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Trabajo Fin de Máster Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR aplicada al estudio de las neumonías atípicas de pequeños rumiantes Autor José Luis Arnal Bernal Directores Dra. Aleida Villa Espinosa Dr. Raúl Carlos Mainar Jaime Facultad de Veterinaria Septiembre 2013 ÍDICE DE COTEIDOS RESUME. ......................................................................................................................... 6 1.- ITRODUCCIÓ. 1.1.- Situación actual del sector de la explotación de la ganadería de pequeños rumiantes en España y Europa. ....................................................................................... 7 1.2.- Descripción del Mycoplasma ovipneumoniae. ....................................................... 9 1.3.- Patogenia. ............................................................................................................. 10 1.4.- Influencia del ambiente en la presentación de enfermedades respiratorias en pequeños rumiantes. ..................................................................................................... 11 1.5.- La neumonía atípica. ............................................................................................ 11 1.6.- La dificultad en el diagnóstico de Mycoplasma ovipneumoniae. ......................... 13 1.7.- Nueva técnica diagnóstica para la detección de Mycoplasma ovipneumoniae: Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real (qPCR) ........... 14 1.8.- Análisis filogenético de los mycoplasmas basado en el gen codificante para la fracción 16S del RNA ribosomal (rRNA). ............................................................... 17 2.- OBJETIVOS DE ESTE TRABAJO. ............................................................................... 20 3.- MATERIALES Y MÉTODOS. 3.1.- Muestras biológicas. ............................................................................................. 21 3.2.- Cultivo microbiológico. ........................................................................................ 22 3.2.1.- Aislamiento de mycoplasmas. ............................................................... 22 3.2.2.- Aislamiento de otras bacterias de interés. ............................................ 22 3.3.- Aislamiento del ácido nucleico de las muestras y su control de calidad. ............. 23 3.3.1.- Pretratamiento de las muestras procedentes de lavados traqueobronquiales. ........................................................................................... 23 3.3.2.- Pretratamiento de las muestras procedentes de pulmones. ...................... 23 3.3.3.- Aislamiento del DNA. ............................................................................. 24 3.3.4.- Control de calidad del DNA aislado. Análisis de concentración y pureza. ................................................................................................................. 25 3.4.- PCR en tiempo real para la identificación de distintos mycoplasmas. ................... 26 3.4.1.- Ensayo qPCR de Mycoplasma ovipneumoniae. ..................................... 29 3.4.2.- qPCR utilizadas para la investigación de otros mycoplasmas estudiados en este trabajo. ................................................................................... 29 3.5.- Análisis de datos estadísticos. ................................................................................ 29 4.- RESULTADOS. 4.1.- Aislamiento de mycoplasmas y cultivo microbiológico. ...................................... 30 4.2.- Cultivo microbiológico. ......................................................................................... 30 4.3.- Control de calidad de los ácidos nucleicos. ........................................................... 31 4.4.- Validación del ensayo qPCR de M. ovipneumoniae. ............................................ 31 4.5.- Validación del ensayo qPCR de M. ovipneumoniae con muestras clínicas. ........ 34 5.- DISCUSIÓ ......................................................................................................................... 36 6.- COCLUSIOES ............................................................................................................... 40 7.- BIBLIOGRAFÍA. ................................................................................................................ 48 Anexo I, situación de los cebadores directo, reverso y sonda en el gen 16S rRNA del genoma de una cepa de M. ovipneumoniae. ............................................................................... 42 Anexo II, tabla resumida de datos obtenidos. ............................................................................ 43 Anexo III, pruebas bioquímicas para la identificación de los aislamientos microbiológicos. ......................................................................................................................... 47 ÍDICE DE FIGURAS Y TABLAS Figura 1. Imagen de microscopía electrónica de Mycoplasma spp. ........................................... 8 Figura 2. Cultivo de Mycoplasma spp. .................................................................................... 13 Figura 3. Oligo interno. ........................................................................................................... 15 Figura 4. Clasificación filogenética de los mycoplasmas en función de la secuenciación del gen 16S rRNA. ................................................................................................................... 18 Figura 5. Distribución geográfica del origen de los casos analizados. ..................................... 21 Figura 6. Extractor automático de ácidos nucleicos. ................................................................ 24 Figura 7. Espectros de emisión en moléculas utilizadas para qPCR ........................................ 26 Figura 8. Plásmido utilizado para clonación de pMov. ........................................................... 26 Figura 9. Cultivo e identificación de M .ovipneumoniae. ........................................................ 30 Figura 10. Ensayo dúplex de M. ovipneumoniae y control endógeno. ..................................... 31 Figura 11. qPCR para M. ovipneumoniae, curva estándar. ..................................................... 32 Figura 12. qPCR para M. ovipneumoniae, vista exponencial del gráfico de amplificación. ........................................................................................................................... 32 Figura 13. qPCR para M. ovipneumoniae, estudio de precisión. ............................................. 33 Figura 14. Coeficientes de variación de las distintas diluciones decimales de pMov. ............. 33 Tabla I. Programa térmico de la reacción de qPCR. ................................................................ 27 Tabla II. Cepas autóctonas de M. ovipneumoniae. ................................................................... 27 Tabla III. Panel de especificidad. ............................................................................................. 28 Tabla IV. Resultados del aislamiento microbiológico.............................................................. 30 Tabla V. Presencia de otros mycoplasmas en las muestras positivas a M. ovipneumoniae. ......................................................................................................................... 34 Tabla VI. Presencia de bacterias de interés en las muestras positivas a M. ovipneumoniae. ......................................................................................................................... 35 Tabla VII. Resultados de coinfección cuando se investiga M. ovipneumoniae por cultivo microbiológico. ......................................................................................................................... 35 Tabla VIII. Resultados de coinfección cuando se investiga M. ovipneumoniae por qPCR. ........................................................................................................................................ 35 Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 6 RESUMEN Mycoplasma ovipneumoniae es el agente primario de la neumonía atípica de los pequeños rumiantes, una enfermedad en la que participa simultáneamente con Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida o Bibersteinia trehalosi. El aislamiento microbiológico de M. ovipneumoniae es lento, tedioso y, en ocasiones, no obtiene resultados concluyentes por la dificultad en la interpretación de las pruebas bioquímicas. Este estudio discute el desarrollo y evaluación de una PCR en tiempo real para la detección y cuantificación de M. ovipneumoniae y su relevancia en el diagnóstico de las neumonías atípicas en ganado ovino y caprino. Para ello se diseñaron cebadores y sonda que reconocen específicamente una región del gen que codifica la subunidad 16S del RNA ribosomal. Un fragmento de este gen fue clonado para usarlo como control positivo y cuantificar la reacción. Un panel de 10 cepas referenciadas de M. ovipneumoniae y otros 32 microorganismos donde se incluían otras 4 especies de mycoplasma fueron evaluados. Se estudiaron 123 casos clínicos de procesos respiratorios de ovejas y cabras mediante técnicas moleculares y microbiológicas. La qPCR resultó específica y obtuvo una sensibilidad diagnóstica 3 veces superior al aislamiento microbiológico. Finalmente se encontraron un 18% de casos que podrían sugerir, dada su etiología, una neumonía atípica. Este ensayo se mostró sensible, específico y reproducible por lo que sugerimos su utilización como una herramienta útil en el diagnóstico de rutina de las neumonías de los pequeños rumiantes. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 7 1.- ITRODUCCIÓ. 1.1.- Situación actual del sector de la explotación de la ganadería de pequeños rumiantes en España y Europa. Para España el sector de pequeños rumiantes, ovino y caprino, cobra una relevancia especial. Este tipo de ganadería, con extensa tradición en nuestro país, cuenta con una filosofía de explotación y rendimientos diferente al resto de especies de abasto más intensivas como son el porcino, bovino o las aves. Aspectos demográficos, sociales y las políticas económicas tienen importancia capital en el desarrollo de estas actividades. En este sentido, el cambio de orientación en la concesión de ayudas de la Política Agraria Común (PAC) del año 2000 ha hecho descender claramente los censos de nuestras cabañas ganaderas. (1)Tanto el ovino como el caprino han sufrido un claro retroceso en los últimos años. España contaba con 18,5 millones de cabezas de ovino en 2010, mientras que en 2012 sólo se censaron 16,3 millones. Esto supone una disminución de casi el 12%, sumándose a una tendencia negativa del 10% desde el año 2000. Según los datos facilitados por el Ministerio de Medio Ambiente, Medio Rural y Marino(2), España en 2008 contaba con el 21,9% del total de cabezas de ganado ovino en la Unión Europea (UE) de los 27. En aquel momento únicamente Reino Unido con un 24,4% superaba a España. Este tipo de ganadería se encuentra focalizado sobre todo en países de ámbito mediterráneo como son Grecia (10%), Rumanía (9,8%), Italia (9,1%) y Francia (8,6%) y por ello tienen un contexto social, económico y sanitario singular. Dentro de España, hay comunidades que tradicionalmente se han dedicado más a la explotación de estas especies. El 80% del total de animales de la especie ovina del territorio español se concentra en Castilla y León, Extremadura, Castilla la Mancha, Andalucía y Aragón. En el sector caprino la situación es bastante similar. Los países de la cuenca mediterránea siguen concentrando el grueso de los censos. Grecia (39,8%), España (22%), Francia (10%), Italia (7,6%) y Rumanía (7,6%) focalizan casi el 90% de la población de caprinos de la UE. Dentro de nuestro país las comunidades que concentran mayor número de cabezas son Andalucía (36,3%), Castilla La Mancha (33,3%), Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 8 Canarias (12,4%) y Castilla y León (6,7%). Nuestras tendencias en el consumo de carne evolucionan y el sector caprino español lo ha acusado sobremanera. Desde el año 2002 al año 2008 el consumo de este tipo de carne bajó en casi un 30%. La evolución en el número de cabezas de caprino es similar al de ovino. Mientras que en el año 2010 contábamos con 2,9 millones de animales, en el año 2012 sólo había 2,6 millones, suponiendo un retroceso de un 10% en tan sólo dos años. A la luz de estos datos, que confirman una tendencia clara de disminución en el número de ovejas y cabras, podemos afirmar que un ajuste del sector puede ser necesario. La búsqueda de sistemas productivos más eficientes, la selección de razas con una mejor adaptabilidad al medio, la modernización de las instalaciones, la mejor formación de los ganaderos y la mejora del estado sanitario de nuestras cabañas deben llevar a un cambio de enfoque en el sector hacia un modelo sostenible por sí mismo y económicamente rentable. La investigación desarrollada en este trabajo intenta realizar una pequeña aportación en la mejora del estado sanitario de nuestros animales a través del desarrollo de una nueva herramienta de diagnóstico de problemas respiratorios en pequeños rumiantes, y en concreto de aquellos procesos en los que interviene Mycoplasma ovipneumoniae. Los procesos respiratorios como las neumonías, son un problema notable en los rebaños, bien sea por la muerte de los animales jóvenes, por los malos resultados de los índices de conversión o por el gasto veterinario, lo que supone una merma tanto en la rentabilidad de la explotación como en el bienestar de los animales. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 9 1.2.- Descripción del Mycoplasma ovipneumoniae. Mycoplasma ovipneumoniae pertenece a la clase Mollicutes, caracterizada por la ausencia de pared celular, simplicidad estructural y un genoma pequeño(3). Su tamaño varía desde 0,1 µm a 0,8 µm, su genoma contiene aproximadamente 1 millón de pares de bases (pb.)(4). Este microorganismo es uno de los mycoplasmas que más frecuentemente se aíslan en procesos respiratorios en las especies ovina y caprina(5,6). No obstante, otras especies de mycoplasmas como son Mycoplasma capricolum subsp. caprineumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. capri, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Mycoplasma capricolum subsp. capricolum, Mycoplasma arginini y Mycoplasma agalactiae son frecuentemente identificadas participando de forma concomitante en este tipo de procesos(7). Aunque tradicionalmente se ha descrito al Mycoplasma ovipneumoniae como un patógeno relacionado con procesos aparentemente crónicos y subclínicos(8), en muchas ocasiones su simple crecimiento en los tejidos de animales susceptibles es suficiente para desencadenar una neumonía proliferativa y exudativa(9,10). La célula carece de pared celular pero está limitada por una membrana citoplasmática compuesta por una triple lámina. Figura 1. Imagen de microscopía electrónica de Mycoplasma spp. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 16 excitados con luz ultravioleta para poder ser visualizados. Toda esta manipulación post amplificación incrementa el riesgo de contaminación del área, personal y útiles del laboratorio. Todos estos inconvenientes son superados con la técnica qPCR. La señal de amplificación se va leyendo al final de cada ciclo térmico, por lo que la captación de datos es continua durante todo el proceso en el termociclador. No obtenemos pues una lectura a punto final sino una en tiempo real. Con esta característica ahorramos claramente tiempo de trabajo. No hay procesado post amplificación, no se necesita una matriz de separación, aparataje para el proceso electroforético, reactivos de visualización o preparaciones de tampones de carga o de carrera. Evitamos manipulación del producto amplificado puesto que la reacción se lleva a cabo en tubo o placa sellada que no tiene porque ser abierto. No obstante hay que precisar que los termocicladores equipados con lector de fluorescencia conllevan un mayor coste económico que los convencionales. La PCR en tiempo real, además, permite al investigador llevar a cabo la detección de distintas dianas contenidas en una única muestra. En las reacciones multiplex utilizaremos distintas parejas de cebadores y oligonucleótidos internos que serán marcados con diferentes moléculas fluorescentes. En este trabajo se utiliza una pareja de cebadores y un oligo interno marcado en FAM además de otra pareja de cebadores con su oligo marcado en HEX. El primero detecta el genoma específico del M. ovipneumoniae mientras que el segundo detecta un gen housekeeping (constitucional) que será utilizado como control interno del proceso de extracción y amplificación. Aunque en los orígenes de esta técnica se llegaron a diseñar reacciones multiplex con gran número de reacciones simultáneas, la experiencia de las casas comerciales va reduciendo los ensayos a dúplex o triplex. Problemas de competencia de reactivos por cantidades pequeñas de DNA o la interferencia de las diferentes longitudes de onda de las moléculas fluorescentes han sido las principales dificultades en la utilización de reacciones multiplex. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 17 1.8.- Análisis filogenético de los mycoplasmas basado en el gen codificante para la fracción 16S del RNA ribosomal (rRNA). La clase Mollicutes son organismos procariotas que tiene un tamaño y un genoma anormalmente pequeño. Dentro de esta clase se localizan los mycoplasmas, los cuales constituyen una gran variedad de especies. Hasta el momento más de 90 especies diferentes han sido aisladas en humanos, animales, insectos y plantas(22). Multitud de estudios de filogenia han sido desarrollados en detalle a partir del análisis de la secuencia perteneciente a la región del genoma que codifica la fracción 16S del rRNA(23). Se ha secuenciado esta región en al menos 50 especies de mycoplasmas y microorganismos filogenéticamente próximos y se han establecido las bases para su clasificación filogenética(24). Los mycoplasmas generalmente tienen uno o dos operones de rRNA y la organización de los mismos es, en ocasiones, diferente de otros microorganismos procariotas. La secuenciación y análisis de esta región del genoma es una de las herramientas más útiles para determinar las interrelaciones filogenéticas e identificar los mycoplasmas a nivel de especie. Esto es posible debido a que contiene regiones con secuencias altamente conservadas a nivel de género pero también regiones con alta variabilidad de secuencias a nivel de especie. Esta característica en concreto hace de este gen un candidato ideal para la identificación de género y especie. Conviene poner de relevancia que las moléculas de rRNA forman parte de todos los ribosomas y por ello podrían ser utilizados como diana para estudios de expresión génica. Dada esta función fundamental en la vida de la célula, prevemos encontrar multitud de copias de estas secuencias a lo largo del genoma del mycoplasma, lo que aumenta la sensibilidad del ensayo. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 18 D endograma que representa las relaciones filogen éticas entre cepas de Mollicutes secuenciando la subunidad 16S del rRNA. El dendograma se basó en la secuencia de 554 pb. que contenía información de las regiones variables V6, V7 y V8. Figura 4. Clasificación filogenética de los mycoplasmas en funci ón de la secuenciación del gen 16S rRNA. Bertil Petterson. (35) Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 19 El primer genoma completo de M. ovipneumoniae se publicó en Septiembre de 2011(4). Se describió un genoma con un tamaño aproximado de 10 6 pb con un contenido en Guanina + Citosina de 29%. Describe unas 860 CDS (secuencias putativas codificantes) con una media de 950 pb. cada una. Esto implica que el 80.5% del genoma de los mycoplasmas sea codificante. El genoma de M. ovipneumoniae presenta un único operón 16S-23S rRNA separado del operón 5S rRNA. Otros genes son codificantes de factores de virulencia. Las hemolisinas (hlyA, hlyC), las enzimas productoras de especies reactivas de oxígeno (glpF, glpK y glpD) o las adhesinas (P102, P146, P97 o P76) fueron consideradas como potenciales dianas específicas por su papel clave en la patogenecidad del microorganismo. Sin embargo, la ausencia de una cantidad suficiente de estas secuencias depositadas en las bases de acceso público hizo desechar todas estas opciones. Proteínas de shock térmico (HSP70) han sido evaluadas en otros trabajos(25) pero contaban con gran homología con Mycoplasma hyopneumoniae restándole especificidad al ensayo. Finalmente, varios autores ya han publicado ensayos de PCR convencional para la identificación de especies de mycoplasmas y en concreto para la detección de M. ovipneumoniae a través del gen 16S rRNA(26). Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 20 2.- OBJETIVOS DE ESTE TRABAJO. Habiendo evidenciado las limitaciones del diagnóstico tradicional de los agentes etiológicos de la neumonía atípica, el objetivo de este estudio es proponer una herramienta alternativa para su diagnóstico microbiológico y bioquímico clásico. El trabajo trata de desarrollar y validar una PCR en tiempo real (qPCR) que detecte Mycoplasma ovipneumoniae para el estudio de casos de neumonías remitidos al laboratorio. Además se valorará la presencia concomitante de los distintos agentes etiológicos descritos en la neumonía no progresiva: Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Bibersteinia trehalosi, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma arginini y Mycoplasma mycoides cluster en pulmones de ovino y caprino cuyas lesiones macroscópicas y anatomopatológicas resulten compatibles con neumonía. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 21 3.- MATERIALES Y MÉTODOS. 3.1.- Muestras biológicas. Ciento veintitrés muestras con sospecha de patología respiratoria de etiología infecciosa fueron incluidas en este estudio. Las muestras procedían de explotaciones de ovino/caprino localizadas en 29 provincias diferentes de España y Portugal. Las muestras se recogieron entre el año 2011 y el año 2013. . Por especie animal, 44 de las muestras provenían de caprinos, 78 de ovinos y 1 muestra de cérvido. Las muestras pertenecían a casos diagnósticos remitidos al laboratorio EXOPOL, recibiéndose órganos seleccionados según criterio diagnóstico del veterinario de campo. Atendiendo al tipo de muestra seleccionada, se estudiaron 105 casos de pulmones provenientes de animales ya necropsiados y 18 casos de lavados traqueobronquiales provenientes de animales todavía con vida. Cada caso podía estar constituido por una o varias muestras, nunca analizando conjuntamente más de 5 pulmones o 5 exudados. En la imagen se muestra el número de muestras remitidas desde cada provincia española y Portugal. Dichas muestras provienen de todas las comunidades autónomas exceptuando Islas Baleares, Navarra, País Vasco y Cantabria. Figura 5. Distribución geográfica del origen de los casos analizados. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 22 3.2.- Cultivo microbiológico. 3.2.1.- Aislamiento de mycoplasmas. Para investigar la presencia de Mycoplasma spp. y su posterior identificación, las muestras fueron inicialmente cultivadas en medio sólido modificado Eaton´s. Dicho medio estaba compuesto por 0.035 µg/mL de agar mycoplasma (Oxoid CM401), 4 µL/mL de Tween 80 qp (Panreac 212050), extracto fresco de levadura y además suplementado con suero equino al 20% (BioSciences HA002), 250 µg/mL de Ampicilina (Sigma A9518), 200 µg/mL de acetato de talio (Sigma T8266). Las placas se incubaron en cámara húmeda a 37ºC un máximo de 7 días antes de dar resultado negativo. En caso de crecimiento de colonias compatibles con mycoplasma se hizo una resiembra en el caldo específico para mycoplasmas PPLO (Difco 255420), suplementado con suero equino al 20% (BioSciences HA002), 250 µg/mL de Ampicilina (Sigma A9518), 200 µg/mL de acetato de talio (Sigma T8266) y 1% de rojo fenol (PANREAC 131615). Este cultivo se mantiene a 37ºC un máximo de 48 horas. Las colonias compatibles con Mycoplasma spp. se sometieron a pruebas de ureasa (urea 1%, Panreac), inhibición de crecimiento en presencia de digitonina (digitonina 1,5%, Sigma) y tinción de Diene´s (azure II 1,25%, Sigma; maltosa 10%, Sigma; azul metileno 2.4%)(27) Los cultivos en medio Eaton´s que formaron colonias irregulares y sin centro marcado y además disminuyeron el pH de del caldo PPLO virándolo a amarillo, fueron consideradas como potencial aislamiento de M. ovipneumoniae. 3.2.2.- Aislamiento de otras bacterias de interés. Además de la investigación de mycoplasmas, las muestras fueron sujeto de aislamiento microbiológico. Fueron sembradas en agar sangre Columbia (OXOID PB5039A) y agar McConkey (OXOID CM0115), incubadas a 37ºC durante 24 horas. Tras la incubación las colonias aisladas se identificaron mediante las pruebas bioquímicas citadas en el anexo III. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 23 3.3.- Aislamiento del ácido nucleico de las muestras y su control de calidad. Todas las muestras procedentes de los 123 casos estudiados fueron sometidas a aislamiento de DNA. Las muestras fueron pretratadas con el objeto de obtener una suspensión de células individuales. 3.3.1Pretratamiento de las muestras procedentes de lavados traqueobronquiales. Los lavados traqueobronquiales se procesaron en conjunto cuando fue necesario, nunca más de cinco lavados por pool y siempre del mismo caso. Se tomaron 200 µL de cada uno y se llevaron a microtubo de 1.7 µL. El contenido se homogeneizó y se centrifugó a 10.000xg durante 5 minutos. Se tomaron los 200 µL del precipitado y se llevaron a otro microtubo de 1.7 µL en el que previamente se había dispensado 200 µL de solución tampón fosfato (0.015 M y pH=7.3). A continuación este microtubo se introdujo en el homogeneizador (Magna Lyser, Roche) a 2.500 rpm durante 25 segundos. Tras esta operación se centrifugó a 10.000xg durante 1 minuto y tomamos 200 µL del sobrenadante para seguir adelante con el aislamiento de DNA en el extractor automático 3.3.2.- Pretratamiento de las muestras procedentes de pulmones. Se seleccionó una porción inferior a 0,1 gramos de cada pulmón. Cuando convino, se trabajó en conjunto las muestras, nunca más de 5 pulmones por conjunto y siempre del mismo caso. Esas porciones seleccionadas se depositaron en un microtubo de 1,7 µL con 200 µL de solución tampón fosfato (0,015 M y pH=7.3) y una perla metálica. Este microtubo lo se introdujo en homogenizador (Magna Lyser, Roche) a 2.500 rpm durante 25 segundos. Tras esta operación se centrifugó el microtubo a 10.000xg durante 1 minuto para depositar todos los residuos celulares en el fondo del microtubo. A continuación se tomó del sobrenadante 200 µL para seguir continuar con el aislamiento de DNA en el extractor automático. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 24 3.3.3.- Aislamiento del DNA. Las operaciones propias del aislamiento del DNA a partir de las muestras pretratadas, se llevaron a cabo en un robot de extracción automática. (LabTurbo 36 Compact System C3620)(figura 6) que usa su propio kit comercial de reactivos de extracción (Genomic mini Kit LGD 500). 3.3.4.- Control de calidad del DNA aislado. Análisis de concentración y pureza. Cada ácido nucleico extraído se sometió a un control de calidad mediante técnicas de espectrofotometría de absorción ultravioleta. Para ello se utilizó el espectrofotómetro Quawell UV Q5000 (software 4.0) configurado para medir abosrbancia a λ=230 nm, λ=260 nm y λ=280 nm. El DNA debido a las estructuras aromáticas de sus bases nitrogenadas, absorbe un máximo de radiación ultravioleta a λ=230 nm, mientras que otro tipo de componentes como los compuestos fenólicos o las proteínas absorben a 230 nm y 280 nm respectivamente. Estos últimos componentes son claramente inhibidores de la acción de la DNA polimerasa. Muestras con absorbancias elevadas en λ=230 nm y λ=280 nm o con cantidades de DNA inferior a 5 ng/µL no son admitidas en el proceso de amplificación del DNA. La elección de este tipo de extracción supuso tr es ventajas principales. Primera , la extracción en esta clase de dispositivos es más uniforme y responde a unos estándares de calidad normalizados. Segundo, permite trabajar un número considerable de muestras a la vez, ahorrando tiempo de trabajo del operario. Y por último, al evitar parte de la manipulación de las muestras y reactivos, disminuimos el riesgo de contaminaciones cruzadas entre unas muestras y otras y los propios reactantes . Figura 6. Extractor automático de ácidos nucleicos. (Imagen cedida por Exopol ) . Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 25 3.4.- PCR en tiempo real para la identificación de distintos mycoplasmas 3.4.1.- Ensayo qPCR de Mycoplasma ovipneumoniae. Se llevó a cabo un estudio del genoma de M. ovipneumoniae eligiéndose el gen codificante de la subunidad 16S del rRNA. (ver epígrafe 1.7) Adaptando el trabajo previo de otros autores(26) a las características propias de la PCR en tiempo real con sonda marcada con molécula fluorescente. Para el diseño de los cebadores directo (ovip 2F), reverso (ovip1R) y sonda marcada en FAM (ovip1S) se utilizó una combinación de programas de libre acceso (Primer3Plus http://primer3plus.com/ y Tm calculator de Appliedbiosystems). Las secuencias se muestran a continuación. Para ver situación en el gen ver Anexo I. Ovip2F Primer Forward: 5’- TTTTGGACCGGGATAACCAT – 3´ Tm=59.83 GC%: 45 20pb Ovip1R Primer Reverse: 5´- CTTACTGCTGCCTCCCGTAG – 3´ Tm=58.55 GC%: 60 20pb Ovip1S Sonda: 5´- GCAACATTAGTTAGTTGGTAGGGTAAA – 3´ Tm=58.92 GC%: 37 27pb El producto de esta PCR tiene una longitud de 235 pb. La sonda que se ha utilizado en este estudio tiene dos moléculas con función de desactivación de fluorescencia o quencher (ZEN-IOWA BLACK, PCT US 7803536). La molécula ZEN se coloca entre el noveno y décimo nucleótido empezando por extremo 5´y la molécula IOWA BLACK se coloca en el extremo 3´del oligo interno. En el extremo 5´se marca la sonda con FAM, una molécula fluorescente que tiene su máximo de emisión a una longitud de onda entre 510 y 530 nm. El ensayo finalmente se diseñó en una reacción dúplex, en el que la segunda reacción de PCR en Tiempo Real tiene como diana un gen constitucional o housekeeping(28). Esta segunda reacción contará con una sonda cuya molécula reportera emitirá en una longitud de onda diferente. Concretamente marcaremos este segundo oligo interno con la molécula HEX, que tiene su máximo de emisión entre 560 Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 32 Figura 11. qPCR para M . ovipneumoniae , curva estándar. Grá fica generada por programa StepOne V2.2.2. (Applied Biosystems). Las señales en rojo indican puntos de la recta estándar que corresponde a diluciones decimales de pMov. El rango de valores varía entre 2,0 10 2 a 2,0 10 8 copias por reacción. En azul se representan las muestras clínicas positivas y en verde las cepas de campo autóctonas. Todas ellas se incluyen en el rango dinámico de cuantificación. Gráfica generada por programa StepOne V2.2.2. (Applied Biosystems). Aquí vemos que el valor del umbral (línea naranja) a partir del cual calculamos los valores Cq de cada muestra amplificada puede ajustarse en torno a 200 unidades de ∆Rn. Por debajo de este nivel no encontramos señal de fluorescencia basal o “ruido de fondo” de la amplificación. Figura 12. qPCR para M . ovipneumoniae , vista exponencial del gráfico de amplificación. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 33 Estudio de especificidad: No se obtuvo amplificación en ninguna de las 36 entidades descritas en el panel de especificidad mostrado en la Tabla III. Estudio de precisión: Los datos del estudio de precisión intra ensayo obtuvieron unos coeficientes de variación cuyo rango fue 6,2% - 31,8%. 012345678 1 10 100 CV intraensayo Log10 copy number % Coeficiente variacion Los coeficientes de variación con valores más altos corresponden a las diluciones decimales de pMov con número de copias menor. Obsérvese que los valores de los distintos puntos correspondientes a las diluciones decimales orbitan alrededor de un coeficiente de variación del 10%. Figura 13. qPCR para M . ovipneumoniae , estudio de precisión. Figura 14. Coeficientes de variación de las dist intas diluciones decimales de pMov. Amplificación de 7 dilucio nes decimales con 5 réplicas por dilución. En rojo se señala el valor previsto para cada una de las diluciones. Los puntos azules corresponden a cada una de las amplificaciones realizadas para las 7 diluciones decimales. La mayor dispersión observada se encuentra en la dilución correspondiente a 2,0 10 1 copias por reacción. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 34 4.5.- Validación del ensayo qPCR de M. ovipneumoniae con muestras clínicas. (En el anexo II se muestra tabla resumida de datos de la investigación.) Una vez estudiadas las 123 muestras, tan sólo 14 (11.4%) obtuvieron aislamiento microbiológico de M. ovipneumoniae mientras que por qPCR, 45 muestras (36.6%) fueron positivas. Once casos positivos a M. ovipneumoniae por qPCR mostraron una contaminación tan profusa que impidió el aislamiento microbiológico. Esto supone que un potencial aislamiento se ha visto impedido en el 25% de las muestras positivas por qPCR. De un total de 78 casos de la especie ovina, 20 resultaron positivos por qPCR, lo que supone un 25,6%. En cambio en la especie caprina, de un total de 44 casos, 25 resultaron positivos, dando una positividad del 56,81% Atendiendo a la naturaleza de las muestras biológicas, los lavados traqueobronquiales tuvieron una positividad (83.3%) significativamente mayor que la de los pulmones (28.6%). (p>0.001; Χ 2 =19,26). Estudio de coinfecciones: Coinfecciones por mycoplasmas: Ocho muestras (6,5%) fueron positivas únicamente a M. ovipneumoniae. En cambio, otros mycoplasmas fueron detectados por qPCR en los 45 casos positivos a M. ovipneumoniae. Analizados los 45 casos positivos al ensayo qPCR de M. ovipneumoniae : Mycoplasma detectado nº casos Porcentaje M. mycoides cluster 2 4,4% M. agalactiae 8 17,8% M. arginini 12 26,66% Tabla V. Presencia de otros mycoplasmas en las muestras positivas a M. ovipneumoniae . Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 35 Coinfecciones por otras bacterias de interés en el estudio de neumonías: Otras bacterias de interés fueron detectadas por cultivo microbiológico en los 45 casos positivos al ensayo qPCR de M. ovipneumoniae. Los resultados se detallan a continuación en la Tabla VI. Los resultados de coinfección por las bacterias estudiadas (Pasteurella, Mannheimia o Bibersteinia) con M. ovipneumoniae difieren según la técnica utilizada para la investigación de M. ovipneumoniae, aislamiento microbiológico (ver Tabla VII) o qPCR (ver Tabla VIII). TOTAL 123 MUESTRAS Presencia bacterias estudiadas Ausencia bacterias estudias M. ovipneumoniae POS 11 3 M. ovipneumoniae NEG 41 68 TOTAL 123 MUESTRAS Presencia bacterias estudiadas Ausencia bacterias estudias M. ovipneumoniae POS 31 14 M. ovipneumoniae NEG 22 56 Tabla VII. Resultados de coinfección cuando se investiga M. ovipneumoniae por cultivo microbiológico . Hay una asociación estadística significativa (p<0,005; Χ 2 =8,36) entre la presencia de Mycoplasma ovipneumoniae investigado por técnicas microbiológicas y la presencia de otras bacterias estudiadas. Tabla VIII. Resultados de coinfección cuando se investiga M. ovipneumoniae por qPCR. Hay una asociación estadística muy significativa (p<0,0001; Χ 2 =19,26) entre la presencia de Mycoplasma ovipneumoniae investigado por qPCR y la presencia de otras bacterias estudiadas. Analizados los 45 casos positivos al ensayo qPCR de M. ovipneumoniae : Bacteria coinfectante nº casos Porcentaje P. multocida 10 22,2% M. haemolytica 24 53,3% B. trehalosi 2 4,44% Tabla VI. Presencia de otras bacterias de interés en las muestras positivas a M. ovipneumoniae . Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 36 5.- DISCUSIÓ. La validación experimental del ensayo qPCR de M. ovipneumoniae ofrece resultados satisfactorios. Los valores estadísticos óptimos (31) que nos marcan la calidad de una reacción de qPCR son comparables a los obtenidos (figura 11). La pendiente está muy cerca del valor óptimo -3.32, de tal forma que como se esperaba, cada 10 ciclos aumentamos tres logaritmos decimales la cantidad de copias detectadas. El valor de la intersección con el eje de ordenadas es de 37,779, por lo que nuestro planteamiento de llevar la amplificación hasta 40 ciclos se considera suficiente y acertado. Además, el valor de eficiencia es de 98.129%, próximo al valor óptimo 100%. Además como queda demostrado por los resultados obtenidos (figura 11), el control positivo diseñado y normalizado para la ocasión muestra un rango dinámico de cuantificación en el ensayo que es suficientemente amplio como para recoger todas las muestras analizadas. Tanto cepas como muestras clínicas pueden interpolarse en la recta de estándares de cuantificación elaborada, por lo tanto, queda demostrada la capacidad de cuantificación de esta técnica. Esta bondad de la técnica permitiría utilizar este ensayo de qPCR no sólo para el diagnóstico de M. ovipneumoniae, sino también para valorar a nivel experimental la eficacia de la aplicación de un tratamiento en concreto. Otra característica fundamental de la técnica es la capacidad de obtener información simultánea de distintos mycoplasmas presentes en una muestra. Los cebadores y sonda de los diferentes ensayos aquí descritos se diseñaron con la finalidad de homogeneizar las temperaturas de anillamiento, y así poder verificar todas las reacciones en una misma carrera del termociclador configurando ensayos multiparamétricos. El cultivo microbiológico se demora en dar un resultado concluyente varios días, más aún en el caso de M. ovipneumoniae cuyo crecimiento es lento y tedioso. Sin embargo un resultado por qPCR puede obtenerse en cuestión de horas. Por ello podemos asumir mediante qPCR el diagnóstico rutinario de estos casos de forma rápida y eficaz. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 37 Aunque el análisis, en función de la naturaleza de las muestras, sugiere una mayor sensibilidad diagnóstica en los lavados traqueobronquiales, no se pueden sacar mayores conclusiones si tenemos en cuenta el origen del muestreo. Al no haber diseñado este trabajo bajo un programa experimental aleatorio, no se contó con ambos tipos de muestras en cada caso, impidiendo inferir conclusiones epidemiológicas. Obviamente la situación sanitaria del animal es fundamental y siempre debemos tener en cuenta que el pulmón nos permite hacer un examen de lesiones macroscópicas y anatomopatológicas que complementa el diagnóstico de neumonía. Como era de esperar, este ensayo de qPCR ha mostrado claramente una mayor sensibilidad diagnóstica que el cultivo microbiológico. La qPCR ha detectado como positivos 45 casos mientras que el aislamiento sólo ha tenido éxito en 14. Esto le confiere a la qPCR de M. ovipneumoniae una sensibilidad diagnóstica relativa 3,21 veces mayor, según los resultados de este trabajo. Todos los casos con aislamiento positivo han obtenido amplificación en la qPCR salvo dos muestras. En estos casos puntuales no se obtuvo amplificación de sus controles internos, por lo que se sospecha que el DNA no había sido extraído o conservado de la mejor manera. Vemos pues que 31 casos se hubieran quedado sin un diagnóstico positivo de M. ovipneumoniae con las técnicas usuales de aislamiento microbiológico. Estos datos coinciden con los resultados de otros trabajos en los que se especula que este mycoplasma está claramente infra diagnosticado(21). Argumentamos las siguientes razones para justificar tal diferencia de sensibilidad diagnóstica entre ambas técnicas. Por un lado, los mycoplasmas no viables presentes en las muestras no pueden ser evidenciados mediante cultivo microbiológico, mientras que si su DNA conserva cierta integridad probablemente será detectado por qPCR. Vemos aquí la primera diferencia entre ambas técnicas, mayor sensibilidad de la qPCR pero imposibilidad de diferenciar entre viables y no viables. Por otro lado, como ha quedado reflejado en los resultados (epígrafe 4.1), la contaminación de las muestras es una clara dificultad en el aislamiento microbiológico. En 11 casos positivos a qPCR fue imposible el aislamiento de mycoplasmas por Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 38 excesiva contaminación. Esto podría explicarse por la larga incubación en cámara húmeda unido al hecho de que las necropsias en el campo no tienen las condiciones higiénicas más adecuadas. Para la técnica qPCR no influye de una manera tan crucial la presencia de DNA de otros microorganismos en la investigación de M. ovipneumoniae. Además gracias al diseño del ensayo en dúplex y la medida espectrofotométrica de los DNA, podemos detectar presencia de inhibidores que influirían negativamente en la eficiencia catalítica de la DNA polimerasa o irregularidades en el proceso de aislamiento de los ácidos nucleicos. Finalmente, tal y como se describe en algunas publicaciones, se aisló simultáneamente M. arginini y M. ovipneumoniae(11,20). Se detectó DNA de M. arginini en 25 casos, 12 de ellos junto con DNA de M. ovipneumoniae. La presencia de M. arginini puede enmascarar el crecimiento de M. ovipneumoniae en el medio de cultivo. El crecimiento mucho más rápido del primero dificulta la identificación de las colonias propias del segundo, constituyendo una dificultad más en la identificación de M. ovipneumoniae mediante cultivo microbiológico(32). Este hecho no hace sino constatar la necesidad de desarrollar una técnica suficientemente sensible y específica como la qPCR. Aunque el papel patógeno de M. arginini no es claro(20), podría considerarse como un agente agravante de la enfermedad respiratoria una vez que ésta ya se ha iniciado(33). Por ello resultaría útil diseñar un ensayo multiplex en el que ambos mycoplasmas pudieran ser detectados en una misma reacción de qPCR. Se hallaron 22 casos (17,9%) donde tan sólo se identifican bacterias como Pasteurella, Mannheimia o Bibersteinia. Estos casos son claros candidatos a clasificarlos como neumonías típicas. Tal y como se esperaba, Mannheimia se encuentra con una mayor frecuencia, hasta en 17 ocasiones. En 31 casos, 25,2% del total, se evidencia M. ovipneumoniae junto a Pasteurella, Mannheimia o Bibersteinia. Estos casos, por el contrario, deberían ser considerados como potenciales neumonías atípicas(11). Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 39 Los resultados estadísticos mostraron que había una asociación significativa entre las bacterias de interés estudiadas y M. ovipneumoniae, tanto en la detección por técnicas moleculares como por cultivo microbiológico. Este hecho podría apoyar, en cierta manera, las conclusiones de otros trabajos (11,16) que defienden que M. ovipneumoniae puede predisponer a los animales a una infección por otras bacterias desencadenantes de neumonía. Finalmente, asumiendo el considerable avance que supone para el diagnóstico de estas patologías respiratorias la utilización de técnicas moleculares, una investigación anatomopatológica de los casos se antoja necesaria para confirmar el proceso neumónico. La relación establecida entre los hallazgos lesionales, los resultados moleculares y los aislamientos microbiológicos contribuirían a describir el verdadero papel de todos estos agentes etiológicos. Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 40 6.- COCLUSIOES. El ensayo para la detección y cuantificación de M. ovipneumoniae ha sido diseñado y validado de forma satisfactoria. Se ha demostrado que es una herramienta más específica y más sensible que las técnicas utilizadas hasta ahora. Esta qPCR permite dar un resultado rápido y completamente fiable y por ello proponemos esta técnica para el diagnóstico rutinario de las neumonías atípicas de los pequeños rumiantes. M. ovipneumoniae, P. multocida, M. haemolytica y B. trehalosi están sin duda presentes en los procesos neumónicos de los pequeños rumiantes. Atendiendo a la presencia de estos agentes etiológicos y sus posibles combinaciones, se han investigado un conjunto de 123 casos donde se han descrito neumonías causadas exclusivamente por mycoplasmas (8 casos), potenciales neumonías atípicas (22 casos) y neumonías típicas (31 casos). Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 41 Agradecimientos, Este trabajo no hubiera sido posible sin la colaboración y trabajo de distintas personas. Todas ellas han sido necesarias y por ello debo agradecer y reconocer su mérito en esta investigación. La Dra. Gema Chacón y Rosa Pueyo desarrollaron la labor de toma de muestras y necropsia de los animales remitidos al laboratorio. La Dra. Ana Fernández y Celia Sanz implementaron los cultivos de mycoplasmas y los aislamientos microbiológicos. Agradecer también el consejo de Jorge Javier Cebolla en el diseño y tratamiento in silico de las secuencias de DNA, las operaciones de extracción de ácidos nucleícos de Laura Pradas así como la producción de plásmidos y normalización de los controles positivos a la Dra. Elena de Tomás y Juan Daniel Serrano. Finalmente también me gustaría citar por su labor consejera y supervisora a la Dra. Aleida Villa Espinosa, al Dr. Alfredo Ángel Benito, al Dr. Rafael Baselga y a mi tutor para este trabajo el Dr. Raúl Carlos Mainar. . Mycoplasma ovipneumoniae Real Time PCR Trabajo Fin de Máster 48 7.- BIBLIOGRAFÍA. (1) Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. Gobierno de España. RESULTADO DE LAS ENCUESTAS DE GANADO OVINO Y CAPRINO DE NOVIEMBRE DE 2012 . Available at: http://www.magrama.gob.es/es/estadistica/temas/estadisticasagrarias/Informe_de_Ovino-Caprino_2012_tcm7-286211.pdf, 2012. (2) Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino. Gobierno de España. CARACTERIZACIÓN DEL SECTOR OVINO Y CAPRINO EN ESPAÑA. AÑO 2009. Available at: http://www.magrama.gob.es/app/vocwai/documentos/Adjuntos_AreaPublica/Ca racterizaci%C3%B3n%20del%20sector%20ovino%20y%20caprino%20en%20E spa%C3%B1a.pdf, 2009. (3) Mycoplasma protocols. Totowa, New Jersey: Humana Press; 1998. (4) Yang F, Tang C, Wang Y, Zhang H, Yue H. Genome Sequence of Mycoplasma ovipneumoniae Strain SC01. 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