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Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Trabajo fin de Máster Amaya López Pascual 06/09/2013 Directores: Patricio Fernández Silva Patricia Meade Huerta Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Universidad de Zaragoza Máster en Biología Molecular y Celular 2012-2013 Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 1 Índice Introducción……………………………………………………………………………..3 Características de la mitocondria Origen de la mitocondria DNA mitocondrial en mamíferos Proteínas mitocondriales Rutas metabólicas en la mitocondria El sistema de fosforilación oxidativa Vías alternativas de transporte de electrones Modelos de organización de la cadena de transporte de electrones Patología mitocondrial Terapia de las enfermedades mitocondriales Hipótesis y objetivos…………………………………………………………………...20 Materiales y métodos……………………………………………………………….….21 Muestras biológicas Ácidos nucleicos para genotipado Purificación de mitocondrias de tejidos de ratón Seguimiento de longevidad Ensayos de respuesta al estrés térmico Ensayos de respuesta a dieta hiperlipídica Medidas de actividad motora Actividad del complejo IV (citocromo c oxidasa) por espectrofotometría Expresión de proteína AOX Análisis histológicos Análisis de datos Resultados……………………………………………………………………………..39 Seguimiento de longevidad Ensayos de respuesta al estrés térmico Ensayos de respuesta a dieta hiperlipídica Medidas de actividad motora Actividad del complejo IV (citocromo c oxidasa) por espectrofotometría Expresión de proteína AOX Análisis histológicos Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 2 Discusión……………………………………………………………………………….45 Interpretación de los resultados Falta de correlación y limitaciones Relación con estudios previos Consecuencias, aplicaciones y sugerencias para estudios posteriores Conclusión……………………………………………………………………………...50 Bibliografía…………………………………………………………………..…………51 Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 3 1. Introducción 1.1. Características de la mitocondria Las mitocondrias son orgánulos que forman parte de los organismos eucariotas y se encuentran en el citosol en proporciones variables según el tipo de tejido. Su tamaño varía entre 0,5 y 10 µm de diámetro y hasta 7 µm de longitud. Las variaciones en número se deben a las funciones que desempeñan en los diferentes tejidos en los que se encuentran. Estructuralmente son orgánulos con dos membranas que separan tres compartimentos: citoplasma, espacio intermembrana y matriz mitocondrial (Figura 1). Las funciones que se llevan a cabo en cada una de las membranas son posibles gracias a estos compartimentos. La membrana externa es una bicapa lipídica permeable que permite el paso de iones, metabolitos y otras moléculas pequeñas de hasta 10 kDa y diámetro de unos 2 nanómetros, tiene poca actividad enzimática y contiene alrededor de un 50% en peso de proteínas. A diferencia de ésta, la membrana interna está formada por una barrera muy selectiva, contiene un 70-80% de proteínas y carece de poros por lo que el gradiente de protones se mantiene, permitiendo la producción energética. Esta membrana tiene pliegues denominados crestas mitocondriales, que aumentan notablemente su superficie permitiendo albergar complejos enzimáticos y sistemas de transporte transmembrana, implicados en la translocación de moléculas. Entre las proteínas que componen la membrana interna se encuentran las que forman la cadena de transporte de electrones, imprescindible para el sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS). El espacio intermembrana tiene una alta concentración de protones como resultado de la función de los complejos enzimáticos de la cadena respiratoria. Además se encuentran enzimas que intervienen en la transferencia del enlace de alta energía del ATP, como la creatina quinasa o la adenilato quinasa, así como moléculas de transporte. En la matriz mitocondrial se encuentran los metabolitos que se utilizarán en la obtención de energía, así como el DNA mitocondrial (mtDNA) y moléculas necesarias para la repliación, transcripción y traducción del material genético. La presencia de un genoma propio es una característica de las mitocondrias que determina una biogénesis especial con respecto al resto de la célula. El DNA del orgánulo es circular de doble cadena, se replica y transcribe en la matriz mitocondrial, y suelen existir varias moléculas por orgánulo. El número de copias del mtDNA es variable en función del tipo y de las necesidades energéticas de la célula, siendo en mamíferos del orden de 10 310 4 Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 4 moléculas por célula. En la matriz mitocondrial se producen las reacciones de diferentes rutas metabólicas, entre ellas la beta-oxidación de ácidos grasos y el ciclo de Krebs. Debido a estas características las mitocondrias pueden llevar a cabo una serie de funciones indispensables que desencadenan en la obtención de la mayor parte de la energía necesaria para la célula por medio de la fosforilación oxidativa [1]. Figura 1. Mitocondrias: A: estructura, B: micrografía electrónica de transmisión (MET) y C: micrografía electrónica de barrido (SEM). 1.2. Origen de la mitocondria Un grupo de científicos estadounidenses, con Lynn Margulis a la cabeza, recuperó en 1967 una antigua hipótesis, reformulándola como Teoría de la Endosimbiosis Seriada [2]. Según la teoría, las mitocondrias son orgánulos derivados de la endosimbiosis de un organismo del grupo de las α-proteobacterias con un ancestro de una célula eucariota que contenía un núcleo. Se estima que este hecho, que sucedió hace unos 1500 millones de años, se produjo debido a la fusión de una célula procariota heterótrofa que empleaba el oxigeno molecular como oxidante, con una eucariota primitiva al ser fagocitada sin ser digerida de forma inmediata. Así se estableció una simbiosis permanente entre las células intercambiando producción de energía en forma de ATP (proporcionada por el simbionte procariota) por un medio rico en nutrientes (de la célula hospedadora). La A B C Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 5 simbiosis se podría dar por acabada en el momento en el que la célula simbionte llega a formar parte del organismo hospedador convirtiéndose en la mitocondria. Esta teoría explica en parte la similitud de estructura y fisiología entre α-proteobacterias y mitocondrias. Con la evolución de las células eucariotas la mayoría de los genes mitocondriales han sido transferidos al núcleo, por lo que la mitocondria no sería viable fuera de la célula hospedadora y ésta no suele serlo sin mitocondrias. 1.3. DNA mitocondrial en mamíferos Las mitocondrias tienen su propio sistema genético que codifica un pequeño número de proteínas que forman parte del sistema de fosforilación oxidativa, mientras que la mayoría están codificadas en el núcleo. La biogénesis de la mitocondria requiere de la expresión coordinada de los dos sistemas genéticos celulares, nuclear y mitocondrial. Los mecanismos básicos de replicación y transcripción del mtDNA, además de los elementos y proteínas implicadas, están bastante bien caracterizados. El mtDNA fue descubierto en 1963 [3] pero no se describió su secuencia completa en humanos y ratón hasta 1981 [4, 5]. Su secuencia se ha ido revisando y completando para diferentes especies con el paso de los años [6, 7]. Por tanto, la biogénesis de las mitocondrias es un caso único en la célula animal ya que se encuentra controlado por dos sistemas genéticos celulares que deben actuar de forma coordinada. El genoma mitocondrial de mamíferos (Figura 2) es una molécula circular cerrada de doble cadena alrededor de 16 Kb con una organización genética muy compacta. Este genoma carece de intrones y los genes se suceden sin la existencia de material genético no codificante a excepción de una pequeña región denominada bucle de desplazamiento (D-loop) de unas 1000 pb que contiene la mayoría de los elementos de control de la replicación y la transcripción. El mtDNA humano, tomado como modelo de todos los mamíferos, consta de 16569 pb, cuya secuencia se conoce en su totalidad [4], codifica 37 genes: 2 RNA ribosómicos (rRNAs), 22 RNA de transferencia (tRNAs) y 13 polipéptidos integrantes de los complejos multienzimáticos del sistema OXPHOS, siete de los 46 polipéptidos del complejo I o NADH ubiquinona oxidoreductasa (ND: 1, 2, 3, 4L, 4, 5 y 6), uno de los 11 polipéptidos del compejo III o ubiquinol citocromo c oxidoreductasa (cytb), tres de los 13 del complejo IV o citocromo c oxidasa (COXI, COXII y COXIII) y dos subunidades de las 16 de la ATP sintasa o complejo V (ATP6 y ATP8). Los genes de los tRNAs se localizan separando los rRNAs y los mRNAs. El Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 6 resto de los genes que codifican para las aproximadamente 1500 proteínas que posee la mitocondria se codifican en el nDNA [4]. Las dos cadenas del mtDNA se pueden separar por gradientes alcalinos de cloruro de cesio dado que poseen un contenido diferente de bases guanina y timina, lo que proporciona a cada cadena una densidad distinta y así se puede distinguir la cadena pesada (H, heavy) de la ligera (L, light) [8]. Ambas cadenas son codificantes y cada una posee su propio origen de replicación. La cadena H, llamada así por su mayor contenido en guanina, alberga la información necesaria para la síntesis de los 2 rRNAs, 14tRNAs y 12 polipéptidos, mientras que la cadena L, llamada así por su mayor contenido en citosina, contienen la información para 8 tRNAs y el polipéptido que queda (ND6 del complejo I). La disposición de los tRNAs en las cadenas es muy particular ya que separan los distintos polipéptidos y rRNAs [9] siendo importantes para el procesamiento de los transcritos mitocondriales que son inicialmente policistrónicos [10-12]. Figura 2. mtDNA. En la imagen A un mapa del genoma mitocondrial humano. Los genes codificantes de las subunidades del complejo I aparecen en azul, las del complejo III en verde, las del complejo IV en rojo, y las del complejo V en amarillo. Las dos subunidades de rRNA en morado y los 22 tRNAs en líneas negras y especificados por la letra que los codifica (según el aminoácido que transfieren). El bucle de desplazamiento (D-loop), o región no codificante de control, contiene secuencias vitales para el inicio de la replicación y transcripción del mtDNA, incluyendo el origen de replicación de la cadena pesada (O H ). El origen de replicación de la cadena ligera aparece como O L . En la imagen B una micrografía electrónica de transmisión del mtDNA. A B Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 7 El mtDNA difiere del nDNA debido a una serie de características entre las que destaca la presencia de un código genético mitocondrial relativamente diferente del código genético universal [13]. Además, tiene una alta tasa de mutación (más de 10 veces superior al nDNA) que se atribuye a su exposición a las especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas en el interior de la mitocondria, la presencia de muchas copias por célula (poliploidía) y a la ausencia de sistemas eficientes para su reparación [14]. Además, tiene un modo de organización y expresión muy específico (sin intrones), y un modo de transmisión muy especial. Así, el genoma mitocondrial se hereda por vía materna, puesto que las mitocondrias de los espermatozoides se degradan selectivamente y permanecen únicamente las mitocondrias que se derivan del óvulo. Este modo de herencia impide la recombinación de los genomas mitocondriales paternos. Este hecho podría haber contribuido, junto con la alta tasa de producción de ROS en el interior de la mitocondria, a la migración de genes mitocondriales al núcleo, donde pueden sufrir recombinación y eliminar más fácilmente variantes deletéreas [9, 15]. En los animales, los únicos genes que han permanecido en la mitocondria están asociados a la función de síntesis de energía en forma de ATP a través del sistema OXPHOS. Otra característica interesante es la posibilidad de coexistencia de varias formas alélicas de mtDNA en un mismo individuo, pudiendo diferir su proporción relativa según el tejido (heteroplasmia). La coexistencia de varias moléculas de mtDNA por mitocondria y de numerosas mitocondrias por célula origina una situación particular, diferente de la del núcleo para la dosis de variantes alélicas (Figura 3). Así, una mutación en un mtDNA creará una población mezclada de moléculas de tipo salvaje y mutante. El porcentaje de heteroplasmia puede variar y, en principio, el reparto de mitocondrias a las células hijas en la división celular es al azar, lo que puede provocar variaciones en los porcentajes de mutación a lo largo de los linajes celulares (segregación replicativa). La heteroplasmia en los diferentes tejidos de un mismo individuo suele hacer necesaria la necesidad de alcanzar un umbral de DNA mutante para que empiecen a manifestarse los efectos patológicos de la mutación [9-16]. El mtDNA es altamente polimórfico, presentando diferencias genéticas entre individuos de la misma especie, sobre todo entre diferentes grupos étnicos en el caso de humanos. Los haplotipos de mtDNA se basan en patrones específicos de polimorfismos que se están investigando en relación con procesos como la motilidad espermática [17], el Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 8 envejecimiento [18], la susceptibilidad a diversas enfermedades [12] o la expresión de algunas mutaciones del mtDNA [19]. En general, cada mitocondria contiene varias moléculas de mtDNA en asociación con proteínas formando unos complejos conocidos como nucleoides que contienen entre 2 y 10 moléculas de mtDNA. El factor de transcripción mitocondrial A (mTFA o TFAM), la proteína de unión al DNA de hebra sencilla (mtSSB), la helicasa Twinkle y la DNA polimerasa gamma (POLG), entre otras proteínas, son parte de estos nucleoides [9]. Se ha descrito que la organización del mtDNA en los nucleiodes es importante durante la segregación y afecta al grado de heteroplasmia [20]. Figura 3. Selección genética mitocondrial. En la producción de oocitos primarios una serie de moléculas de mtDNA se transfieren a cada oocito. Durante la maduración se produce una replicación rápida, que al amplificar las moléculas puede derivar en cambios aleatorios entre generaciones con niveles variables de mtDNA mutante. Las mitocondrias con mtDNA mutado están en rojo mientras que las de genotipo salvaje están en verde. 1.4. Proteínas mitocondriales Las mitocondrias contienen cientos de proteínas diferentes (en mamíferos se estima que alrededor de 1500), de las que sólo alrededor de un 1% están codificadas por el mtDNA [4, 10]. El resto están codificadas por genes nucleares y sintetizadas por ribosomas citosólicos. Debido a la estructura de membranas de la mitocondria el importe de proteínas es más complejo que la transferencia de moléculas a través de las bicapas Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 15 1.9. Patología mitocondrial Las enfermedades mitocondriales, y más específicamente las enfermedades debidas a defectos del sistema OXPHOS, constituyen en conjunto uno de los desórdenes metabólicos innatos más frecuentes, aunque se consideran enfermedades raras por su baja prevalencia en la población. Debido al doble control genético, los defectos en el sistema OXPHOS pueden ser debidos a mutaciones en el mtDNA o en nDNA, y manifiestan una gran variedad de fenotipos clínicos, que aparecen en la infancia o en la edad adulta. Estos defectos pueden afectar a diferentes tejidos y órganos, de una manera específica de tejido o multisistémica. Sin embargo, los tejidos con alta demanda energética como cerebro, corazón y músculo esquelético son más vulnerables de sufrir efectos perjudiciales, mientras que riñón, hígado, ojo, médula ósea, páncreas y sistema nervioso periférico pueden verse afectados aunque sucede en menos ocasiones. Las enfermedades mitocondriales son patologías que tienen en común un defecto de síntesis de ATP y pueden clasificarse en cuatro categorías dependiendo del tipo de mutación que las provoca: grandes reorganizaciones del mtDNA, mutaciones puntuales en tRNAs y rRNAs, mutaciones de genes que codifican proteínas mitocondriales y mutaciones en genes nucleares. En el caso de mutaciones del mtDNA, esta heterogeneidad de los desórdenes mitocondriales es consecuencia de la herencia materna, la heteroplasmia, la segregación replicativa y el efecto umbral. Desde hace varias décadas se están estudiando las características estructurales e histoquímicas de tejidos afectados por patologías mitocondriales y su relación con la alteración del mtDNA [35]. Las mutaciones descritas en el mtDNA están recogidas en MITOMAP (http://www.mitomap.org). Grandes reorganizaciones del mtDNA En este grupo se engloban normalmente las deleciones o duplicaciones espontáneas en el mtDNA, presentándose en heteroplasmia con una proporción de mtDNA mutado variable en función del tejido. Estas mutaciones están asociadas a diferentes patologías con un fenotipo característico: el Síndrome de oftalmoplejia externa progresiva crónica (CPEO), el Síndrome de Kearns-Sayre (miopatía, oftalmoplejia, cardiomiopatía) y el Síndrome de Pearson (anemia macrocítica, trombocitopenia, neutropenia, acidosis láctica). Todas estas patologías tienen en común grandes deleciones de entre 1 y 9 Kb que se localizan en el arco comprendido entre los dos orígenes de replicación pero sin incluirlos, aunque implican la eliminación completa de algún tRNA. Las deleciones no Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 16 suelen heredarse pero las duplicaciones pueden transmitirse genéticamente vía materna. Las duplicaciones forman dímeros de mtDNA normal y delecionado, que son menos frecuentes pero heredables [9, 12]. Mutaciones puntuales en tRNAs o rRNAs Aproximadamente la mitad de las mutaciones descritas en el mtDNA se localizan en los genes codificantes de tRNAs. Se ha observado que mutaciones en los genes de tRNAs producen gran variedad de defectos que se asocian con síndromes como el MERRF (síndrome de epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas rasgadas) o el MELAS (encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y accidente cerebrovascular), mientras que las mutaciones en los genes de rRNAs se han asociado principalmente a fenotipos de sordera, sobre todo tras el tratamiento con aminoglicósidos. También se han descrito mutaciones responsables de la intolerancia al ejercicio y de la aparición de CPEO [12]. Mutaciones en genes que codifican proteínas mitocondriales Suelen ser pequeñas deleciones puntuales en las proteínas que codifican las subunidades que forman los complejos de la cadena respiratoria, provocando una deficiencia del complejo del que forman parte. Algunas patologías causadas por estas mutaciones son la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), el Síndrome de Leigh y la retinitis pigmentosa (NARP). Estos desórdenes clínicos tienen como fenotipos característicos la neuropatía óptica (LHON), encefalopatía y acidosis láctica (Leigh), neuropatía, ataxia y retinitis pigmentosa (NARP) [9,12]. Mutaciones en genes nucleares Se caracterizan por tener un patrón de herencia mendeliano y dan lugar a patologías análogas a las producidas por los genes mitocondriales. Muchos genes pueden verse afectados, desde subunidades estructurales de los complejos de la cadena respiratoria, factores de ensamblaje, chaperonas, hasta genes implicados en el mantenimiento, replicación y traducción del material genético mitocondrial. Mutaciones que afectan al Complejo IV Debido a que el objetivo de este trabajo de máster es el estudio de la terapia génica de enfermedades mitocondriales en las que se ve afectado el complejo IV, a continuación se explican con algo más de detalle las patologías asociadas al mismo. La deficiencia en Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 17 COX es uno de los defectos de la cadena respiratoria más común en humanos y se asocia con distintos fenotipos debido a causas genéticas heterogéneas. Las mutaciones en subunidades estructurales codificadas en el mtDNA que afectan al ensamblaje o estabilidad del complejo se asocian a un amplio rango de fenotipos incluyendo miopatía, MELAS, encefalomiopatía y fallo neuronal [36]. La primera mutación en una subunidad estructural codificada en el genoma nuclear fue descrita en dos casos de encefalopatía mitocondrial y deficiencia aislada en COX [37]. Hasta entonces, se pensaba que las mutaciones en proteínas estructurales nucleares del complejo IV eran incompatibles con la vida extrauterina. En cuanto a las mutaciones en factores de ensamblaje de complejo IV se han descrito en varios de ellos, y también se dispone de modelos animales para el estudio de alguno de estos defectos. En el estudio en curso en el que se enmarca el proyecto de Máster se están utilizando dos modelos con defectos en el complejo IV causados por la eliminación de dos de estos factores de ensamblaje, Cox10 y Cox15. El gen COX10 codifica una hemo A:farnesiltransferasa, que cataliza el primer paso en la conversión de protohemo a hemo A del grupo prostético de la enzima, y se basa en la transferencia de un grupo farnesilo al grupo vinilo en posición dos del hemo B [38]. Por otro lado, el gen COX15 cataliza el segundo paso de la conversión a hemo A, que consiste en la hidroxilación del grupo metilo en posición ocho de la molécula protohemo [41]. En concreto, mutaciones en COX10 pueden determinar leucodistrofia y tubulopatía renal [38], síndrome de Leigh o cardiomiopatía hipertrófica infantil fatal [39, 40]. Mutaciones en COX15 también pueden causar cardiomiopatía hipertrófica infantil fatal [41] o síndrome de Leigh [42, 43]. 1.10. Terapia de las enfermedades mitocondriales Actualmente no existe una terapia efectiva para las enfermedades mitocondriales, y las estrategias disponibles son solo terapias paliativas. Entre ellas, la suplementación de la dieta (carnitina, CoQ, tiamina, succinato, ácido fólico), la eliminación de metabolitos nocivos (lactato), la administración de antioxidantes, el tratamiento de los síntomas mediante ejercicio, cirugía (implantes cocleares, transplante hepático o cardíaco, corrección de ptosis) y el consejo genético. Algunas perspectivas terapéuticas actuales se basan en el aumento de la biogénesis mitocondrial, y por consiguiente el número de mitocondrias, mediante la estimulación de coactivadores de la transcripción mitocondrial [44]. Otra estrategia prometedora es la manipulación de la dinámica Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 18 mitocondrial, mediante agentes farmacológicos. Las mitocondrias tienen gran capacidad para fusionarse, dividirse y redistribuir los nucleoides, logrando incluso la complementación entre diferentes moléculas de mtDNA. Se ha propuesto que aumentando los procesos de fusión, podría alcanzarse una complementación funcional entre diferentes moléculas de DNA mitocondrial y al mismo tiempo, debido a la estrecha relación de este proceso de fusión con la autofagia, eliminar las mitocondrias que contienen elevados niveles de mtDNA mutante [45]. Otro grupo de aproximaciones terapéuticas proponen el uso de distintas estrategias de terapia génica como posible alternativa para el tratamiento de las enfermedades mitocondriales. Entre ellas encontramos la eliminación del gen mutante (mediante el uso de enzimas de restricción dirigidos a la mitocondria y que cortan específicamente las copias mutadas), la introducción del gen sano para su expresión en el citoplasma e importe a la mitocondria (expresión alotópica) y la xenoexpresión de enzimas alternativas (procedentes de otros organismos). Este último método se ha estudiado en el grupo de investigación GENOXPHOS como terapia para las enfermedades mitocondriales basada en el uso de vías alternativas al transporte electrónico en la cadena respiratoria y es el objeto de la presente memoria. Las investigaciones desarrolladas en el estudio de las enfermedades mitocondriales se han dirigido hacia la obtención de líneas de ratones que porten mutaciones para dar lugar a fenotipos equivalentes a los de las distintas enfermedades mitocondriales humanas. Este esfuerzo investigador permitiría disponer de modelos para avanzar en el conocimiento de estas enfermedades y ensayar posibles aproximaciones terapéuticas. Se avanzaría así con respecto a los modelos más usados hasta ahora, basados en cultivos celulares derivados de tejidos procedentes de pacientes y que presentan muchas limitaciones. Actualmente se dispone de estirpes de ratones portadores de mutaciones, creadas por técnicas de recombinación homóloga, para genes nucleares que codifican numerosos genes involucrados en funciones y estructuras mitocondriales, entre ellos las citadas que afectan al complejo IV. Aunque no es posible la creación de mutantes para genes individuales codificados en el mtDNA con las técnicas clásicas de mutagénesis aplicables al núcleo, se ha conseguido introducir mutaciones en el mtDNA siguiendo estrategias de fusión entre citoplastos (células enucleadas) que portan la mutación y, células madre embrionarias o cigotos. Estas mutaciones son heredables y afectan a las subunidades del complejo III, IV y tRNAs. Estos modelos, cuya obtención sigue siendo Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 19 un objetivo del grupo, servirían también para el ensayo de la estrategia de xenoexpresión. La expresión de la oxidasa alternativa AOX podría proporcionar una opción en el caso de deficiencias que afecten a los complejos III y IV. Esta enzima ha sido expresada en células humanas sanas en cultivo, comprobando que su expresión no resulta tóxica y las hace parcialmente resistentes al cianuro y a la antimicina A, inhibidores de los complejos IV y III, respectivamente [46]. Dicha oxidasa alternativa permite la supervivencia de moscas que tienen disminuida parcialmente la expresión del factor de ensamblaje del complejo IV Surf1, así como compensar el fenotipo de una cepa de Drosophila que contiene una mutación en el gen homólogo al humano Park7 relacionado con la enfermedad del Parkinson [47]. La xenoexpresión simultánea de la proteína AOX y una NADH deshidrogenasa (NADI1) en una línea celular carente de mtDNA (rho cero o ρ o ) permitió restablecer el transporte electrónico desde NADH hasta oxígeno molecular [48]. Además de la función respiratoria, se restablecieron vías metabólicas adyacentes como la síntesis de pirimidinas. Sin embargo, no se recuperó el bombeo protónico, ya que ninguna de estas proteínas cumple esta función, por lo que la compensación funcional de la cadena respiratoria fue incompleta. Para restaurarla, y así establecer un potencial de membrana para la síntesis de ATP, se podría desarrollar una estrategia de xenoexpresión con proteínas con función de bombeo de protones. La expresión de AOX en el modelo de ratón permite el estudio del potencial terapéutico de dicha proteína como terapia génica en mamíferos con defectos del sistema OXPHOS. Por ello, en el presente proyecto Máster se abordó el estudio de un modelo de ratón knock-in para AOX y del modelo resultante de cruzar dicho knock-in con animales knock-out para factores de ensamblaje del complejo IV de la cadena respiratoria (COX10 y COX15). Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 20 2. Hipótesis y objetivos 2.1. Hipótesis Nuestra hipótesis, basándonos en los resultados obtenidos in vitro, es que cuando la enzima monopeptídica AOX se exprese en un animal que tenga interrumpida su cadena respiratoria a nivel de los Complejos III ó IV, restaurará el paso de electrones hasta el oxígeno, disminuyendo la producción de ROS y recuperando al mismo tiempo la actividad del Complejo I y de otras rutas metabólicas esenciales que dependen de dicha cadena y con ello mejorando la sintomatología. 2.2. Objetivos 1. Completar la caracterización funcional de AOX en los ratones knock-in comparando con el genotipo salvaje. 1.1. Seguimiento en el tiempo para determinar la longevidad. 1.2. Ensayos de respuesta al estrés térmico. 1.3. Ensayos de respuesta a la dieta hiperlipídica. 2. Estudiar la posible compensación por AOX del fenotipo patológico en dos modelos knock-out para el complejo IV específicos de músculo (COX10 y COX15). 2.1. Ensayos de actividad motora. 2.2. Análisis de la actividad de la cadena respiratoria (complejo IV). 2.3. Análisis de la expresión de la proteína AOX. 2.4. Análisis histológico del músculo esquelético. Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 21 3. Material y métodos Metodología general En primer lugar se describen los métodos que se siguieron para la obtención de los ratones transgénicos, así como la extracción de DNA y mitocondrias de los mismos. 3.1. Muestras biológicas Los ratones knock-in para AOX (KI AOX o KI) se generaron en varios pasos mediante ingeniería genética. El cDNA procedente del hongo Emericella nidulans, fue recodificado e integrado en el genoma del ratón bajo la influencia del promotor Rosa26 que hace que su expresión sea constitutiva y ubicua. También se le añadió el epítopo de la Hemaglutinina del virus de la gripe al extremo carboxilo terminal para facilitar su inmunodetección y la resistencia a la neomicina para seleccionar los cíbridos. El transgen contiene un cassette STOP flanqueado por sitios loxP, seguido del cDNA de AOX y un cassette de resistencia a neomicina que está flanqueado por sitios FRT (Figura 6A). Se introdujo el transgen en células madre embrionarias (ES) por recombinación homóloga en el locus Rosa26 y las células ES seleccionadas fueron inyectadas en blastocistos. Cruzando los ratones portadores del transgen con ratones que expresan Flp recombinasa se escindió el cassette de selección por el sistema de recombinación específica de sitio con el sistema Flp-FRT (flippase recognition target). Por último, cruzando los ratones portadores del transgén con ratones que expresaban Cre recombinasa (con un promotor Cre constitutivo), se produjo la recombinación específica de sitio en los sitios loxP, eliminando el cassette STOP (Figura 6A). Para el objetivo 1, las crías resultantes de estos cruces se genotiparon y caracterizaron como se describe más adelante. Para la realización del segundo objetivo del presente proyecto se contó con dos modelos de ratones knock-out para las proteínas específicas del complejo respiratorio IV. El ratón knock-out para la proteína Cox10 (KO COX10) cedido por el Dr. Carlos Moraes (Univ. Miami-USA) y el ratón knock-out para la proteína Cox15 (KO COX15) cedido por el Dr. Massimo Zeviani (Istituto Carlo Besta, Milán), ambos presentan un severo defecto respiratorio. El ratón knock-out COX10 se generó eliminando el exón 6 del gen con el sistema CreLoxP (Figura 6B) [49]. En el ratón KO COX15 se eliminaron los exones 1 y 2 (Figura 6C) [44]. En ambos casos los sitios loxP flanqueando el gen se introdujeron en células Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 22 ES por recombinación homóloga. Después se eliminó el cassette de selección con la Cre recombinasa para obtener el gen “floxeado”. Posteriormente, estas células ES se inyectaron en blastocistos para producir ratones quiméricos y así obtener una transmisión en línea germinal del gen “floxeado”. Por último, se escindió el gen in vivo cruzando el ratón “floxeado” con animales transgénicos que expresaban Cre recombinasa de forma específica en musculo esquelético [44, 49]. Figura 6. Generación del ratones transgénicos. A: Pasos que se siguieron para introducir el gen AOX. B: locus COX15 salvaje y eliminado del genoma por el sistema Cre-LoxP. C: locus COX10 y mapa de restricción con los sitios LoxP indicados con triángulos negros. Ambas líneas de ratones knock-out se han cruzado con los ratones knock-in AOX para crear modelos knock-in–knock-out (KI-KO). Concretamente, los ratones con el transgen AOX se cruzaron con ratones que expresaban Cre de forma específica en músculo esquelético por un lado, y de forma independiente con ambos ratones KO para obtener las diferentes posibilidades que se muestran en los cruces representados en la Figura 7. A B C Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 23 Figura 7. Cruces. Izquierda: Expresión AOX en miopatía COX15 (-/-) con recombinación por Cre específica de músculo (3 rondas de cruces = 6 meses). Derecha: Expresión constitutiva AOX en COX10 (-/-). Efecto en letalidad embrionaria (3 rondas de cruces = 6 meses). Los ratones knock-in para AOX utilizados en este trabajo fueron criados en el animalario de la Unidad Mixta de Investigación de la Universidad de Zaragoza donde se han mantenido bajo condiciones de temperatura y humedad adecuadas. Los ratones knock-out KO COX10 y KO COX15 y los KI-KO resultantes del cruce de los primeros con el ratón KI AOX, fueron criados en el animalario del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) en colaboración con el grupo del Dr. José Antonio Enríquez. 3.2. Ácidos nucleicos para genotipado Extracción de DNA de tejidos El genotipado de los ratones utilizados en nuestro trabajo se realizó siguiendo el protocolo de extracción de DNA cedido por Mark Strunk, técnico superior del Servicio Científico Técnico de Genómica Funcional del IACS. Las muestras correspondían a dedos de las crías que venían en tubos Eppendorf procedentes del animalario de la Unidad Mixta de Investigación de la Universidad de Zaragoza. A cada muestra se le añadió 50 µl de solución de lisis alcalina (25 mM NaOH y 0,2 mM EDTA) y se agitaron en un vortex, seguidamente se centrifugaron unos segundos en microcentrífuga y se incubaron primero a 65ºC durante 30 minutos y después a 98ºC durante otros 15 minutos. A continuación, se dejaron en un baño de hielo durante 5 minutos, se volvieron a centrifugar unos segundos y a cada muestra se añadió 50 µl del reactivo de neutralización (40 mM de Tris-HCl a pH=4) y se agitaron en un vortex, seguidamente se centrifugaron durante un minuto en microcentrífuga a 14000 xg. El último paso fue Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 24 tomar 80 µl del sobrenadante con mucho cuidado de no arrastrar nada de la fase inferior en la que quedaban los restos procedentes de la digestión y el tejido biopsiado, y se pasaron a nuevos tubos Eppendorf correctamente etiquetados y estériles que se almacenaron hasta su uso a -20ºC. La extracción de DNA a partir de homogenado de tejido tras el sacrificio de los ratones se realizó por el siguiente método. Con el fin de extraer DNA total procedente de cada órgano se añadió al tejido cortado tampón de digestión a una concentración de 12 µl/mg tejido (10 mM Tris-HCl pH=8, 25 mM EDTA pH=8, 100 mM NaCl y 0,5% SDS) y se trataron con proteinasa K para una concentración final de 0,1 mg/ml. Esta mezcla se incubó a 37ºC durante toda la noche con agitación. A continuación se añadió Ribonucleasa A a una concentración final de 10 µg/ml, y se incubó a 37ºC durante 60 minutos o a 60ºC durante 15 minutos y se procedió a realizar las extracciones. Primero se extrajo con un volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), se agitó en vortex 15-30 segundos y se centrifugó en microcentrífuga a 10000 xg 5 minutos. Tras pasar la fase acuosa (superior) a otro tubo se extrajo con un volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), se volvió a agitar en vortex 15-30 segundos y se centrifugó en microcentrífuga a 10000 xg 5 minutos. Se volvió a recoger la fase acuosa y se precipitó con 1/2 volumen de acetato de amonio 7,5 M y dos volúmenes de etanol 99% frío. Una vez mezclado por inversión se incubaron las muestras a -20ºC durante toda la noche o a -80ºC durante 3 horas. Después de centrifugar durante 30 minutos a 13000 xg, se eliminó el etanol por decantación, se lavó con 500 µl de etanol 70%, se decantó y el pellet se resuspendió en agua destilada (Gibco). Cuantificación de ácidos nucleicos La concentración de los ácidos nucleicos obtenidos a partir de los métodos anteriormente citados, se determinó mediante espectrofotometría visible ultravioleta (VIS-UV) con ayuda de un sistema NanoVue Plus (GE Healthcare) (Figura 9). Antes de su uso se debe calibrar el aparato, para ello se cargaron 2 µl de agua destilada repitiéndose la operación dos veces, para verificar el valor cero de absorbancia. Una vez calibrado el aparato, se cargaron 2 µl de muestra a cuantificar en la zona de carga y el aparato determinó la concentración en ng/µl y las relaciones de pureza según la absorbancia a la longitud de onda a la que absorben ácidos nucleicos y proteínas. Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 31 Metodología para el análisis de la compensación del fenotipo patológico Para llevar a cabo el segundo objetivo, estudiar la posible compensación por AOX del fenotipo patológico en dos modelos knock-out para el complejo IV específicos de músculo (COX10 y COX15), se realizaron medidas de actividad motora con los animales, mientras que con las muestras biológicas tras el sacrificio se analizó la actividad del complejo IV, la expresión de proteína AOX y la morfología histológica. 3.7. Medidas de actividad motora Se llevaron a cabo estudios de comportamiento en animales vivos con ratones de genotipo salvaje (n=10), KI (n=7), KO (n=15) y KI-KO (n=13) para comparar su función motora y diferenciar el fenotipo sano del enfermo. Estos ensayos medían la coordinación, fuerza y actividad basal de los ratones y se realizaron en el Servicio Científico Técnico de Valoración Funcional del IACS. En el ensayo de coordinación se hizo correr a los ratones dos veces por semana hasta un total de 12 pruebas en un RotaRod (Panlab) (Figura 8) durante 3 minutos a 15 rpm y se registró el número de caídas de cada animal en ese intervalo de tiempo. Antes de someter a los ratones a la prueba se les entrenó durante 10 días en el RotaRod a la misma velocidad y tiempo que se usarían en la prueba. Transcurrido el periodo de entrenamiento en el cual los ratones se acostumbran al aparato, se les dejó descansar una semana, tras la cual se empezaría a realizar la prueba semanalmente. En el ensayo de fuerza se hicieron dos experimentos para los cuales no se requería entrenamiento. Uno de ellos medía la fuerza de agarre mediante el Grip-Strength Meter (UGO Basile), que tiene un sensor de fuerza conectado a un amplificador (Figura 8). Los ratones se colocaron sobre la reja y se registró la fuerza de cada animal al tirar de la cola del ratón, el cual se agarra a la barra con fuerza hasta soltarse. Una vez se ha soltado el equipo da una lectura registrando la fuerza máxima ejercida por el ratón. Se realizó 12 veces por animal, dos veces por semana, y se hizo una media de los resultados obtenidos. Además, se registraron el valor máximo y la desviación estándar. En el segundo experimento de fuerza de agarre los ratones se situaron sobre la rejilla de una caja, se le dio la vuelta y se midió el tiempo que los ratones tardaban en caer. Si pasados 2 minutos los animales no caían, se consideró que habían superado la prueba, la cual se realizó 12 veces por animal en 6 semanas. Se considera que un ratón sano puede Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 32 aguantar los dos minutos en la reja, estableciéndose así una escala de fuerza entre los ratones con debilidad muscular. Por último, se realizó un ensayo de campo abierto (Figura 8) en Open-Field box (Panlab). Este consiste en medir la actividad basal global del ratón en un ambiente desconocido. Para ello se colocó al ratón en el centro del cubículo y se registró y grabó su movimiento durante 15 minutos con la cámara situada encima de la caja. Entre cada ratón se limpió el equipo para evitar que quedase cualquier olor o resto del anterior animal y pudiese interferir en su forma de moverse. El programa de análisis registra múltiples datos que pueden analizarse y compararse posteriormente. Los datos que se utilizaron para comparar los diferentes genotipos se describen a continuación. En los ensayos de campo abierto se analizó el promedio de los movimientos rápidos y lentos, con desplazamiento y estáticos. Para el resto de ensayos, al ser 12 pruebas totales, se calculó la media para cada animal, y luego se compararon los promedios de cada genotipo. Figura 8. Ensayos de actividad motora. De izquierda a derecha: ensayo de coordinación (rotarod), fuerza de agarre (rejilla) y campo abierto (campo abierto). 3.8. Actividad del complejo IV (citocromo c oxidasa) por espectrofotometría La actividad de la citocromo c oxidasa se mide como disminución de la absorbancia a 550 nm debido a la oxidación del citocromo c reducido (ε= 21 mM -1 cm -1 ) por parte del complejo IV. La reacción se siguió durante 2 minutos a 38ºC. Este protocolo se utilizó usando mitocondrias aisladas a partir de homogenados celulares totales. Las muestras se sometieron al método de freeze-thawing para la lisis celular. Para ello se congelaron las muestras biológicas en nitrógeno líquido o en hielo seco y se descongelaron rápidamente a 37ºC. Para lisar las células se necesitan varios ciclos de congelacióndescongelación que hacen que se hinchen y encojan, hasta que la membrana celular se rompa debido a los cristales que se forman en el interior durante el proceso de Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 33 congelación. Los reactivos necesarios para preparar 100 ml de tampón KP (Hidrogenofosfato potásico 100mM pH=7) fueron: 38,5 ml de K 2 HPO 4 100 mM y 61,5 ml de KH 2 PO 4 100 mM, ajustando el pH. El citocromo c se debe preparar en fresco antes de las medidas. Para preparar 1,5 ml citocromo c reducido 1%, se pesaron 15 mg de citocromo c que se resuspendieron en 1 ml de tampón KP 10 mM pH=7. Para reducir el citocromo se añadió una punta de espátula de NaBH 4 . La mezcla se agitó y se mantuvo en hielo 30 minutos. El pH se ajustó con pHmetro (Crison, pH-Meter Basic 20 + ) a 7-7,3 con HCl 1N. Se completó con agua destilada hasta 1,5 ml. La disolución se mantuvo en hielo todo el rato. Las medidas se realizaron en placa de 96 pocillos en un lector de microplacas (Espectrofotómetro-Fluorímetro-Luminómetro Biotek Sinergy HT SIAFRD). El volumen total de reacción fue de 200 µl: 158 µl de agua destilada, 20 µl de tampón KP 100 mM, 2 µl de homogenado total y 20 µl de citocromo c reducido (1% en tampón KP 10 mM pH=7). La actividad del complejo IV se corrigió por cantidad de proteína, determinada por el método Bradford. Los valores corresponden a unidades internacionales por litro (nmol*min -1 *µg proteína -1 ). 3.9. Expresión de proteína AOX Cuantificación de proteínas La cuantificación de la concentración proteica en homogenados tisulares totales o en mitocondrias aisladas se llevó a cabo por espectrofotometría, utilizando el método de Bradford (Bradford 1976) y el espectrofotómetro UV-VIS (Unicam, UV 500 y software Vision32 versión 1.05). Para ello, se elaboró una curva de calibrado, formada por 6 diluciones patrón que contenían: 1, 3, 5, 10 ,15 y 20 µg de seroalbúmina bovina (BSA), respectivamente. Las muestras, diluidas o no, se midieron por triplicado. Tanto las muestras, como los patrones y blancos, se llevaron a un volumen final de 800 µl en agua mili-Q y se les añadieron 200 µl del reactivo Bradford concentrado (Bio-Rad Protein assay). Se dejó desarrollar el color durante al menos 5 minutos (máximo una hora) y, finalmente, se procedió a la lectura de la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm. Con los valores de absorbancia de las diluciones patrón, se construyó una recta de Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 34 calibrado. Con la ecuación de esta recta de calibrado, se relacionó la absorbancia de las muestras con su concentración de proteína. Electroforésis de proteínas La separación electroforética de las proteínas se llevó a cabo mediante geles desnaturalizantes de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). El sistema que se utilizó para realizar este experimento fue Mini Protean III de Bio-Rad (Figura 11A). El porcentaje del gel concentrador fue siempre del 5% y el del gel separador del 12,5% (Tabla 3). Poliacrilamida (30:0,8) Tampón 4x Tris-HCl H2Odestilada APS 20% TEMED Separador 12,5% 2,08 ml 1,25 ml 3 ml 15 ml 5 ml Concentrador 5% 0,33 ml 0,5 ml 2,3 ml 10 ml 5 ml Tabla 3. Disolución poliacrilamida: acrilamida 30%:bisacrilamida 0,8% (p/v). Tampón de electroforesis 10x: Tris-HCl 250 mM, glicina 1,92M, SDS 1%(p/v). Tampón gel separador 4x: Tris-HCl 1,5M (pH=8,8), SDS 0,4%, EDTA 8 mM. Tampón gel concentrador 4x: Tris-HCl 0,5M (pH=6,8), SDS 0,4%, EDTA 8 mM. Tampón de carga 4x: Glicerol 10%, Tris-HCl 50 mM (pH=6,8), SDS 2%(p/v), azul de bromofenol 0,02% (p/v), β-mercaptoetanol 1% (v/v). El gel separador se vertió entre los cristales que forman el soporte, dejando unos 2 cm para el gel concentrador. A continuación se añadió una fina capa de isopropanol para favorecer la formación del frente y evitar la posible entrada de oxígeno, que dificultaría la polimerización. Una vez polimerizado el gel, se eliminó el exceso de isopropanol y se lavó su superficie con agua destilada. Tras retirar el exceso de agua con un papel secante, se vertió el gel concentrador. Finalmente, se insertó el peine con cuidado y se esperó la polimerización del gel concentrador. Cuando polimerizó, se quitó el peine y antes de cargar las muestras, se limpiaron los pocillos con agua destilada para retirar los restos de acrilamida y SDS. La cubeta se llenó de tampón de electroforesis 1x y se procedió a cargar las muestras, mezcladas con tampón de carga y el marcador de peso molecular Precision Plus Protein Dual Color de Bio-Rad. La electroforesis se desarrolló a una intensidad de corriente constante de 10 mA hasta que las muestras alcanzaron el gel separador, momento en el que se subió la intensidad de corriente a 20 mA hasta que las muestras llegaron a la altura deseada, lo que se pudo controlar gracias a la posición de las bandas del marcador. Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 35 Transferencia de proteínas a membrana La transferencia de las proteínas separadas electroforéticamente a membranas de PVDF se realizó mediante electrotransferencia utilizando el sistema Mini Trans-Blot Cell de Bio-Rad (Figura 11B). Para ello se cortó un trozo de membrana de PVDF (Hybond-P de Amersham) adecuado al tamaño del gel a transferir, se incubó en metanol durante 10 segundos, se lavó con agua destilada durante 5 minutos y finalmente se equilibró durante 10 minutos en el tampón de transferencia (BSN: Tris 48 mM, glicina 39 mM, metanol 20% (v/v)). Simultáneamente, el gel se sumergió en el mismo tampón durante 20 minutos. El sándwich del aparato de trasferencia se montó sumergido en tampón de transferencia, siguiendo las indicaciones del fabricante (Figura 11C). Las esponjas y papeles de filtro se humedecieron en BSN antes de colocarse y la transferencia se realizó a 4ºC a 100V durante 2 horas o a 30V durante toda la noche. Una vez terminada la transferencia, se dejó secar la membrana a temperatura ambiente y seguidamente las proteínas se fijaron a la misma sumergiéndola en metanol durante 10 segundos. La membrana se lavó con PBS-T y se utilizó inmediatamente para la detección o se conservó envuelta en film de plástico a 4ºC hasta su uso. Figura 11. A: Mini Protean III de Bio-Rad, B: Mini Trans-Blot Cell de Bio-Rad y C: ensamblaje del sándwich para la transferencia. Inmunodetección de proteínas Antes de empezar la primera incubación, la membrana se lavó con PBS-T (Tween 20 al 0,1% en PBS) durante el tiempo necesario para su rehidratación y todas las incubaciones y lavados para la inmunodetección de proteínas mediante Western-Blot se realizaron con agitación (agitador horizontal, ELMI DOS-20M). Electrodo negativo Esponja Papel de filtro Gel Membrana Papel de filtro Esponja Electrodo positivo A B C Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 36 Lo primero que se hizo fue bloquear la membrana para eliminar los posibles sitios de unión inespecíficos de la misma. Para ello, se incubó la membrana en una disolución de leche desnatada en polvo al 12% en PBS-T y 4 mg/ml de BSA durante al menos una hora a temperatura ambiente o a 4ºC toda la noche. Seguidamente, se eliminó el exceso de agente bloqueante mediante un lavado con PBS-T de 5 minutos. Para la inmunodetección de la proteína AOX, el primer anticuerpo HA-peroxidasa (que no precisa de anticuerpo secundario) se diluyó en la proporción adecuada (Tabla 4) en una disolución de PBS-T con 1% de leche desnatada en polvo y 2,5 mg/ml BSA. La incubación de dicho anticuerpo se dejó 2 horas a temperatura ambiente, o a 4ºC durante toda la noche. Pasado este tiempo, se realizaron tres lavados de 10 minutos con PBS-T, y la membrana ya estaba lista para la detección de proteínas. Para la inmunodetección de las proteínas control, se requirió el uso de anticuerpo primario y secundario. Se incubó la membrana en una disolución de leche desnatada en polvo al 5% en PBS-T al menos 1 hora, o a 4ºC toda la noche. Transcurrido ese tiempo, se eliminó el exceso de agente bloqueante con un lavado de 5 minutos de PBS-T. El anticuerpo primario comercial (Anti-Actina) se diluyó en la proporción adecuada (Tabla 4) en una disolución de PBS-T con 0,5% de leche desnatada en polvo. La incubación se dejó 2 horas a temperatura ambiente o a 4ºC toda la noche. Pasado ese tiempo, la membrana se lavó con PBS-T tres veces durante 10 minutos. El anticuerpo secundario (anti IgG de conejo) se diluyó a la proporción adecuada (Tabla 4) en 0,5% de leche desnatada en polvo disuelta en PBS-T y se incubó la membrana con él durante 1 hora. Finalmente, se eliminó esta última disolución y se procedió a los tres últimos lavados de 10 minutos con PBS-T. Anticuerpo primario (dilución) Proteína diana Anticuerpo secundario (dilución) Casa Comercial HAperoxidasa HA peroxidasa (1:5000) Epítopo HA * Roche Control Actina Anti-actina (1:5000) β-Actina Anti-conejo (1:6.000) SIGMA Tabla 4. Anticuerpos utilizados en la inmunodetección de proteínas mediante Western Blot. El anticuerpo HA-peroxidasa tiene como diana el epítopo de la hemaglutinina (HA). * No precisa de anticuerpo secundario, está conjugado con la peroxidasa de rábano. La detección de la proteína de interés se realizó mediante la reacción de la enzima peroxidasa de rábano, conjugada al anticuerpo, al entrar en contacto con el luminol como sustrato quimioluminiscente, para ello se utilizó el kit comercial EZ-ECL (Biological Industries). Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 37 La membrana, incubada con los anticuerpos correspondientes, se incubó durante tres minutos con el sustrato quimioluminiscente y la luz emitida en dicha reacción se detectó al exponer la membrana, envuelta en un film transparente de plástico, a una placa autorradiográfica (Amersham, Hyperfilm) en un cassette de exposición, durante el tiempo adecuado. Pasado el tiempo de exposición, se usó el líquido revelador y fijador (SIGMA-ALDRICH, Kodak). Primero se sumergió la placa en el líquido de revelado de Kodak durante no más de 2 minutos (controlando la aparición de señal), después se lavó unos segundos en agua destilada, en segundo lugar se fijó sumergiéndola 1 minuto en el fijador Kodak y finalmente se lavó con agua destilada y se dejó secar a temperatura ambiente. Cabe destacar, que todo este proceso se realizó en cuarto oscuro. Con el fin de eliminar los anticuerpos unidos a las proteínas fijadas en la membrana y poder volver a reutilizarla en otra inmunodetección, la membrana se sumergió en una solución stripping (2-mercaptoetanol 100mM, SDS 2%, Tris-HCl 1M, pH=6,7) y se incubó durante 30 minutos a 58ºC, con agitación ocasional, lo que permite la desnaturalización de los anticuerpos. A continuación, se realizaron tres lavados de 10 minutos a temperatura ambiente con PBS-T y a partir de ese momento, la membrana estaba lista para ser reutilizada. 3.10. Análisis histológicos Los análisis morfológicos se realizaron en el Servicio Técnico de la Unidad de Anatomía Patológica del IACS. Se tomaron muestras de secciones longitudinales y transversales de músculo esquelético de ambas extremidades posteriores de un total de 22 ratones: 5 de genotipo salvaje, 4 KI AOX, 4 KO y 9 KI-KO. Las muestras fueron fijadas en paraformaldehído al 4% a 4ºC, procesadas de forma rutinaria hasta su inclusión en parafina, cortadas a 3 µm y teñidas con el método de Hematoxilina-Eosina (HE) para su valoración histopatológica. Este método consiste en aplicar la tinción de hematoxilina, que al ser catiónica o básica tiñe estructuras ácidas en tonos azul y púrpura, y la eosina que tiñe componentes básicos en tonos de color rosa gracias a su naturaleza aniónica o ácida. El análisis anatomopatológico de tejido muscular por el método HE permite comprobar alteraciones morfológicas y con ello determinar la condición de los ratones de distinto genotipo ya que tiñe fibras musculares y núcleos de diferente color, pudiéndose analizar su distribución, número y morfología y compararla con los ratones control. Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 38 Metodología estadística Con el fin de interpretar los datos obtenidos en el proyecto Máster se hizo uso de análisis estadísticos. 3.11. Análisis de datos El análisis estadístico se llevó a cabo con el programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS version 20.0; Chicago, IL, USA) y los datos y figuras se procesaron con las hojas de cálculo de Microsoft Excel ( Reading, UK). El estudio de la caracterización funcional del ratón AOX incluyó el seguimiento de longevidad, la respuesta al estrés térmico y a la dieta hiperlipídica. Para la longevidad se analizaron los valores de días de vida, mientras que en el ensayo de respuesta al estrés térmico se utilizaron la temperatura y actividad a lo largo del tiempo. Estos ensayos incluyeron dos genotipos (el salvaje y el homocigoto para AOX) y la significancia estadística se determinó usando el test T-Student. La respuesta a la dieta hiperlipídica se analizó en los tres genotipos (KI AOX, heterocigoto para AOX y genotipo salvaje), se tomaron datos de ganancia de peso (gramos) durante 8 semanas y posteriormente se compararon mediante el análisis de la varianza (ANOVA) de una vía o factor, seguido de la prueba de Dunnett para comparaciones múltiples. Por otro lado, el estudio de la posible compensación del fenotipo patológico de los KO por AOX se realizó en cuatro genotipos diferentes. Los ensayos de actividad motora y la actividad de COX fueron las medidas cuantitativas analizadas mediante ANOVA de una vía, seguido de la prueba de Dunnett. Todos los datos mostrados en los resultados representan medias con sus desviaciones estándar, obtenidos a partir de datos individuales de entre 4 y 15 ratones por grupo. Se realizaron pruebas (Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk) para verificar el supuesto de normalidad, así como el test de Levene para verificar la homogeneidad de la varianza. El intervalo de confianza se estableció en el 95%, por lo que el valor de significancia necesario para descartar que el efecto era debido al azar fue p<0,05. Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 39 4. Resultados Caracterización funcional del ratón AOX Con el fin de completar la caracterización funcional de los ratones knock-in para AOX y de analizar los efectos asociados a la potencial disminución de la producción de ROS y al potencial desacoplamiento de la cadena respiratoria inducidos por la proteína exógena se realizaron estudios de envejecimiento, de respuesta al estrés térmico y a una dieta hiperlipídica capaz de causar obesidad. 4.1. Seguimiento de longevidad AOX se ha asociado con la longevidad en las especies donde existe de forma natural y además se ha descrito su capacidad para reducir la producción de ROS [50]. Por ello nos pareció adecuado analizar su posible efecto sobre el envejecimiento en los animales KI. El seguimiento de longevidad de los animales se llevó a cabo con 22 ratones (11 hembras y 11 machos) para determinar si existían diferencias significativas en el envejecimiento entre ratones de genotipo homocigoto para AOX (+/+) y de genotipo salvaje (-/-) separados por sexo. A pesar de que el estudio está inconcluso debido a que algunos animales siguen vivos (13 en total), hasta el momento no se han observado diferencias significativas entre los dos genotipos (Figura 12). Figura 12. Seguimiento de la longevidad. Días de vida para ratones KI AOX (+/+) y ratones de genotipo salvaje, separados por sexo. Se muestran medias ± SD (desviación estándar representada por barras verticales). n=22; hembras: 5 AOX (+/+) y 6 genotipo salvaje (-/-); machos: 6 AOX (+/+) y 5 genotipo salvaje (-/-). No hay diferencias significativas. 0 200 400 600 800 Hembras Machos Días de vida Genotipo salvaje (-/-) Homocigoto AOX (+/+) Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 40 4.2. Ensayos de respuesta al estrés térmico La actividad de AOX (transferencia de electrones desde la ubiquinona al oxígeno sin bombeo de protones) equivale en parte a un efecto desacoplante con respecto a la cadena de electrones normal. Por lo tanto, se podrían esperar consecuencias sobre el control de la temperatura (mayor termogénesis en los animales KI) y sobre el gasto energético (mayor para un mismo rendimiento en ATP en los KI) que se pudiera evidenciar en respuesta a una dieta capaz de inducir obesidad. Así, se decidió en primer lugar analizar la actividad y temperatura corporal en respuesta al estrés térmico causado por bajas temperaturas. Para ello se realizó el ensayo en un total de 16 ratones machos (8 de cada genotipo), a los que se midió la temperatura corporal y la actividad durante el periodo nocturno (197h), en tres situaciones diferentes: condición basal de 24ºC, condición experimental de 4ºC y condición experimental de 4ºC con ayuno. El análisis estadístico reveló en el experimento a 4ºC (sin ayuno) que la temperatura corporal fue menor para el grupo de ratones de genotipo salvaje (-/-) en comparación con el grupo homocigoto para AOX (+/+) desde las 3 horas, siendo una diferencia significativa desde las 5 a las 6 horas y a las 7 horas 30 minutos tras el inicio del ensayo (Figura 13A). En el resto de experimentos no se observaron diferencias significativas en la temperatura corporal. Por otro lado, en los experimentos de actividad se observó una disminución significativa en condiciones de ayuno a 4ºC en los ratones de genotipo salvaje con respecto a los KI AOX (Figura 13B). Figura 13. Telemetría. Izquierda: temperatura. Derecha: actividad. Medidas obtenidas durante la noche en ratones KI AOX (+/+) y ratones de genotipo salvaje (-/-). Los valores son medias . n=16. Las diferencias significativas (p<0,05) se muestran mediante asteriscos (*). 0 5 10 15 20 25 0123456789101112 Actividad (counts/min) tiempo (horas) 32 33 34 35 36 37 38 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Temperatura (ºC) tiempo (horas) * * * * * * * * * * * * * * Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 47 Cabe destacar que los ratones estudiados en este trabajo se encuentran en un fondo genético mixto (C57 y 129) y se necesitan 10 generaciones de cruces para purificar la especie hacia C57, los cuales se están realizando de forma paralela en el grupo de investigación. Por último, sería necesario separar los dos tipos de KO (COX10 y COX15) y los grupos resultantes de los cruces entre estos KO con el KI AOX para analizar el comportamiento y posible compensación del fenotipo patológico por separado. Este análisis de datos exhaustivo se podrá realizar cuando haya una muestra mayor, y por tanto más representativa. Relación con estudios previos Otros grupos de investigación han conseguido expresar satisfactoriamente una oxidasa alternativa (AOX) del organismo Ciona intestinalis en células humanas, demostrando beneficios en el flujo de electrones a través del sistema OXPHOS [46]. Además, observaron que la presencia de AOX tenía efecto beneficioso sobre las consecuencias de defectos en el complejo IV en células de pacientes [51]. Posteriormente, la expresión de AOX en Drosophila demostró que se podían compensar parcialmente los efectos de mutaciones patológicas [47]. Recientemente, un estudio en ratones ha demostrado que la expresión de AOX restablece el paso de electrones si se bloquea con inhibidores, y disminuye la producción excesiva de ROS [50]. En investigaciones anteriores realizadas en el grupo GENOXPHOS se demostró que era posible restablecer el transporte de electrones mediante coexpresión de AOX y NDI1 (AOX de Emericella nidulans y NADH deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae) en células de mamíferos [48]. El presente proyecto en el que se engloba el trabajo fin de Master investigó la posible compensación del fenotipo patológico de los ratones KO en los genes de las proteínas de ensamblaje del complejo IV. Los ratones fueron cedidos por dos grupos de investigación en los que se estudió el efecto de las mutaciones sobre los animales. Los animales KO COX10 y KO COX15 fueron estudiados para analizar el fenotipo patológico [49, 52, 44] y, a diferencia de los resultados heterogéneos del presente proyecto, los ratones enfermos tenían problemas funcionales graves y las histologías mostraban alteraciones estructurales. Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 48 Consecuencias, aplicaciones y sugerencias para estudios posteriores Los resultados obtenidos en este proyecto apuntan hacia una posible terapia con la oxidasa alternativa de Emericella nidulans en mamíferos con defectos en el sistema OXPHOS. Estos resultados junto con otros resultados previos del grupo han demostrado que no existen efectos tóxicos o negativos como consecuencia de dicha expresión en ratones. Sin embargo, los experimentos realizados para estudiar la funcionalidad y el efecto fenotípico de AOX en los ratones enfermos no han permitido observar la mejora que se esperaba. Esto puede deberse a que el nivel de expresión de AOX en mitocondrias de ratón sea bajo, a una baja eficiencia en el proceso de importe de la proteína a la mitocondria o en su inserción y estabilidad en la membrana interna del orgánulo. Como continuación del proyecto de investigación del grupo GENOXPHOS, el primer paso será la continuación de los estudios de compensación del fenotipo patológico para aumentar el número de ratones analizados en todos los grupos y obtener resultados que nos permitan establecer conclusiones. Entre los siguientes pasos están el analizar los niveles de mRNA de las proteínas mediante PCR a tiempo real y el estudio del efecto de la expresión de AOX sobre la letalidad embrionaria del modelo KO constitutivo (a diferencia de los presentes músculo específicos). De esta forma se pretende comprobar si AOX es capaz de revertir los defectos funcionales provocados por las mutaciones. Las alteraciones funcionales provocadas por la mutación, y la posible compensación de la misma con la proteína AOX podría analizarse mediante microscopía electrónica, pudiendo verse así las estructuras celulares con más detalle. Por el momento se han analizado tres ratones por microscopía electrónica para poner a punto la técnica, aunque no se han visto diferencias. Esta misma aproximación de trabajo descrita para AOX puede llevarse a cabo para NDI1, empleándose como posible herramienta terapéutica frente a enfermedades causadas por deficiencias en el sistema OXPHOS. La xenoexpresión de AOX y NDI1 en pacientes con desordenes mitocondriales podría llegar a tener un importante papel terapéutico en un grupo de enfermedades caracterizado por la ausencia actual de tratamientos. Otra cuestión pendiente sería la xenoexpresión de una proteína que restablezca el bombeo de protones hacia la matriz. Podría incluso crearse un modelo doble knock-in de AOX o NDI1 y una proteína que bombee protones para estudiar su efecto en mutaciones combinadas que comprometen la cadena de transporte electrónico. Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 49 Sin embargo, aún hace falta un gran esfuerzo investigador centrado en el desarrollo de modelos, en mejorar y hacer más seguras las técnicas de inserción de DNA en humanos y en estudiar los posibles rechazos inmunológicos debidos a la xenoexpresión. Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. Máster en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza 50 6. Conclusiones Los resultados obtenidos en la caracterización del ratón AOX nos han llevado a las siguientes conclusiones: • La proteína AOX expresada en homocigosis (+/+) no influye en el envejecimiento de los ratones al compararlo con el genotipo salvaje (-/-), que no expresa la proteína. • Los ratones homocigotos para AOX parecen ser más eficientes al mantener la actividad y la temperatura en condiciones de estrés térmico (4ºC) y en ayuno que los de genotipo salvaje. • La xenoexpresión de AOX en heterocigosis (+/-) en ratones adultos sometidos a una dieta hiperlipídica les induce una mayor ganancia de peso que a los de genotipo homocigoto para AOX (+/+) y que a los de genotipo salvaje, que no presentan diferencias observables entre sí. Los resultados obtenidos de la terapia génica para la compensación por xenoexpresión de AOX del fenotipo patológico de los modelos knock-out para el complejo IV específicos de músculo (COX10 y COX15) parecen indicar que: • La expresión de la proteína AOX no parece suficiente para compensar el fenotipo patológico de déficit motor característico de los ratones KO. • Los ratones KO que expresan AOX (KI-KO) no restablecen la actividad de COX (complejo IV), aunque presentan una tendencia hacia la mejora. • AOX presenta un nivel de expresión bajo en los ratones adultos y se degrada al descongelarse empezando por las subunidades de menor tamaño, es decir, las que han sido procesadas tras importarse a la mitocondria. • Los análisis histológicos de los ratones KI-KO y KO muestran fenotipos muy variados, pudiendo intuirse una mejora en los que expresan AOX. Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX Amaya López Pascual. 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