantienen la homeostasis produce una alteración en las concentraciones de los lípidos provocando una dislipemia1. 1. Metabolismo lipídico El metabolismo lipídico está finamente regulado por factores genéticos, ambientales y la interacción entre ambos. Todos ellos pueden alterar el metabolismo generando una situación conocida como dislipemia 1. Clínicamente los lípidos más importantes en plasma son los triglicéridos (TG) y el colesterol2. El colesterol juega numerosos papeles: es componente de las membranas celulares, precursor de hormonas esteroideas y de la vitamina D, y es necesario para la activación neuronal, como señal molecular3. El 80% del colesterol es derivado de la síntesis endógena por la HMG-CoA Reductasa y, sólo un pequeño porcentaje proviene de la dieta. Los TG son una llave energética formada por tres ácidos grasos unidos a un glicerol. Son sintetizados en el intestino y en células hepáticas y transportados hacia el plasma. Posteriormente se produce la lipolisis en la superficie endotelial, liberando los ácidos grasos en las células periféricas para su β-oxidación o su almacenaje4. INTRODUCCIÓN 16 La masa lipídica de las HDL proviene, principalmente, de tejidos periféricos, aunque los mecanismos mediante los cuales se produce la lipidación no se conocen en su totalidad. El proceso de maduración de la HDL se realiza por diferentes vías: una parte importante de las HDL nacientes maduran gracias a la lipolisis de partículas ricas en TG, principalmente VLDL y QM. La LpL actúa sobre estas partículas liberando lípidos superficiales, FL y CL. Los productos liberados se unen a las HDL nacientes. Las HDL nacientes también intercambian lípidos con las HDL maduras en un proceso de remodelado mediante la acción de la lipasa hepática (LH), la proteína transferidora de ésteres de colesterol (CETP) y la proteína transferidora de FL (PLTP). Los FL derivados de las VLDL y los QM se transfieren a las HDL a través de la PLTP, pero, para la maduración total de la partícula es necesario que el CL se esterifique y formen el núcleo hidrofóbico característico. El colesterol internalizado en la partícula de HDL es esterificado por la enzima LACT (Lecitina Colesterol Acil Transferasa) 24, que cataliza la transferencia de grupos 2acilo de la lecitina al CL21. Figura1.6: Síntesis y maduración de las partículas de HDL Fosfolípidos, FL; Colesterol no esterificado, CL; Colesterol esterificado, CE. “Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies”. J. Clin. Invest. 2006 El riñón, el hígado y los tejidos esteroidogénicos son los principales sitios implicados en el catabolismo de las HDL. La eliminación de las HDL puede llevarse a cabo bien por captación selectiva de colesterol u otros lípidos de la partícula, o bien por endocitosis y degradación de toda la partícula. INTRODUCCIÓN 17 El colesterol transportado por la HDL se retira principalmente en hígado por medio del receptor Scavenger SR-BI25. Este receptor es capaz de captar selectivamente colesterol, tanto libre como esterificado, pero no apolipoproteínas20. Estudios realizados con este receptor en hepatocitos polarizados, sugieren que SR-BI participa en la internalización de las partículas completas de HDL, la eliminación del colesterol y secreción de partículas HDL delipidadas26. Otro mecanismo clave en la eliminación del colesterol transportado por la HDL es el catalizado por la CETP27, 28. Esta enzima cataliza el intercambio de TG desde las lipoproteínas de baja densidad, LDL, y VLDL por el CE de la HDL, resultando un empobrecimiento de CE y un enriquecimiento en TG de la partícula HDL. Figura 1.7: Catabolismo de las HDL en el hepatocito Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies”. J. Clin. Invest. 2006. 1.2 Metabolismo de los triglicéridos Los niveles de TG en plasma pueden tener un origen endógeno (derivados de dietas ricas en ácidos grasos) o endógenos (provenientes de la síntesis hepática). En el intestino los TG de la dieta son hidrolizados por la lipasa hepática en 2 monoglicerol (2-MN) y ácidos grasos libres (AGL) formando micelas29. Los AGL entran en los enterocitos por medio del transportadores FABP (proteína unida a los ácidos grasos), como los CD36. En su interior los TG son resintentizados de nuevo por medio de la enzima DGAT, estos pueden ser hidrolizados de nuevo por la ACTGL y por lipasa sensible a hormonas4. Posteriormente la MTP media el ensamblaje de los TG a la Apo B-48 y Apo E en un primer paso de formación de los QM. Estos QM se secretan al sistema linfático, después de su secreción los QM adquieren la Apo C-II, Apo CIII, que modulan en plasma el metabolismo de lipoproteínas ricas en TG30. INTRODUCCIÓN 18 Los QM son secretados al sistema linfático, entran en la vena cava y circulan hasta que interactúan con la lipoprotein lipasa (LpL), la secreción de esta enzima depende de LMF1 y está asegurada al endotelio vascular por los proteoglicanos y por GPIHBP14. Los QM contienen Apo A-V, Apo C-II y Apo C-III. Apo C-II es un cofactor necesario para la LpL, mientras que Apo C-III puede interferir con LpL, inhibiéndola4 Ha sido demostrado que Apo A-V mejora la hidrólisis de lipoproteínas ricas en TG (TRL) 31, aunque este mecanismo no está definido completamente. En el hígado, los TG son sintetizados a partir de AGL extraídos del plasma o de AG sintetizados de nuevo. La enzima central para la síntesis de novo de AG es la FAS (Sintetasa de Ácidos Grasos) que cataliza la conversión del Malonyl-CoA a Palmitato. La enzima FAS es inducida por SREBP1 (Sterol Regulatory Element Binding Protein 1), que se auto regula por los AG poliinsaturados, glucosa y la insulina. La MTP hepática media el ensamblaje de TG con los ésteres de colesterol, la Apo B-100 y la Apo E, para formar VLDL32. En el tejido adiposo y los capilares musculares, los TG de los QM y las VLDL son hidrolizados en AGL por la lipasa unida al endotelio vascular. Los AGL son re-esterificados y almacenados en adipocitos o se lleva a cabo la βoxidación de los mismos para obtener energía 32. Los QM se remodelan en partículas pequeñas, densas, de vida corta y ricas en colesterol esterificado, llamadas QMr, y las VLDL convirtiéndose, del mismo modo, en VLDLr (también llamados IDL). Los QMr y algunas IDL son aclarados mediante endocitosis a través de la unión de la Apo E a los receptores LDL y en su ausencia, por los receptores LRP1. IDL puede ser hidrolizado por la LH generando partículas pequeñas ricas en colesterol esterificado, denominadas partículas LDL ricas en CE 32. INTRODUCCIÓN 19 Figura 1.8: Metabolismo de los TG 2. Dislipemias Las dislipemias son un conjunto de patologías caracterizadas por alteraciones en las concentraciones lipídicas plasmáticas. Es un término genérico para denominar cualquier situación clínica en la cual existan concentraciones anormales de colesterol total, colesterol HDL (c-HDL), colesterol LDL (c-LDL) o TG1. 2.1 Hipertrigliceridemia La hipertrigliceridemia (HTG) está definida como la concentración de TG en plasma en ayunas, sin tratamiento previo, por encima del percentil 90 ajustado por sexo y edad en la población (3.0 mmol/l en adultos de edad media) 32. La HTG es una forma común de dislipemia que se encuentra frecuentemente asociada con una enfermedad coronaria prematura. La aparición del evento cardiovascular puede verse adelantada en caso de pacientes fumadores en 5 o 10 años. La hipertrigliceridemia está correlacionada negativamente con la concentración de cHDL33. INTRODUCCIÓN 20 Existen varios trastornos genéticos comunes relacionados con las HTG que pueden generar un evento cardiovascular prematuro (ECP), que incluyen la hiperlipemia familiar combinada (HFC), la dislipemia residual en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 y la hipoalfalipoproteinemiafamilar, pudiendo ser los responsables del 50% de los ECP. En contrapartida, otra forma hereditaria de HTG, la hipertrigliceridemia familiar monogénica no está asociada con ECP3. La obesidad, en particular la troncular, está asociada con un incremento de los niveles de TG, una disminución de los niveles de c-HDL. y resistencia a la insulina, siendo éste el mayor factor que puede contribuir a la dislipemia asociada con la diabetes tipo 234. La HTG secundaria puede deberse a otras anormalidades como la diabetes descontrolada, el consumo de alcohol, hipotiroidismo, enfermedad renal o una infección por el virus de la inmunodeficiencia humana34. 2.2 Fenotipos de las hipertrigliceridemias Los pacientes con HTG presentan un cuadro que puede cursar con xantomas palmares, hepatoesplenomegalia, pancreatitis lipémica, así como la formación de placas de ateroma que suponen un aumento del riesgo de padecer un evento cardiovascular34. La HTG de tipo 1 o hiperquilomicronemia (OMIM 238600), tiene una frecuencia en la población menor a 1:106 suele aparecer en la infancia o adolescencia y se caracteriza por niveles de TG de 1000-10000 mg/dl debidos a deficiencia en la actividad de la LpL o Apo C-II33. Suele ir acompañada de alteraciones cutáneas y oculares, así como pancreatitis recurrente32. Actualmente, se conocen más de 80 variantes disfuncionales en el gen LPL que producen la reducción o eliminación de la actividad LpL, resultando en la acumulación de TRL30. Mutaciones en homocigosis en APOC2 pueden generar un fenotipo similar, ya que codifica para la Apo C-II, un cofactor clave para la LpL. Variaciones en homocigosis que se han demostrado disfuncionales para el gen APOC2 son causantes de variaciones en la actividad de LpL en plasma33. La mayoría de las HTG primarias se diagnostican en adultos, con un rango de TG entre 200 y 2000 mg/dl, principalmente debido a la acumulación de partículas VLDL, que pueden acompañarse o no de QM. Normalmente los pacientes son asintomáticos pero dependiendo del grado de HTG, pueden presentar xantomas eruptivos, lipemia retinalis, hepatomegalia, síntomas focales neurológicos, dolor recurrente epigástrico y pancreatitis35. Apo A-V es una apolipoproteina clave, cuya relación con la HTG fue confirmada con la evidencia de INTRODUCCIÓN 21 triglicéridos altos en ratones knockout (KO) 32. Recientemente, se han identificado mutaciones en los genes LMF1 y GPIBHP1 como causales de este tipo de HTG 10, 11 12,36,42 y 59. Tradicionalmente se ha usado la clasificación Fredrickson (Tabla 1.1) para fenotipar las dislipemias. Actualmente, se ha observado que la frontera entre estos fenotipos no es tan clara, y, en la práctica clínica, las decisiones terapéuticas se basan en el nivel de TG y el contexto asociado a la anormalidad lipídica12. Tabla 1.1: Clasificación de Fredrickson de las dislipemias primarias. Prevalencia en la población Perfil lipídico Variación lipoproteína Variaciones genéticas HLP tipo 1 1:106 TG CT Alto QM con Baja LDL y VLDL Mutaciones en LPL y también en Apo C-II HLP tipo 2A 1:50 CT Alto LDL Mutaciones en Apo B y LDLr HLP tipo 2B 5% TG CT Alto VLDL Alto LDL Mutaciones en Apo B, Apo CIII y USF1. HLP tipo 3 1:104 CT TG Alto CT Alto TG Mutaciones en homocigosis en Apo E HLP tipo 4 5-10% TG CT Alto VLDL No se conoce HLP tipo 5 1:108 CT TG Alto QM Alto VLDL Mutaciones en heterocigosis en LPL en el 5-10% de los casos. HLP: hiperlipoproteinemia. TC: Colesterol total. TG: triglicéridos. LDL: Lipoproteína de baja densidad. VLDL: Lipoproteína de muy baja densidad. LPL: lipoproteína lipasa. Muy elevado (por encima del percentil 99 por edad y por sexo). Elevado (por encima del percentil 95 por edad y sexo). Moderadamente elevado (por encima del percentil 90). 2.3 HTG y el riesgo cardiovascular Una moderada HTG es factor de riesgo independiente para enfermedades arterioescleróticas, particularmente para un evento cardiaco prematuro37, 38. El estudio de cientos de sujetos durante más de 10 años, muestran que un incremento de 1 mmol/l en los niveles de TG plasmáticos incrementan el riesgo de un ECP del 32% al 76%, incluso después de ajustar el cHDL39. Más recientemente, se ha confirmado que concentraciones en plasma de TG en ayunas tienen una fuerte asociación con el riesgo de ECP40, 41. Complejos mecanismos subyacen la asociación TGarterioesclerosis, ya que existen anormalidades metabólicas, como la obesidad, INTRODUCCIÓN 22 la Diabetes Mellitus tipo 2, niveles de c-HDL bajos, concentraciones elevadas de LDL, altos niveles de AGL, la hiperinsulinemia y el incremento de la viscosidad plasmática que pueden estar asociadas con niveles altos de TG. Sin embargo, se ha demostrado que las lipoproteínas ricas en TG (QM y VLDL) y sus remanentes pueden contribuir directamente la formación de la placa de ateroma42. 3. Variantes genéticas asociadas a la hipertrigliceridemia Junto con las influencias ambientales, variantes genéticas comunes y raras pueden determinar las concentraciones de TG en plasma. Identificar genes y variantes genéticas asociadas con la concentración de TG en plasma permite mejorar el entendimiento sobre las vías metabólicas de las lipoproteínas ricas en TG e identificar a los sujetos con alta susceptibilidad al desorden metabólico, lo que permite desarrollar intervenciones terapéuticas para mejorar los niveles de TG, su concentración, disminuyendo así el riesgo de ECP43. El entendimiento de la arquitectura genética, mediante e estudio de todas las variantes genéticas que puedan tener efecto sobre las concentraciones plasmáticas de TG, se ha visto incrementado substancialmente mediante el estudio de los GWAS (Genome Wide Association Study). Los GWAS muestran asociaciones entre variantes genéticas comunes con frecuencias superiores al 1% (polimorfismo de un solo nucleótido o SNPs), y otros rasgos cualitativos y discretos44. Gracias a estos estudios se han identificado nuevas regiones genómicas que pueden relacionarse con los TG para estudios posteriores45-46. Sin embargo, para establecer totalmente la arquitectura genómica de las concentraciones de TG en plasma se requieren experimentos complementarios, incluyendo secuenciación, estudio con modelos animales, estudios de linaje y familiares, funciones celulares y experimentos bioquímicos44. 3.1 Lipoprotein lipasa (LpL) y triglicéridos La existencia de la enzima LpL fue descubierta por primera vez en 194347. La LpL es una glicoproteína de 55 KDa, localizada en la cara luminal de las células endoteliales. El gen LPL se encuentra en el cromosoma 8 y se extiende 30 kb, contiene 9 exones. La producción de LpL está altamente regulada en la transcripción, posttranscripción y mecanismos postraduccionales47. La LpL se sintetiza en gran cantidad en los tejidos que requieren AGL para su metabolismo energético, predominantemente en corazón, tejido adiposo y músculo esquelético. Posteriormente, es secretada al torrente sanguíneo donde se unirá a la GPIHBP1 en la superficie de las células endoteliales48. INTRODUCCIÓN 23 La síntesis, procesamiento (glicosilación) y secreción de LpL está regulada bajo control hormonal. Se ha demostrado en estudios con ratas que la adición de insulina, genera un aumento de la actividad de LpL. En humanos, el aumento de la ingesta de carbohidratos genera un incremento de LpL de 3 a 6 h después, aunque el papel de la insulina todavía no es claro 49. También se ha demostrado que el sistema adrenérgico disminuye la actividad de LpL en tejido adiposo y aumenta la síntesis de LpL en el musculo43. La LpL hidroliza los TG de QM y VLDL liberando AGL, que podrán ser usados para re-sintetizar de nuevo TG en tejido adiposo o ser β-oxidados en el músculo. La acción de LpL es dependiente de Apo C-II, un cofactor esencial para su activación. Sin embargo, la Apo C-III puede inhibir la lipolisis mediante inactivación de LpL. Figura 1.9: Estructura de la lipoprotein lipasa Modelo para la unión de los QM y LpL GPIHBP1 en la superficie de células endoteliales. GPIHBP1 está atado a la superficie de la célula endotelial por un anclaje GPI y contiene un dominio de ácido amino-terminal que se propone ser un lugar de unión específica para los QMy LpL. El dominio ácido de GPIHBP1 puede unirse a quilomicrones través de la interacción con los dominios cargados positivamente de apolipoproteínas expuestos en la superficie de las lipoproteínas. El dominio ácido de GPIHBP1 también puede servir como el sitio de unión para LpL, que contiene dominios de unión a heparina cargados positivamente. La interacción entre los quilomicrones GPIHBP1-enlazados y LpL puede implicar la agrupación de las proteínas ancladas a GPI o homodimerización. La lipólisis de TGasociados a los quilomicrones libera ácidos grasos libres (FA), que son transportados en las células endoteliales50. INTRODUCCIÓN 24 La expresión anormal de LpL está asociada con arterioesclerosis, obesidad, diabetes y quilomicronemia.49 Estudios realizados con ratones KO para LPL, han demostrado un aumento de la concentración de TG con un incremento en las VLDL después del nacimiento y de los QM después de mamar. La acumulación de TRL es letal tras 18 horas desde el inicio de la alimentación. A la inversa, la sobreexpresión de LpL en ratones confiere un fenotipo protector, aumentado el aclaramiento de QM y VLDL y disminuyendo la concentración de TG cerca de un 75%51. 3.2 Apolipoproteína A-V y triglicéridos El gen que codifica para la Apo A-V (APOA5) fue identificado bioinformáticamente dentro de la agrupación génica APOA5-APOA4-APOC3-APOA1 en el cromosoma 1152. El gen APOA5 de 1,9 Kb está formado por 4 exones que codifican 366 aminoácidos. Se expresa exclusivamente en el hígado, particularmente en zonas de regeneración hepática. El 80% de Apo A-V está asociado con QMs, VLDLs y HDLs, mientras que aproximadamente el 20% es retenido a nivel intrahepático asociado con gotas lipídicas16. La Apo A-V en plasma afecta, probablemente, a la distribución de moléculas de Apo C-III en VLDL, aunque el papel intracelular de Apo A-V no está claro. Presumiblemente, Apo A-V afecta directamente al ensamblaje intracelular de VLDL o a su secreción a nivel hepático53. El papel de Apo A-V todavía debe ser dilucidado. Ensayos celulares sugieren que el complejo QM/Apo A-V, pero sin partículas de Apo E y Apo CIII está ávidamente unido al dominio ácido de GPIHPB1, aunque Apo A-V puede no competir con el LpL unido. Por otro lado, los QM unidos requieren tanto de Ly6, como del dominio ácido. Así los quilomicrones se unen a GPIHPB1 en presencia tan solo de LpL, y Apo A-V no parece desempeñar un papel esencial en este proceso. Se ha observado en ratones que la sobreexpresión de APOA5 disminuye marcadamente la concentración de TG plasmáticos, mientras que en ratones KO para APOA5 se observa una severa HTG (los TG se ven multiplicados por cuatro, respecto a concentraciones basales) 34, 54. La expresión de APOA5 está regulada por factores transcripcionales, que están involucrados en las lipoproteínas plasmáticas y en la homeostasis de la glucosa, sugiriendo que responde a múltiples señales ambientales54. ApoA-V es claramente crucial en el metabolismo de las lipoproteínas ricas en TG tanto en ratones como en humanos, aunque su regulación y funciones moleculares son todavía desconocidas. Algunas variantes comunes de APOA5 se han asociado con los niveles de TG en plasma en numerosas etnias55. INTRODUCCIÓN 25 Los análisis funcionales realizados en las mutaciones en APOA5que se asocian con HTG, han revelado generalmente una pérdida de la actividad de LpL, particularmente cuando existe mutaciones en extremo C-terminal, que interfiere con la capacidad de Apo A-V para interactuar con lípidos y lipoproteínas56. 3.3 Factor de Maduración de la Lipasa 1 y triglicéridos Las proteínas LpL, LH y lipasa endotelial son enzimas lipolíticas involucradas en el metabolismo lipídico. En 1983 fue descrita por primera vez una mutación en ratón denominada deficiencia combinada de lipasa (cld) que cursaba con deficiencia tanto de LpL como de LH58. Los ratones homocigotos para la mutación cld desarrollan QM postparto y mueren por isquemia y cianosis debida a un aumento de la viscosidad sanguínea57, 9. El fenotipo cld fue mapeado en el cromosoma 17 usando análisis de ligamiento, y posteriormente se identificó el gen Tmen112, renombrándolo como Lmf1 (factor 1 de maduración de la lipasa)9. Estudios posteriores han demostrado que Lmf1 está localizado en tejidos que expresan LpL o HL. La proteína Lmf1 se localiza en la membrana del RE estimulando la maduración tanto de LpL como de HL9, 57. La mutación cld produce un truncamiento prematuro de Lmf1 que afecta a un dominio conservado de función incierta, que impide la maduración de las lipasas, independientemente de la localización subcelular y sin requerir ninguna intervención directa58. Se ha demostrado, en estudios, in vitro que mutaciones en Lmf1comprometen la actividad de Lmf159. En humanos se ha identificado el gen LMF1,homólogo al de los ratones, localizado en el cromosoma 16, como un candidato para el metabolismo de TG. En un estudio realizado con 11 pacientes con hiperquilomicronemia y un defecto en la actividad de LpL se identificó la mutación Y439X que genera un codón Stop en el exón 9 de LMF1 de un paciente que presentaba episodios de pancreatitis recurrente y una concentración de TG de 30 mmol/l. La mutación W464X fue encontrada en pacientes con una actividad disminuida en LpL y HL en un 76% y un 27% respectivamente9. Así, LMF1 parece ser un gen clave que regula el metabolismo de TG60. Lmf1 es una proteína transmembrana localizada en el RE. La proteína está formada por 5 segmentos transmembrana, que separan la proteína en 6 dominios, la mitad de los cuales dan al lumen del retículo endoplasmático y la otra mitad al citoplasma61. Los defectos en Lmf1 producen una deficiencia combinada de LpL y HL. Ambas, junto con la lipasa endotelial, son lipasas homodiméricas, pero no afecta a la lipasa pancreática, monomérica. Por tanto, la proteína Lmf1 interviene en la dimerización y maduración de estas lipasas, para convertirlas en MATERIAL Y MÉTODOS 32 En la tabla 3.2 se muestran las secuencias de los cebadores utilizados, el tamaño de los productos amplificados (en pb) y la temperatura de unión de cada par de cebadores (Tm). Tabla 3.2: Cebadores para la amplificación del gen LPL. CEBADOR PRODUCTO Exón Nombre Secuencia Pb Tamaño 1u Directo Reverso 5´-TGTAAAACGACGGCCAGTAGCGAACAGGAGCCTAACAAAGCAA-3´ 5´- CAGGAAACAGCTATGACCTTTGGCGCTGAGCAAGTCGC-3´ 43 38 340 1D Directo Reverso 5´- TGTAAAACGACGGCCAGTCACTTCTAGCTGCCCTGCCA-3´ 5´- CAGGAAACAGCTATGACCAGGGGAGTTTGCGCGCAAAA-3´ 35 35 330 2 Directo Reverso 5´- TGTAAAACGACGGCCAGTAACCCTCCAGTTAACCTCATATCCAA-3´ 5´- CAGGAAACAGCTATGACCCACCACCCCAATCCACTCTTCCCAC-3´ 44 40 227 3 Directo Reverso 5´-TGTAAAACGACGGCCAGTTAGGTGGGGTATTTTAAGAAAGCTGTG-3´ 5´-CAGGAAACAGCTATGACCCACTGTTTTGGACACATAAGTCTCC-3´ 42 43 296 4 Directo Reverso 5´-TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGAACTGTAAGCACCTTCATTTC-3´ 5´-CAGGAAACAGCTATGACCTTCACCTCTTATGATAAGACCAACGAA-3´ 43 45 180 5 Directo Reverso 5´-TGTAAAACGACGGCCAGTAAATTTACAATCTGTGTTCCTGCTTTTT-3 5´-CAGGAAACAGCTATGACCGATAAGAGTCACATTTAATTCGCTTCTA-3 46 46 350 6 Directo Reverso 5´- TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTGCCGAGATACAATCTTGGTGTC-3´ 5´-CAGGAAACAGCTATGACCGACTCCTTGGTTTCCTTATTTACAACA-3´ 44 45 359 7 Directo Reverso 5´-TGTAAAACGACGGCCAGTATAAAGATTGATCAACATGTTCGAATTTC-3 5´-CAGGAAACAGCTATGACCGGGACTGGTGCCATGATGACCGCCC-3´ 46 42 237 8 Directo Reverso 5´-TGTAAAACGACGGCCAGTGATCTCTATAACTAACCAATTTATTGCT-3 5´-CAGGAAACAGCTATGACCTGGGGGTCTAAAGTGAAGGAAGAAAA-3´ 45 43 299 9 Directo Reverso 5´-TGTAAAACGACGGCCAGTTTGTTCTACATGGCATCTTCACATCCA-3´ 5´-CAGGAAACAGCTATGACCAGCTCAGGATGCCCAGTCAGCTTTA-3´ 44 42 310 1U: amplificación que incluye la zona del promotor lejano. 1D: amplificación que incluye la zona del promotor y el exón 1. Pb: pares de bases El resultado de las amplificaciones se comprobó mediante electroforesis de 96V durante 20 min en un gel de agarosa convencional al 2% en TAE 1X y teñido con SYBR® Safe (Lifetechnologies). MATERIAL Y MÉTODOS 33 5.2 Gen LMF1 Se amplificaron el promotor, los 11 exones y las uniones exón-intrón del gen LMF1 utilizando como secuencia de referencia ENSG00000103227. Los exones 7 y 8 se amplificaron en un único fragmento. Para la amplificación se usaron diferentes programas de amplificación para cada exón. Para cada reacción de amplificación se mezcló la enzima Biotaq DNA polimerasa (Bioline), el tampón 10x (20mM Tris-HCl, pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1mM EDTA, 2mM DTT, 50% glicerol), el MgCl2, los dNTPs (Life Technologies), los cebadores correspondientes, el DNA de interés y el agua destilada estéril hasta alcanzar un volumen final de 20 µl. Las cantidades y concentraciones finales se muestran en la tabla 3.3. Tabla 3.3: Cantidades y concentraciones de los reactivos utilizados en la reacción de PCR LMF1 REACTIVO CANTIDAD (µL) CONCENTRACCIÓN FINAL dH2O 13,5 Tampón (10x) 2 1x dNTPs (2mM) 2 200µM MgCl2 (50mM) 0,6 1,5mM Cebador directo (10µM) 0,4 200µM Cebador reverso (10µM) 0,4 200µM Biotaq DNA polimerasa (5U/µl) 0,12 0,03 U/µl DNA genómico (100µg/µl) 1 5ng/µl Los programas térmicosdifirieron según atendiendo a las necesidades de cada amplificación en cuanto a tamaño y temperatura de hibridación de los cebadores (Tabla 3.4): Exón 1 94ºC 2 min 94ºC 20seg 62ºC 30seg 72ºC 1min 72ºC 10min 4ºC ∞ 40 ciclos MATERIAL Y MÉTODOS 34 Exones 2 y 4 94ºC 2min 94ºC 20seg 60ºC 20seg 72ºC 30 seg 72ºC 4 min 4ºC ∞ 35 ciclos Exón 3 94ºC 2 min 94ºC 20seg 55ºC 20 seg 72ºC 30seg 72ºC 5 min 4ºC ∞ 35 ciclos Exón 5 94ºC 2min 94ºC 20seg 55ºC 20seg 72ºC 30seg 72ºC 4min 4ºC ∞ 40 ciclos Exón 10 94ºC 2min 94ºC 20seg 63ºC 20 seg 72ºC 30seg 72ºC 4min 4ºC ∞ 35 ciclos Exones 6, 7-8,9 y 11 94ºC 2min 94ºC 20seg 62ºC 20seg 72ºC 30seg 72ºC 4min 4ºC ∞ 35 ciclos MATERIAL Y MÉTODOS 35 Tabla 3.4: Cebadores para la amplificación del gen LMF1. CEBADOR PRODUCTO Exón Nombre Secuencia Pb Tamaño 1 Directo Reverso 5´-GTGCCTCCGGGACTGTGA-3´ 5´- CGGAGGAGTCTCGAGGGA-3´ 18 18 422 2 Directo Reverso 5´- ATTCTGAGCTGCGCCCAT-3´ 5´- CAGTGCCTGTGCTGAGTGAC -3´ 18 20 466 3 Directo Reverso 5´- CAAGCCAAAGTGTTAATACTCGTTTC-3´ 5´- GAAGGCTGATGGCAGAGGCTAAGGAA-3´ 26 26 170 4 Directo Reverso 5´- GGCTGGTGTCTCTCAGTAGCA-3´ 5´- AAGCCCTCACAGGTTAGAAGAG3´ 21 21 345 5 Directo Reverso 5´- CTTCGTGGATGGTTCGTCTT-3´ 5´- TGATGCGACAGCTCACCA-3´ 20 18 269 6 Directo Reverso 5´- GGGGATCCTGTGTGCAGTAG-3´ 5´- GGGCAGCCAGAAATAGGG-3´ 20 18 354 7 Directo Reverso 5´- GCTCCAGGAAGAGAGGCG-3´ 5´- CCGACTTTCTCCTGCCCT-3´ 18 18 308 8 Directo Reverso 5´- AGCAGCAGCTGGGGTCTC-3´ 5´- GCACTGTAACCCCACCTGAA-3´ 18 20 320 9 Directo Reverso 5´- ATGGACAGTCGGGGAACC-3´ 5´- AAGAGGGTGGGGGTACAG-3´ 18 17 330 10 Directo Reverso 5´- ATGGACAGTCGGGGAACC-3´ 5´- AAGAGGGTGGGGGTAC-3´ 18 17 259 11 Directo Reverso 5´- CAGCAGCAGGCTGAGGAG-3´ 5´- CTCTCCTCTCCACGTCTCTCTT-3´ 18 22 363 El resultado de las diferentes amplificaciones se comprobó mediante electroforesis de 96V durante 20 minutos en un gel de agarosa 2% en TAE 1X teñido con SYBR® Safe (Life Technologies). MATERIAL Y MÉTODOS 36 5.3 Gen APOA5 Utilizando como referencia la secuencia ENSG00000110243 del gen APOA5 se amplificaron el promotor, los 4 exones y las uniones exón-intrón en 4 fragmentos individuales. Debido a su gran tamaño, el exón 4 se dividió en dos fragmentos de amplificación: 4.1 y 4.2. Los exones 2 y 3 se amplificaron en único fragmento. En cada reacción de amplificación se mezcló la enzima Biotaq DNA polimerasa (Bioline), el tampón 10x (20mM Tris-HCl, pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1mM EDTA, 2mM DTT, 50% glicerol), el MgCl2, los dNTPs (Life Technologies), los cebadores correspondientes, el DNA de interés y el agua destilada estéril hasta alcanzar un volumen final de 20 µl. Las cantidades y concentraciones finales se muestran en la tabla 3.5 Tabla 3.5: Cantidades y concentraciones de los reactivos usados en la reacción de PCR APOA5. REACTIVO CANTIDAD(µL) CONCENTRACCIÓN FINAL dH2O 13,5 Tampón (10X) 2 1X dNTPs(2mM) 2 200µM MgCl2 (50mM) 0,6 1,5mM Cebador directo (10µM) 0,4 200µM Cebador reverso (10µM) 0,4 200µM Biotaq DNA polimerasa (5U/µl) 0,12 0,03U/ µl DNA genómico 1 5ng/ µl Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador Gene Amp® 9700 (AppliedBiosystem). Los programas térmicos son diferentes para cada uno de los exónes de acuerdo a las características de los cebadores y el producto de PCR (Tabla 3.6). Exón 1 94ºC 2min 94ºC 20seg 60ºC 20seg 72ºC 30 seg 72º 4min 4ºC ∞ 40 ciclos MATERIAL Y MÉTODOS 37 Exón 2-3 94ºC 2min 94ºC 20seg 65ºC 20seg 72ºC 30 seg 72ºC 4min 4ºC ∞ 40 ciclos Exon 4.1 94ºC 2 min 94ºC 20seg 65ºC 30seg 72ºC 1min 72ºC 4min 4ºC ∞ 35 ciclos Exon 4.2 94ºC 2min 94ºC 20seg 60ºC 20seg 72ºC 30seg 72ºC 10min 4ºC ∞ 35 ciclos PCR unión: 94ºC 2min 94ºC 20seg 65ºC 20seg 72ºC 30 seg 72ºC 4min 4ºC ∞ 40 ciclos Tabla 3.6: Cebadores para la amplificación del gen APOA5. CEBADOR PRODUCTO Exón Nombre Secuencia Pb Tamaño (nt) 1 Directo Reverso 5´- GTGAGTGCTGGGAGGCAGCTGAGGTCAACTT-3´ 5´- CCACCTGCAAT//GCCCTCCCTTAGGACTGTG-3´ 31 184 2-3 Directo Reverso 5´- GCATTGCAGGTGG//CGCCATGTCCCTTC-3´ 5´- ATGGCCCAGCTGTGTCCTCCCTTCGCCTACA-3´ 31 408 4.1 Directo Reverso 5´- CAGAGGATCAGTGCGCGATGACTTG-3´ 5´- ATGGCGCGAGTGAAGGCAGCTATC-3´ 25 25 834 4.2 Directo Reverso 5´- GAGGTGCGCCAGCGACTT-3´ 5´- GGCGTGCTCTTGCTACCTC-3´ 18 19 1042 Para disminuir el número de reacciones de secuenciación se llevó a cabo una PCR de unión del exón 1 y los exones 2-3. Para ello, el diseño del cebador reverso de la amplificación del exón 1 incluyó una cola complementaria al cebador directo de la amplificación 2-3 que permitiría su MATERIAL Y MÉTODOS 38 unión mediante PCR utilizando los cebadores directo del exón 1 y el reverso del exón 2-3. La reacción de PCR se llevó a cabo con las mismas cantidades y concentraciones descritas en la tabla 3.5, utilizando como DNA molde 0,5 μl del producto de PCR del exón 1 y 0,5 μl del producto de la PCR de los exones 2-3. El resultado de las diferentes amplificaciones se comprobó mediante electroforesis de 96V durante 20 minutos en un gel de agarosa 2% en TAE 1x teñido con SYBR® Safe (Lifetechnologies). 6. Purificación del producto de PCR mediante ExoSAP-IT® (USB) Para la purificación de los productos de PCR se utilizó el producto comercial ExoSAP-IT ® (USB) que consta de las enzimas exonucleasa I y fosfatasa alcalina de camarón (SAP), elimina los cebadores y nucleótidos sin hibridar sin pérdida de muestra. La enzima exonucleasa I degrada los cebadores residuales y cualquier DNA de cadena única, mientras que la SAP hidroliza los dNTPs remanentes de la mezcla de la PCR. Se preparó una dilución 1:10 de ExoSAP-IT® (USB) en dH2O de la que se añadieron 2 µl a 5 µl del producto de PCR. En un termociclador Gene Amp® 9700 (Applied Biosystem) se realizó una incubación a 37 °C durante 45 min, seguida de 15 min a 80 °C con objeto de inactivar la enzima. Las muestras purificadas se conservaron a -20 °C para su posterior utilización. 7. Reacción de secuenciación Para la identificación de variantes comunes y raras en los genes de interés, se realizó la secuenciación, por electroforesis capilar, de los fragmentos amplificados utilizando el producto comercial BigDye® Terminator v3.1 CycleSequencing Kit (AppliedBiosystems), que contiene un vial de BigDye v3.1 ReactionMix que contiene una DNA polimerasa termoestable y dNTPs marcados con fluorocromos y un vial con el tampón de secuenciación BigDye v3.1 5X que aporta las condiciones idóneas para la acción enzimática. Por cada muestra, en primer lugar se realizó una dilución de 0,5 µl de BigDye v3.1 Reaction mix en 1,75 µl de tampón de secuenciación BigDye v3.1 5X y 4,75 µl de agua estéril destilada. Posteriormente, se añadieron 7 µl de esta mezcla a 1,5 µl del producto purificado y 1,5 µl del cebador de secuenciación a 2,1 µM. Todo el proceso se llevó a cabo en frío y protegiendo el reactivo BigDye y sus diluciones de la luz. Las reacciones se prepararon en un volumen final de 10 µl según indica la tabla 3.7. MATERIAL Y MÉTODOS 39 Tabla 3.7: Cantidades de los reactivos empleadas en la reacción de secuenciación. REACTIVO CANTIDADES (µl) Producto de PCR purificado 1,5 Mix BigDye 7 Primer de secuenciación (2,1 µM) 1,5 Siendo el programa térmico utilizado el siguiente: 96ºC 1min 96ºC 10 seg 55ºC 5 seg 60ºC 4 min 4ºC ∞ 25 ciclos El resultado de las reacciones de secuenciación se purificó por precipitación alcohólica con el fin de eliminar los terminadores sobrantes. Para ello se añadió 4 µl de EDTA 62,5mM a los 10µl de la reacción de secuenciación. A continuación se preparó una mezcla de 2,6 µl de NaAc 3M pH 5,2, 7,8 µl de agua destilada y 67,71 µl de etanol al 96% (v/v) de la que se añadieron 60 µl a la muestra, se agitó por inversión y se centrifugó durante 1 min a 2.090 xg en una centrífuga 316K (Sigma). Seguidamente, la muestra se incubó protegida de la luz durante 15 min Transcurrido este tiempo, las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 30 min a 2.090 xg. Para eliminar el sobrenadante se realizó una centrifugación con las muestras invertidas durante 1 min a 180 xg. A continuación, se añadieron 70 µl de etanol al 70% y se centrifugaron las muestras durante 15 min a 4 °C a 2.090 xg. De nuevo se eliminó el sobrenadante centrifugando las muestras invertidas durante 1 min a 180 xg. Tras este paso, el pellet obtenido se guardó a - 20 °C para su posterior utilización. Previamente a realizar la electroforesis capilar, se resuspendió el pellet en 20 µl de formamida (LifeTechonologies) y para la desnaturalización de las muestras se realizó una incubación en un termociclador Gen Amp® 9700 (AppliedBiosystems) de 2 min a 94 °C. La electroforesis capilar se llevó a cabo en el secuenciador automático ABI 3500XL (AppliedBiosystems). El alineamiento y la lectura de las secuencias obtenidas se llevó a cabo mediante el programa informático VariantReporter™ (AppliedBiosystems). MATERIAL Y MÉTODOS 40 8. Análisis bioinformático Para evaluar la patogenicidad de las variantes génicas identificadas, se usaron los siguientes programas informáticos y bases de datos, cuando el cambio era no –sinónimo: PolyPhen-266, SIFT67 y MutationT@ster68. Polyphen-2 clasificó las variantes en benignas, posiblemente dañinas y probablemente dañinas, de acuerdo a la conservación de la secuencia y la estructura de la proteína. SIFT clasificó las variantes en función de la homología de secuencia, como tolerante o intolerante. Mutation Taster se utilizó también para variantes que incluían codones de parada y alteraciones intrónica o complejas, clasificándolas como posiblemente causal de la enfermedad o posiblemente polimorfismos. El efecto de las variantes en sitios potenciales de ayuste se estudió mediante NetGene269 y NNSplice70, analizando la estructura de los sitios donador y aceptor. 9. Extracción del RNA Para el estudio de las mutaciones identificadas por primera vez en este trabajo y cuyo efecto puede alterar el patrón de ayuste se recogió una muestra de sangre, de los pacientes portadores de dichas variantes, en un tubo PAXgene (PreAnalytiX) que contiene un estabilizador que evita la degradación del RNA. La muestra sanguínea se obtuvo por medio de una punción venosa tras un ayuno de 10-12 horas y tras la extracción de 2ml de sangre en un tubo con EDTA para evitar la contaminación. Los tubos PAXgene con la muestra sanguínea se almacenaron a -80 °C hasta su posterior utilización. Para la extracción de RNA, en campana de flujo vertical y con material específico para RNA, se llevó a cabo el siguiente protocolo utilizando TRI Reagent (Sigma): Se centrifugó el tubo PAXgene durante 10 min a 4.000 xg a temperatura ambiente en una centrífuga Eppendorf 5415 Se descartó el sobrenadante y se añadió 1 ml de agua DEPC (agua ultrapura) para resuspender el pellet que se transfirió a un tubo de 2 ml. La muestra fue centrifugada durante 10 min a 4000xg en una centífuga Eppendorf 5415 Se eliminó el sobrenadante y se añadió 1 ml del TRI Regent™ (Sigma) para producir la lisis celular. Se resuspendió el pellet y se incubó la muestra durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, se adicionaron 200 µl de cloroformo (Carlo Erba Reagenti) y se agitó vigorosamente durante 15 segundos. La muestra fue incubada durante 7 min a temperatura ambiente hasta observarse claramente 2 fases. Posteriormente, se centrifugó el tubo a 12.000 MATERIAL Y MÉTODOS 41 xg durante 15 min a 6 °C. Tras la centrifugación se observaron tres fases: una fase orgánica (en la que se encontraban las proteínas), una interfase (donde se localizaba el DNA) y una fase acuosa superior (donde se encontraba el RNA). Se recogió esta fase acuosa y se traspasó a un nuevo tubo donde se añadieron 500 µl de isopropanol (AnalarNormapur ®). La mezcla se incubó durante 7 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se centrifugó durante 10 min a 12.000 xg a 6 °C, resultando en la precipitación del RNA precipitó y formándose un pellet visible. Para lavar el RNA obtenido se eliminó el sobrenadante, se adicionó 1 ml de etanol 75%, se agitó con vortex hasta la disolución del pellet de RNA y se centrifugó a 7500 xg durante 5 min a 6 °C. Para eliminar los alcoholes, se llevó a cabo el secado del RNA dejando el tubo abierto en posición horizontal. Finalmente se eluyó el RNA en 50 µl de agua libre de RNAsas previamente calentada a 55 °C y se llevó a cabo la cuantificación con NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) tal y como se describe en el apartado 4. Tras la cuantificación del RNA, se llevó a cabo una electroforesis, en un gel de agarosa 1% durante 45 minutos a 90V, de la muestra para estudiar su viabilidad. 10. Obtención del cDNA Para la obtención del DNA complementario (cDNA) al RNA obtenido en el apartado 8 se utilizó la enzima Retrotranscriptasa inversa en una reacción RT-PCR. Para ello se preparó una mezcla de 0.8 μl de RandomPrimers (300 ng/μl) (Lifetechnologies), 1 μl de dNTPs, 1210 ng de RNA y 1,2 μl de agua destilada estéril que se incubó durante 5 min a 65 °C en un termociclador Gen Amp® 9700 (AppliedBiosystems) y un minuto en hielo. Posteriormente, se adicionaron 4 μl de Tampón 5X (Lifetechnologies), 1 μl de DTT 1M (Ditiotreitol), 1 μl del inhibidor de RNAsas RNAse OUT™ (Lifetechnologies) y un 200 U de enzima SuperScript™ III RT (Lifetechnologies). A continuación se realizó una incubación en un termociclador GenAmp 9700® (Applied Biosystems) durante 5 minutos a 25 °C, 60 min a 50 °C y 15 min a 20 °C. RESULTADOS 48 Tabla 4.3: Frecuencias genotípicas de las variantes comunes del gen LPL encontradas en los sujetos con HTG del estudio. Variante GENOTIPOS N FRECUENCIA c.-281T>G rs1800590 GG 101 0.902 GT 11 0.098 TT 0 0 p.Asp36Asn rs1801177 GG 103 0.919 GA 9 0.08 AA 0 0 p.Val135Val rs1121923 GG 109 0.973 GA 3 0.026 AA 0 0 p.Glu145Glu rs248 GG 102 0.91 GA 8 0.071 AA 2 0.018 c.430-6C>T rs11570897 CC 101 0.902 CT 11 0.098 TT 0 0 p.Pro234Leu rs118204060 CC 110 0.982 CT 2 0.018 TT 0 0 p.Asn318Ser rs268 CC 110 0.982 CT 2 0.018 TT 0 0 p.Thr379Ile rs76708715 GG 111 0.991 GA 1 0.009 AA 0 0 p.Thr388Thr Rs316 CC 93 0.83 CA 18 0.16 AA 1 0.009 p.Ser474X Rs328 CC 103 0.919 CG 9 0.08 GG 0 0 RESULTADOS 49 Tabla 4.4. Frecuencias alélicas de los SNPs identificados en el gen LPL en la población con HTG y los 1000 Genomas de la población europea. 2.3 Análisis bioinformático de las variantes en el gen LPL Todas las variantes que supusieron un cambio no sinónimo fueron analizadas con los programas informáticos PolyPhen-266, SIFT67 y MutationTaster68, las mutaciones que se encontraban en promotores o dieron lugar a un codón de parada sólo pudieron ser analizadas por MutationTaster. El resultado de este análisis bionformático de las variantes del gen LPL se muestra en la tabla 4.5. El análisis mediante PolyPhen-2 mostró que las variantes raras p.Pro234Leu y p.Gly215Glu eran probablemente dañinas y por tanto causales para la enfermedad, tal y como también se obtuvo mediante MutationTaster. De igual manera, para estas dos variantes se obtuvo una puntuación de 0 con el análisis de SIFT, lo que implica que son perjudiciales para la proteína. El resto de variantes no pudieron ser analizadas por PolyPhen-2 y SIFT o resultaron benignas. El análisis mediante MutationTaster, mostró que además de las mutaciones nombradas con anterioridad, los cambios c.1018+2G>A, p.Gln16GlufsX11, p.Asp36Asn, p.Gln133X, c.430-6C>T y p.Asn318Ser eran posibles causas para la HTG. Variante Alelo menor Frecuencia alélica HTG Frecuencia alélica 1000 Genomas P c. 281T>G rs1800590 G 0,049 0,013 0,001 p.Asp36Asn rs1801177 A 0,040 0,013 0,002 p.Val135Val rs1121923 A 0,125 0,041 0,047 p.Glu145Glu rs248 A 0,054 0,063 0,579 c.430-6C>T rs11570897 T 0,049 0,002 <0,001 p.Pro234Leu rs118204060 T 0,009 0,000 <0,001 p.Asn318Ser rs268 T 0,090 0,016 0,444 p.Thr379Ile rs76708715 A 0,040 0,000 0,002 p.Thr388Thr rs316 A 0,089 0,120 0,201 p.Ser474X rs328 G 0,040 0,123 <0,001 RESULTADOS 50 Tabla 4.5. Análisis bioinformático de las variantes encontradas en el gen LPL. Análisis in silico Variante PolyPhen-2 SIFT MutationTaster c.-16A>G NA NA 0.999 Polimorfismo c.-241G>C NA NA 1 Causal de enfermedad c.-281T>G NA NA 0Polimorfismo c.1018+2G>A NA NA 1 Causal de enfermedad p.Gln16GlufsX39 NA NA 0,986 Causal de enfermedad p.Asp36Asn Benigna 0,14 0,416 Causal de enfermedad c.250-8A>G 0,999 Polimorfismo p.Gln133X NA NA 1 Causal de enfermedad p.Val135Val NA NA 0 Polimorfismo p.Glu145Glu NA NA 0 Polimorfismo p.Pro234Leu Probablemente dañina 0 0,999 Causal de enfermedad p.Gly215Glu Probablemente dañina 0 0,999 Causal de enfermedad c.430-6C>T NA NA 0,999 Causal de enfermedad p.Asn318Ser Benigna 0,22 0,989 Causal de enfermedad p.Thr379Ile Benigna 0,25 0,998 Polimorfismo p.Thr388Thr NA NA 0 Polimorfismo p.Ser474X NA NA 0 Polimorfismo NA: no analizado. En el caso de las variantes c.250-8A>G y c.1018+2G>A se analizó específicamente el efecto sobre el ayuste de LPL tal y como se describe en el apartado 8 de Material y Métodos. El análisis del cambio c.250-8G>A no predijo ninguna alteración en el ayuste. Sin embargo, el RESULTADOS 51 análisis de la mutación c.1018+2G>A mostró la eliminación del sitio donador natural en el intrón 6 (Fig 4.1). Se observa que, en la región del intrón 6 existen tres potenciales sitios donadores, con unas puntuaciones de 1, 0,66 y 0,71, respectivamente (siendo 1 el valor de mayor probabilidad de ayuste). Además, este análisis no mostraba el sitio natural aceptor de ayuste del intrón 5, lo que implica que es un aceptor débil, pero sí que se observó un posible aceptor de ayuste en el intrón 6, en una posición más 5’ que el donador potencial con puntuación 1. Se observaron 3 posibles resultados: - Ayuste usando el aceptor natural del intrón 5 y el donador con puntación 1 del intrón 6, o, con menor probabilidad, los otros dos donadores, el cDNA observado sería de mayor longitud que el esperado (Fig 4.1A y B). - El ayuste usando los sitios aceptor y donador con puntuación 0.95 y 1 del intrón 6 (Fig 4.1C) daría lugar a la eliminación completa del exón 6, generándose a la vez un falso exón 6 con una región del intrón 6 de 259 bp. Figura 4.1: Esquema del ayuste de LPL 2.4 Análisis funcional de la mutación c.1018+2G>A del gen LPL La mutación c.1018+2G>A ha sido descrita simultáneamente a este trabajo por nuestro grupo71. Para el análisis funcional se realizó la extracción de RNA y su posterior transformación a cDNA para, posteriormente, llevar a cabo una PCR de elongación, que nos permitió dar una explicación plausible del efecto de dicha mutación. 2.4.1 Extracción del RNA A partir de 2 tubos de sangre PAXgene (PreAnalytiX) correspondientes al paciente y a un control sano se extrajo el RNA mediante el método del TRI Regent™ (Sigma), tal y como se detalla en el apartado 9 del capítulo Material y Métodos. Posteriormente se llevó a cabo la cuantificación con NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), como se detallan en apartado 4 del capítulo Material y Métodos. Sus concentraciones se detallan a continuación, en la tabla 4.4. RESULTADOS 52 Tabla 4.6: Características del RNA obtenido RNA CONCENTRACCIÓN (ngr/µl) A260/280 A260/230 Control 180.6 ng/µl 1.80 0.92 Paciente problema 242 ng/µl 1.80 0.92 Posteriormente para estudiar la viabilidad de la muestra obtenida se llevó a cabo una electroforesis del RNA extraído, descartando así que este se pueda haber degradado. 2.4.2 Obtención del cDNA Tras la extracción del RNA, este se convierte en cDNA mediante una PCR Retrotranscriptasa Inversa tal y como se describe en el apartado 10 del capítulo Material y Métodos, se llevó a cabo una PCR de prueba para poder comprobar que la retrotranscripción se ha llevado a cabo con éxito. Para confirmar la predicción resultado del análisis bioinformático se amplificó, mediante PCR, una región de 1150 bp del cDNA comprendiendo los exónes 5-9 y parte de la zona 3’UTR del gen LPL, tal y como se describe en los apartados 11 y 12 del capítulo Material y Métodos. Los resultados de dicha PCR se muestran en la figura 4.2. Figura 4.2: Visualización del gel del producto de PCR del fragmento exón 5-3’UTR del cDNA del gen LPL. M B C P M: Marcador DNA Lapper 100 bp. B: Blanco. C: muestra control sano. P: Paciente problema, portador de la mutación c.1018+2A>G. En la figura 4.2 se observa una banda a la altura de 1.150 bp tanto en el carril correspondiente al control como en el paciente correspondiente al cDNA imagen del chequeo de la PCR se puede observar la doble banda del paciente, que contiene la mutación en heterocigosidad, a RESULTADOS 53 diferencia de la única banda que aparece en el sujeto control. Esta doble banda podría ser la respuesta a la patología del paciente. 2.5 Estudio de la segregación familiar de las mutaciones en LPL En el caso de dos sujetos portadores de las mutaciones c.1018+2G>A y p.Gln133X, respectivamente, se recogieron muestras de familiares directos, para llevar a cabo un estudio de la segregación familiar de las variantes. Se obtuvo una muestra sanguínea de los familiares y se llevó a cabo el protocolo tal y como se describe en el apartado 5.1 de Material y Métodos pero exclusivamente para los fragmentos específicos. En la figura 4.3 se muestra la segregación familiar de la mutación c.1018+2G>A y la figura 4.4 muestra la segregación familiar de la mutación p.Gln133X. Figura 4.3: Segregación familiar de la mutación c.1018+2G>A TG 346 TG 562 1018 +2 A>G TG 150 Figura 4.4: Segregación familiar de la mutación p.Gln133X TG 2237 TG 107 TG 233 RESULTADOS 54 3. Identificación de las variantes en el gen LMF1 El gen LMF1 es un gen que codifica para el factor 1 de maduración de la lipasa, dicha proteína es requerida para la maduración post-traduccional de LpL, LH y lipasa endotelial. La pérdida de función de LMF1 produce HTG. Para la identificación de las variantes comunes y la detección de mutaciones nuevas y previamente descritas en el gen LMF1 asociadas con HTG, se realizó la secuenciación automática del promotor, los exones y los nexos de unión-intrón del gen LMF1, tal y como se describe en el apartado 7.X del capítulo Material y Métodos. En la población afecta de HTG estudiada se identificaron las variantes raras que se muestran en la tabla 4.7, considerando como tales, aquellas que no han sido registradas en el proyecto de los 1000 Genomas. Tabla 4.7 Frecuencia de las variantes raras en el gen LMF1 encontradas en los sujetos del estudio. Variante Localización N Frecuencia (%) p.Arg451Trp Exón 8 1 0,89 p.Pro562Arg Exón 11 2 1,778 N: número de individuos Se registraron todas las variantes comunes que presentaron los 112 sujetos con HTG en el gen LMF1, calculándose las frecuencias alélicas y genotípicas, que se muestran en la Tabla 4.8. El análisis de las frecuencias genotípicas mostró que todos los polimorfismos a excepción del c.194-28T>C se encontraban en equilibrio Hardy-Weinberg, siendo su frecuencia la esperada en la población general. Se realizó la comparación (Tabla 4.4) de las frecuencias alélicas de estas variantes comunes o polimorfismos en nuestra población de estudio frente a la población Europea del estudio de los 1000 Genomas (www.1000Genomes.org). Los SNPs c.194-28T>C y c.729+18C>G mostraron una frecuencia significativamente menor en los sujetos con HTG (p <0.05). RESULTADOS 55 Tabla 4.8: Frecuencias genotípicas las variantes comunes del gen LMF1. SNP FRECUENCIAS GENÓMICAS GENOTIPOS N FRECUENCIA p.Leu85Leu Rs12448005 TT 96 0.857 CT 16 0.143 CC 0 0 p.Thr102Thr Rs371667 GG 63 0.5625 GA 45 0.4018 AA 4 0.0357 c.194-28T>C Rs3751666 TT 65 0.58 CT 31 0.277 CC 16 0.143 p.Tyr180Tyr Rs2277892 GG 84 0.75 GA 27 0.241 AA 1 0.009 p.Glu181Glu Rs2277893 GG 67 0.598 GA 40 0.357 AA 5 0.044 c.664-58G>C Rs4984706 GG 67 0.598 GC 40 0.357 CC 5 0.044 c.664-35T>C rs4984705 TT 71 0.634 CT 35 0.3125 CC 6 0.0535 c.729+18C>G Rs11864203 CC 83 0.741 CG 29 0.2589 GG 0 0 p.Ala252Ala Rs2076425 GG 95 0.847 GA 16 0.143 AA 1 0.009 c.897+28G>A rs18431133 GG 111 0.991 GA 1 0.009 AA 0 0 c.897+27C>T rs76200860 CC 111 0.991 CT 1 0.009 TT 0 0 p.Arg351Gln Rs192520307 GG 111 0.991 GA 1 0.009 AA 0 0 p.Arg354Trp rs138461953 CC 107 0.955 CT 5 0.0446 TT 0 0 p.Arg364Gln Rs351683 GG 106 0.946 GA 6 0.535 AA 0 0 RESULTADOS 56 Tabla 4.9. Frecuencias alélicas de los SNPs identificados en el gen LMF1 en la población con HTG y los 1000 Genomas de la población europea. 3.1 Análisis bioinformático de las variantes en el gen LMF1 Todas las variantes que supusieron un cambio no sinónimo fueron analizadas con los programas informáticos PolyPhen-266, SIFT67 y MutationTaster68, las mutaciones que se encontraban en promotores o dieron lugar a un codón de parada sólo pudieron ser analizadas por Mutation Taster. El resultado de este análisis bionformático de las variantes del gen LMF1 se muestra en la tabla 4.10. Variante Alelo menor Frecuencia alélica HTG Frecuencia alélica 1000 Genomas P p.Leu85Leu Rs12448005 C 0,071 0,065 0,690 p.Thr102Thr Rs371667 A 0,237 0,206 0,322 c.194-28T>C Rs3751666 C 0,281 0,385 0,004 p.Tyr180Tyr Rs2277892 A 0,129 0,096 0,153 p.Glu181Glu Rs2277893 A 0,223 0,177 0,118 c.664-58G>C Rs4984706 C 0,223 0,263 0,235 c.194-28T>C Rs3751666 T 0.090 0.016 0.444 c.729+18C>G Rs11864203 G 0,129 0,273 <0,001 p.Ala252Ala Rs2076425 A 0,080 0,104 0,293 c.897+28G>A rs18431133 A 0,040 0,000 0,066 c.897+27C>T rs76200860 T 0,040 0,000 0,066 p.Arg351Gln Rs192520307 A 0,040 0,010 0,359 p.Arg354Trp rs138461953 T 0,022 0,025 0,815 p.Arg364Gln Rs351683 A 0,027 0,033 0,641 RESULTADOS 57 Tabla 4.10: Análisis bioinformático de las variantes encontradas en el gen LMF1 Análisis in Silico Variante Polyphen SIFT MutationTaster p.Arg351Gln rs19520307 Benigno 0,63 Polimorfismo 0,999 p.Arg354Trp rs138461953 Benigno 0,78 Polimorfismo 0,999 p.Arg364Gln rs35168378 Probablemente dañino 0,07 Causal de enfermedad 0,999 p.Arg451Trp COSM417215 Probablemente dañino 0,04 Polimorfismo 0,999 p.Pro562Arg rs4984948 Posiblemente dañino 0,23 Causal de enfermedad 0,999 p.Leu85Leu rs12448005 NA NA Causal enfermedad 1,00 p.Thr102Thr rs3751667 NA NA Polimorfismo 0,999 c.194-28T>C rs3751666 NA NA Polimorfismo 0,999 p.Tyr180Tyr rs2277892 NA NA Polimorfismo 0,999 p.Glu181Glu rs2277893 NA NA Polimorfismo 0,00 c.664-58G>C rs4984706 NA NA Polimorfismo 0,999 c.664-35T>C rs4989705 NA NA Polimorfismo 0,999 c.729+18C>G rs11864203 NA NA Polimorfismo 0,999 p. Ala252Ala rs2076425 NA NA Polimorfismo 0,00 c.897+28G>A rs18431133 NA NA Polimorfismo 0,999 c.897+27C>T rs76200860 NA NA Polimorfismo 0,999 El análisis mediante PolyPhen-2 mostró que las variantes raras p.Arg364Gln, p.Arg451Trp y p.Pro562Arg eran probablemente dañinas y por tanto causales para la enfermedad, tal y como también se obtuvo mediante Mutation Taster. De igual manera, para estas tres variantes se obtuvieron puntuaciones cercanas de 0 con el análisis de SIFT, lo que implica que son perjudiciales para la proteína. El resto de variantes no pudieron ser analizadas por PolyPhen-2 y SIFT o resultaron benignas. El análisis mediante Mutation Taster, mostró que además de las BIBLIOGRAFÍA 64 BIBLIOGRAFÍA 1. Durrington P. Dyslipidaemia. Lancet. 2003;362:717-31. 2. Brown M.S, Goldstein J L. A receptor mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 1986;232:34-.47 3. Rader DJ, Mangelsdorf DJ. The role of orphan nuclear receptors in the regulation of cholesterol homeostasis. 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