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TRABAJO FIN DE GRADO GRADO EN V aloración del Optomotor como método de control de AV en modelos degenerativos de TRABAJO FIN DE GRADO GRADO EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA 2009 – 2013 V Realizado por: Paula Olmos Larena Directores: Isabel Pinilla Lozano Francisco Segura Calvo aloración del Optomotor como método de control de AV en modelos degenerativos de ratas ÓPTICA Y OPTOMETRÍA Paula Olmos Larena Isabel Pinilla Lozano Francisco Segura Calvo aloración del Optomotor como método de control de AV en modelos degenerativos de - ÍNDICE - 1. INTRODUCCIÓN ........................................................... 1 1.1 Concepto de Retinosis Pigmentaria ................ 1 1.2 Nistagmo optocinético ................................... 2 1.3 Motivación y objetivos del trabajo ................. 3 2. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................ 3 2.1 Sujetos............................................................ 3 2.2 Descripción del aparato ................................. 4 2.3 Funcionamiento del aparato .......................... 5 2.4 Determinación de los umbrales visuales ........ 7 2.4.1 Determinación de la AV .................... 7 2.4.2 Determinación de la SC ..................... 7 2.5 Análisis estadístico ......................................... 8 3. RESULTADOS ............................................................... 9 3.1 Agudeza visual ................................................ 9 3.2 Sensibilidad al contraste ................................ 9 4. DISCUSIÓN ................................................................. 13 5. CONCLUSIONES .......................................................... 14 6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................. 15 1.INTRODUCCIÓN 1.1 CONCEPTO DE RETINOSIS PIGMENTARIA La Retinosis Pigmentaria (RP) es la causa de degeneración hereditaria más frecuente de la retina y que afecta desarrollado [1].Fue d iagnosticada por primera vez a finales del siglo XIX, día de hoy todavía sigue siendo una gran desconocida dentro de la medicina [2]. La RP es tá constituida por retina, los cuales tienen en común pérdida progresiva de la función de la retina ceguera en la edad adulta [3 ]. La RP actúa de la siguiente manera: primero, se afecta la estruc fotorreceptores y del epitelio pigmentario de la reti pérdida de los fotorreceptores por apoptosis, afectadas, dando como resultado capas de la retina. El signo más frecuente de la RP es la hemeralopía o dificultad de visión nocturna debido a la función anómala de los bastones. Se produce una restricción del campo visual periférico, iniciándose las alteraciones campimétricas entre los 30º y 50º concentración de bastones) , pero posteriormente avanza también hacia la periferia y hacia el centro, dejando un respeto macular V isión de un paciente con RP Otro signo clínico, es el acúmulo de pigmento con morfología variable (habitualmente simulando espículas óseas) cuya distribución en la retina se correlaciona bastante bien lesiones campimétricas. Estos depósitos se deben a la migración y proliferación de pigmento del EPR lesionado hacia las capas internas de la retina. alteraciones en la visión cromática, conos [4]. [1] 1.INTRODUCCIÓN 1.1 CONCEPTO DE RETINOSIS PIGMENTARIA La Retinosis Pigmentaria (RP) es la causa de degeneración hereditaria más frecuente de la retina y que afecta aproximadamente a 1 de cada 3.500 personas en el mundo iagnosticada por primera vez a finales del siglo XIX, pero sin embargo, a día de hoy todavía sigue siendo una gran desconocida dentro de la medicina [2]. tá constituida por un grupo heterogéneo de trastornos degenerativos de la tienen en común una base polimórfica hereditaria y quedan lugar a pérdida progresiva de la función de la retina siendo una de las causas más importantes de ]. de la siguiente manera: primero, se afecta la estruc tura y la fotorreceptores y del epitelio pigmentario de la reti na (EPR) y como consecuencia pérdida de los fotorreceptores por apoptosis, el resto de células de la retina se ven también afectadas, dando como resultado una atrofia retiniana generalizada y remodelación de las El signo más frecuente de la RP es la hemeralopía o dificultad de visión nocturna debido a la función anómala de los bastones. Se produce una restricción del campo visual las alteraciones campimétricas entre los 30º y 50º , pero posteriormente avanza también hacia la periferia y hacia el un respeto macular (campo visual en cañón de escopeta) hasta fases finales isión de un paciente con RP comparada con visión normal. Otro signo clínico, es el acúmulo de pigmento con morfología variable (habitualmente simulando espículas óseas) cuya distribución en la retina se correlaciona bastante bien Estos depósitos se deben a la migración y proliferación de pigmento del EPR lesionado hacia las capas internas de la retina. Posteriormente pueden darse lugar la visión cromática, probablemente a causa de la pérdida funcional de los La Retinosis Pigmentaria (RP) es la causa de degeneración hereditaria más frecuente a 1 de cada 3.500 personas en el mundo pero sin embargo, a día de hoy todavía sigue siendo una gran desconocida dentro de la medicina [2]. un grupo heterogéneo de trastornos degenerativos de la hereditaria y quedan lugar a una siendo una de las causas más importantes de tura y la función de los na (EPR) y como consecuencia a esta el resto de células de la retina se ven también y remodelación de las El signo más frecuente de la RP es la hemeralopía o dificultad de visión nocturna debido a la función anómala de los bastones. Se produce una restricción del campo visual las alteraciones campimétricas entre los 30º y 50º (zona de mayor , pero posteriormente avanza también hacia la periferia y hacia el hasta fases finales . Otro signo clínico, es el acúmulo de pigmento con morfología variable (habitualmente simulando espículas óseas) cuya distribución en la retina se correlaciona bastante bien con las Estos depósitos se deben a la migración y proliferación de pigmento Posteriormente pueden darse lugar causa de la pérdida funcional de los Representación del fondo de ojo afectado por RP 1.2 NISTAGMO OPTOCINÉTICO Lo primero que debemos conocer nistagmo optocinético. Se trata de un movimiento involuntario, de naturaleza refleja, presente desde el fases: una de “movimiento de seguimiento” lenta, que se dirige en el sentido desplaza el objeto, seguido de otra fase rá sentido contrario a éste[5]. La determ inación de la agudeza visual en en las consultas de oftalmología pediátrica se utiliza como método de evaluación para su determina ción el sistema optocinético, el cual se basa precisamente en la exploración del nistagmo optocinético. El sistema optoc inético se basa en el fenómeno por cual un estímulo que se desplaza, genera un movimiento de seguimiento, y cuando abandona el campo visual se produce un movimiento sacádico de refijación. Si no se percibe el estímulo no movimiento. El ta mbor de nistagmo optocinético cilindro con bandas de alto contraste que gira de forma lenta, provocando este nistagmo. bandas de distinto grosor se puede mínimo que desencadena el nistagmo como aproxi a la agudeza visual. La agudeza obtenida con este método se correlaciona bien con la visión obtenida con lo mirada preferencial [6]. [2] Representación del fondo de ojo afectado por RP 1.2 NISTAGMO OPTOCINÉTICO Lo primero que debemos conocer para entender el porqué de este estudio nistagmo optocinético. Se trata de un movimiento rítmico de los ojos, inconsciente e involuntario, de naturaleza refleja, presente desde el nacimiento. Está compuesto por dos “movimiento de seguimiento” lenta, que se dirige en el sentido objeto, seguido de otra fase rá pida , el verdadero “movimiento sacádico”, de inación de la agudeza visual en niños preverbales es complicada por lo que en las consultas de oftalmología pediátrica se utiliza como método de evaluación para su ción el sistema optocinético, el cual se basa precisamente en la exploración del inético se basa en el un estímulo que se desplaza, genera un movimiento de seguimiento, y cuando abandona el campo visual se produce un movimiento sacádico de refijación. Si no se percibe el estímulo no se genera el mbor de nistagmo optocinético consiste en un cilindro con bandas de alto contraste que gira de forma lenta, provocando este nistagmo. Mediante el uso de se puede determinar el grosor nistagmo como aproxi mación agudeza obtenida con este método se correlaciona bien con la visión obtenida con lo s test de Exploración de la AV con tambor para entender el porqué de este estudio es qué es el rítmico de los ojos, inconsciente e nacimiento. Está compuesto por dos “movimiento de seguimiento” lenta, que se dirige en el sentido en que se , el verdadero “movimiento sacádico”, de niños preverbales es complicada por lo que en las consultas de oftalmología pediátrica se utiliza como método de evaluación para su ción el sistema optocinético, el cual se basa precisamente en la exploración del Exploración de la AV con tambor optocinético [3] 1.3 MOTIVACIÓN Y OBJETIVOS DEL TRABAJO Un sistema Optomotor de valoración visual permite una estimulación simple y rápida de la visión espacial de animales de experimentación, concretamente de roedores como ratones o ratas, basado en el mismo fundamento que el nistagmo optocinético, y suficientemente sensible para medir el déficit visual de diferentes modelos de enfermedades como degeneraciones retinianas, diabetes y glaucoma. En nuestro estudio, como explicaré posteriormente, vamos a utilizar un sistema optomotor formado por cuatro monitores LCD que van a simular el funcionamiento de un tambor optocinético. Los objetivos de este trabajo son la familiarización con el manejo del equipo, toma de medidas en ratas normales y con defectos visuales y obtención e interpretación de resultados. Los resultados relativos a agudeza visual y sensibilidad al contraste se analizarán en conjunto y se compararán con la bibliografía existente. 2. MÉTODO Y OBJETIVOS 2.1 SUJETOS Para la realización de este estudio, van a utilizarse dos modelos de ratas: • 8 ratas Long Evans: modelo control, procedentes de los laboratorios Charles Rives, Barcelona, España, y mantenidas en colonia en la Universidad de Zaragoza. Las ratas fueron valoradas a la edad de 2 meses de edad (día postnatal 60 ó P60). • 8 ratas P23H línea 1 heterocigotas pigmentadas (cruce de P23H albina y Long Evans): modelo de degeneración retiniana. Se analizaron en dos tiempos diferentes de la degeneración, a los 2 meses (P60) y a los 4 meses de edad (P120). A continuación detallo las características de las mismas: • Long Evans. Se trata del modelo animal muy utilizado en investigación. Su origen se remonta a 1915, cuando los doctores Largo y Evans, cruzaron varias hembras WistarInstitute blancas con un macho gris salvaje. Este tipo de ratas suelen ser blancas con manchas negras o en su defecto, marrones [7]. [4] • Rata P23H. Este modelo animal de la RP posee una mutación autosómica dominante en el gen de la rodopsina. Se caracterizan por tener una lenta degeneración de los bastones, sin embargo los conos poseen una función normal inicialmente; lo que guarda gran relación con los síntomas clínicos que presentan los pacientes con RP, ya que muchos de ellos presentan diferentes mutaciones en el gen de la rodopsina. Existen 3 líneas de ratas P23H (línea 1, línea 2 y línea 3). En este trabajo se ha utilizado la línea 1, que es la que sufre una degeneración retiniana más rápida. Las ratas transgénicas homocigóticas P23H línea 1 han sido donadas por el Dr. Matthew LaVail (Universidad de San Francisco, California). Las ratas P23H heterocigóticas para el gen del P23H pigmentadas se obtuvieron del cruce de ratas homocigóticas P23H línea 1 con ratas normales pigmentadas Long Evans. La colonia se mantuvo en el animalario de la Universidad de Zaragoza, con un ciclo de 12 horas luz, 12 horas oscuridad, con una iluminación variable en las horas de luz dependiendo del lugar de la caja entre 7-30 lux. Todos los procedimientos experimentales de este estudio se realizaron tras la aprobación por la Comisión Ética Asesora para la Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza y cumpliendo la normativa Española de protección animal RD53/2013, que cumple con la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo del 22 de septiembre de 2010 relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. 2.2 DESCRIPCIÓN DEL APARATO El sistema optocinético está compuesto por cuatro monitores LCD de 17 pulgadas (modelo 1703FP, Dell, Phoenix, AZ) que forman un cuadrado. De esta forma se simula un cilindro virtual, el cual se proyecta en tres dimensiones dando lugar a una rejilla sinusoidal vertical. Elcampo de pruebaconsiste en unacaja dePlexiglas(39 ×39×32,5cm[L ×W×H]) con aberturasrectangulares (33,5 ×26,5cm[W ×H]) en cada pared, las cuales están pintadas de blanco mate. La parte inferior del campo de prueba consiste en un espejo con un agujero en el centro de forma tangencial. En la parte superior, y de forma tangencial se coloca un espejo con un gran agujero central (diámetro 25,3 cm). La plataforma donde se van a colocar los animales a examinar es un disco de plexiglás blanco de distintos diámetros según el tamaño del animal estudiado (en el trabajo hemos utilizado el diámetro 5,3 cm) y se sitúa a 13 cm de altura. Éste se atornilla al suelo, pasando primero a través del agujero del espejo. En la parte superior del campo de prueba se sitúa, unida a la tapa, una cámara (FireWireiSight, Apple ComputerCorp. Por último comentar, que existen unos ventiladores que se utilizan para enfriar tanto los monitores como el campo de prueba. Fig. 1. Representación esquemática del aparato El programa de ordenador que vamos a usar L ethbride, Alberta, Canadá) Apple Computer Corp.) [8]. 2 .3 FUNCIONAMIENTO DEL APARATO Primero, debe centrarse el retículo y enfocarse la cámara; para posteriormente colocar el roedor sobre la plataforma central. Éstos tienen libertad de movimiento dentro del campo de prueba. A continuación, comienza el estudio. Cuando el ratón se mueve sobre la plataforma, el investigador debe seguirlo, manteniendo siempre sobre su cabeza un imagen del vídeo. Las coordenadas“xy ” rotación del cilindro coincida con el centro del animal; de esta forma nos aseguramos que las paredes virtuales del cilindro se rejilla es la deseada. [5] En la parte superior del campo de prueba se sitúa, unida a la tapa, una cámara Apple ComputerCorp. , Mountain View, CA, EEUU) Por último comentar, que existen unos ventiladores que se utilizan para enfriar tanto los monitores como el campo de prueba. Fig. 1. Representación esquemática del aparato El programa de ordenador que vamos a usar (OptoMotry© ; CerebralMecha ethbride, Alberta, Canadá) se ejecuta en un procesador dual (G4 o G5 Power Mac .3 FUNCIONAMIENTO DEL APARATO centrarse el retículo y enfocarse la cámara; para posteriormente colocar el roedor sobre la plataforma central. Éstos tienen libertad de movimiento dentro del campo A continuación, comienza el estudio. Cuando el ratón se mueve sobre la plataforma, el investigador debe seguirlo, manteniendo siempre sobre su cabeza un a cruz superpuestaa ” de posición delpunto de mira se utilizan para que el centro de rotación del cilindro coincida con el centro del animal; de esta forma nos aseguramos que las paredes virtuales del cilindro se sitúan a una distancia constante; y la frecuencia espacial de la En la parte superior del campo de prueba se sitúa, unida a la tapa, una cámara Por último comentar, que existen unos ventiladores que se utilizan para enfriar tanto ; CerebralMecha nics, (G4 o G5 Power Mac intosh, centrarse el retículo y enfocarse la cámara; para posteriormente colocar el roedor sobre la plataforma central. Éstos tienen libertad de movimiento dentro del campo A continuación, comienza el estudio. Cuando el ratón se mueve sobre la plataforma, el a cruz superpuestaa la se utilizan para que el centro de rotación del cilindro coincida con el centro del animal; de esta forma nos aseguramos que las sitúan a una distancia constante; y la frecuencia espacial de la Fig. 2A Representación esquemática del funcionamiento Cuandoseproyectauna rejillaperceptible para elratón enla pared del cilindro roedordeja de mover su cuerp moviendo la cabeza en el mismo sentido que lo hace la rejilla. El experimentador evalúa si el animal consigue ver la rotación del cilindro mediante el control en la pantalla de orden que l o hace el cilindro y a continuación volverá a su posición inicial. Si durante el curso de la prueba, el ratón volveremos a colocar sobre ésta y [6] Fig. 2A Representación esquemática del funcionamiento Cuandoseproyectauna rejillaperceptible para elratón enla pared del cilindro mover su cuerp o ycomienza arealizar un seguimientode la rejilla moviendo la cabeza en el mismo sentido que lo hace la rejilla. El experimentador evalúa si el animal consigue ver la rotación del cilindro mediante el control en la pantalla de orden ador. Siel ratón consigue verla, su cabeza girará en el sentido o hace el cilindro y a continuación volverá a su posición inicial. el curso de la prueba, el ratón abandona su posición en la plataforma, volveremos a colocar sobre ésta y la reanudaremos [8]. Fig. 2B Representación del movimiento de cabeza en función al sentido de giro de la Cuandoseproyectauna rejillaperceptible para elratón enla pared del cilindro , el arealizar un seguimientode la rejilla , únicamente El experimentador evalúa si el animal consigue ver la rotación del cilindro mediante el consigue verla, su cabeza girará en el sentido abandona su posición en la plataforma, lo Fig. 2B Representación del movimiento de cabeza en función al sentido de giro de la rejilla [7] 2.4DETERMINACIÓN DE LOS UMBRALES VISUALES Los umbrales visuales que vamos a explorar son: • Agudezas visuales • Sensibilidad al contraste Va realizarse de dos formas: • El observador observa el sentido de giro del cilindro • El observador no ve la dirección en que gira el cilindro 2.4.1 Determinación de agudeza visual (AV) La prueba comienza utilizando estímulos de frecuencias espaciales bajas (aproximadamente 0,1 c/g). Cuando observamos que el animal realiza el giro de cabeza, es decir, ha visto el estímulo presentado, respondemos “SI” o el sentido en el que lo ha realizado a favor (clockwise; CW) o en contra de las agujas del reloj (counterclockwise; CCW) en el programa, y automáticamente pasa a explorarse otra frecuencia más alta o bien la misma frecuencia pero en el otro sentido. Si por el contrario, tras varios intentos, vemos que el roedor no ve el estímulo presentado, responderemos “NO” y se explorará otra frecuencia más baja. Debe comentarse que para cada ojo, el movimiento del estímulo en dirección temporal – nasal provoca seguimiento, es decir CW mide el ojo izquierdo y CCW el ojo derecho. Cuando nos acercamos al umbral, se van intercalando frecuencias con valores próximos a éste, tanto por encima como por debajo. Al final de este procedimiento, cuando ya se ha determinado el máximo umbral que el animal es capaz de ver, se proyectará sobre el cilindro de nuevo el estímulo totalmente gris y en el programa aparecerán directamente los resultados (CW/CCW/media). Cuando nos acercamos al umbral, se van intercalando frecuencias con valores próximos a éste, tanto por encima como por debajo. Al final de este procedimiento, cuando ya se ha determinado el máximo umbral que el animal es capaz de ver, se proyectará sobre el cilindro de nuevo el estímulo totalmente gris y en el programa aparecerán directamente los resultados (CW/CW/media). 2.4.2 Determinación de la sensibilidad al contraste Para evaluar la sensibilidad al contraste, el procedimiento a seguir va a ser similar al utilizado en la medición de la AV. En este caso, la frecuencia espacial de la rejilla va a ser constante y lo que va a ir variando va a ser el contraste de la misma. En nuestro estudio van a explorarse cuatro frecuencias diferentes. Los estímulos que vamos a usar son: [14] También se observó una correlación con otro estudio similar de McGill y colaboradores [10] en el cual se utilizaban ratas de los mismos modelos que los que han sido utilizados en la realización de esta investigación. Este estudio demuestra que no existe una relación directa entre la pérdida de fotorreceptores y la disminución de la agudeza visual y la sensibilidad al contraste. Por último, y comparándolo con un tercer estudio [11] comprobamos que nuestra investigación sigue la misma línea que éste: disminución de agudeza visual y sensibilidad al contraste en ratas con degeneración retiniana. Al igual que sucedía con el primer caso, los picos de agudeza visual así como el pico máximo de la curva en “U invertida” de la sensibilidad al contraste son mayores que los valores que se han obtenido en nuestras medidas. Teniendo en cuenta todos los trabajos mencionados anteriormente, vemos la coherencia de nuestros resultados así como la correlación con otros que siguen la misma línea. Las pequeñas diferencias encontradas entre éstos, pueden ser debidas a la experiencia en el manejo del sistema optocinético, a los diferentes modelos de ratas utilizados así como la edad de los animales en el momento de la medición. Aunque se ha visto una clara relación entre la pérdida de visión con el avance de la degeneración retiniana, no podemos afirmar a ciencia cierta que la disminución de agudeza visual y de sensibilidad al contraste esté asociada a una pérdida de fotorreceptores como argumenta uno de los estudios mencionados; por lo que para completar esta investigación, si hubiese sido posible, debería haberse realizado un electrorretinograma (ERG) de campo completo, tipo Ganzfeld, a los animales que han sido objeto de este proyecto que nos aporta datos adicionales sobre la respuesta de la totalidad de la retina al estímulo lumínico en distintas condiciones ambientales y con distintas intensidades y longitudes de onda de la luz 5. CONCLUSIONES Las conclusiones obtenidas a partir de este estudio han sido las siguientes: 1. El sistema optocinético es de utilidad para la valoración de la agudeza visual y la sensibilidad al contraste en modelos roedores. 2. La agudeza visual en el modelo P23H línea 1 pigmentada heterocigota a la edad de 60 días fue inferior a la obtenida para la rata control Long Evans de la misma edad. 3. Se ha observado una disminución de agudeza visual transcurridos dos meses (mediciones a los 60 y 120 días) en el modelo P23H. [15] 4. En términos generales, la sensibilidad al contraste en los sujetos con 60 días en el modelo Long Evans y P23H eran similares. 5. Se ha encontrado, al igual que ocurría con la agudeza visual, una disminución de los valores de sensibilidad al contraste en el modelo de rata P23H con 60 y 120 días. 6. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas ni en la agudeza visual ni en la sensibilidad al contraste entre el ojo derecho e izquierdo. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. Martinez-Navarrete, G., et al. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res, 2011. 92(3): p. 227-37. 2. http://www.retinosispigmentaria.org/es/retinosis1.html 3. Lax, P., et al., Circadian dysfunction in P23H rhodopsin transgenic rats: effects of exogenous melatonin. J Pineal Res, 2011. 50(2): p. 183-91. 4. Valverde-Perez, D. Análisis molecular de dos genes candidatos para la retinosis autosómica recesiva, 1997, Universidad de La Coruña: La Coruña. 5. Perea, J. Definición de estrabismo a lo largo de la historia.http://www.doctorperea.es/pdfs/capitulo14.pdf 6. http://www.neuropedwikia.es/content/exploracion-de-la-agudeza-visual-en-lainfancia 7. http://www.taconic.com/wmspage.cfm?parm1=779 8. Glen T. Prusky, Nazia M Alam, Steven Beekman, Robert M Douglas. Rapid Quantification of Adult and Developing Mouse Spatial Vision Using a Virtual Optomotor System.InvestigativeOphtalmology& Visual Science, December 2004, Vol 45, Nº12. 9. Trevor J. McGill, Robert M. Douglas, Raymong D. Lund, Glen T. Prusky. Quantification of Spatial Vision in the Royal College of Surgeons Rat.InvestigativeOphtalmology& Visual Science, December 2004, March 2004 vol. 45 Nº. 3 932-936 [16] 10. McGill TJ, Prusky GT, Douglas RM, Yasumura D, Matthes MT, Lowe RJ, Duncan JL, Yang H, Ahern K, Daniello KM, Silver B, LaVail MM.Discordant anatomical, electrophysiological, and visual behavioral profiles of retinal degeneration in rat models of retinal degenerative disease.InvestigativeOphtalmology& Visual Science, December 2012, vol 53, Nº 10 6232-6244 11. T. J. McGill, R.M. Douglas, N.M Alam,Silver, W.W. Tschetter, G.T. Prusky. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience, 2005, vol 22, Nº. 677–684.