Repositorio Institucional de Documentos

UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Trabajo Fin de Máster: ACTIVIDAD ANTITUMORAL DEL ALCALOIDE NATURAL BERBERINA EN CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS Presentado por: Miguel Ángel Martin Serrano Directores: Dr. Julián Pardo Jimeno Dra. Eva Mª Gálvez Buerba (2013) D. JULIAN PARDO JIMENO, Doctor en Ciencias Químicas e Investigador Aragón I+D en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular y Profesor Asociado del Departamento de Microbiología, Salud Pública y Medicina Preventiva de la Universidad de Zaragoza y Dª. EVA GÁLVEZ BUERBA, Doctora en Ciencias y Científica Titular en el Instituto de Carboquímica (CSIC). CERTIFICAN: Que el Proyecto Máster “ACTIVIDAD ANTITUMORAL DEL ALCALOIDE NATURAL BERBERINA EN CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS”, ha sido realizado por el Licenciado en Bioquímica MIGUEL MARTINEZ en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza bajo su dirección y que reúne, a su juicio, las condiciones requeridas para optar al Título de Máster en Biología Molecular y Celular. Zaragoza, Septiembre de 2013 Fdo.: D. Julián Pardo Jimeno Dª. Eva Mª Galvez Buerba ABREVIATURAS 7-AAD: 7-Amino-Actinomicina D. Apaf-1: factor 1 de la activación por proteolización de la apoptosis. ABB: buffer de unión de la anexina. CARD: dominio de reclutamiento de caspasas DD: dominio de muerte. DED: dominio efector de muerte. DISC: complejo de señalización inductor de muerte. FITC: isotiocianato de fluoresceína. IC50: concentración mínima inhibitoria. IFN: interferon IL: interleuquina. LDL: lipoproteínas de baja densidad. LDLR: receptor de lipoproteínas de baja densidad. LLC-B: leucemia linfocítica crónica de tipo B. MDR: complejo de resistencia a drogas. PBS: suero fisiológico. PE: ficoeritrina ROS: especies reactivas de oxígeno. SFB: suero fetal bobino. SH: suero de caballo. TMRE: tetrametilrodamina metil ester. TNF: factor de necrosis tumoral. TNFR: receptor del factor de necrosis tumoral. Z-DEVD-FMK: benciloxicarbonil-Asp-Val-Asp-fluorometilcetona. 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 1 1.1. MUERTE CELULAR. ........................................................................................................ 1 1.1.1. Apoptosis..................................................................................................................... 1 1.1.2. Muerte celular que cursa con autofagia. ...................................................................... 2 1.1.3. Necrosis. ...................................................................................................................... 2 1.2. APOPTOSIS. ...................................................................................................................... 3 1.2.1. Ruta extrínseca o de receptores mortales. .................................................................. 3 1.2.2. Ruta intrínseca o mitocondrial. ................................................................................... 5 1.3. CASPASAS ........................................................................................................................ 5 1.4. PROTEÍNAS DE LA FAMILIA Bcl2. ............................................................................... 7 1.5. LA BERBERINA................................................................................................................ 9 1.5.1. Efecto antimicrobiano. .............................................................................................. 10 1.5.2. Efecto antiinflamatorio. ............................................................................................. 10 1.5.3. Efecto antidiabético. .................................................................................................. 10 1.5.4. Tratamiento de enfermedades cardiacas.................................................................... 10 1.5.5. Hiperlipidemias. ........................................................................................................ 11 1.5.6. Ensayos clínicos. ....................................................................................................... 11 1.5.7. La berberina y el cáncer. ........................................................................................... 13 2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS. ................................................................................ 13 3. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 16 3.1. CULTIVOS CELULARES ............................................................................................... 16 3.1.1. Líneas celulares utilizadas. ........................................................................................ 16 3.1.2. Materiales y medios de cultivo. ................................................................................. 16 3.1.3. Mantenimiento de cultivos celulares. ........................................................................ 17 3.1.4. Inactivación del complemento en el suero bovino. ................................................... 17 3.1.5. Congelación y descongelación de líneas celulares. ................................................... 17 3.1.6. Detección de micoplasmas en cultivos celulares mediante PCR. ............................. 18 3.1.7. Separación de células en gradiente de densidad. ....................................................... 19 3.1.8. Obtención, purificación y cultivo de células mononucleares de sangre periférica humana. ..................................................................................................................... 19 3.1.9. Pacientes incluidos en el estudio. .............................................................................. 20 3.1.10. Determinación del inmunofenotipo de pacientes con LLC-B. .................................. 20 3.1.11. Obtención de macrófagos derivados de médula ósea de ratón. ................................. 21 3.2. ESTUDIO DE PROLIFERACIÓN, CITOTOXICIDAD, APOPTOSIS Y NECROSIS CELULAR. ....................................................................................................................... 21 3.2.1. Materiales y reactivos para estudios de proliferación y citotoxicidad. ................... 21 3.2.2. Contaje y determinación de la viabilidad celular. ..................................................... 22 3.2.3. Determinación del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm). ............................ 22 3.2.4. Determinación simultanea de la translocación de fosfatidilserina y la permeabilidad de la membrana plasmática. ...................................................................................... 23 3.3. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS. .......................................................................................... 23 3.3.1. Extracción y fraccionamiento de lisados celulares con detergentes. ......................... 24 3.3.2. Separación de proteínas celulares. Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS. .......................................................................................................................... 24 3.3.3. Transferencia de proteínas a membranas. ................................................................. 25 3.3.4. Análisis de proteínas por inmunoblot (Western blotting). ........................................ 25 3.3.5. Anticuerpos. .............................................................................................................. 26 3.4. RATONES. ....................................................................................................................... 26 3.4.1. Desarrollo tumoral en ratones. .................................................................................. 26 3.5. ANÁLISIS INFORMÁTICO DE DATOS ....................................................................... 27 3.5.1. Estadística. ................................................................................................................ 27 4. RESULTADOS................................................................................................................. 28 4.1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (IC50) DE LA BERBERINA SOBRE DISTINTOS TIPOS CELULARES. ..................................... 28 4.1.1. Determinación de la IC50 en el mieloma múltiple MM1S. ...................................... 28 4.1.2. Determinación de la IC50 en el mieloma múltiple RPMI 8226. ............................... 29 4.1.3. Determinación de la IC50 en el linfoma histiocítico U937. ...................................... 30 4.1.4. Determinación de la IC50 en la leucemia T Jurkat. .................................................. 31 4.2. ANÁLISIS DEL MECANISMO DE MUERTE CELULAR ACTIVADO POR LA BERBERINA UTILIZANDO MUTANTES DE LAS LINEAS TUMORALES. ........... 32 4.2.1. Determinación de la exposición de la fosfatidilserina y la permeabilidad de la membrana celular en la línea celular Jurkat y sus líneas mutantes. .......................... 32 4.2.2. Determinación de la exposición de la fosfatidil serina y la permeabilidad en la membrana celular en la línea celular U937 y sus líneas mutantes. ........................... 33 4.2.3. Determinación de la caída de potencial mitocondrial en la línea celular Jurkat y sus líneas mutantes. ......................................................................................................... 35 4.2.4. Determinación de la caída de potencial mitocondrial en la línea U937 y sus líneas mutantes. ................................................................................................................... 36 4.2.5. Niveles de expresión de las proteínas de la familia Bcl2 en la apoptosis inducida por berberina en la línea MM1S. ..................................................................................... 37 4.2.6. Niveles de expresión de las proteínas de la familia Bcl2 en la apoptosis inducida por berberina en la línea RPMI........................................................................................ 38 4.2.7. Niveles de expresión de las proteínas de la familia Bcl2 en la apoptosis inducida por berberina en la línea U937. ....................................................................................... 39 4.3. ACTIVIDAD DE LA BERBERINA FRENTE A MUESTRAS DE PACIENTES CON LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÓNICA DE TIPO B (LLC-B). ..................................... 40 4.3.1. Ensayo sobre el paciente 01/2012. ............................................................................ 41 4.3.2. Ensayo sobre el paciente 04/2011. ............................................................................ 42 4.3.3. Ensayo sobre el paciente 08/2011. ............................................................................ 43 4.4. TOXICIDAD DE LA BERBERINA EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA (PBLs). ...................................................................................................... 44 4.4.1. Ensayo sobre PBLs de pacientes poliglobúlicos. ...................................................... 44 4.4.2. Ensayo sobre macrófagos extraídos de ratón. ........................................................... 45 4.5. ACCIÓN PREVENTIVA DE LA BERBERINA FRENTE AL DESARROLLO TUMORAL DE LEUCEMIA “IN VIVO”. ....................................................................... 46 5. CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN. ................................................................................. 52 6. REFERENCIAS. ..................................................................................................................... 55 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1. MUERTE CELULAR. La muerte celular es un proceso que está estrechamente relacionado con el desarrollo fisiológico normal de los tejidos y con varios mecanismos de defensa de varios tipos de enfermedad humana. Según la definición del NCCD (Nomenclature Conmmitte on Cell Death) [1] una célula se considera muerta cuando se cumple uno o más de los siguientes criterios establecidos: la célula ha perdido la integridad de la membrana plasmática, la célula, incluyendo al núcleo, ha sufrido fragmentación completa, mostrando los llamados cuerpos apoptóticos, o los fragmentos de las células han sido fagocitados por células adyacentes. Aunque durante muchos años la clasificación de muerte celular ha estado dominada por criterios morfológicos, actualmente se pretende una mejor clasificación de la muerte celular en función de criterios enzimáticos, aspectos funcionales o de acuerdo a características inmunogénicas. Por ello el NCCD propuso una clasificación y definición actualizada de las diferentes modalidades de muerte. 1.1.1. Apoptosis. Apoptosis fue un término introducido por Kerr y colaboradores en 1972 [2]. Es un tipo de muerte celular programada con características morfológicas como son: reducción del volumen celular (pyknosis), fragmentación nuclear (karyorrhexis), división de la membrana plasmática en vesículas, aunque sin pérdida de la integridad física (blebbing) y la fagocitosis de la célula “in vivo”. Algunos de los elementos bioquímicos involucrados en la apoptosis son la activación de caspasas, la pérdida de potencial de la membrana mitocondrial, fragmentación del DNA y la exposición de la fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plasmática. Este último representa una señal para las células fagocíticas para eliminar estas células y los cuerpos apoptóticos resultantes de este proceso, contribuyendo, a evitar que se liberen componentes extracelulares al medio que desencadenen procesos inflamatorios [3]. 2 Existen otros tipos de muerte celular programada que no tienen las características morfológicas de la apoptosis. Aunque para la adquisición de dichas características sea necesario la activación de caspasas, ésta no es suficiente para definir un proceso como apoptosis, ya que la activación de estas puede estar asociada a procesos biológicos no letales. La muerte celular independiente de caspasas puede ocurrir a pesar de ella y exhibir signos morfológicos de la apoptosis, autofagia o necrosis. 1.1.2. Muerte celular que cursa con autofagia. Se define morfológicamente como un tipo de muerte celular que ocurre en ausencia de condensación de la cromatina, pero acompañada por una masiva vacuolización autofágica. En la mayoría de casos este proceso es una respuesta de supervivencia que se activa en situaciones de estrés como deprivación de nutrientes, calor o estrés oxidativo [4]. Los autofoagosomas, por definición, tienen doble membrana y contienen orgánulos citoplásmicos degenerados o citosol, que pueden distinguirse tales como lisosomas, endosomas o cuerpos apoptóticos mediante microscopía electrónica de transmisión. La fusión de los autofagosomas con los lisosomas da lugar a los autolisosomas, donde se llevan a cabo los procesos catabólicos característicos de la autofagia. Al contrario que las células apoptóticas, las células que mueren con morfología autofágica no tienen asociación o muy poca con los fagocitos. Actualmente no debe asumirse que la autofagia es la ejecutora de esta muerte, ya que en un principio, la autofagia es un mecanismo de supervivencia celular, como lo indica el hecho de que la inhibición de la autofagia acelera el proceso de muerte celular. Algunos informes indican que las células que presentan características de la muerte celular por autofagia todavía pueden recuperarse tras la retirada de los estímulos que inducen la muerte, a pesar de que no está claramente definido el punto de no retorno. 1.1.3. Necrosis. Es un tipo de muerte celular caracterizada por un aumento de volumen de los orgánulos y del citoplasma celular, moderada condensación de la cromatina y rotura de la membrana plasmática con la consecuente pérdida del contenido intracelular. 3 Durante mucho tiempo se consideró la necrosis como un tipo de muerte celular accidental, pero se están recogiendo evidencias de que es un proceso finalmente regulado por una vía de transducción de señal y mecanismos catabólicos [5]. Así receptores de muerte (TNF-R1, Fas, TRAIL-R) y receptores Toll-like, son capaces de inducir necrosis en presencia de inhibidores de caspasas. Esta muerte celular inducida puede ser inhibido por necrostatina [6], por tanto se ha propuesto el término de necroptosis [7] para distinguir este tipo de necrosis de la que no esta regulada. Muchos orgánulos y procesos celulares se han descrito como mediadores de la muerte celular necrótica, pero aún no está muy claro cuál es la relación existente entre unos y otros. Estos fenómenos incluyen alteraciones mitocondriales (producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), permeabilización de la membrana mitocondrial), cambios lisosomales (producción de ROS por reacciones de Fenton, permeabilización de la membrana lisosomal), cambios nucleares (hiperactivación de PARP-1) o incremento en la concentración citosólica de calcio. En ausencia de denominador bioquímico común, la muerte celular por necrosis está aún en gran parte identificada en términos negativos por la ausencia de apoptosis o marcadores autofágicos, en particular cuando las células se someten a la permeabilización temprana de la membrana plasmática. 1.2. APOPTOSIS. La apoptosis es un mecanismo de defensa del organismo frente a células infectadas o transformadas, controla el desarrollo de los organismos y la homeostasis de poblaciones celulares. Los posibles fallos que puedan darse en la maquinaria apoptótica desencadenan muchos tipos de enfermedades, ya sea por la acumulación de células (enfermedades de tipo autoinmune o el cáncer) o por la pérdida de células (enfermedades degenerativas). 1.2.1. Ruta extrínseca o de receptores mortales. Se caracteriza por la unión de ligandos a sus receptores específicos desencadenando una cascada de señalización a través de moléculas y caspasas [8]. 10 1.5.1. Efecto antimicrobiano. La berberina ejerce su efecto antimicrobiano mediante la unión a la cadena de DNA, lo que lleva a la muerte de la bacteria debido al daño en su material genético [30]. Pocos estudios han analizado la relevancia “in vivo” de estos hallazgos. La mayoría de los datos sugieren que la berberina tiene un bajo poder antimicrobiano por sí sola, pero muy alto cuando actúa en sinergia con otras drogas. Esta baja actividad antimicrobiana se debe a la presencia de bombas MDR (Multi Drug Resitance) en la membrana de esos microorganismos, por lo que en combinación con inhibidores de MDR se mejora la actividad de la berberina. 1.5.2. Efecto antiinflamatorio. La actividad antiinflamatoria de la berberina se da mediante la inhibición de la síntesis de las citoquinas TNFα (Tumor Necrosis Factor α) e Il-6 (interleuquina-6), y de MCP-1 (monocyte chemo-attractant protein 1). También afecta a la producción de la prostaglandina E2 (PGE2) y disminuye la expresión de COX-2, y de las metaloproteinasas de matriz -2 (MMP-2) y -9 (MMP-9) a través de las vías de señalización de MAPK y de NF-κβ [31]. 1.5.3. Efecto antidiabético. Existen informes sobre los beneficios del tratamiento de la diabetes de tipo II. Como ampliamente se describe en ratas diabéticas inducidas experimentalmente, este efecto parece ser mediado por la mejora de la homeostasis de la glucosa, aumento de la expresión de insulina y la regeneración de las células β del páncreas [32, 33]. También se han obtenido resultados prometedores en la administración de berberina a pacientes afectados por el síndrome metabólico, en el que la sensibilidad a la insulina se ve mejorada con el consecuente beneficio en la enfermedad [34, 35]. 1.5.4. Tratamiento de enfermedades cardiacas. La berberina posee propiedades inotrópicas positivas (mejora de la contracción cardiaca), cronotrópicas negativas (deceleración de la frecuencia cardíaca), antiarrítmicas, vasodilatadoras y antiateroescleróticas. Se conoce su papel como vaso 11 relajante en animales [36,37] y se ha usado con éxito en personas [38], lo que sugiere su potencial en el tratamiento de arritmias. El mecanismo por el cual se da este efecto antiarrítmico no está claro todavía, pero el modelo de conejo parece indicar que puede estar relacionado con la supresión del retraso de despolarización en el músculo ventricular [39]. Otro trabajo en ratas sugiere que la berberina tiene un efecto vasodilatador atribuible a su potenciación de la acetilcolina [40]. 1.5.5. Hiperlipidemias. Se ha encontrado que reduce el colesterol en el suero de personas voluntarias mediante un mecanismo independiente de las estatinas [41]. En un modelo de rata se observó como la berberina era capaz de aumentar la expresión de LDLR en el hígado [41]. Este aumento de LDLR suponía la reducción del colesterol asociado a LDL en sangre. Unos pocos estudios demuestran el aumento de formación y secreción de la bilis, y que la berberina es capaz de interactuar con las micelas [42, 43]. Se cree que de esta manera disminuye la capacidad de las micelas para solubilizar el colesterol disminuyendo por tanto la absorción de colesterol, aunque esto último no haya sido estudiado de forma directa. 1.5.6. Ensayos clínicos. Se han realizado ensayo clínicos con este compuesto que sugieren que es beneficioso para el tratamiento de tracomas (una inflamación conjuntiva causada por microorganismos), diarrea causada por un agente infeccioso y leishmaniosis. Además de estos existen más ensayos clínicos en los que se está examinando el valor de la berberina, los cuales quedan recogidos en la siguiente tabla (tabla 1) [28]. Study Status Condition Interventions Polycystic Ovary Syndrome (POCS): Effect Of Letrozole and Berberine Recruiting Polycystic ovary syndrome Drug: letrozle-berberine Drug: letrozole Drug: berberina 12 Role of Pioglitazone and Berberine in Treatement of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Completed Nonalcoholic fatty liver disease Lifestyle intervention Drug: pioglitazone Drug: berberina Effect of Berberine on Hormonal and Metabolic Features in Obese Women With Polycystic Ovary Syndrom (POCS) Active, not recruiting Polycystic ovary syndrome Obesity Drug: berberina Drug: placebo Efficacy and Safety of Berberine in the Treatment of Diabetes With Dyslipidemia Completed Diabetes mellitus, type 2 Metabolic syndrome Drug: berberina Therapeutic Effects of Berberine in Patients With Type 2 Diabetes Completed Type 2 diabetes Drug: berberina Drug: metformin Armolipid Plus and Metabolic Syndrome Completed Metabolic syndrome Dietary supplement: Armolipid Plus The Role of a Combination of Neutraceuticals in the Control of Cardiovascular Risk Active, not recruiting Metabolic syndrome Drug: Armolipid Plus Combined Effects of Bioactive Compound in Lipid Profile Recruiting Hyperlipidema lowdensity-lipoprotein-type elevated triglycerides Dietary supplement: Armolipid Plus Dietary supplement: placebo Effects of Armolipid Plus on Cholesterol Levels and Endothelial Function Completed Hyperlipidemia endothelial dysfunction Dietary supplement: mixture of berberina, policosanol, red yeast, placebo Ezetimibe Versus Nutraceuticals in Statin-intolerant Patients Not yet recruiting Coronary artery disease Drug: esetemibe Drug: nutraceuticals Tabla 1: Clinical trial. Se ha demostrado que la berberina es segura en la mayoría de los ensayos clínicos y que tiene una baja toxicidad secundaria frente a tejidos sanos. Se ha documentado que tanto las células T activadas o como las células T naive son resistentes a la berberina [44] y que esta es capaz de proteger a los timocitos de la muerte inducida por dexametasona, etoposido o camptotecina [45]. También existen informes de que los macrófagos no solo son resistentes a la muerte celular inducida por berberina sino que además es capaz de estimular la producción de citoquinas como IFNγ e IL12 “in vitro” e “in vivo” potenciando su efecto antimicrobiano. 13 1.5.7. La berberina y el cáncer. Aunque no se ha usado todavía en ensayos clínicos la berberina posee actividad antitumoral frente muchos tipos de tumores. De hecho, un estudio en el cual se usaron 60 líneas tumorales mostró que el valor de la IC50 para la berberina era similar al de otros alcaloides usados en quimioterapia como paclitaxel o vinblastina [46]. La mayoría de los datos se basan en la evidencia “in vitro” de su capacidad de afectar a varios pasos de desarrollo del tumor incluyendo la proliferación, la invasividad y la muerte celular [47, 48]. La berberina también se ha usado en combinación con radiación y otras drogas, siendo aparentemente más efectivo que las terapias individuales. En cuanto al mecanismo a través del cual la berberina elimina células tumorales parece ser mayoritariamente la inducción de apoptosis a través de la ruta mitocondrial, si bien algún trabajo indica que también es capaz de inducir autofagia. [28]. 2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS. La berberina se ha probado “in vitro” en diversos tipos de carcinomas sólidos tales como carcinoma de lengua, hepático, pulmonar, de tiroides, de próstata, de pecho, cerebral, de piel, de esófago y de colon [28]. Lo más interesante es que parece prevenir el desarrollo de carcinomas sólidos “in vivo” en modelos de xenotrasplante, autotrasplante, o tumores inducidos por carcinógenos. En ratones inmunocomprometidos a los que se les ha xenotrasplantado un tumor, se ha visto que inhibe el crecimiento de células cancerosas humanas que provienen de pulmón o de próstata [49, 50]. Finalmente, la administración de berberina inhibe el crecimiento del cáncer de lengua SCC-4 sugiriendo un efecto beneficioso en las plantas que contienen este alcaloide para la prevención de esta neoplasia. Asimismo es capaz de retardar la aparición de fibrosarcomas inducidos con agentes químicos [28]. Sorprendentemente, aunque la berberina inhibe el crecimiento de algunas líneas tumorales en ratones desnudos [51], no parece afectar al crecimiento del carcinoma pulmonar de Lewis de ratón después de la implantación ortotópica en la parénquima pulmonar [52]. Estos resultados contradictorios podrían ser debido al uso de diferentes líneas celulares de pulmón, el sitio de la implantación, o el uso modelos de trasplante xenogénicos frente asingénicos (autotrasplante). Por lo tanto, la interpretación de los 14 resultados procedentes de xenotrasplante de tumores humanos en ratones debe hacerse con cautela. Al igual que en carcinomas sólidos, la berberina presenta actividad antitumoral frente a diversos tipos de tumores hematológicos “in vitro” como leucemias mieloides agudas, leucemias linfocíticas agudas y algunos tipos de linfomas non-Hodgkin. Existen muy pocos estudios sobre la eficacia y el mecanismo de acción de la berberina contra estos tipos de neoplasias hematológicas, comparado con los estudios en canceres sólidos. Además solo un estudio ha analizado el papel de la berberina en pacientes con leucemia mieloide aguda [53], y los resultados indican que es capaz de inhibir la migración de las células tumorales, si bien no resulta muy citotóxica. Se ha demostrado que la berberina tiene potencial antitumoral “in vivo” frente a las leucemias linfocíticas agudas P388 [54] y la leucemia mieloide aguda WEHI-3 [55] en ratón. Además es capaz de inhibir la progresión de la eritroleucemia inducida por retrovirus en ratones inmunocompetentes [56]. En cuanto al mecanismo de acción de la berberina, los datos obtenidos en su mayoría en tumores sólidos indican que podría ser capaz de activar la ruta mitocondrial tras la inducción de daño en el DNA a través de la parada de ciclo inducida por la ruta TM/p53 y ATM/Chk1 [28]. Sin embargo los datos sobre el papel de la familia Bcl2 en la apoptosis inducida por la berberina son escasos y todos ellos indirecto. Únicamente se ha correlacionado la variación en los niveles de estas proteínas con el progreso de la apoptosis inducida por berberina, sin conocer de modo más directo cual es el efecto del aumento o inhibición de la expresión de estas proteínas sobre la apoptosis inducida por este alcaloide. En este trabajo fin de master se propuso arrojar más luz a las capacidades antitumorales que ha demostrado la berberina en tumores hematológicos así como el papel de la familia Bcl2 en la muerte celular ejecutada. También, ante la falta de estudios realizados en pacientes acusados de estas patologías, se quiso realizar más ensayos sobre las capacidades de este alcaloide sobre pacientes con neoplasias hematológicas y corroborar la baja toxicidad secundaria que se le atribuye. Por último se quiso obtener más resultados sobre el papel antileucémico “in vivo” de la berberina en un modelo de autotrasplante de ratón. Para ello se plantearon los siguientes objetivos: 1. Calcular la dosis inhibitoria mínima en diversas líneas tumorales hematológicas.  Leucemia aguda de tipo T. 15  Mieloma Múltiple.  Leucemia promonocítica. 2. Analizar el papel de la familia Bcl2 en el mecanismo de muerte celular activado en las líneas tumorales hematológicas analizadas en el objetivo anterior.  Analizar el efecto de la sobreexpresión de proteínas antiapoptóticas.  Analizar la inhibición de la expresión de proteínas proapoptóticas.  Evaluar la variación de la expresión de proteínas de la familia Bcl2. 3. Estudiar el papel antitumoral de la berberina en pacientes de leucemia linfocítica crónica de tipo B “in vitro”. 4. Comprobar la baja toxicidad secundaria de la berberina en células mononucleares de sangre periférica. 5. Analizar el papel preventivo de la berberina frente al desarrollo tumoral de un linfoma T “in vivo”. 16 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. CULTIVOS CELULARES 3.1.1. Líneas celulares utilizadas. Las líneas celulares utilizadas en este trabajo han sido las líneas establecidas de mieloma múltiple humano MM1S y RPMI 8226, las líneas de leucemia linfoblástica aguda humana Jurkat, las sublíneas derivadas Jurkat CrmA, Jurkat BclXL, la línea establecida de linfoma histiocítico difuso U937, y las sublíneas derivadas U937 Bcl2 y U937 Mcl1, todas obtenidas en nuestro laboratorio previamente mediante transfección estable de los cDNA correspondientes. Todas estas líneas crecieron en suspensión. Además se empleó la línea El4 de linfoma tímico de ratón de origen C57BL6 (H-2b). 3.1.2. Materiales y medios de cultivo. En este proyecto se han utilizado los siguientes medios de cultivo: medio RPMI 1640 y medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), todos suministrados por PAN Biotech GMBH. Los siguientes productos utilizados en el cultivo celular se obtuvieron de PAN Biotech: tripsina /EDTA, penicilina, estreptomicina. El piruvato sódico, la uridina, la mitomicina C, el β-mercaptoetanol suero de caballo (SH) y suero fetal bovino (SFB) fueron suministrados por Sigma (España), y la glucosa por Panreac. La glutamina fue de Invitrogen. Los frascos de cultivo utilizados para cultivos celulares se obtuvieron de TPP (Suiza), al igual que el resto de material de plástico estéril (placas Petri, placas de 6, 12, 24 y 96 pocillos, tubos para centrifugación, pipetas, etc.). Las placas de 24 pocillos antiadherentes fueron suministradas por Starstedt. Los filtros de 0,22 μm de tamaño de poro utilizados para la esterilización de soluciones fueron de Pall Corporation. Los tubos criogénicos utilizados para la congelación de células fueron suministrados por Nunc (Dinamarca), y los viales de 1,5ml fueron de Axigen Quality. 17 3.1.3. Mantenimiento de cultivos celulares. Todas las líneas celulares se cultivaron rutinariamente en frascos de cultivo de 25 cm2 (volumen máximo de células en suspensión, 20 ml) o 75 cm2 (volumen máximo de células en suspensión, 40 ml). Todas las células se sembraron a una densidad mínima de 3·105 cel/ml. Todas las líneas, a excepción de la línea MM1S, se cultivaron en medio RPMI 1640 completo con 5% SFB. La línea MM1S se cultivó con medio RPMI 1640 completo con 10% SFB. Las células se cultivaron en un incubador termostatizado, a 37oC, en aire saturado de humedad y con un 5% CO2. A los 3 o 4 días de cultivo, alcanzada una densidad menor de 1·106 cel/ml, se realizó el pase de los cultivos. Todas las manipulaciones con células se realizaron en campanas de flujo laminar vertical en condiciones estériles. El material de vidrio usado en la manipulación de las células se esterilizó previamente en un autoclave durante 20-30 min a 1,2 atm de presión y las disoluciones añadidas a los cultivos se esterilizaron usando filtros de 0.22 μm. 3.1.4. Inactivación del complemento en el suero bovino. En los experimentos realizados con células EL4 de ratón, el suero utilizado se decomplementó para evitar la lisis de las células por el sistema del complemento. Para ello, el suero se trató durante 30 min a 56oC y trascurrido este tiempo se centrifugó 15 min a 2095 g. El sobrenadante se recogió en un tubo de fondo cónico y se congeló hasta su uso. 3.1.5. Congelación y descongelación de líneas celulares. Aproximadamente 6·106 células se centrifugaron a 335 g durante 5 min, se eliminó el sobrenadante, se resuspendieron en 500 μl de medio completo conteniendo un 7,5% de DMSO y se trasvasó el contenido a un criotubo de congelación estéril. Los viales fueron introducidos rápidamente en un congelador a -80oC. Pasadas al menos 24 horas, los viales se almacenaron en un contenedor de nitrógeno líquido (-196oC) hasta su utilización. Para descongelar las células, se añadió lentamente a los criotubos un pequeño volumen de medio completo, hasta la descongelación de las células. En este momento, la 18 suspensión se añadió a aproximadamente 10 ml de medio completo, y rápidamente se centrifugó a 335 g durante 5 min. Tras la centrifugación y la eliminación del sobrenadante, se resuspendió el pellet de las células en 5-10 ml de medio completo, según la cantidad de células congeladas. Una vez las células se recuperaron de la descongelación, se sembraron a la densidad normal. 3.1.6. Detección de micoplasmas en cultivos celulares mediante PCR. La detección de micoplasmas mediante PCR se realizó de modo rutinario en todas las células en cultivo. Para una detección óptima, las células deben haber permanecido al menos 48 horas en cultivo antes de realizar el análisis. Como muestra se tomó una pequeña cantidad de medio de cultivo de cada línea celular, se centrifugó y se recogió el sobrenadante. Si la detección no se realizó de inmediato, estos sobrenadantes se conservaron a -20oC hasta su análisis. Las secuencias de los oligonucleótidos usados como cebadores de la reacción fueron: Mico A: 5’-GGC GAA TGG GTG AGT AAC ACG-3’ Mico B: 5-CGG ATA ACG CTT GCG ACC TAT G-3’ La amplificación se llevó a cabo en una mezcla de reacción que contenía por cada muestra:  5 μl de tampón de reacción (MgCl2 15 mM, KCl 500 mM, 1 % Tritónx100, Tris -HCl 100 mM pH 8.8)  2,5 μl de cebador Mico A 10 μM  0.25 μl de cebador Mico B 100 μM  5 μl dNTPs 2 mM  2 μl de sobrenadante  0,5 μl de Taq polimerasa 2 U/μl  36,5 μl de agua Milli-Q estéril Como control negativo de la amplificación se preparó la misma mezcla anterior sustituyendo el sobrenadante celular por H2O libre de DNasas y como control positivo se utilizó el sobrenadante de un cultivo celular contaminado, testado con anterioridad. 19 La amplificación se realizó con el siguiente programa de PCR:  Calentamiento inicial: 94oC / 3 min  Desnaturalización: 94oC / 30 seg.  Hibridación: 60oC / 30 seg.  Extensión: 72oC / 30 seg.  Extensión: 72oC / 5 min  30 ciclos: pasos 2-4. Los productos de amplificación obtenidos se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa (Sigma) al 1% en TBE (0,045 M Tris-borato, 1mM EDTA) que contenía SYBR® Safe DNA gel stain 1x (Invitrogen). Como marcadores de peso molecular se utilizó el 100bp DNA ladder de Promega. La visualización se llevó cabo en el transiluminador Gel Doc 2000 de BioRad Laboratories (Hércules, CA) y se analizó mediante el programa Bio-Rad Muti-Analyst (PC versión 1.1). En caso de resultado positivo apareció una banda de aproximadamente 500 bp. 3.1.7. Separación de células en gradiente de densidad. La separación de células en gradiente de densidad se llevó a cabo con el fin de eliminar las células muertas en los cultivos. Un volumen determinado de células se añadió despacio, con cuidado de no mezclar las fases, a un volumen equivalente de la solución de extracción Ficoll (Ficoll-Paque, obtenido de HE Healthcare). Se centrifugó a 524 g durante 20 min sin freno y posteriormente se recuperó con mucho cuidado el anillo que se encuentra en la interfase, correspondiente a las células vivas. 3.1.8. Obtención, purificación y cultivo de células mononucleares de sangre periférica humana. Para la obtención de las células mononucleares con las que se va a realizar los posteriores experimentos se utiliza sangre total con EDTA como anticoagulante procedente de los pacientes afectados de Leucemia linfocítica crónica de tipo B (LLCB) así como de voluntarios sanos. Tras diluir la sangre a la mitad con PBS estéril (Na2HPO4 8mM, KH2PO4 2 mM, NaCl 15 mM pH 7.4) las células mononucleares se separaron del resto de las células 26 segundos hasta varios min, aunque no es conveniente utilizar un tiempo de revelado muy largo debido al aumento de coloración inespecífica. Los líquidos de revelado y fijado utilizados fueron de la marca Kodak, y la preparación de los mismos se realizó según las instrucciones del fabricante. 3.3.5. Anticuerpos. Los anticuerpos utilizados en este trabajo para inmunoblot se resumen en la siguiente tabla (tabla 2). Anticuerpo Características Concentración Proveedor Bax mc, conejo 1/1000 BD Pharmigen Bak pc, conejo 1/1000 Millipore BclXL pc, conejo 1/1000 Cell Signaling Bim pc, conejo 1/1000 Calbiochem Bcl2 pc, conejo 1/1000 Santa Cruz Mcl1 pc, conejo 1/1000 Santa Cruz Tabla 2: Relación de anticuerpo. mc: monoclonal; pc: policlonal 3.4. RATONES. Para los experimentos “in vivo” realizados en este trabajo se utilizaron ratones de la estirpe C57BL6 y C57BL10 deficiente para el receptor tipo toll-2 (TLR2-/-). Todos estos ratones provienen del laboratorio de Markus Simon, del Max-Planck Institute of Immunobiology, Friburgo, Alemania. Estos ratones se han mantenido y criado en condiciones libres de patógenos en el animalario del Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria (CITA) del Gobierno de Aragón. 3.4.1. Desarrollo tumoral en ratones. A ratones de 8-9 semanas de edad se les separo en una población tratada, a la que se le administro 10mg/Kg (200 µL a una concentración 0.9 mg/mL) cada 48 horas durante una semana, y una población control, a la que se le administro 200 µL de PBS cada 48 27 horas durante una semana. Posteriormente se inyectaron subcutáneamente 2·105 células EL4, recogidas en fase exponencial de crecimiento, en 100 μl de RPMI 1640 Al 2% de SFB decomplementado. Tras la inoculación, el tratamiento se administraba cada 24 horas y se analizó el desarrollo del tumor mediante la medición del tumor diaria con un calibre de precisión. Para calcular el volumen del tumor, se midió el ancho (A), largo (L) y alto (T) del tumor y se aplicó la siguiente fórmula: Los ratones se sacrificaron a los 9-12 días de la inoculación. Los tumores se extirparon y se procedió a medir su volumen y peso final. 3.5. ANÁLISIS INFORMÁTICO DE DATOS 3.5.1. Estadística. El análisis estadístico de la significancia fue realizado mediante un análisis del cálculo de la t Student de dos colas, desapareado y con un intervalo de confianza del 95% empleando el programa GraphPad Prisma 4.0. (GrandPath Software, Inc., San Diego, CA, USA). Los análisis estadísticos que dieron como resultado no significativos no se reflejan en las figuras. Los datos reflejados con un asterisco (*) dieron como resultado una P menor de 0.05. Los datos reflejados con dos asteriscos (**) dieron como resultado una P menor de 0.01. 28 4. RESULTADOS. 4.1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (IC50) DE LA BERBERINA SOBRE DISTINTOS TIPOS CELULARES. Se llevó a cabo la determinación de la IC50 en distintas líneas celulares tumorales con el objetivo de analizar la distinta sensibilidad de estas células a la acción citotóxica de la berberina. Las distintas líneas celulares tumorales empleadas fueron: los mielomas múltiples humano MM1S y RPMI 8226, el linfoma histiocítico U937 y la leucemia T humana Jurkat. 4.1.1. Determinación de la IC50 en el mieloma múltiple MM1S. Figura 1: Análisis de la translocación de la fosfatildilserina y la permeabilidad de la membrana plasmática inducida por la berberina en las células MM1S. Se trataron las células MM1S con las distintas concentraciones de berberina durante 24 y 48 horas. Posteriormente se incubaron con Anexina V dy634 y 7-AAD tal y como se describe en los métodos y se analizó la fluorescencia por citometría de flujo. Las imágenes superiores muestran el análisis por citometría de flujo de un experimento representativo. Los 29 números indican el % de células en cada cuadrante. La gráfica representa la media+/-SEM de 3 experimentos independientes. Se compararon estadísticamente los mismos rangos de concentración a distinto tiempo mediante el programa GraphPad Prisma. Como se observa en la figura 1, La línea MM1S resulto sensible al efecto de la berberina, alcanzando la IC50 a una concentración cercana a 100 µM tanto a 24 como a 48 horas. Se optó por usar esta concentración para realizar los experimentos posteriores. 4.1.2. Determinación de la IC50 en el mieloma múltiple RPMI 8226. Figura 2: Análisis de la translocación de la fosfatildilserina y la permeabilidad de la membrana plasmática inducida por la berberina en las células RPMI 8226. Se trataron las células RPMI 8226 con las distintas concentraciones de berberina durante 24 y 48 horas. Posteriormente se incubaron con Anexina V dy634 y 7-AAD tal y como se describe en los métodos y se analizó la fluorescencia por citometría de flujo. Las imágenes superiores muestran el análisis por citometría de flujo de un experimento representativo. Los números indican el % de células en cada cuadrante. La gráfica representa la media+/-SEM de 3 experimentos independientes. Se compararon estadísticamente los mismos rangos de concentración a distinto tiempo mediante el programa GraphPad Prisma. A diferencia de la línea MM1S, la línea RPMI resulto ser más resistente a la berberina. De hecho, como puede observarse en la figura 2, a las 24 horas no se alcanzaba la IC50 en el rango de concentraciones utilizado. A pesar de que la desviación entre los datos 30 obtenidos de uno a otro ensayo es grande, de nuevo se optó por la concentración de 100 µM, en este caso a las 48 horas, por ser la más cercana a la IC50. 4.1.3. Determinación de la IC50 en el linfoma histiocítico U937. Figura 3: Análisis de la translocación de la fosfatildilserina y la permeabilidad de la membrana plasmática inducida por la berberina en las células U937. Se trataron las células U937 con las distintas concentraciones de berberina durante 24 y 48 horas. Posteriormente se incubaron con Anexina V dy634 y 7-AAD tal y como se describe en los métodos y se analizó la fluorescencia por citometría de flujo. Las imágenes superiores muestran el análisis por citometría de flujo de un experimento representativo. Los números indican el % de células en cada cuadrante. La gráfica representa la media+/-SEM de 3 experimentos independientes. Se compararon estadísticamente los mismos rangos de concentración a distinto tiempo mediante el programa GraphPad Prisma. En la figura 3 se observa que la línea U937 fué completamente resistente a la berberina a 24 horas en el rango de concentraciones utilizado, alcanzándose la IC50 a las 48 horasde a una concentración de berberina alrededor de 50 µM. 31 4.1.4. Determinación de la IC50 en la leucemia T Jurkat. Figura 4: Análisis de la translocación de la fosfatildilserina y la permeabilidad de la membrana plasmática inducida por la berberina en las células Jurkat. Se trataron las células Jurkat con las distintas concentraciones de berberina durante 24 y 48 horas. Posteriormente se incubaron con Anexina V dy634 y 7-AAD tal y como se describe en los métodos y se analizó la fluorescencia por citometría de flujo. Las imágenes superiores muestran el análisis por citometría de flujo de un experimento representativo. Los números indican el % de células en cada cuadrante. La gráfica representa la media+/-SEM de 3 experimentos independientes. Se compararon estadísticamente los mismos rangos de concentración a distinto tiempo mediante el programa GraphPad Prisma. La línea Jurkat presento una sensibilidad intermedia a la berberina, dando como resultado para la mayor concentración analizada (200 µM) un índice de toxicidad muy alto tanto a 24 como a 48 horas (figura 4). Al igual que para la línea U937, la concentración de la IC50 se situaba alrededor de 50µM, si bien en este caso esta concentración era más evidente a las 48 horas. 32 4.2. ANÁLISIS DEL MECANISMO DE MUERTE CELULAR ACTIVADO POR LA BERBERINA UTILIZANDO MUTANTES DE LAS LINEAS TUMORALES. Uno de los objetivos planteados era intentar determinar cuál de los mecanismos de muerte celular programada, la vía apoptótica extrínseca o la vía apoptótica intrínseca, cobraba más importancia en el mecanismo desencadenado por la acción de la berberina. Para ello se analizó la exposición de la fosfatidilserina, la permeabilidad de la membrana celular y la caída del potencial mitocondrial utilizando mutantes donde se habían sobrexpresado diferentes proteínas que protegen de estas dos vías de apoptosis. Se utilizaron las líneas celulares Jurkat y U937, que servirían como control, y las líneas mutantes: Jurkat CrmA, Jurkat BclXL, U937 Bcl2 y U937 Mcl1. 4.2.1. Determinación de la exposición de la fosfatidilserina y la permeabilidad de la membrana celular en la línea celular Jurkat y sus líneas mutantes. Se realizaron ensayos a 24 y 48 horas sobre las líneas celulares: Jurkat, Jurkat CrmA y Jurkat BclXL a una concentración de berberina de 100 µM, la cual habíamos determinado como la más cercana a la IC50 en la línea Jurkat. Figura 5: Análisis de la translocación de la fosfatildilserina y la permeabilidad de la membrana plasmática inducida por la berberina en las células Jurkat, Jurkat CrmA y Jurkat BclXL. Se trataron las células Jurkat, Jurkat CrmA y Jurkat BclXL con berberina 100 µM durante 24 y 48 horas. 33 Posteriormente se incubaron con Anexina V dy634 y 7-AAD tal y como se describe en los métodos y se analizó la fluorescencia por citometría de flujo. Las imágenes superiores muestran el análisis por citometría de flujo de un experimento representativo. Los números indican el % de células en cada cuadrante. La gráfica representa la media+/-SEM de 2 experimentos independientes. Se compararon estadísticamente cada control con las células tratadas, además de las diferencias entre las líneas tratadas y los controles entre sí a mismo tiempo mediante el programa GraphPad Prisma. A pesar de haber determinado la concentración de berberina 100 µM como la más cercana a la IC50, en estos experimentos la mortalidad de la línea celular Jurkat tratada con berberina no supero el 20% a ninguno de los dos tiempos (figura 5). Los resultados obtenidos para la línea celular Jurkat CrmA determinan que la mortalidad a las 24 horas se encuentra en torno al 20% mientras que a las 48 horas se encuentra en torno al 10%, teniendo en cuenta que no existe diferencia entre el control y las células tratadas. En el caso de la línea celular Jurkat BclXL a las 24 horas existe una diferencia cercana al 20% de mortalidad de las células tratadas respecto del control. Sin embargo a las 48 horas no existe ninguna diferencia aparente entre ambas. 4.2.2. Determinación de la exposición de la fosfatidilserina y la permeabilidad en la membrana celular en la línea celular U937 y sus líneas mutantes. Se realizaron ensayos a 24 y 48 horas sobre las líneas: U937, U937 Bcl2 y U937 Mcl1 a una concentración de berberina de 50 µM, la cual se había determinado que era la más cercana a la IC50 en la línea U937. 34 Figura 6: Análisis de la translocación de la fosfatildilserina y la permeabilidad de la membrana plasmática inducida por la berberina en las células U937, U937 Bcl2 y U937 Mcl1. Se trataron las células U937, U937 Bcl2 y U937 Mcl1 con berberina 50 µM durante 24 y 48 horas. Posteriormente se incubaron con Anexina V dy634 y 7-AAD tal y como se describe en los métodos y se analizó la fluorescencia por citometría de flujo. Las imágenes superiores muestran el análisis por citometría de flujo de un experimento representativo. Los números indican el % de células en cada cuadrante. La gráfica representa la media+/-SEM de 2 experimentos independientes. Se compararon estadísticamente cada control con las células tratadas, además de las diferencias entre las líneas tratadas y los controles entre sí a mismo tiempo mediante el programa GraphPad Prisma. Como se puede observar en la figura 6, de nuevo sucede que a la concentración determinada como más cercana a la IC50, la mortalidad de la línea U937 tratada no superó el 10% a ninguno de los dos tiempos en estos experimentos. Los resultados obtenidos para la línea U937 Bcl2 y U937 Mcl1 tienen mucha similitud. Ambas presentan muy poca mortalidad y valores prácticamente idénticos para el caso de la línea tratada y la línea control. Solo en el caso de la línea U937 Mcl1 a las 48 horas se observa una mortalidad en la línea tratada del doble respecto al control, pero a pesar de ello ese dato no supera el 15% de mortalidad. 35 4.2.3. Determinación de la caída de potencial mitocondrial en la línea celular Jurkat y sus líneas mutantes. Se realizaron ensayos a 24 y 48 horas sobre las líneas: Jurkat, Jurkat CrmA y Jurkat BclXL a una concentración de berberina de 100 µM, la cual se había determinado que era la más cercana a la IC50 en la línea Jurkat. Figura 7: Análisis de la caída de potencial mitocondrial inducida por la berberina en las células Jurkat, Jurkat CrmA y Jurkat BclXL. Se trataron las células Jurkat, Jurkat CrmA y Jurkat BclXL con berberina 100 µM durante 24 y 48 horas. Posteriormente se incubaron con TMRE tal y como se describe en los métodos y se analizó la fluorescencia por citometría de flujo. Las imágenes superiores muestran el análisis por citometría de flujo de un experimento representativo. Los números indican el % de células en cada cuadrante. La gráfica representa la media+/-SEM de 2 experimentos independientes. Se compararon estadísticamente cada control con las células tratadas, además de las diferencias entre las líneas tratadas y los controles entre sí a mismo tiempo mediante el programa GraphPad Prisma. En la figura 7 no se observa una caída de potencial apreciable al comparar las células tratadas con el control a las 24 horas ni en la línea Jurkat CrmA, ni en la línea Jurkat BclXL. Únicamente se observa una gran caída de potencial en el caso de la línea Jurkat, lo cual puede deberse a un efecto basal, puesto que las células tratadas presentan también un alto porcentaje de caída de potencial mitocondrial. En los datos recogidos a las 48 horas no se observa que ninguna de las líneas, tanto las tratadas como los controles, superen una caída del potencial mitocondrial superior al 30%. A diferencia de la línea Jurkat, sí que se observan diferencias al comparar las 42 4.3.2. Ensayo sobre el paciente 04/2011. Figura 14: Ensayo de la citotoxicidad de la berberina frente a un paciente con LLC-B. Las células obtenidas del paciente de LLC-B 04/2011 se trataron a distintas concentraciones de berberina durante 24 horas, en presencia y ausencia de Z-DEVD-FMK. Posteriormente se incubaron con AnnV V Dy634 y 7AAD tal y como se describe en los métodos y se analizó la fluorescencia por citometría de flujo. Las imágenes superiores muestran el análisis por citometría de flujo de un experimento representativo. Los números indican el % de células en cada cuadrante. En el caso del paciente de LLC-B 04/2011, el control llega a alcanzar una muerte basal del 60%. A pesar de ello sigue observándose un incremento de la muerte en función de concentraciones más altas de berberina (figura 14). De nuevo los datos obtenidos en presencia del inhibidor Z-DEVD-FMK son muy similares a los datos obtenidos en su ausencia, sin embargo sí que puede apreciarse una ligera protección en este caso. 43 4.3.3. Ensayo sobre el paciente 08/2011. Figura 15: Ensayo de la citotoxicidad de la berberina frente a un paciente con LLC-B. Las células obtenidas del paciente de LLC-B 08/2011 se trataron a distintas concentraciones de berberina durante 24 horas, en presencia y ausencia de Z-DEVD-FMK. Posteriormente se incubaron con AnnV V Dy634 y 7AAD tal y como se describe en los métodos y se analizó la fluorescencia por citometría de flujo. Las imágenes superiores muestran el análisis por citometría de flujo de un experimento representativo. Los números indican el % de células en cada cuadrante. Al igual que se ha ido observando con los otros pacientes de LLC-B, se repite un incremento de la mortalidad a concentraciones mayores de berberina, siendo para este caso mayor el salto dado entre el control y la primera concentración que los saltos sucesivos (figura 15). La presencia del inhibidor Z-DEVD-FMK sigue suponiendo una muy ligera protección, de modo que no podemos aventurar que dichas diferencias puedan deberse a él o a simples errores experimentales. 44 4.4. TOXICIDAD DE LA BERBERINA EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA (PBLs). Para determinar la posible aplicación de la berberina en tratamientos era necesario llevar a cabo ensayos sobre la toxicidad de la misma en PBLs sanos, de modo que su actividad citotóxica se desempeñe únicamente en las células objetivo del tratamiento. Con este objetivo se realizaron ensayos “ex vivo” con poblaciones de PBLs sanos extraídos de muestras de pacientes poliglobúlicos, donadas por el Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa de Zaragoza. Los PBLs se incubaron a las dosis de 25 µM, 50 µM, 100 µM y 200 µM de berberina durante 24 y 48 horas. Transcurrido este tiempo las células se marcaron con Anexina V Dy634. De la misma manera se llevaron a cabo ensayos “ex vivo” con poblaciones de macrófagos obtenidos de la médula ósea de ratones C57BL6. 4.4.1. Ensayo sobre PBLs de pacientes poliglobúlicos. Figura 16: Análisis de la citotoxicidad de la berberina sobre PBLs sanos. Se trataron los PBLs con las distintas concentraciones de berberina durante 24 y 48 horas. Posteriormente se incubaron con AnnV V 45 dy634 tal y como se describe en los métodos y se analizó la fluorescencia por citometría de flujo. Las imágenes superiores muestran el análisis por citometría de flujo de un experimento representativo. Los números indican el % de células en cada cuadrante. La gráfica representa la media+/-SEM de 3 experimentos independientes. Se compararon estadísticamente los mismos rangos de concentración a distinto tiempo y cada concentración con el control a cada tiempo mediante el programa GraphPad Prisma. En la figura 16 observamos como el porcentaje de células positivas al marcaje con Anexina V incrementa a concentraciones mayores de berberina, al igual que ha ido repitiéndose con los ensayos similares que se han presentado anteriormente. Aunque la diferencia es significativa al comparar el control con 200 µM de berberina, ninguno de los datos sobrepasa el 20% de la población. Solo el dato representado a las 48 horas y a una concentración de 100 µM sobresale entre los demás, pero no puede considerarse fiable dado el error experimental. 4.4.2. Ensayo sobre macrófagos extraídos de ratón. Figura 17: Análisis de la citotoxicidad de la berberina sobre macrófagos de ratón. Se trataron los PBLs con las distintas concentraciones de berberina durante 24 y 48 horas. Posteriormente se incubaron con Anexina V dy634 y 7-AAD tal y como se describe en los métodos y se analizó la fluorescencia por citometría de flujo. Las imágenes superiores muestran el análisis por citometría de flujo de un 46 experimento representativo. Los números indican el % de células en cada cuadrante. La gráfica representa la media+/-SEM de 3 experimentos independientes. Se compararon estadísticamente los mismos rangos de concentración a distinto tiempo y cada concentración con el control a cada tiempo mediante el programa GraphPad Prisma. Aunque según los dot plots representativos se podría decir que en todos ellos se observan grandes porcentajes de poblaciones positivas únicamente para 7-AAD (figura 17), estos datos fueron discriminados debido a un problema en la realización de los settings en los que no se tuvo en cuenta la propia autofluorescencia de los macrófagos y la fluorescencia intrínseca de la berberina. Descartados estos datos, ninguna de las poblaciones a las distintas concentraciones de berberina, tanto a las 24 como a las 48 horas, sobrepasa el 30% de mortalidad, salvo la población a berberina 200 µM a las 24 horas. 4.5. ACCIÓN PREVENTIVA DE LA BERBERINA FRENTE AL DESARROLLO TUMORAL DE LEUCEMIA “IN VIVO”. En el laboratorio ya se habían llevado a cabo ensayos en los cuales se había tratado con berberina a una población de ratones a los que previamente se les habían inoculado células de leucemia de ratón EL4. Se había visto que la berberina retrasaba el crecimiento tumoral aunque no eliminaba los tumores. Al ser un componente natural de las plantas utilizadas en medicina tradicional se pensó en el beneficio que puede desempeñar su toma habitual por lo que se diseñó un nuevo ensayo en el que se empezara a tratar con berberina a la población en estudio una semana previa a la inoculación de las células tumorales. Los 16 ratones C57BL6 de los que se disponían se dividieron en dos poblaciones, una a la que se trataría con 10mg/Kg de berberina cada 48 horas y otra población control en la que se sustituyó la berberina por PBS. Los ratones tratados fueron numerados del 1 al 8 mientras que a los ratones control se les asigno números del 9 al 16. Después de una semana de tratamiento, se inocularon 2·105 células EL4 a cada ratón de forma subcutánea en uno de los costados, considerándose este como el día 0. El crecimiento de los tumores se controló cada día hasta el día 12, en el cual los ratones fueron sacrificados, se les extirparon los tumores y se procedió a medir su volumen real y su peso. 47 Figura 18: Análisis “in vivo” de la acción de la berberina frente a EL4 en ratones C57BL6. En la gráfica A se representa el volumen medido del tumor de cada ratón (en negro los ratones control y en verde los ratones tratados) frente a los días. En la gráfica B se representa el volumen medio de los tumores de los ratones tratados (en verde) y de los ratones control (en negro) frente a los días. En la gráfica C se representa el volumen final de los tumores después de sacrificar a los ratones. En la gráfica D se representa el peso de los tumores extraídos después de sacrificar a los ratones. Los datos representados en las gráficas C y D se compararon estadísticamente de forma respectiva mediante el programa GraphPad Prisma. Durante la disección de los ratones para extirparles el tumor, se tomaron notas sobre la apariencia que mostraba el interior de cada ratón, las cualidades de cada tumor, si se observaba infiltración, si había afectado a otros órganos o si se observaba necrosis:  EL ratón 1 presentaba un tumor muy consistente y delimitado, el cual además no presentaba rasgos de necrosis.  El ratón 2 presentaba una ligera infiltración que llegaba hasta los riñones. El tumor no mostraba rasgos de necrosis pero si de disgregabilidad.  El ratón 3 presentaba un tumor compacto, delimitado, sin rasgos de necrosis ni de infiltración.  El ratón 4 presentaba un tumor muy necrotizado por la cara externa, pero delimitado, compacto y subcutáneo. Adherido al tumor se observó una 48 irrigación a simple vista similar a la grasa, la cual se hipotetizo que fueran ganglios o células El4.  El ratón 5 se halló muerto el día del sacrificio. A pesar de presentar un tumor pequeño en tamaño, este era deleznable y con un alto grado de infiltración a uno de los riñones.  El ratón 6 presentaba un tumor con dos zonas diferenciables, una sólida y otra endeble. Se encontraba ligeramente infiltrado y no mostraba rasgos de necrosis.  El ratón 7 presentaba un tumor pequeño, subcutáneo, firme y bien delimitado.  El ratón 8 presentaba un tumor por debajo de la hipodermis que había invadido uno de los riñones, además de tener un aspecto inconsistente.  El ratón 9 presentaba un tumor con dos secciones, una pequeña y con cierto grado de necrosis que se mantenía en la capa subcutánea, y otra mayor la cual se había infiltrado hasta e hueso.  El ratón 10 presentaba dos tumores, uno de ellos más compacto y subcutáneo, y otro más endeble e interno sin llegar a sobrepasar la hipodermis. Ambos tumores se mantenían unidos por un tejido blanquecino similar al observado en el ratón 4.  El ratón 11 presento dos tumores de apariencia similar a los vistos en el ratón 10. El mayor de los tumores presentaba tropismo hacia a columna pero no llegaba a presentar infiltración.  El ratón 12 presentaba un tumor diminuto con adherencias del tejido blanquecino comentado anteriormente.  El ratón 13 presentaba un tumor deleznable. Unido a él se observaban ganglios y tejido blanquecino.  El ratón 14 presentaba una pequeña zona necrotizada en la parte exterior. En el interior mostro ser compacto, subcutáneo y sin infiltraciones.  El ratón 15 presentaba dos tumores, uno de ellos considerablemente mayor que el otro, con tropismo hacia la columna. Aunque no firme, no era tan frágil como el que presentaba el ratón 13.  El ratón 16 presento un tumor pequeño, necrótico en la cara expuesta pero completamente superficial. Los resultados obtenidos, sin tener en cuenta aquellos casos que se salen de la tendencia, parecen mostrar que los ratones tratados frente a los ratones control presentan 49 tumores de menor tamaño y pesos (figura 18). Además estos presentan un aspecto menos invasivo y más encapsulado, lo que podría considerarse más benigno. Esta prueba realizada se repitió pasado un tiempo con la diferencia de que se consideró como día 0 el día en que los tumores alcanzaron un volumen de 30-50 mm3, retrasando o adelantando el periodo en unos u otros ratones según el crecimiento para ajustar al máximo las desviaciones. En este caso los ratones usados fueron 17 ratones de la estirpe TLR2-/- C57BL10, al ser aquellos de los que se disponía y juzgar que no afectaría al desarrollo del ensayo. Los ratones se dividieron en una población de 8 y 9 ratones de las cuales la primera se consideró como la población de ratones a tratar y la segunda como la población control. La población tratada se numeró del 1 al 8 y la población control del 9 al 17. Tras la inoculación de las células EL4 de forma similar a la anterior, el crecimiento de cada tumor fue controlado hasta el día 9 en que los ratones fueron sacrificados. Figura 19: Análisis “in vivo” de la acción de la berberina frente a EL4 en ratones TLR2-/- C57BL10. En la gráfica A se representa el volumen medido del tumor de cada ratón (en negro los ratones control y en verde los ratones tratados) frente a los días. En la gráfica B se representa el volumen medio de los tumores de los ratones tratados (en verde) y de los ratones control (en negro) frente a los días. En la gráfica C se representa el volumen final de los tumores después de sacrificar a los ratones. En la gráfica D se representa el peso de los tumores extraídos después de sacrificar a los ratones. Los datos 50 representados en las gráficas C y D se compararon estadísticamente de forma respectiva mediante el programa GraphPad Prisma. De nuevo se llevó a cabo un análisis cualitativo sobre la apariencia que mostraba el interior de cada ratón, las cualidades de cada tumor, si se observaba infiltración, si había afectado a otros órganos o si se observaba necrosis en el momento de la disección.  El ratón 1 presentaba un tumor diferenciable en 3 partes de las cuales la más pequeña era ligeramente invasiva sin llegar a atravesar la hipodermis ni a afectar a los riñones.  El ratón 2 presentaba un tumor diferenciable en 3 partes superficiales y sin infiltraciones. El tumor era fácilmente disgregable de la dermis y presentaba mucha irrigación sanguínea.  Los ratones 3, 4 y 5 presentaban tumores prácticamente idénticos, superficiales, planos y completamente subcutáneos. Se podía observar cierto grado de necrotización en el centro de la cara expuesta del tumor.  El ratón 6 presentaba un tumor de nuevo idéntico a los observados en los ratones 3, 4 y 5, con la única salvedad de que en este caso la cara externa estaba totalmente necrotizada.  El ratón 7 presentaba un tumor superficial y necrótico en la superficie además de otro de menor tamaño que se infiltro por debajo de la hipodermis. Este segundo tumor se encontraba adherido al hueso y parecía haberse introducido en las costillas. A pesar de su invasión no había afectado a los riñones.  El ratón 8 presentaba la misma morfología que se había observado en los ratones 3, 4 y 5.  El ratón 9 presentaba dos tumores, uno superficial con gran presencia de tejido blanquecino y cierto grado de necrotización, y otro que había llegado a infiltrar hasta los intestinos. En un principio no se observaron afectados ni los riñones ni el hígado, pero el tumor se extendió hasta las costillas.  El ratón 10 presentaba un tumor superficial necrotizado con gran presencia de tejido blanquecino.  El ratón 11 presentaba un tumor superficial con ligeros signos de necrosis, y un segundo tumor de gran tamaño infiltrado por debajo de la hipodermis y muy irrigado. Este segundo tumor había llegado hasta las costillas. Aunque los 51 riñones e hígado no parecían estar afectados, este ultimó presenta un color extraño.  El ratón 12 presentaba un tumor superficial, completamente subcutáneo y ligeramente necrotizado.  El ratón 13 presentaba un tumor localizado por debajo de la hipodermis que mostraba signos de irrigación.  El ratón 14 presentaba un tumor subcutáneo con gran presencia de tejido blanquecino. En este caso dicho tejido presentaba una consistencia más espesa a la que se había observado anteriormente.  El ratón 15 presentaba un tumor con la cara externa necrótica y un segundo tumor infiltrado. El tumor presentaba moderada irrigación.  El ratón 16 presentaba un tumor superficial necrótico, muy extendido e irrigado. Se puedo observar también una protuberancia del tumor completamente infiltrada en las costillas.  El ratón 17 presentaba un tumor con menor irrigación como la que se había visto en el resto de los ratones control. Como el resto de tumores, presentaba la cara externa necrótica. También se observó por la zona inguinal, un cuerpo con el aspecto pero demasiado grande para ser un ganglio, que se recogió para su posterior análisis. Como se había observado en la prueba anterior con los ratones C57BL6, los datos aportados en este ensayo coincidían en que los ratones tratados frente a los ratones control presentan tumores de menor tamaño y peso (figura 19). Además estos presentan un aspecto menos invasivo y más encapsulado, lo que podría considerarse más benigno. Éste estudio es quizás más visible al haber intentado corregir la desviación y poder verse más claramente, exceptuando los casos que siempre se salen de la normal, los datos obtenidos de forma cuantitativa y cualitativa. 58 46. Efferth, T., et al. Molecular determinants of response of tumor cells to berberine. Cancer Genomics Proteomics, 2005. 2: p. 115–124. 47. Sun, Y., et al. A systematic review of the anticancer properties of berberine, a natural product from Chinese herbs. Anticancer Drugs, 2009. 20(9): p. 757–769. 48. Tang, J., et al. Berberine and Coptidis rhizome as novel antineoplastic agents: a review of traditional use and biomedical investigations. J Ethnopharmacol, 2009. 126(1): p. 5–17. 49. Katiyar, S. K., et al. p53 Cooperates berberine-induced growth inhibition and apoptosis of non-small cell human lung cancer cells in vitro and tumor xenograft growth in vivo. 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