Repositorio Institucional de Documentos

CENTRO INTERNACIONAL DE ALTOS ESTUDIOS AGRONÓMICOS MEDITERRÁNEOS INSTITUTO AGRONÓMICO MEDITERRÁNEO DE ZARAGOZA EVALUACIÓN DE PARÁMETROS DE FERMENTACIÓN RUMINAL Y EMISIONES DE METANO EN RACIONES REPRESENTATIVAS DE DIFERENTES SISTEMAS DE PRODUCCIÓN DE OVINO LECHERO EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO Carolina PINEDA QUIROGA Este trabajo fue realizado en el Departamento de Producción Animal del Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario NEIKER-Tecnalia bajo la supervisión de los Drs. Roberto Ruíz Santos y Aser García Rodríguez El presente trabajo de investigación es un requisito para obtener el grado académico de Máster of Science en Nutrición Animal AGRADECIMIENTOS Al Departamento de Producción Animal del Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario, Neiker-Tecnalia por la oportunidad de vincularme con ellos. A Roberto Ruíz Santos por su gran apoyo durante toda la estancia de investigación en el Departamento de Producción Animal, por su orientación y acompañamiento constante en el desarrollo del trabajo de investigación. A Aser García Rodríguez por su orientación permanente en el desarrollo del trabajo de investigación, por su enorme contribución en mi formación profesional y personal y por su continuo respaldo. A Nerea Mandaluniz por su incondicionalidad y voluntad de ayuda en todo lo necesario durante la ejecución del trabajo, por la confianza y por la oportunidad de establecer un agradable vínculo de amistad. A mi familia por creer en mí, por su apoyo incondicional. A mis padres por acompañarme cada día y en todo momento a pesar de la distancia. A mi madre por ser mi gran motivación, mi alegría, por sus palabras oportunas y llenas de afecto cada vez que fueron necesarias, a mi padre por ser el mejor que maestro tengo, por su palabra precisa, clara y siempre llena de razón; a ellos dos por enseñarme siempre que todo lo que se hace bien desde el principio, ahorra la incertidumbre y las dudas de lo que pueda venir. Para ellos que lo merecen todo, este y todos los demás triunfos que vendrán. “De la lengua maya se aprende que no hay jerarquía que separe el sujeto del objeto, porque yo bebo el agua que me bebe y soy mirado por todo lo que mire… y se aprende a saludar así: - Yo soy tu. – Tu eres otro yo”. Eduardo Galeano. La ejecución de este trabajo de investigación ha sido llevada a cabo en el marco del proyecto RTA-2011-00133-C02-01 financiado por el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria INIA. i RESUMEN El objetivo de este estudio fue: i) Evaluar in vitro los parámetros de fermentación ruminal, la digestibilidad y emisiones de metano de las dietas empleadas en explotaciones de ovino lechero con diferente nivel de intensificación y representativas de los principales sistemas de producción existentes en la Comunidad Autónoma del País Vasco (CAPV); ii) así como proponer estrategias de mitigación de emisiones de metano para este sistema ganadero. Se monitorizaron y caracterizaron 16 rebaños en fase de preparto y 14 rebaños al inicio de lactación. Para cada caso, mediante encuesta a los pastores se identificaron características de raza empleada, manejo nutricional y tipo de forraje suministrado. Se tomaron muestras individuales de los ingredientes que conformaron las raciones suministradas en cada uno de los rebaños para realizar el análisis químico laboratorial, calcular el aporte nutricional de la ración total y realizar incubaciones in vitro para determinar parámetros de la cinética de producción de gas, digestibilidad, producción de ácidos grasos volátiles y de metano. La proporción media forraje/concentrado empleado en las raciones de preparto fue de 70:30, siendo heno de pradera de diferente calidad el forraje suministrado en la mayoría de los rebaños. Las raciones de inicio de lactación emplearon una proporción media forraje/concentrado de 60:40, ofreciendo heno de pradera en la mitad de los rebaños en conjunto con otro tipo de forrajes. Las raciones de inicio de lactación presentaron con respecto a las de preparto presentaron una menor producción potencial de gas (268,11 vs. 312.98 ml/g MOI, P<0,001), menor producción de gas/día por gramo de materia orgánica incubada (159,87 vs. 169,23 ml/g, MOI, P=0,043) y una mayor digestibilidad (64 vs. 59 g/100 g, P=0,005); la eficiencia de los procesos fermentativos también fue mayor, siendo superiores el factor de partición a 24 horas (4,04 vs. 3,66 mg MO/ml, P=0,009), la síntesis de biomasa microbiana a 24 horas (126,08 vs. 104,37 mg, P=0,010) y la eficiencia de dicha síntesis microbiana a 24 horas (45 vs. 39 g/100g, P=0,002), mientras que la producción de gas/día por gramo de materia orgánica fermentable (248,18 vs. 278,77 ml/g, P<0,001) y el ratio ácido graso volátil : materia orgánica fermentable (17,33 vs. 19,84 mmol/g MOF, P=0,005) fueron menores. Las diferencias dentro de las raciones de preparto sólo se presentaron para el parámetro que describe el tiempo en el que se alcanza la mitad del valor ii potencial de gas, siendo menor para la ración que empleó heno de alfalfa con un valor relativo forrajero de segunda como único aporte forrajero en una proporción forraje/concentrado 69/31 y un contenido en ración total de FND y FAD de 353 y 276 g/kg respectivamente, con respecto a 9 raciones con proporciones similares donde en uno de los casos el único componente forrajero fue paja de cereal y para el resto fue heno de pradera de diferente calidad. El promedio de producción de metano/día por gramo de materia orgánica fermentable e incubada en las raciones de preparto fue de 5,97 mmol y 3,56 mmol y en inicio de lactación de 5,65 mmol y 3,57 mmol respectivamente. De las raciones de lactación temprana, aquella que menos producción de metano presentó, empleó heno de alfalfa y de pradera con un valor relativo forrajero excelente en una proporción forraje/concentrado 72/28 y un contenido en ración total de FND y FAD de 267 y 198 g/kg respectivamente, en sentido opuesto con una ración 50/50 que empleó heno de alfalfa y ensilaje de maíz con un valor relativo forrajero de primera y un contenido de FND y FAD de 404 y 253 g/kg respectivamente. De esta parte se concluye que existe una amplia variabilidad en el manejo alimenticio en los dos estados fisiológicos monitorizados, que repercutió de igual forma en la variabilidad observada dentro de las raciones de cada estado fisiológico, así como en la observada en la comparación entre estados fisiológicos. Las estrategias de mitigación evaluadas en laboratorio consideraron la inclusión de distintas fuentes de grasa en la dieta, diferentes niveles de inclusión en la ración y henos de diferente calidad. Se realizó un diseño multifactorial con 2 henos de diferente calidad (alta y baja) x 3 tipos de grasa (torta de girasol, de colza y grasa de palma) x 2 niveles de grasa en ración total (3% y 5%). Se realizaron incubaciones in vitro para determinar los parámetros de la cinética de producción de gas, digestibilidad de la materia orgánica, producción de AGV’S y producción de metano. La interacción entre la calidad del heno y el nivel de grasa redujo la emisión de gas por gramo de materia orgánica fermentable (275,87 vs. 236,55 ml/g MOF, P=0,001), la proporción de ácido acético (0,71 vs. 0,69 g/g del total de AGV, P=0,030), el ratio ácido acético/propiónico (4,06 vs. 3,94, P=0,040) y la producción de metano por gramo de materia orgánica fermentable (5,98 vs. 4,44 mmol día, P=0,006) en la incubación del heno de alta calidad y un nivel de grasa del 5%. De otro modo, la interacción entre el tipo de grasa y la calidad del heno afectó la digestibilidad in vitro de la iii materia orgánica, siendo mayor para el heno de alta calidad cuando se incubó con torta de colza (64 g/100g vs. 51 g/100g, P=0,001), torta de girasol (64 g/100g vs. 50 g/100g, P=0,001) y grasa de palma (65 g/100g vs. 47 g/100g, P=0,001). El efecto simple de incubar con torta de girasol redujo la producción de gas por g/materia orgánica incubada con respecto a la torta de colza (142,30 vs. 149,90, p=0,003). Del mismo modo, la torta de girasol incrementó el factor de partición a 24 horas (4,03 vs. 3,78 mg MO/ml, P=0,035) y la síntesis de biomasa microbiana a 24 horas (105,56 mg vs. 93,08, P=0,049) con respecto a las raciones con grasa de palma. El heno de alta calidad en relación con el de baja redujo la producción potencial de gas (258,17 vs. 308,83 ml/g MO, P<0,001), incrementó el factor de partición a 24 horas (4,06 vs. 3,71 mg MO/ml, P=0,003), la síntesis de biomasa microbiana a 24 horas (119,74 vs. 80,20 mg, P<0,001) y la eficiencia de síntesis microbiana a 24 horas (46 vs. 41 g/100g, P<0,001 respectivamente), y redujo el ratio ácido graso volátil : materia orgánica fermentable (20,94 vs. 25,25 mmol/g MOF, P=0,002). Desde el punto de vista de la mitigación de emisión de metano se concluye que la combinación de un heno de alta calidad de características composicionales como las del incubado en este ensayo, con un nivel de grasa del 5% en la ración, reduce la emisión de gas diaria y de metano por gramo de materia. Por su parte, la producción potencial de gas se redujo al incubar con un heno de alta calidad con respecto al de baja. v ABSTRACT The aim of this research was to evaluate in vitro the parameters of ruminal fermentation, digestibility and methane emissions in diets employed in dairy sheep flocks with different intensification level in the Autonomous Community of the Basque Country, as well as to propose mitigation strategies of methane emissions. A sample of 16 flocks were monitored during the prepartum stage and 14 flocks in early lactation. Information was gathered through a survey to the shepherds, and the flocks were characterized according to the characteristics of the breed employed, feeding management practices and the type of forage used. Individual samples of every ingredient of the diets provided were collected to assess the chemical analysis, to calculate the nutritional value of the total rations and to carry out in vitro incubations of the diets to determinate the kinetics parameters of gas production, digestibility, volatile fatty acids and methane production. The forage/concentrate ratio supplied in the prepartum rations was 70:30 and 60:40 in early lactation. Grass hay was the forage more frequently used, and during early lactation half of the flocks also provided another additional forage. Shepherds usually reserve the best quality forages for lactation. In comparison to the diets provided at the end of pregnancy, the early lactation rations produced significantly less potential gas production (268.11 vs. 312.98 ml/g IOM, P<0.001), lower daily gas production per g/incubated organic matter (159.87 vs. 169.23 ml/g IOM) and higher digestibility (64 vs. 59 g/100 g, P=0.005); the fermentative ruminal process were higher, so were higher the partitioning factor at 24 hours (4.04 vs. 3.66 mg OM/ml, P=0.009), microbial biomass synthesis at 24 hours (126.08 vs. 104.37 mg, P=0.010) and efficiency microbial synthesis at 24 hours (45 vs. 39 g/100g, P=0.002), while the daily gas production/g fermentable organic matter (248.19 vs. 278.77 ml/g, P<0.001) and volatile fatty acid: fermentable organic matter was lower (17.33 vs. 19.84 mmol/g FOM, P=0.005). The differences within the rations provided in late pregnancy were only significantly different for the parameter the describes the time to reach the half of the value of potential gas production. The lowest value corresponded to the ration number 15, which used lucerne hay of second category according to the forage relative as the unique forage xiii TABLA DE CONTENIDO RESUMEN ............................................................................................................................. i ABSTRACT .......................................................................................................................... v RESUMÉ .............................................................................................................................. ix ÍNDICE DE TABLAS ....................................................................................................... xxi ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................... xxiii ABREVIATURAS ............................................................................................................ xxv 1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 1 2. OBJETIVO .................................................................................................................... 3 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 5 3.1 OVINO DE LECHE EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DEL PAÍS VASCO ........... 5 3.2 FERMENTACIÓN Y DEGRADACIÓN RUMINAL DE LOS ALIMENTOS ................ 7 3.2.1 Fermentación de los carbohidratos ................................................................ 7 3.2.2 Fermentación de la proteína ............................................................................ 8 3.2.3 Fermentación de la grasa ................................................................................. 9 3.3. PRODUCTOS DE LA FERMENTACIÓN RUMINAL ............................................... 10 3.3.1 Ácidos Grasos Volátiles ................................................................................. 10 3.3.2. Metano y CO2 ................................................................................................ 12 3.4 TÉCNICA DE PRODUCCIÓN DE GAS COMO HERRAMIENTA PARA CUANTIFICAR LA FERMENTACIÓN Y DEGRADACIÓN RUMINAL .......................... 15 3.5 EMISIONES DE METANO DERIVADAS DE LA PRODUCCIÓN ANIMAL ............ 16 3.6 ALTERNATIVAS DE MANEJO NUTRICIONAL PARA MITIGAR LA PRODUCCIÓN DE METANO .................................................................................................................... 17 4. MATERIAL Y MÉTODOS ....................................................................................... 19 4.1 FASE DE CARACTERIZACIÓN ................................................................................ 19 4.1.1 Caracterización de rebaños y recolección de las muestras de alimento ........... 19 4.1.2 Analítica química de muestras de alimento ....................................................... 20 4.1.3 Clasificación de forrajes .................................................................................... 21 4.1.4 Incubaciones in vitro ......................................................................................... 22 xiv 4.1.5 Cálculos y análisis estadístico ........................................................................... 25 4.1.5.1 Parámetros de la cinética de producción de gas .................................... 25 4.1.5.2 Determinación de la digestibilidad in vitro de la materia orgánica ...... 26 4.1.5.3 Estimación de parámetros de síntesis microbiana ................................. 26 4.1.5.4 Estimación de la producción de metano ................................................. 27 4.1.5.5 Análisis estadístico ................................................................................. 28 4.2 FASE DE MITIGACIÓN ............................................................................................. 29 4.2.1 Tratamientos experimentales ............................................................................. 29 4.2.2 Incubaciones in vitro, cálculos y análisis estadístico ........................................ 32 5. RESULTADOS ............................................................................................................ 35 5.1 FASE DE CARACTERIZACIÓN ................................................................................ 35 5.1.1 Raciones de preparto ......................................................................................... 35 5.1.1.1 Analítica química de las muestras de alimento .......................................... 37 5.1.1.2 Clasificación de forrajes ............................................................................. 37 5.1.1.3 Cinética de producción de gas .................................................................... 38 5.1.1.4 Digestibilidad in vitro de la materia orgánica y ácidos grasos volátiles ... 40 5.1.1.5 Parámetros de síntesis microbiana y producción de metano ..................... 40 5.1.2 Raciones de inicio de lactación ......................................................................... 43 5.1.2.1 Analítica química de las muestras de alimento .......................................... 44 5.1.2.2 Clasificación de Forrajes ........................................................................... 45 5.1.2.3 Cinética de producción de gas .................................................................... 45 5.1.2.4 Digestibilidad in vitro de la materia orgánica y ácidos grasos volátiles ... 46 5.1.2.5 Parámetros de síntesis microbiana y producción de metano ..................... 47 5.1.3 Comparación entre estados fisiológicos (preparto vs. inicio de lactación) ....... 51 5.1.3.1 Cinética de producción de gas .................................................................... 51 5.1.3.2 Digestibilidad in vitro de la materia orgánica y ácidos grasos volátiles ... 52 5.1.3.3 Parámetros de síntesis microbiana ............................................................. 53 5.2 FASE MITIGACIÓN ................................................................................................. 54 5.2.1 Cinética de producción de gas ....................................................................... 54 5.2.2. Digestibilidad in vitro de la materia orgánica ............................................. 58 xv 5.2.3 Ácidos grasos volátiles ................................................................................... 60 5.2.4. Parámetros de síntesis microbiana y producción de metano ....................... 63 6. DISCUSIÓN ................................................................................................................. 67 6.1 Caracterización de los sistemas productivos .............................................................. 67 6.2 Incubaciones in vitro .................................................................................................. 70 6.3. Estrategia de mitigación ............................................................................................ 75 7. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 79 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 81 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Composición química del medio de cultivo .......................................................... 23 Tabla 2. Analítica química y clasificación de los forrajes experimentales.......................... 30 Tabla 3. Ingredientes y analítica química de los piensos experimentales ........................... 31 Tabla 4. Caracterización de raciones suministradas durante la fase de preparto en rebaños comerciales de ovino lechero en la CAPV ........................................................................... 36 Tabla 5. Composición química calculada (g/kg) de raciones de preparto suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV .............................................................. 37 Tabla 6. Parámetros del ajuste de producción de gas y producción de gas total por día de raciones incubadas de preparto suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV ................................................................................................................................... 39 Tabla 7. Digestibilidad in vitro de la materia orgánica (g/100g) y producción de ácidos grasos volátiles de raciones de preparto suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV .............................................................................................................. 41 Tabla 8. FP24 (mg MO/ml), AGV:MOF (mmol/g MO), SBM24 (mg), ESM24 (g/100g) y metano/día estimados in vitro a partir de la incubación de raciones de preparto suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV .................................. 42 Tabla 9. Caracterización de raciones suministradas durante la fase de inicio de lactación en rebaños comerciales de ovino lechero en la CAPV .............................................................. 44 Tabla 10. Composición química calculada (g/kg) de raciones de inicio de lactación suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV .................................. 45 Tabla 11. Parámetros del ajuste de producción de gas y producción de gas total por día de raciones de incubadas de inicio de lactación suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV .............................................................................................................. 48 xxii Tabla 12. Digestibilidad in vitro de la materia orgánica (g/100g) y producción de ácidos grasos volátiles de raciones de inicio de lactación suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV .................................................................................................... 49 Tabla 13. FP24 (mg MO/ml), AGV:MOF (mmol/g MO), SBM24 (mg) y ESM24 (g/g) y producción de metano/día estimados in vitro a partir de la incubación de raciones de inicio de lactación suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV .............. 50 Tabla 14. Análisis del efecto de la etapa productiva sobre los parámetros del ajuste de producción de gas, producción de gas total por día y producción de metano de raciones incubadas de preparto e inicio de lactación suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV .............................................................................................................. 52 Tabla 15. Análisis del efecto de la etapa productiva sobre la producción de ácidos grasos volátiles en el fluido ruminal durante la incubación in vitro de raciones de preparto y inicio de lactación suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV .............. 53 Tabla 16. Análisis del efecto de la etapa productiva sobre FP24 (mg MO/ml), AGV:MOF (mmol/g MO), SMB24(mg) y ESM24 (g/g) estimados in vitro a partir de la incubación de raciones de preparto y inicio de lactación suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV .............................................................................................................. 54 Tabla 17. Efecto del tipo de forraje, tipo de grasa y nivel de inclusión de grasa en la ración total sobre los parámetros del ajuste de producción de gas de las raciones experimentales incubadas. ............................................................................................................................. 56 Tabla 18. Efecto del tipo de forraje, tipo de grasa y nivel de inclusión de grasa en la ración total sobre la producción de gas/día por gramo de materia orgánica incubada de raciones experimentales. ..................................................................................................................... 57 Tabla 19. Efecto del tipo de forraje, tipo de grasa y nivel de inclusión de grasa en la ración sobre la producción in vitro de AGV en el fluído ruminal ................................................... 61 Tabla 20. Efecto del tipo de forraje, tipo de grasa y nivel de inclusión de grasa en la ración en FP24 (mg MO/ml), SBM24 (mg), ESM24 (g/g) y AGV:SVF (mmol/g MOF) de raciones experimentales. ..................................................................................................................... 64 xxiii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Formación de ácidos grasos volátiles y metano en el rumen………………… 11 Figura 2. Efecto del tipo de heno y el nivel de grasa en las raciones experimentales sobre la producción de gas/día por gramo de materia orgánica fermentable…………………….. 58 Figura 3. Efecto del tipo y nivel de grasa en las raciones experimentales sobre digestibilidad verdadera in vitro de la materia orgánica (g/g)……………………………. 59 Figura 4. Efecto del tipo de grasa y la calidad del heno en las raciones experimentales sobre la digestibilidad verdadera in vitro de la materia orgánica (g/g)…………………… 59 Figura 5. Efecto del nivel de grasa y la calidad del heno en las raciones experimentales sobre la producción de ácido acético (g/g del total de AGV)…………………………….. 62 Figura 6. Efecto del nivel de grasa y la calidad del heno en las raciones experimentales sobre el ratio ácido acético:propiónico………………………………………………….... 62 Figura 7. Efecto del nivel de grasa y la calidad del heno en las raciones experimentales sobre la producción de metano por gramo de materia orgánica incubada………………. 65 Figura 8. Efecto del nivel de grasa y la calidad del heno en las raciones experimentales sobre la producción de metano por gramo de materia orgánica fermentada……………. 65 xxv ABREVIATURAS A: Producción potencial de gas (ml/g MOI) AGV: Ácido Graso Volátil : Materia Orgánica Fermentable B: Tiempo de incubación en el que se alcanza una producción de gas equivalente a la mitad del valor potencial (h) c: Constante adimensional que determina la forma de la curva CAPV: Comunidad Autónoma del País Vasco CC: Crisol más Cenizas CMS: Crisol más Materia Seca DE: Desviación Estándar DIVMO: Digestibilidad in vitro de la Materia Orgánica DMS: Digestibilidad de la Materia Seca EEM: Error Estándar de la Media ESM24: Eficiencia de la Síntesis Microbiana a 24 horas FAD: Fibra Ácido Detergente Fig: Figura FND: Fibra Neutro Detergente FP24: Factor de Partición a 24 horas G: Producción de gas (ml/g MOI) a tiempo t, GB: Grasa Bruta 6 algunas horas en pastoreo, concentrados en establo y forrajes preservados. Por lo general, una vez los animales son secados, los rebaños son movidos a pastos comunales en áreas de montaña donde suelen estar alrededor de 5 meses (Ruiz et al., 1997; Gabiña y Ugarte, 2001) luego de lo cual retornan a la granja y comienzan a recibir forraje y concentrado generalmente en pesebre cerca de un mes antes del parto (Gabiña et al., 2000). Varias razones resultan relevantes al momento de considerar la existencia y permanencia de este tipo de sistema productivo en la región, tales como motivos sociales, culturales, económicos, ambientales y de preservación de áreas comunales (Ugarte et al., 1999), aunque la mayor importancia desde el punto de vista económico lo sustenta la transformación de la leche producida en el queso con denominación de origen protegido, conocido como Idiazábal (Gabiña y Ugarte, 2001; Ruiz et al., 2011). De igual forma, se han identificado rebaños que utilizan razas foráneas puras o en cruzamiento como la Assaf, Awasi, Lacaune y East Fresian, suceso que ha generado a que se calcule que el 45% de los rebaños de ovino lechero en España o son rebaños de razas foráneas o tienen algún tipo de cruzamiento con el tipo de razas anteriormente mencionadas. Según Legaz et al. (2008), la raza Assaf representa la principal raza ovina lechera de España. De manera general, el manejo de los sistemas productivos de razas foráneas como la Assaf no es compatible con los sistemas tradicionales extensivos, ya que no es frecuente el manejo en pastoreo de montaña, el uso de campos de rastrojos ni de subproductos de la agricultura, requiriendo de manera principal condiciones productivas de manejo estabulado permanente, lo cual incrementa los costos de producción (Ugarte et al., 2001). Por tanto, resulta importante profundizar en el conocimiento de los sistemas de alimentación de los principales sistemas ovinos, así como en sus implicaciones sobre los aspectos productivos y ambientales. Las metodologías de incubación in vitro ofrecen la posibilidad de analizar con detalle y de manera relativamente económico el comportamiento fermentativo, la degradación y emisiones de gases de efecto invernadero de un gran número de muestras. En la medida que estas sean representativas de las utilizadas en los sistemas de producción, los resultados obtenidos podrían ser utilizados 7 como referencia en los programas de asesoramiento a los ganaderos y en la toma de desiciones. 3.2 FERMENTACIÓN Y DEGRADACIÓN RUMINAL DE LOS ALIMENTOS La fermentación y degradación ruminal es principalmente el resultado de la actividad de bacterias, protozoos y hongos que allí cohabitan y actúan sobre las diferentes fracciones que componen el alimento. De manera particular, esta microflora ruminal hace posible que la fracción fibrosa ingerida que no puede ser enzimáticamente digerida por el animal, sea degradada y fermentada hacia ácidos grasos volátiles, gases de fermentación y calor o incorporada a la materia microbiana digestible (Williams, 2000; Bannink y Tamminga, 2005b). La dinámica de la degradación y fermentación de la materia orgánica en el rumen y la digestión de los mismos en el intestino son los mayores determinantes de la utilización de las raciones en los rumiantes. Por lo tanto es relevante que esa dinámica de los procesos sea conocida y entendida para que luego pueda ser controlada o modulada con el fin de mejorar su aprovechamiento en el tracto gastrointestinal y optimizar los parámetros productivos de interés (Van der Poel et al., 2005). 3.2.1 Fermentación de los carbohidratos Los carbohidratos que sufren procesos fermentativos en el rumen generalmente abarcan tres tipos de compuestos: la fibra, el almidón y los carbohidratos solubles (Dijkstra et al., 2005a). La degradación de la fracción de carbohidratos estructurales o fibra neutro detergente (FND) ha sido caracterizada mediante técnicas tanto in situ como in vitro, las cuales o bien ofrecen resultados en términos de tasa de desaparición del sustrato a un determinado tiempo o cinéticas de degradación mediante mediciones de producción de gas. A partir de reportes sobre tasas de degradabilidad de dicha fracción recopilados por Bannink y Tamminga (2005a), registran valores que varían desde un 13% hasta un 82% y 8 que según el autor, dependen más de las características propias de degradación de la FND que de su nivel de ingestión. Por su parte, el almidón es un constituyente importante en la dieta de rumiantes al ser el compuesto principal de los piensos. Una fracción del almidón por lo general es parcialmente fermentada en el rumen y otra puede escapar para ser digerida enzimáticamente en el intestino y ser absorbida como glucosa; del mismo modo debe considerarse que parte del almidón puede ser incorporado dentro de los microorganismos amilolíticos como reserva de polisacáridos, constituyéndose en una vía a considerar de llegada del almidón al duodeno (Bannink y Tamminga, 2005a). Mediante la aplicación de técnicas in situ y/o in vitro se han establecido características de las fuentes de almidón relacionadas con su susceptibilidad a la degradación microbial, identificando que la mayor parte de los tipos de almidón son altamente degradables en el rumen, teniendo valores de hasta 95%; sin embargo tal y como para el caso de los carbohidratos estructurales, estos valores son sólo orientativos y las condiciones reales del rumen influenciarán en cierta medida la degradación in vivo (Bannink y Tamminga, 2005a). Con respecto a la degradación y fermentación de los carbohidratos solubles, debe mencionarse que ésta es bastante rápida y mucho más completa que para varias fuentes de almidón, asumiéndose que son fermentados en el rumen casi instantáneamente después de la ingestión, por lo que también se considera que la degradación y fermentación de grandes cantidades de estos carbohidratos inducen fluctuaciones en el pH que pueden tener consecuencias negativas sobre la actividad fibrolítica y la población protozoal (Bannink y Tamminga, 2005a). 3.2.2 Fermentación de la proteína La proteína constituye la principal fuente de nitrógeno en la mayor parte de las dietas para rumiantes y su degradación y fermentación debe considerarse como un factor importante que influye a la fermentación ruminal y al suministro de aminoácidos al animal 9 (Grossblatt, 2001b). Como es bien sabido, la proteína es hidrolizada por las proteasas secretadas por la microflora ruminal dando lugar entonces a péptidos y aminoácidos. Sin embargo grado de degradación y fermentación dependerá de: la actividad proteolítica de la microflora ruminal como de la estructura, solubilidad, susceptibilidad y accesibilidad a los enlaces peptídicos, la tasa de paso ruminal de la digesta, la interacción con otros nutrientes y técnicas de procesamiento de alimentos, entre otros factores (Cone y van Gelder, 1999; Atasoglu y Wallace, 2003; Bach et al., 2004). El destino de los péptidos y aminoácidos absorbidos por las células microbianas dependerá de la disponibilidad de energía, ya que si es suficiente estos aminoácidos serán transaminados o usados directamente para la síntesis de proteína microbial. Tal y como afirma Grossblatt (2001b) y Bannink y Tamminga (2005a), el conocimiento de la cinética y de la tasa fraccional de degradación ruminal de las proteínas del alimento es fundamental para formular dietas que suministren cantidades adecuadas de proteína degradable y aprovechable para los microorganismos ruminales y de proteína no degradable en el rumen pero directamente absorbible por el animal hospedador. 3.2.3 Fermentación de la grasa Los lípidos en las dietas de rumiantes se encuentran tanto en los forrajes consumidos como en semillas de oleaginosas, mezclas de grasas animales y vegetales, grasas secas granuladas o grasas protegidas que son suministradas en la ración. Los lípidos ingeridos provenientes en menor medida de las plantas y en su mayoría del aporte de las semillas del pienso, son altamente modificados por los procesos de fermentación y degradación ruminal que tienden a favorecer la hidrogenación, antes de ser finalmente absorbidos por el animal. Así, los procesos de lipólisis ruminal ocasionan la liberación de ácidos grasos que más tarde serán biohidrogenados y que pueden o bien salir del rumen a través del epitelio ruminal o ser catabolizados a ácidos grasos volátiles o dióxido de carbono. De manera adicional, los microorganismos ruminales sintetizan ácidos grasos y aportan entre un 10 a 15% de los ácidos grasos absorbidos (Van Soest, 1983d; Jenkins, 1993; Grossblatt, 2001a). Debe considerarse que el tipo y fuente de grasa de la dieta pueden alterar los patrones de 10 fermentación ruminal al ocasionar una reducción de la digestibilidad de los carbohidratos estructurales hasta en un 50% al adicionar hasta un 10% de grasa, mientras que su efecto en los carbohidratos no estructurales y en la fracción proteica es menor (Jenkins, 1993). Van Soest (1983d) reporta que los ácidos grasos insaturados inhiben en una mayor medida la fermentación que los ácidos grasos saturados; del mismo modo Jenkins (1993) considera que el modo de administración de una grasa insaturada tiene una influencia variable en los patrones de fermentación. 3.3. PRODUCTOS DE LA FERMENTACIÓN RUMINAL La fermentación microbiana ocurrida en el rumen genera productos que pueden ser aprovechables para el animal tales como los ácidos grasos volátiles y proteína microbiana, y otro tipo de productos que se consideran desechos, tales como el dióxido de carbono y el metano (Williams, 2000; Getachew et al., 2005b; Mitsumori y Weibin, 2008). 3.3.1 Ácidos Grasos Volátiles A partir de los procesos hidrolíticos ocurridos en el rumen sobre diferentes componentes del alimento, se genera de manera principal la liberación de monómeros que son fermentados intracelularmente por el metabolismo anaeróbico en ácidos grasos volátiles, constituidos básicamente por ácido acético, propiónico y butírico, así como por pequeñas cantidades de ácido valérico, capróico, isobutirico, isovalérico, 2-metil butírico y trazas de otros varios ácidos (Figura 1) (Van Soest, 1983b; Bannink y Tamminga, 2005a; Dijkstra et al., 2005b). Debe considerarse que junto a los carbohidratos, la fermentación de los lípidos y proteína de la ración también contribuyen en la producción de ácidos grasos volátiles, siendo menor para los lípidos y considerable para las proteínas cuando las dietas tienen alto contenido de proteína degradable en el rumen o cuando ocurre un aporte considerable de valina, leucina e isoleucina, que específicamente favorecerán la formación de ácido 11 isobutírico, isovalérico y 2-metil butírico (France y Dijkstra, 2005). Para la población microbiana la mayoría de estos ácidos grasos volátiles constituyen productos de desecho pero para el rumiante representa la principal fuente de energía absorbida, llegando a representar entre un 50% a 70% de la energía digestible ingerida para el caso de ovejas en mantenimiento (Van Soest, 1983b; France y Dijkstra, 2005). El aporte energético y el destino metabólico de cada tipo de ácidos grasos producidos varía, siendo el acetato el principal sustrato para la lipogénesis, mientras que el propionato es usado para gluconeogénesis. Así pues, es de tenerse en cuenta que el balance entre la tasa de ácidos grasos volátiles glucogénicos / no glucogénicos afecta a la eficiencia de su uso para fines productivos así como su contribución en la composición de los productos finales (Van Soest, 1983a; Bannink y Tamminga, 2005a; France y Dijkstra, 2005). 12 Fig 1. Formación de ácidos grasos volátiles y metano en el rumen (Tomado y modificado de Dijkstra et al. (2005a) 3.3.2. Metano y CO2 Los procesos fermentativos que prevalecen en el rumen normalmente generan un ambiente reductor. Por un lado, en dichas condiciones anaeróbicas las reacciones de oxido – reducción necesarias obtener energía en forma de ATP a partir del piruvato se encuentran mediadas por las coenzimas NAD y FAD que actúan como transportadores de electrones y que deben tener un estado constante en sus formas oxidadas y reducidas. Sin embargo, a pesar de que entre ellas existe un flujo constante de hidrogeniones, puede darse la condición de que el sistema regulador de dicho proceso se inhiba y exista una alta presión 13 de hidrogeno, lo cual afecta la fermentación en general y favorece la formación de metano (France y Dijkstra, 2005; Bell y Eckard, 2012; Bodas et al., 2012). De igual modo, si se considera que la fermentación microbiana genera diferentes ácidos grasos volátiles que no son equivalentes en términos de uso o liberación de hidrógeno para su formación, se concluye que existe una estrecha relación entre el patrón de fermentación, la tasa de producción de ácidos grasos volátiles, las emisiones de metano y por ende se considera un proceso altamente dependiente de la ración ingerida (Mirzaei-Aghsaghali y Maheri-Sis, 2011; Wright y Klieve, 2011). De cualquier manera el exceso del poder reductor generado durante la conversión de glucosa a ácido acético o butírico debe ser dispuesto en una vía rápida y eficiente, lo cual es facilitado por la presencia de arqueas metanogénicas que lo utilizan como sustrato para reducir el carbono y formar metano (Esquema 1) (France y Dijkstra, 2005; Mitsumori y Weibin, 2008; Lascano y Cárdenas, 2010; Mirzaei-Aghsaghali y Maheri-Sis, 2011). Cabe resaltar la relevancia de los protozoos en los procesos de formación de metano, pues ellos mantienen una relación simbiótica con las arqueas metanogénicas con quienes están asociados intra y extracelularmente y realizan transferencia de este hidrógeno (Hook et al., 2010) Esquemáticamente, el flujo de hidrogeno procedente de los procesos fermentativos hasta la formación de piruvato es el siguiente (Bell y Eckard, 2012): Celulosa Hemicelulosa Almidón Glucosa 2 piruvato + 4 H (Esquema 1) Fructosa Sucrosa Pentosanos 14 Piruvato + H2O Acetato + CO2 + 2H 2 Piruvato + H2O Butirato + 2 CO2 CO2 + 8H Metano + 2H2O Debe considerarse también que la formación de ácido propiónico lleva implícita el uso de moléculas de hidrógeno. Así pues, si los niveles de sustrato que favorezcan un tipo de fermentación propiónica son altos, bien sea por incrementar la ingestión de alimento o por sus características intrínsecas, se puede producir un cambio en el patrón de fermentación de ácido acético a propiónico y de esta manera contribuir en un descenso del poder reductor (Esquema 2) (France y Dijkstra, 2005) Piruvato + 4H Propionato + H2O (Esquema 2) Aunque en menor medida, la fermentación en el intestino grueso también contribuye a la producción de metano, aunque no es constante y depende del nivel de ingestión y de la cantidad de materia orgánica que escape de la fermentación ruminal y llegue al tracto posterior (France y Dijkstra, 2005). Las estimaciones de la cantidad de metano producido pueden realizarse mediante la aplicación de procedimientos in vivo como la técnica SF6 (técnica de marcado con hexafloruro de azufre) o in vitro por medio de la técnica de producción de gas o en el sistema de fermentación continua que simula las condiciones del rumen RUSITEC, los cuales han sido validados encontrando siempre una mayor correlación con la medición mediante la técnica de producción de gas (0.74 a 0.98) que con el RUSITEC (0.16 a 0.20) (Bhatta et al., 2007). 15 3.4 TÉCNICA DE PRODUCCIÓN DE GAS COMO HERRAMIENTA PARA CUANTIFICAR LA FERMENTACIÓN Y DEGRADACIÓN RUMINAL La fermentación, degradación y digestibilidad de los alimentos han sido reconocidos como las principales fuentes de variación de la ración y de sus componentes alimenticios, por lo cual se hace necesario conocer y cuantificar dichos procesos (Dijkstra et al., 2005a). Si bien sería interesante monitorizar en todo momento las materias primas, piensos o dietas completas de rumiantes en todas la situaciones posibles in vivo para conocer tanto cualitativa como cuantitativamente los nutrientes ingeridos, en la práctica esto no es factible ni viable económicamente (Dijkstra et al., 2005b; Navarro-Villa et al., 2011). La búsqueda de métodos que fuesen económicos, simples, de fácil adopción, eficientes, que tuvieran la posibilidad de evaluación de un amplio número de muestras en el tiempo con el uso mínimo de animales ha llevado al desarrollo de numerosas técnicas in vitro e in situ, que utilizando la aplicación de modelos matemáticos vinculan los datos obtenidos con los procesos que ocurren in vivo, generando una aproximación e indicando un nivel de confiabilidad de la respuesta obtenida (Williams, 2000; Getachew et al., 2005a; López, 2005). De manera general las técnicas in vitro resultan similares entre sí ya que utilizan como sustrato la muestra molida de interés, un medio de incubación tamponante y un inóculo que por lo general es líquido ruminal, lo cual en conjunto se pone a incubar en condiciones de anaerobiosis a temperatura controlada, realizando mediciones de los indicadores de interés con cierta periodicidad (Williams, 2000; López, 2005). Este tipo de métodos pretenden simular las condiciones de digestión in vivo y permiten la manipulación de diversidad de factores de variación de una manera controlada, lo cual facilita su uso en el estudio de la incidencia de componentes individuales sobre los parámetros de fermentación, pudiendo evaluar la interacción entre componentes de la ración (Wood y Manyuchi, 1997; Tang et al., 2008), las variaciones particulares en el inóculo (Calabrò et al., 2005), la evaluación de compuestos secundarios del alimento (Makkar, 2005), además de permitir realizar la predicción del valor nutritivo de los alimentos (Williams, 2000) así como la cuantificación 22 4.1.4 Incubaciones in vitro Con el objeto de evaluar la producción de gas correspondiente a cada una de las raciones suministradas en los rebaños, se implementó la técnica de producción de gas en botellas de acuerdo a la metodología propuesta por Theodorou et al. (1994), considerando las modificaciones sugeridas por Mauricio et al. (1999). Las incubaciones se realizaron utilizando como donantes de inóculo ruminal dos ovejas no gestantes ni lactantes de raza Latxa fistuladas en rumen que recibían una ración diaria de forraje ad libitum. La recolección del contenido ruminal se realizó antes de la distribución de la ración de la mañana, siendo éste filtrado a través de una doble capa de gasa y almacenado en termos previamente calentados para ser transportado al laboratorio. De cara a la incubación se preparó el medio de cultivo siguiendo el protocolo propuesto por McDougall (1948) (Tabla 1) el cual fue gaseado con CO2 luego de su elaboración con el fin de garantizar las condiciones de anaerobiosis; el medio se mezcló con el inóculo ruminal en una proporción 1:4 (v/v; fluido ruminal/medio de cultivo). 23 Tabla 1. Composición química del medio de cultivo Soluciones Solución final (ml/l) Concentración parcial (/l) Solución de macrominerales Na2HPO4.12H2O (g) 208,09 9,45 KH2PO4 (g) 6,20 MgSO4.7H2O (g) 0,60 Solución de tampón NH4CO3 (g) 208,09 4,00 NaHCO3 (g) 35,00 Solución de reductora Cisteína - HCL (g) 62,43 6,25 NaOH 1M (g) 40 Na2S.10H2O (g) 6,67 Solución de microminerales CaCl2.2H2O (g) 0,10 13,20 MnCl2.4H2O (g) 10,00 CoCl2.6H2O (g) 1,00 FeCl3.6H2O (g) 8 Solución de resazurin Resazurin (g) 1,04 0,01 Agua destilada 518,63 24 Para la preparación de las muestras a incubar se realizó el cálculo relativo de cada ingrediente en las raciones para una cantidad total de 500 mg. De este modo, la víspera del inicio del ensayo se pesó un total de 500 ± 5 mg MS en botellas de suero de 125 ml, que luego fueron dosificadas con 50 ml de la mezcla fluido ruminal-medio de cultivo. Para cada ración evaluada se realizó una incubación por triplicado en dos series independientes; además se incubaron blancos, entendiendo como tales aquellas botellas que contienen la solución el medio de cultivo junto con el inóculo ruminal pero carecían de sustrato a fermentar. Las botellas se cerraron con tapón de butilo, se sellaron herméticamente y se colocaron finalmente en un incubador SELECTA a temperatura constante (39,0 ± 0,1 °C). Para la determinación de la producción de gas se empleó un transductor de presión Vega Bar 14 y se realizaron lecturas de la presión acumulada en la cabeza de la botella a las 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 24, 30, 36, 48, 72 y 96 horas tras la inoculación, liberando el gas acumulado y agitando las botellas antes de regresarlas al incubador. Los valores de presión registrados se usaron para estimar el volumen de gas acumulado utilizando la fórmula propuesta por Frutos et al. (2002); los valores posteriormente fueron corregidos por el volumen de gas procedente del “blanco”, así como por la cantidad de materia orgánica incubada. Para la determinación de la digestibilidad de la materia orgánica y de los ácidos grasos volátiles se realizó la incubación de las muestras de interés por 24 horas. La digestibilidad fue determinada siguiendo la metodología propuesta por Pell y Schofield (1993), quienes describen que luego del tiempo de incubación debe procederse a detener la fermentación microbiana mediante la introducción de las botellas por 30 minutos a temperaturas de congelación, para posteriormente aplicar 45 ml de una solución neutro detergente e introducirlas en estufa a 105°C durante una hora. Cumplido el tiempo indicado, las muestras se filtran en un equipo digestor de fibra Tecator, realizando un lavado con agua caliente, acetona y etanol con el fin de recoger los residuos en crisoles filtrantes que posteriormente se desecan en estufa a 105°C e incineran en mufla a 550°C. Para la determinación de la producción de ácidos grasos volátiles se implementó la técnica descrita por Jouany (1982), adaptada para columna capilar utilizando ácido metil valérico como patrón interno. Una vez finalizado el tiempo de incubación, se tomó una muestra de cada 25 botella y se mezcló con solución desproteinizante (4:1 v/v), se centrifugó a 12000 rpm durante 15 minutos, se recogió el sobrenadante en viales de cromatografía y se procedió a la cuantificación de la concentración de AGV (acético, propiónico, butírico, isovalérico, isobutírico) utilizando un cromatógrafo de gases. 4.1.5 Cálculos y análisis estadístico 4.1.5.1 Parámetros de la cinética de producción de gas Los datos de producción de gas registrados a lo largo de la serie temporal indicada anteriormente se ajustaron al modelo basado en la generalización de Michaelis-Menten descrito por Groot et al. (1996): G= A (1+Bc / tc)-1 Donde: G: Producción de gas (ml/g MOI) a tiempo t, A: Producción potencial de gas (ml/g MOI) B: Tiempo de incubación en el que se alcanza una producción de gas equivalente a la mitad del valor potencial (h) c: Constante adimensional que determina la forma de la curva Mediante la siguiente fórmula se realizó el cálculo del tiempo de incubación necesario para que se alcance la tasa de producción de gas máxima (Groot et al., 1996) tRM= B (c-1)1/c Partiendo de los parámetros B y c, se realizó el cálculo de la tasa de producción de gas (RM) a tiempo “tRM” a partir de la siguiente ecuación (Groot et al., 1996) RM= c tc-1 / (Bc + tc) Finalmente, a partir de los valores de gas registrados a las 24 horas, se realizó el cálculo de emisiones de gas por día tanto por gramo de materia orgánica incubada como por gramo de materia orgánica fermentada. 26 4.1.5.2 Determinación de la digestibilidad in vitro de la materia orgánica Para determinar la digestibilidad in vitro, se cuantificó en primera lugar la materia orgánica del residuo contenido en los crisoles filtrantes: MOR = CMS - CC Donde: MOR: Materia Orgánica del Residuo (g) CMS: Crisol más Materia Seca (g) CC: Crisol más Cenizas (g) Partiendo del parámetro anterior, se calculó el valor de digestibilidad in vitro de la materia orgánica mediante la fórmula DIVMO = (MOI - (MOR - MOB)) / MOI Donde: DIVMO: Digestibilidad in vitro de la Materia Orgánica (g/g) MOI: Materia Orgánica Incubada (g) MOR: Materia Orgánica del Residuo (g) MOB: Materia Orgánica del Blanco (g) 4.1.5.3 Estimación de parámetros de síntesis microbiana Para la estimación del factor de partición entre el gas producido por mg de materia orgánica fermentable, síntesis de biomasa microbiana, la eficiencia de síntesis microbiana y el ratio ácidos grasos volátiles totales / materia orgánica fermentable fue necesario calcular la materia orgánica fermentable mediante la siguiente fórmula: MOF = MOI * DIMO 27 Donde: MOF: Materia Orgánica Fermentable (g) MOI: Materia Orgánica Incubada (g) DIMO: Digestibilidad in vitro de la Materia Orgánica (g/g) Del mismo modo, se hizo uso de los valores de gas acumulados durante las primeras 24 horas de incubación realizada para la cinética de producción de gas y se procedió al cálculo de cada parámetro siguiendo las fórmulas propuestas por Blümmel y Lebzien (2001) y Blümmel et al. (2005) que se detallan a continuación: FP24= MOF / gas SBM24= MOF – (gas * 2.2) ESM24= (MOF - (gas*2.2)) / MOF AGV / MOF= mmol totales AGV / MOF Donde FP24: Factor de Partición a 24 horas (mg MO/ml) SBM24: Síntesis de Biomasa Microbiana a 24 horas (mg) ESM24:: Eficiencia de Síntesis de Biomasa Microbiana (g/g) AGV: Ácidos Grasos Volátiles (mmol) 4.1.5.4 Estimación de la producción de metano A partir de los valores registrados de ácidos grasos volátiles y teniendo en cuenta la ecuación propuesta por Wolin (1960) se determinó la cantidad de metano producida por unidad de MS incubada (mmol de metano/ g MS incubada). Haciendo uso del contenido de materia orgánica de las raciones incubadas y de la cantidad de materia orgánica fermentable, se realizó el cálculo de producción de metano referido a estas dos variables (mmol de metano/ g MOI; mmol de metano/ g MOF). 28 4.1.5.5 Análisis estadístico Los resultados de la analítica química de las raciones monitorizadas fueron analizados mediante estadística descriptiva. Los parámetros de cinética de producción de gas (A, B, c, tRM y RM), la producción de gas/día por materia orgánica incubada y fermentada, la digestibilidad in vitro de la materia orgánica, la producción ácidos grasos volátiles totales e individuales, el ratio ácido acético/propiónico, el factor de partición, la síntesis de biomasa microbiana, la eficiencia de la síntesis de biomasa microbiana, el ratio ácido graso volátil total/materia orgánica fermentable y los valores de metano fueron comparados entre estados fisiológicos así como dentro de las raciones que conforman cada estado. Para el caso de las raciones de preparto se realizó la incubación en botellas de 17 muestras por triplicado (16 raciones y un blanco) en dos series independientes que fueron consideradas como la unidad experimental, teniendo un número total de observaciones de 17 (muestras) x 3 (réplicas) x 2 (series) = 102. Para las raciones de inicio de lactación se incubaron 15 muestras por triplicado (14 raciones y un blanco) en dos series independientes que fueron consideradas como la unidad experimental, teniendo para este caso un número total de observaciones de 15 (muestras) x 3 (réplicas) x 2 (series) = 90. Para la comparación entre estados fisiológicos se emplearon los resultados obtenidos para cada parámetro en el análisis de cada estado comparando 16 resultados de datos en las raciones de preparto y 14 en inicio de lactación, tomando como unidad experimental al rebaño. El modelo estadístico fue el siguiente: Y = μ + T + ε Donde: Y: Variable dependiente, μ: Media poblacional, T: Efecto debido al estado fisiológico o efecto debido a la ración dentro de cada estado, según el caso. ε: Error residual 29 Todos los parámetros anteriormente mencionados fueron analizados por unidad experimental mediante un GLM, realizando también un contraste ortogonal de Tukey para la separación de medias mediante el programa estadístico SAS 2003; las diferencias se consideraron estadísticamente significativas con un valor p<0,05. 4.2 FASE DE MITIGACIÓN Partiendo de los resultados obtenidos en la fase de caracterización en el estado fisiológico de inicio de lactación, se propusieron las siguientes estrategias de mitigación de las emisiones de metano: - la inclusión de grasa de diferente origen (torta de colza, torta de girasol y grasa de palma). - la inclusión de dos niveles de grasa en la ración (3% y 5%). - el empleo de forrajes de distinta calidad en raciones de lactación. 4.2.1 Tratamientos experimentales Se planteó un diseño multifactorial 2 x 3 x 2 con el fin de realizar la evaluación de la inclusión de dos niveles de grasa (Tabla 2) en una ración constituida por un 60% de forraje y 40% de concentrado, utilizando tres materias primas como fuentes de grasa (torta de colza, torta de girasol y grasa de palma), dos niveles de inclusión de grasa en la ración total (3% y 5%) y dos henos de pradera de distinta calidad (alta y baja). El componente forrajero se seleccionó a partir de los henos y ensilajes muestreados en inicio de lactación provenientes de recursos locales considerando el VRF calculado en la fase anterior. 30 Tabla 2. Analítica química y clasificación de los forrajes experimentales Forraje % MS % Cen % PB % FAD % FND VRF Clasificación Heno de hierba 87,33 9,72 15,76 31,28 46,73 112,18 Segunda Heno de hierba 79,58 6,9 9,4 36,13 61,33 73,34 Quinta MS: Materia seca; Cen: Cenizas; PB: Proteína bruta; FAD: Fibra ácido detergente; FND: Fibra neutro detergente; VRF: Valor relativo forrajero. Del mismo modo se formularon 6 piensos experimentales isograsos e isocalóricos (1,05 UFL) que cubrieran los requerimientos de proteína bruta para animales en fase de lactación. Los ingredientes utilizados y la analítica química de los piensos pueden verse en la tabla 3. 31 Tabla 3. Ingredientes y analítica química de los piensos experimentales Pienso Grasa en ración total 3,1% Girasol 3,1% Colza 3,2% Palma Ingrediente (% sobre material seca) Torta de colza obtenida mediante prensado en frío / 12 / Torta de girasol obtenida mediante prensado en frío 12,4 / Palma / 2,2 Torta de soja 6,0 3,6 11,0 Cebada 17,5 19,0 17,2 Maíz 5,6 7,6 5,0 Avena 39,0 39,0 50,0 Habas 14,0 13,4 13,2 Guisante 5,2 5,5 2,0 Composición química (% sobre materia seca) Materia orgánica 87,6 87,7 87,7 Proteína bruta 21,2 20,7 19,7 Fibra bruta 11,4 9,6 10,8 Grasa bruta 6,2 6,2 6,6 Pienso Grasa en ración total 4,8% Girasol 4,4% Colza 4,7% Palma Ingrediente (% sobre material seca) Torta de colza obtenida mediante prensado en frío / 35,0 / Torta de girasol obtenida mediante prensado en frío 36,1 / Palma / / 6,3 Torta de soja / / 14,5 Cebada 13,2 15,4 / Maíz 1,0 4,1 / Avena 44,3 45,0 79,0 Habas 5,7 / / Composición química (% sobre materia seca) Materia orgánica 87,8 87,6 87,9 Proteína bruta 17,8 18,4 16,0 Fibra bruta 12,9 9,8 12,0 Grasa bruta 10,7 9,5 10,4 38 5.1.1.3 Cinética de producción de gas En la tabla 6 se detallan los parámetros del ajuste de producción de gas y producción de gas total por día de raciones incubadas de preparto. No se encontraron diferencias significativas entre las raciones (P=0,133) para el parámetro que describe la producción potencial de gas (“A”), encontrando que los valores registrados se encuentran entre 252,7 y 342,2 ml/g MO. Del mismo modo, el tiempo de incubación necesario para que se alcance la tasa de producción de gas máxima (“tRM”) no fue diferente entre raciones (P=0,963), registrando valores que oscilaron entre 8,26 y 15,22 h. La tasa de producción de gas máxima (“RM”) y la constante que define la forma de la curva de producción de gas (“c”) tampoco fueron diferentes (P=0,658), registrándose valores entre 0,1 y 0,23 h-1 para “RM” y entre 1,10 y 1,4 para “c” (Tabla 6). Para el parámetro que describe el tiempo de incubación en el que se alcanza la mitad del valor potencial de producción de gas (“B”) se observaron valores mayores para la dieta del rebaño 2, cuando se comparó con las dietas de los rebaños 7 (P=0,040) y 15 (P<0,001). Por su parte los valores registrados para este mismo parámetro en la dieta del rebaño 15 fueron menores cuando se compararon con las raciones de los rebaños 1 (P=0,040), 3 (P=0,020), 4 (P=0,009), 8 (P=0,010), 9 (P=0,008), 10 (P=0,008), 11 (P=0,003), 14 (P=0,002) y 16 (P=0,002) (Tabla 6). Con respecto a la producción de gas total por día no se observaron diferencias entre raciones al expresar dicha producción como ml/gas por gramo de materia orgánica incubada (P=0,618) ni como ml/gas por gramo de materia orgánica fermentada (P=0,543) (Tabla 6). 39 Tabla 6. Parámetros del ajuste de producción de gas y producción de gas total por día de raciones incubadas de preparto suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV RACIONES/REBAÑOS EEM P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 AJUSTES AL MODELO DE PRODUCCIÓN DE GAS A 304,4 327,0 325,4 326,2 342,2 319,9 313,9 287,8 302,3 302,3 339,6 317,2 326,1 301,4 252,7 309,4 22,9 0,133 B 20,7ab 26,6a 21,8ab 22,7ab 19,1abc 19,1abc 16,5bc 21,9ab 22,9ab 23,0ab 24,2ab 18abc 18,7abc 24,6ab 10,7c 21,9ab 2,4 0,002 c 1,2 1,2 1,2 1,2 1,3 1,2 1,3 1,3 1,1 1,3 1,1 1,2 1,2 1,2 1,4 1,3 0,1 0,658 tRM 12 14,2 11,2 9,9 11,3 8,3 9,8 14,3 11,2 15,2 11,3 8,6 8,9 11,1 9,2 15,9 5,4 0,963 RM 0,16 0,16 0,15 0,15 0,17 0,12 0,20 0,18 0,14 0,18 0,10 0,14 0,14 0,13 0,23 0,20 0,59 0,778 PRODUCCIÓN TOTAL DE GAS/DÍA ml/g MOI 166,9 155 168 164,6 190,7 178 189 150,2 164,3 154,5 165,7 179,5 184,2 145,4 184,7 162,5 21,42 0,618 ml/gMOF 268,1 233 316 300,1 252,5 325,1 290 256,7 280,6 261,8 283,4 298,8 300,3 257,6 286,8 252 37,45 0,543 “A”: Producción potencial de gas; “B”: Tiempo de incubación en el que se alcanza la mitad del valor potencial; “c”: Constante adimensional que determina la forma de la curva; “tRM”: Tiempo de incubación necesario para que se alcance la tasa de producción de gas máxima; “R”: Tasa de producción de gas máxima; MOI: Materia orgánica incubada; MOF: Materia orgánica fermentableEEM: Error estándar de la media. Valores medios dentro de una misma fila con superíndices diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) 40 5.1.1.4 Digestibilidad in vitro de la materia orgánica y ácidos grasos volátiles La digestibilidad media de las raciones empleadas (Tabla 7) fue de 59 g/100g, oscilando entre 53 y 66 g/100g, sin bien no se encontraron diferencias significativas (P=0,116) entre las raciones de preparto monitorizadas. La producción total de ácidos grasos volátiles totales no fue diferente estadísticamente (P=0,493); no fue diferente la proporción de ácido acético (P=0,997), propiónico (P=0,998), butírico (P=0,150), de la sumatoria de isovalérico-isobutírico (P=0,626) y la relación ácido acético/ácido propiónico (P=0,999) (Tabla 7). 5.1.1.5 Parámetros de síntesis microbiana y producción de metano En la tabla 8 se detallan los valores de FP24, AGV:MOF, SBM24, ESM24 y metano/día estimados in vitro a partir de la incubación de raciones de preparto. No se encontraron diferencias para FP24 (P=0,958), AGV:MOF (P=0,171), SBM24 (P=0,278) ni ESM24 (P=0,796) entre raciones. Tampoco fueron determinadas diferencias entre raciones en producción de diaria de metano producido por gramo de MOF (P=0,426) o por gramo de MOI (P=0,834). 41 Tabla 7. Digestibilidad in vitro de la materia orgánica (g/100g) y producción de ácidos grasos volátiles de raciones de preparto suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV RACIONES/REBAÑO EEM P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 DIVMO (g/100g) 60,5 60,2 53,22 55,16 66,30 53,63 64,99 56,19 53,63 57, 56,41 61,6 58,83 61,20 63,05 62,08 0,40 0,116 AGV Totales (mmol/500 mg) 4,98 5,08 5,58 5,33 4,85 4,84 4,73 5,25 4,8 5,55 5,18 5,18 4,95 5,90 5,71 5,31 0,49 0,493 AGV Individuales (g/g AGV totales) Acético 0,58 0,59 0,59 0,59 0,58 0,60 0,60 0,59 0,60 0,60 0,59 0,60 0,59 0,59 0,60 0,60 0,02 0,997 Propiónico 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 0,22 0,22 0,23 0,22 0,24 0,23 0,22 0,22 0,01 0,998 Butírico 0,12 0,11 0,11 0,11 0,11 0,10 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,005 0,15 Isovalérico+Isobutírico 0,04 0,03 0,03 0,03 0,04 0,03 0,04 0,04 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,002 0,626 Acético:Propiónico 2,55 2,61 2,53 2,53 2,51 2,57 2,64 2,57 2,69 2,67 2,57 2,69 2,41 2,62 2,69 2,68 0,28 0,999 DIVMO: Digestibilidad in vitro de la materia orgánica; AGV: Ácidos grasos volátiles; EEM: Error estándar de la media 42 Tabla 8. FP24 (mg MO/ml), AGV:MOF (mmol/g MO), SBM24 (mg), ESM24 (g/100g) y metano/día estimados in vitro a partir de la incubación de raciones de preparto suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV RACIONES/REBAÑO EEM P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 FP241 (mg MO/ml) 3,7 4 3,5 3,2 3,8 3,7 3,4 3,9 3,4 3,7 3,6 3,4 3,4 3,9 3,5 4,1 0,59 0,958 AGV:MOF2 (mmol/ g MO) 18 17,5 18,1 20,7 18,2 16,9 18,6 19,9 19,4 19,2 24,0 21,7 21,0 21,6 22,4 22,7 2,32 0,171 SBM243 (mg) 112,8 147,9 131,0 123,2 97,4 132,2 93,8 83,1 107,5 112,2 62,8 73,9 88,6 98,5 106,7 97,9 27,17 0,278 ESM243 (g/100g) 41,0 51,9 42,6 44,3 35,5 45,2 37,5 32,5 43,4 38,2 29,4 32,4 37,3 36,1 42,4 40,0 0,90 0.796 METANO DÍA mmol/g Fermentable 5,3 5,2 5,3 6,2 5,4 5,0 5,5 5,9 5,9 5,8 7,1 6,5 6,4 6,3 6,3 6,8 0,85 0,426 METANO DÍA mmol/g Incubado 3,3 3,5 3,7 3,6 3,3 3,2 3,3 3,7 3,3 3,7 3,8 3,6 3,5 4,1 3,9 3,6 3,64 0,834 1FP: Factor de partición; 2AGV:MOF: Ratio ácido graso volátil total: Materia orgánica fermentable;3SBM: Síntesis de biomasa microbiana,4ESM: Eficiencia de síntesis microbiana; EEM: Error estándar de la Media 43 5.1.2 Raciones de inicio de lactación A través de la encuesta que se aplicó a los ganaderos, se identificaron las siguientes características de los sistemas productivos en esta fase (Tabla 9): - Raza: Se monitorizó la misma muestra de rebaños considerados durante la fase de preparto, salvo 1 Assaf y 1 rebaño Latxa. Por tanto, el conjunto de rebaños estuvo constituido por 1 rebaño Assaf y 13 rebaños de raza Latxa. - Proporción forraje/concentrado: Se identificaron raciones en las que prevaleció la cantidad de forraje ofrecida, encontrando 1 rebaño con 72/28, 2 rebaños con 70/30 y 2 rebaños con 68/32, aunque también se identificaron raciones con relaciones medias (50/50 1 rebaño, 48/52 1 rebaño) o de menos aporte de forraje, como en el caso de un rebaño con 40/60. - Manejo alimenticio: El manejo alimenticio de los rebaños monitorizados fue el mismo indicado que para el caso de preparto, salvo 1 rebaño Assaf menos que implementaba un manejo intensivo y un rebaño Latxa de manejo convencional con certificación ecológica. - Tipo de forraje empleado y modo de conservación: La mayoría de los rebaños aportaban al menos dos forrajes diferentes en esta etapa productiva, siendo la base principalmente heno (7 rebaños) o heno de pradera (8 rebaños), utilizando la combinación de ambos en 2 rebaños. En el resto de los rebaños que usban heno de alfalfa como forraje principal, 2 únicamente usaban esta como aporte forrajero único y el resto lo complementaba con ensilado de maíz o heno de festuca. En el caso de los que utilizaban heno de pradera, 2 emplearon heno de veza como forraje adicional; existió sólo 1 rebaño que utilizó henolaje de hierba de pradera como forraje único. 44 Tabla 9. Caracterización de raciones suministradas durante la fase de inicio de lactación en rebaños comerciales de ovino lechero en la CAPV RACIONES/REBAÑO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Raza1 As Lt Lt Lt Lt Lt Lt Lt Lt Lt Lt Lt Lt Lt Manejo alimenticio2 1;3 2 2 2 2 2 2 2 2 2;3 2 2;4 2;5 2;5 F/C3 50/50 61/39 40/60 63/37 70/30 63/37 68/32 63/37 60/40 48/52 60/40 70/30 72/28 68/32 Contenido en proteína bruta (%) Forraje 13,4 13,8 19,2 14,7 8,8 15,9 9,4 15,5 13,8 16,5 13,9 15,2 17,0 10,9 Concentrado 22,4 18,1 17,3 22,8 16,3 21,4 19,3 13,0 16,9 17,2 20,0 11,6 11,6 15,8 Valor Relativo Forrajero 147,5 106,9 127,0 119,7 85,7 116,3 117,6 95,7 93,1 175,0 116,7 151,1 159,3 64,5 Clasificación4 1a 2a 1a 2a 4a 2a 2a 3a 3a 1a 2a Exc4 Exc4 5a Tipo de forraje (% del total de forraje ofrecido) Heno alfalfa 46,0 36,8 100 / / / / 47,0 / 100 / 100 83,3 / Ensilaje de maíz 54,0 / / / / / / / / / / / / / Heno de pradera / 31,6 / 51,9 100 63,5 100 53,0 100 / / / 16,7 / Heno de festuca / 31,6 / / / / / / / / 100 / / / Heno de veza / / / 48,1 / 36,5 / / / / / / / / Henolaje de hierba / / / / / / / / / / / / / 100 1 As: Assaf, Lt: Latxa; 2 1: Intensivo, 2: Convencional, 3: Unifeed, 4: Pienso sin soja como fuente de proteína, 5: Explotación con certificación de ecológico; 3 F/C: Relación forraje/concentrado; 4 Exc: Excelente 5.1.2.1 Analítica química de las muestras de alimento Como puede observarse en la tabla 10, el contenido de materia seca se encontró entre 592 g/kg y 911 g/kg con un valor promedio de 844, el contenido de materia orgánica entre 505 g/kgMS y 833 g/kgMS, el contenido en proteína cruda entre 111 g/kgMS y 195 g/kgMS, la grasa bruta entre 1 g/kgMS y 38 g/kgMS, la fibra neutro detergente entre 155 g/kgMS y 446 g/kgMS y la fibra ácido detergente entre 117 g/kgMS y 244 g/kgMS. 45 Tabla 10. Composición química calculada (g/kg) de raciones de inicio de lactación suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV RACIONES/REBAÑOS Prom DE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ANALÍTICA QUÍMICA DE LA RACIÓN (g/kg) MS 592 905 911 888 704 860 863 891 911 903 918 900 813 757 844,0 96,6 MO 505 823 833 816 634 783 780 803 840 802 850 825 731 691 765,4 96,8 PB 195 141 181 176 111 179 161 160 157 169 163 141 154 125 158,1 22,7 GB 1 17 29 24 10 25 1 12 11 1 38 14 12 9 14,6 11,1 FND 404 302 155 290 446 283 434 330 332 330 298 260 267 415 324,7 79,3 FAD 253 220 117 195 283 190 275 234 217 244 177 194 198 242 217,1 43,3 MS = Materia seca; MO = Materia orgánica; PB = Proteína bruta; GB = Grasa bruta; FND = Fibra neutro detergente; FAD = Fibra ácido detergente; Prom= Promedio; DE= Desviación estándar 5.1.2.2 Clasificación de Forrajes A través del cálculo del VRF se clasificó la calidad de los forrajes empleados por rebaño. Se identificaron 2 explotaciones que suministraron forrajes de calidad excelente, 3 de primera, 5 de segunda, 2 de tercera, 1 de cuarta y 1 de quinta (Tabla 9). De acuerdo al VRF obtenido para el forraje o la combinación de los forrajes empleados, se observa que en el 36% de los rebaños era de alta calidad, destacando que en el 50% de los rebaños se empleó forraje de calidad media e incluso 1 heno y 1 henolaje de hierba de pradera de baja calidad. 5.1.2.3 Cinética de producción de gas Como puede observarse en la tabla 11, al comparar los parámetros del ajuste de producción de gas de las 14 raciones monitorizadas se encontraron diferencias en todos los parámetros 46 evaluados (“A”, “B”, “c”, “tRM” y “RM”). La producción potencial de gas (“A”) fue mayor en la ración 14 con respecto a los valores presentados en la ración 1 (P=0,020) y 12 (P=0,050). El tiempo necesario en el que se alcanza la mitad del valor potencial de producción de gas (“B”) fue menor en la ración 10 con respecto a los valores presentados por la dietas 5 (P=0,002), 9 (P=0,040) y 11 (P=0,040). La constante adimensional que determina la forma de la curva (“c”) presentó un mayor valor en la ración 14 en relación con los valores registrados en las raciones 2 (P=0,030), 7 (P=0,010) y 11 (P=0,050). El tiempo de incubación necesario para que se alcance la tasa de producción de gas máxima (“tRM”) fue mayor en la ración 9 con respecto a la ración 2 (P=0,020) y 7 (P=0,005), mientras que la ración 14 presentó mayores valores con respecto a la ración 2 (P=0,005), 4 (P=0,030), 6 (P=0,020), 7 (P=0,001), 10 (P=0,010) y 11 (P=0,010). Finalmente, el parámetro que indica la tasa de producción de gas máxima (RM) para la ración 14 fue diferente con respecto a las raciones 2 (P=0,030), 7 (P=0,010) y 11 (P=0,060). La producción total de gas/día por gramo de materia orgánica incubada fue menor en la ración 5 con respecto a las raciones 2 (P=0,010), 3 (P<0,001), 4 (P<0,001), 6 (P=0,01), 7 (P=0,030), 10 (P=0,005) y 14 (P=0,001). Del mismo modo, las raciones 3 y 4 presentaron valores mayores con respecto a las raciones 9 (P=0,010 – 0,009 respectivamente), 11 (P=0,02 – 0,02 respectivamente), 12 (P=0,02 – 0,01 respectivamente) y 13 (P=0,04 – 0,04 respectivamente). Al expresar la producción total de gas/día por gramo de materia orgánica fermentada no se encontraron diferencias entre raciones (P=0,260), aunque cabe destacar que dichos valores incrementan en todos los casos con respecto a aquellos registrados en la producción total por gramo de materia orgánica incubada. 5.1.2.4 Digestibilidad in vitro de la materia orgánica y ácidos grasos volátiles La digestibilidad media de las raciones empleadas fue de 64 g/100g, oscilando entre el 56 g/100g y el 68 g/100g. Como puede observarse en la tabla 12, la digestibilidad de la materia orgánica no fue diferente entre las raciones monitorizadas muestreadas (P=0,390). Para la 47 cantidad de cantidad de ácidos grasos volátiles totales entre raciones, a pesar de registrase un valor de P=0,010, no se encontraron diferencias al observar el valor de P registrado para cada ración. La proporción de ácido acético fue mayor en la ración 10 respecto a las raciones 3 (P=0,008), 4 (P=0,030) y 5 (P=0,030). Por su parte, la proporción de ácido propiónico (P=0,392), butírico (P=0,344), la suma de isovalérico e isopropiónico (P=0,159) y la tasa acético:propiónico (P=0,095) no fueron diferentes entre las raciones raciones (Tabla 12). 5.1.2.5 Parámetros de síntesis microbiana y producción de metano En la tabla 13 se detallan los valores obtenidos en los parámetros de síntesis microbiana y de producción de metano. El FP24 no fue diferente entre raciones (P=0,320), mientras que la relación de AGV:MOF fue mayor en la ración 1 con respecto a las raciones 6 (P=0,020), 9 (P=0,02), 10 (P=0,030), 11 (P=0,011) y 12 (P=0,011). La SBM24 y ESM24 no fueron diferentes (P=0,251, P=0,348 respectivamente). La producción de metano por gramo de materia orgánica fermentable fue mayor para la ración 1 con respecto a la ración 13 (P=0,050), mientras que por gramo de materia orgánica incubada fue mayor en la ración 3 con respecto a la ración 13 (P=0,050). 54 Tabla 16. Análisis del efecto de la etapa productiva sobre FP24 (mg MO/ml), AGV:MOF (mmol/g MO), SMB24(mg) y ESM24 (g/g) estimados in vitro a partir de la incubación de raciones de preparto y inicio de lactación suministradas en rebaños comerciales de ovino lechero de la CAPV PREPARTO LACTACIÓN EEM P FP1(mg MO/ml) 3,66a 4,04b 0,27 0,009 AGV:MOF2 (mmol/ g MO) 19,84a 17,33b 2,15 0,005 SBM3 (mg) 104,37a 126,08b 20,48 0,010 ESM4 (g/100g) 39,0a 45,0b 0,50 0,002 1FP: Factor de partición; 2AGV:MOF (mmol/g MO): Ratio ácido graso volátil total/materia orgánica fermentable; 3SBM: Síntesis de biomasa microbiana; 4ESM: Eficiencia de síntesis de biomasa microbiana. EEM: Error estándar de la media. Valores medios dentro de una misma fila con superíndices diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). 5.2 FASE MITIGACIÓN 5.2.1 Cinética de producción de gas De acuerdo al análisis estadístico aplicado y tal y como se indica en la tabla 17, no se detectó un efecto significativo de ninguna de las interacciones estudiadas para ninguno de los parámetros que describen la cinética de producción de gas. El tipo de grasa afectó el parámetro “B”, siendo mayor para las raciones que contenían torta de girasol en relación con las que contenían torta de colza (P=0,042), sin encontrarse diferencias entre torta girasol y grasa de palma o entre grasa de palma y torta de colza. Los niveles de grasa evaluados determinaron diferencias significativas para los parámetros “c” (P=0,021), “tRM” (p=0,003) y “RM” (p=0,007) siendo mayores en todos los casos en el nivel de 3% con respecto a 5%. 55 El tipo de heno empleado afectó todos los parámetros del ajuste de la cinética de producción de gas, siendo “A” y “B” menores en el heno de alta calidad con respecto al de baja calidad (P<0,001 para ambos casos), mientras que los valores registrados de “c” (P<0,001), “tRM” (P=0,004) y “RM” (P<0,001) fueron mayores en el heno de baja calidad con respecto al de alta calidad. Como se detalla en la tabla 18, no se detectó un efecto significativo de ninguna de las interacciones estudiadas para la producción de gas por gramo de materia orgánica incubada. El efecto individual del tipo de grasa determinó diferencias en la producción de gas por unidad de MOI, siendo mayor para las raciones incubadas con torta de colza como fuente de grasa con respecto a aquellas con torta de girasol (P=0,012) y con grasa de palma (P=0,025). Para la calidad del heno, el parámetro indicado fue mayor en el heno de alta calidad en relación con el de baja (P<0,001). 56 Tabla 17. Efecto del tipo de forraje, tipo de grasa y nivel de inclusión de grasa en la ración total sobre los parámetros del ajuste de producción de gas de las raciones experimentales incubadas. “A”: Producción potencial de gas; “B”: Tiempo de incubación en el que se alcanza la mitad del valor potencial; “c”: Constante adimensional que determina la forma de la curva; “R”: Tasa de producción de gas máxima;”tRM”: Tiempo de incubación necesario para que se alcance la tasa de producción de gas máxima.EEM: Error estándar de la media. Valores medios dentro de una misma fila con superíndices diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05); ns: diferencias no significativas A B c tRM RM TIPO DE GRASA Torta de girasol 284,42 25,23a 1,31 14,10 0,18 Torta de colza 283,13 22,84b 1,34 13,91 0,19 Grasa de palma 282,95 24,47ab 1,32 14,84 0,19 NIVEL DE INCLUSIÓN DE GRASA 3% 287,88 24,83 1,36a 15,92a 0,21a 5% 279,12 23,53 1,29b 12,65b 0,17b HENO Alta calidad 258,17a 17,36ª 1,46a 15,83a 0,26a Baja calidad 308,83b 31,00b 1,19b 12,74b 0,12b EFECTOS Tipo 0,967 0,047 0,415 0,669 0,706 Nivel 0,112 0,092 0,021 0,003 0,007 Heno <0,001 <0,001 <0,001 0,004 <0,001 Tipo*nivel ns ns ns ns ns Tipo*heno ns ns ns ns ns Nivel*heno ns ns ns ns ns Tipo*nivel*heno ns ns ns ns ns EEM 12,50 1,73 0,05 2,16 0,02 57 Tabla 18. Efecto del tipo de forraje, tipo de grasa y nivel de inclusión de grasa en la ración total sobre la producción de gas/día por gramo de materia orgánica incubada de raciones experimentales. ml/g MO incubada TIPO DE GRASA Torta de girasol 142,3b Torta de colza 149,9a Grasa de palma 143,2b NIVEL DE INCLUSIÓN DE GRASA 3% 145,17 5% 145,16 HENO Alta calidad 156,86a Baja calidad 133,47b EFECTOS Tipo 0.009 Nivel 0.995 Heno <,001 Tipo*nivel ns Tipo*heno ns Nivel*heno ns Tipo*nivel*heno ns EEM 4,42 EEM: Error estándar de la media. Valores medios dentro de una misma fila con superíndices diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05); ns: diferencias no significativas Finalmente, al referir la producción de gas diaria por gramo de materia orgánica fermentable se encontró una interacción significativa entre el nivel de grasa y el tipo de heno (P=0,025), donde para raciones con 3% y 5% de grasa no existen diferencias cuando el componente forrajero es un heno de alta calidad (P=0,311), mientras que un nivel de grasa en la dieta del 5% se encontró más gas por g de MOF en para el heno de baja calidad en comparación con el de alta (P=0,006) (Figura 2). 58 3% 5% 3% 5% 0 100 200 300 Heno Alta Calidad Heno Baja Calidad aaab Nivel de grasa ml/g MOF Figura 2. Efecto del tipo de heno y el nivel de grasa en las raciones experimentales sobre la producción de gas/día por gramo de materia orgánica fermentable. 5.2.2. Digestibilidad in vitro de la materia orgánica Se encontró un efecto significativo de la interacción entre el nivel de grasa por el tipo de grasa (P=0,029), de la calidad del heno por el tipo de grasa (P=0,028) y del nivel de grasa por el tipo de heno (P=0,056). Como puede observarse en la figura 3, mientras que al incluir grasa en un 3% no se encontraron diferencias significativas entre tipo de grasa, en la relación 5% sí se encontró una menor digestibilidad con grasa de palma en comparación con torta de colza (P=0,006) y torta de girasol (P=0,004). Por otra parte, mientras que al incubar heno de alta calidad no se determinaron diferencias significativas entre tipos de grasa en los valores de DIVMO, ésta fue menor en las raciones incubadas con heno de baja calidad y grasa de palma en comparación con torta de colza (P=0,002) y torta de girasol (P=0,013) (Figura 4). 59 Girasol Colza Palma 0 20 40 60 80 Heno Alta Calidad Heno Baja Calidad a bbb aa g/100 g 3% 5% 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Girasol Colza Palma ab aaaa Nivel de grasa g / 100g Figura 3. Efecto del tipo y nivel de grasa en las raciones experimentales sobre digestibilidad verdadera in vitro de la materia orgánica (g/100g). Figura 4. Efecto del tipo de grasa y la calidad del heno en las raciones experimentales sobre la digestibilidad verdadera in vitro de la materia orgánica (g/100g). 60 5.2.3 Ácidos grasos volátiles Como puede observarse en la tabla 19, la producción de AGV totales fue mayor para el heno de alta calidad con respecto al de baja (P=0,024). Las diferencias en la proporción de ácidos grasos volátiles individuales solamente ocurrieron para el ácido acético. Como se observa en la figura 5 existió una interacción del nivel de grasa por el tipo de heno sobre la proporción de ácido acético, ya que no se encontraron diferencias significativas entre henos a un nivel de inclusión de grasa del 3%, pero en el nivel de inclusión de 5% de grasa en la ración se encontró una proporción más alta en un heno de baja calidad en comparación con el de alta (P=0,039). Del mismo modo, la interacción del nivel de grasa por la calidad del heno afectaron el ratio ácido acético:propiónico (Figura 6), sin encontrarse diferencias significativas entre tipos de heno al incluir 3% de grasa en la dieta, pero resultando en un mayor ratio al incubar heno de baja calidad en comparación con el de alta calidad (P=0,003) al incluir 5% de grasa en la ración. 61 Tabla 19. Efecto del tipo de forraje, tipo de grasa y nivel de inclusión de grasa en la ración sobre la producción in vitro de AGV en el fluído ruminal AGV totales (mmol 500 mg) AGV (g/g AGV totales) Propiónico Butírico Isovalérico+Isobutírico TIPO DE GRASA Torta de girasol 4,97 0,17 0,07 1,15 Torta de colza 5,38 0,17 0,07 1,24 Grasa de palma 5,17 0,17 0,07 1,19 NIVEL DE GRASA 3% 0,71 0,17 0,07 0,17 5% 0,70 0,17 0,07 0,16 HENO Alta calidad 5,44a 0,17 0,07 1,18 Baja calidad 4,90b 0,17 0,07 1,15 EFECTOS Tipo 0,334 0,278 0,969 0,668 Nivel 0,216 0,172 0,939 0,209 Heno 0,024 0,870 0,963 0,011 Tipo*nivel ns ns ns ns Tipo*heno ns ns ns ns Nivel*heno ns ns ns ns Tipo*nivel*heno ns ns ns ns EEM 0,525 0,003 0,007 0,022 EEM: Error estándar de la media. Valores medios dentro de una misma fila con superíndices diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05); ns: diferencias no significativas 62 3% 5% 0 1 2 3 4 5Heno Alta Calidad Heno Baja Calidad aaab Nivel de grasa C2:C3 Figura 5. Efecto del nivel de grasa y la calidad del heno en las raciones experimentales sobre la producción de ácido acético (g/g del total de AGV). Figura 6. Efecto del nivel de grasa y la calidad del heno en las raciones experimentales sobre el ratio ácido acético:propiónico. 3% 5% 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Heno Alta Calidad Heno Baja Calidad aa a b Nivel de grasa Ác. Acético g/g 63 5.2.4. Parámetros de síntesis microbiana y producción de metano Como puede apreciarse en la tabla 20, tanto FP24 como SBM24 fueron influenciados por el tipo de grasa empleada en las raciones experimentales, observándose que aquellas que contienen como fuente de grasa la torta de girasol presentaron valores mayores (P=0,035 para el FP24 y P=0,049 para SBM24) con respecto a aquellas en las que se utilizó palma. Por su parte, la calidad del heno utilizado en las incubaciones influyó tanto en el factor de partición como en la síntesis de biomasa microbiana y en la eficiencia de dicha síntesis, siendo mayor en todos los casos en los que se empleó forraje de alta calidad (P=0,001); por su parte, el ratio AGV:MOF fue menor en el heno de alta calidad (P=0,001). Como se observa en la figura 7, existió una interacción del nivel de grasa por la calidad del heno para la producción de metano por gramo de MOI, sin encontrarse diferencias entre henos al incubar un 5% de grasa en la ración, pero resultando en una menor producción de metano por gramo de MOI en el heno de alta calidad al incubar con 3% de grasa (P=0,013). La misma interacción afectó la producción de metano por gramo de MOF, sin encontrar diferencias al suplementar con 3% de grasa en la ración, resultado en una mayor producción de metano por gramo de MOF al incubar heno de baja calidad con un nivel de grasa en la ración del 5% (P=0,006) (Figura 8). 70 6.2 Incubaciones in vitro Cuando un alimento es incubado con líquido ruminal tamponado, los microorganismos convierten los carbohidratos y en menor medida la proteína de los alimentos en productos finales como ácidos grasos volátiles, proteína microbiana, metano y gas carbónico (Zicarelli et al., 2011; Singh et al., 2012). De acuerdo con Singh et al. (2012) y Van Soest (1983c), el patrón de producción de gas y la velocidad a la cual el alimento incubado puede ser fermentado por unidad de tiempo depende de la composición de la ración, su calidad y disponibilidad de nutrientes, por lo cual las particularidades observadas en el manejo alimenticio, la proporción forraje/concentrado y tipo de forraje empleado pueden explicar en parte las diferencias observadas en la totalidad de los parámetros de la cinética de producción de gas al comparar las raciones de inicio de lactación con las de preparto. La reducción de un 14,34% en la producción potencial de gas (“A”), 5,53% en la cantidad de gas diaria por gramo incubado y 10,97%, por gramo fermentado en las raciones de inicio de lactación con respecto a las de preparto indican diferencias tanto en los procesos de fermentación como en la degradación de las raciones ofrecidas. Si bien es cierto que trabajos como los de Zicarelli et al. (2011) y González-García et al. (2010) sustentan que al incrementar la cantidad de pienso en la ración, como es el caso de las raciones de inicio de lactación con respecto a preparto, existe una mayor producción potencial de gas, una mayor disponibilidad de carbohidratos rápidamente fermentables como los aportados por el pienso favorece la síntesis microbiana (Krause et al., 2002; Cone y Becker, 2012). De igual forma, Tang et al. (2008) y Getachew et al. (2004) consideran que la técnica de producción de gas y la cuantificación del mismo a través de registros periódicos sólo tiene en cuenta el sustrato que es empleado para la producción de ácidos grasos volátiles y otros gases sin diferenciar la cantidad de sustrato que es utilizado para el crecimiento microbiano. Dijkstra et al. (2005b) argumenta que la partición del sustrato degradado entre síntesis de biomasa microbiana, ácidos grasos volátiles o gas refleja la eficiencia de dicho proceso y guardan una alta relación entre sí (Blümmel et al., 1999; Liu et al., 2009), de modo que la 71 combinación de mediciones de gas con la cuantificación del residuo proporcionan información complementaria relevante (Blümmel y Bullerdieck, 1997). En el presente trabajo, los indicadores de síntesis microbiana cuantificados fueron mayores en las raciones de inicio de lactación que en las de preparto, estimándose esas diferencias en un 9,40% para FP24, 17,22% para SBM24 y 13,33% para ESM24, lo cual supone que en las dietas de lactación se observa una mayor eficiencia en el proceso de fermentación, degradación y partición del sustrato encaminado hacia la incorporación y síntesis microbiana que hacia la producción de gas. Lo anterior está de acuerdo con lo reportado por Blümmel et al. (1997), quien determinó que una baja producción de gas fue un indicativo de alta incorporación del sustrato en la biomasa microbiana tras haber cuantificado mayores valores en el factor de partición. Los AGV totales fueron un 10,21% menores en las raciones de inicio de lactación, lo cual indica una menor fermentación; del mismo modo, el cálculo del ratio AGV:MOF fue un 12,65% menor, reiterando para el último caso que el sustrato fermentado no se destinó a la producción de ácidos grasos volátiles, lo cual está de acuerdo con lo argumentado por Blümmel et al. (1997), Blümmel y Bullerdieck (1997) y Dijkstra et al. (2005b), quienes indican precisamente que existe una relación inversa entre la producción de gas y la producción de ácidos grasos volátiles y la producción de biomasa microbiana determinada in vitro. Además, el patrón de fermentación fue diferente en las raciones de cada estado monitorizado, encontrando que las cantidades de ácido acético, butírico e isovalérico+isobutírico fueron un 1,66%, 15,38%, 25% mayores en las raciones de lactación, así como el ratio ácido acético/ácido propiónico fue un 19,56%, mientras que la producción de ácido propiónico se redujo en un 17,39%. Aunque la mayoría de estudios indican que el tipo de fermentación de raciones en las que el componente fibroso representa una mayor cantidad favorece un aumento en la relación ácido acético/ácido propiónico y que proporciones molares de acetato y butirato son mayores, los datos obtenidos in vitro en este estudio se desvían de dichos argumentos. Sin embargo, de acuerdo con Getachew et al. (2004) un alto ratio ácido acético/ácido propiónico está indicando que proporcionalmente el componente fibroso de la ración es más fermentable y digestible, y si se tiene en cuenta que el aporte de pienso favorece hasta cierto punto la fermentación de la fibra, los resultados encontrados en las raciones de inicio de lactación en los cuales el ratio ácido acético/ácido 72 propiónico fue un 24,32% mayor y el contenido de concentrado en las raciones en general supera al de las raciones de preparto, estos resultados podrían deberse a dicho efecto. De igual forma, el hecho de que las raciones de preparto presenten mayores valores de ácido propiónico podrían atribuirse en cierta medida a lo reportado por Cone y Becker (2012) quienes concluyen que la incubación in vitro en fluido ruminal de sustratos lentamente fermentables, como sería el caso de las raciones de preparto por su contenido importante de material fibroso, presenta en la parte inicial de la fermentación una fermentación más glucogénica reflejada en mayores cantidades de ácido propiónico. En relación con los ácidos grasos volátiles ramificados, Hildebrand et al. (2012) reportan que su concentración se encuentra directamente relacionada tanto con la cantidad y composición de la proteína como son su degradación. Del mismo modo, Getachew et al. (2004) afirman que el incremento en la producción de isovalerato e isobutirato puede darse cuando el contenido de proteína incrementa en la dieta. Considerando que las raciones de preparto tenían un contenido medio de proteína bruta de 131,1 g/kg y las de inicio de lactación de 158,1 g/kg, el 33,30% de más en la producción de isovalerato-isobutirato en las raciones de lactación puede deberse en parte a dicha diferencia en la cantidad de proteína bruta. De manera complementaria es de referir que Liu et al. (2009) reportan que en estudios in vitro se ha determinado que los ácidos grasos volátiles ramificados estimulan la síntesis de proteína microbiana, lo cual está de acuerdo con los resultados encontrados en el presente estudio para los parámetros indicados. Al comparar los valores obtenidos de digestibilidad en los dos estados fisiológicos, encontramos las raciones de inicio de lactación son un 8,6 % más digestibles que las de preparto. La digestibilidad representa una medida importante para la evaluación de los alimentos para rumiantes (Zicarelli et al. 2011)y se encuentra determinada en parte por propiedades intrínsecas de cada uno de los componentes del alimento que integran la ración y por las interacciones tanto positivas como negativas que puedan darse entre los mismos (Nousiainen et al., 2009), pudiendo inferir que tal como lo argumenta Cho et al. (2012), un ingrediente de la dieta influencia la digestibilidad de otros ingredientes y de la totalidad de la ración. Del mismo modo, si se tiene en cuenta que las raciones de lactación temprana tenían un contenido superior de concentrado, los resultados obtenidos estarían de acuerdo 73 con lo reportado por el estudio de meta-análisis hecho por Cho et al. (2012), quienes concluyen que el incremento de concentrado en la ración favorece la digestibilidad de las raciones evaluadas. La reducción del 14,97% para el parámetro “B” y el incremento del 39,72% de “tRM” de las raciones de inicio de lactación podría estar relacionado con una mayor proporción de concentrado en la ración (40% en general en raciones de lactación vs. 30% en raciones de preparto). De acuerdo con Hildebrand et al. (2012), el tiempo de fermentación y degradación de la materia orgánica aumenta al incrementar la proporción de concentrado en la dieta como resultado de una cantidad más alta de carbohidratos solubles, favoreciendo en gran medida la fermentación y degradación del sustrato total incubado. Del mismo modo, Zicarelli et al. (2011) y Hildebrand et al. (2012) reportaron un incremento en la tasa de producción de gas máxima al incrementar el aporte de concentrado en la ración. Lo valores de los parámetros de la cinética de producción de gas en cada una de las raciones en el estado de preparto solamente fueron diferentes para “B”, siendo un 48,59% para la ración 15 con respecto a la ración 2. Si bien es cierto que no debe dejarse de lado que el aporte nutritivo de los alimentos en la ración es aditivo y que la respuesta en términos de fermentación y degradación está relacionada con los componentes que la integran (Tang et al., 2008), la diferencia encontrada para “B” en este caso pudo deberse a la variación en el tipo de recurso forrajero empleado, pues aún con una proporción forraje/concentrado similar entre las raciones (69/31 y 68/32 para cada caso respectivamente) el rebaño 15 empleó heno de alfalfa y el rebaño 2 paja de cereal. Lo anterior está de acuerdo con lo expuesto por Singh et al. (2012) y Shibata y Terada (2010), quienes a través de la técnica de producción de gas y mediciones in situ determinaron que las leguminosas son más fuertemente fermentadas y degradadas en comparación a gramíneas y cereales; del mismo modo Williams et al. (1995) determinaron mediante la misma técnica que la paja de cereal presenta un mayor valor para el tiempo en el que alcanza la mitad de la producción potencial de gas cuando lo comparó con otro tipo de forrajes. 74 Por su parte, las diferencias en todos los parámetros de la cinética de producción de gas, en la producción de gas por día por gramo de materia orgánica incubada, AGV totales, ácido acético, AGV:MOF y metano en las raciones de inicio de lactación reflejan la amplia variabilidad en los componentes de las raciones, pues como pudo observarse en la caracterización, el componente forrajero empleado fue diverso y en todos los casos se empleó más de un tipo por ración. Es de destacar que la eficiencia del proceso de fermentación varió entre raciones, observando que la ración 1 tuvo un incremento del 59,44% en el ratio AGV:MOF con respecto a la ración 13. Del mismo modo, en términos de emisiones de metano expresado como mmol por g fermentable, el rebaño 1 produjo un 33,33% más que el rebaño 13, por lo cual puede inferirse que una ración similar a la empleada por el rebaño 13 con una proporción de forraje/concentrado 72/28 en la cual se empleó una combinación forrajera de heno de alfalfa y de pradera que resultó en un VRF de excelente y un valor de FND y FAD de 267 y 198 g/kg respectivamente, propende por emitir menos metano que la ración del rebaño 1 que empleó una proporción forraje/concentrado 50/50 conformado por heno de alfalfa y ensilaje de maíz, con un VRF de primera y un contenido en FND y FAD de 404 y 253 g/kg respectivamente. Si bien es cierto que en esta fase productiva se monitorizaron raciones que emplean forrajes con un VRF de cuarta y quinta y con valores de FND y FAD superiores a los anteriormente mencionados, los valores de metano emitido por gramo de materia orgánica fermentable no difirieron estadísticamente de los registrados como más altos o más bajos. Aunque en el presente estudio se tuvo acceso a información detallada acerca del manejo nutricional de los rebaños, en condiciones ideales sería conveniente profundizar en la caracterización de los forrajes empleados en términos de composición botánica del pasto de partida, estado vegetativo en el momento de la cosecha, entre otros, para poder hacer una mejor interpretación de los resultados obtenidos. De igual modo debe tenerse en cuenta que factores comúnmente asociados con diferencias en los procesos de metanogénesis incluyen el contenido de fibra en la ración, el contenido de carbohidratos rápidamente fermentables y la velocidad de paso de degradación del alimento (Johnson y Johnson, 1995), de los cuales desconocemos el contenido, aporte y tipo de carbohidratos rápidamente fermentables en los piensos suministrados. Por otro lado, de acuerdo con López et al. (2007), aspectos 75 importantes relacionados con la composición del pienso suministrado en la ración, el tipo de forraje ofrecido, su estado de madurez y edad de corte deben ser controlados y tenidos en cuenta para realizar apreciaciones concluyentes sobre resultados encontrados, pues tal y como demostró Lovett et al. (2006) la producción de metano de ciertos recursos forrajeros estimada mediante la técnica de producción de gas varía en función de la estación de crecimiento y de la calidad de los mismos. En este sentido, Mitsumori y Weibin (2008) plantea que mejorando la calidad del forraje se puede reducir la producción de metano en un rango de 20% a 40% Como resultado de la existencia de diferencias significativas entre estados fisiológicos en términos de cinética, producción de gas y parámetros de síntesis microbiana, podría inferirse que las raciones inicio de lactación producirían menos metano por favorecer procesos de degradación encaminados a la síntesis más que a la producción de gas como tal. En este sentido los valores de producción de metano por gramo de MOI fue muy similar entre ambos estados, y por gramo de MOF fue aparentemente un 5,36% inferior en las raciones de lactación, sin embargo, dicha diferencia no fue estadísticamente significativa. 6.3. Estrategia de mitigación Según Grainger y Beauchemin (2011) y Bocquier y González-García (2010), la suplementación de grasa en la dieta es considerada como la estrategia alimenticia más promisoria para reducir las emisiones de gases de efecto invernadero y en especial del metano en los rumiantes, pues además de existir una persistencia en dicha reducción, se ejerce un efecto nutricional favorable al representar un aporte de energía en la ración. En este estudio se propuso evaluar la inclusión de dos tortas de semillas de oleaginosas obtenidas mediante prensando en frío, que constituyen un co-producto de la industria de producción de aceite. Grainger y Beauchemin (2011) consideran que el uso en la alimentación animal de co-productos ricos en grasa provenientes de industrias agrícolas y/o alimentarias constituye un enfoque práctico a considerar para reducir las emisiones de gases de origen entérico en los sistemas productivos animales. De manera conjunta Shibata y 76 Terada (2010) y Eckard et al. (2010) proponen que si se tiene en cuenta que las raciones de rumiantes tienen un aporte importante de componente forrajero, también debe considerarse la mejora del estatus nutricional y la reducción de emisiones a través de la optimización en la calidad del forraje. Sin embargo, desde un punto de vista del sistema de producción en conjunto resulta relevante tener en cuenta las consideraciones de Waghorn y Clark (2006) con respecto a que un enfoque multifacético de la mitigación en general, en el que se consideren aspectos como el análisis del ciclo de vida para integrar todas las entradas y salidas del sistema productivo identificará mejores oportunidades para desarrollar y aplicar. Partiendo de lo planteado por Blümmel et al. (1997), quien hace referencia a que la producción de gas se encuentra estrechamente relacionada con la fermentación del sustrato incubado, y considerando que la cuantificación del mismo no diferencia la cantidad de sustrato que es utilizado para el crecimiento microbiano conviene interpretar de manera conjunta los parámetros que describen los dos comportamientos. En este estudio los parámetros de la cinética de producción de gas se encontraron afectados por la calidad del heno incubado y por el tipo de grasa incubado. Para el heno de alta calidad la producción potencial de gas fue 19,62% menor, mientras que la tasa máxima de producción de gas y el tiempo en el que se alcanza dicha tasa máxima fueron 53,84% y 19,52% mayores con respecto al de baja calidad. Para las raciones incubadas con torta de girasol se presentó una reducción del 10,46% en el tiempo en el que se alcanza la mitad del valor potencial de gas. En términos de los parámetros que indican síntesis microbiana, en las raciones incubadas con heno de alta calidad se presentó un aumento del FP24, SBM24 y ESM24, de un 9,43%, 49,30% y 12,20% , mientras que el ratio AGV:MOF fue 20,53% menor para dicho tipo de heno. Por su parte la inclusión de torta de girasol como fuente de grasa en la ración favoreció en un 6,61% el FP24 y un 13,40% la SBM24 en con respecto a la grasa de palma. Teniendo en cuenta que la partición del sustrato fermentado entre producción de gas y síntesis de biomasa microbiana refleja la eficiencia del proceso fermentativo (Dijkstra et al. (2005b), se considera que las raciones incubadas con heno de alta calidad son más eficientes en dicho proceso en relación con las incubadas con heno de baja calidad. Por su parte Blümmel et al. (2003) consideran que en nutrición de rumiantes es preferible una alta eficiencia de síntesis microbiana en lugar de altas tasas de producción de ácidos grasos 77 volátiles, pues conlleva a un eficaz uso del nitrógeno y carbono disminuyendo su flujo hacia la emisión de desechos y gases. En relación al efecto favorable de incubar con heno de alta calidad, los resultados están de acuerdo a lo planteado por Mitsumori y Weibin (2008), quienes argumentan que una síntesis de biomasa microbiana adecuada difícilmente se logra con el uso de forrajes de baja calidad. Con respecto al efecto del tipo de grasa en la ración, Ivan et al. (2001) afirman que el contenido de ácidos grasos insaturados de cadena larga en la dieta ejercen un efecto tóxico sobre los protozoos, que si se tiene en cuenta que dentro de las diversas funciones de estos microorganismos está la de consumir y digerir bacterias ruminales (Dayani et al., 2007), puede inferirse que al reducir su número se reduce su efecto deletéreo sobre la población bacteriana. En términos prácticos, una alta conversión del alimento degradado a biomasa microbiana disminuye la necesidad de suplementar en la ración fuentes de proteína indegradable en el rumen (Blümmel et al., 2003)), lo cual se suma como otro argumento favorable a considerar al elegir tanto el componente forrajero de la ración como otro tipo materias primas que se quieran incluir. La producción de metano es un proceso intrínseco de la fermentación ruminal. Sin embargo, el enfoque actual se centra en reducir las emisiones de metano por unidad de alimento digerido, aunque debe tenerse en cuenta que el interés final es mitigar las emisiones del sistema productivo entero como un reto (Bodas et al., 2012). Teniendo en cuenta que no todos los componentes de la ración se fermentan de la misma manera en el rumen, la producción de metano varía de acuerdo a la composición de la ración y al tipo de fermentación que se favorezca. Así, Dijkstra et al. (2005a) y Mitsumori y Weibin (2008) afirman que dentro de los factores que afectan dicha producción se encuentran la calidad del alimento, la eficiencia de crecimiento microbiano y el tipo de ácidos grasos producidos, siendo el ácido acético aquel que ejerce una mayor influencia. En el presente estudio, la incubación de raciones con 5% de grasa y heno de baja calidad ocasionaron un incremento del 16,62% en la producción de gas por gramo de materia orgánica fermentada, de 2,8% en la cantidad de ácido acético, de 3% en el ratio acido acético:propiónico lo cual indica que se está favoreciendo una fermentación acética que a su vez se reflejó en un incremento del 34,4% de la producción de metano por gramo de MOF. Considerando que el contenido en FND del heno de baja calidad empleado en este estudio fue superior en relación al de alta 78 calidad (613,3 vs. 467,3), y teniendo en cuenta que forrajes de baja calidad con mayor contenido de fibra incrementa la cantidad de metano producido por favorecer el aumento en la cantidad de ácido acético en relación al propiónico (Johnson y Johnson, 1995; Mitsumori y Weibin, 2008), los resultados obtenidos resultan coherentes. Por su parte, en relación al efecto ejercido por el nivel de grasa, Martin et al. (2010) y Bodas et al. (2012) consideran que la respuesta al suministro de lípidos en la producción de metano depende en gran parte del tipo de dieta, de la proporción forraje/concentrado y de las características propias de cada componente, incluso del tipo de ácidos grasos que constituyan el aporte de lípido suministrado. En todo caso, el modo de acción de las mismas es mediante la reducción de la metanogénesis a través de la inhibición de los protozoos, el incremento en producción de ácido propiónico y la biohidrogenación de ácidos grasos insaturados (Loor et al., 2004). Aunque el efecto benéfico de la grasa sobre las emisiones de metano se encuentra suficientemente argumentado, la cantidad más conveniente de la misma depende de la calidad del heno que conforme la ración, pues en este caso se logró una reducción en la emisión de metano por gramo de materia orgánica fermentable al incubar un 5% de grasa en la ración total con un heno de alta calidad en comparación con uno de baja. 79 7. CONCLUSIONES  Los rebaños ovinos lecheros de la CAPV que fueron monitorizados en el presente trabajo durante las etapas de preparto e inicio de lactación, presentaron una amplia variabilidad en el tipo y calidad de los recursos forrajeros empleados, la proporción forraje/concentrado y el aporte nutricional de las raciones, con valores promedios en el contenido de proteína bruta y fibras en la ración que proporcionan la cantidad indicada como requerida por los animales en cada etapa productiva.  Aunque los ganaderos tienden a reservar los forrajes de más alta calidad para el inicio de lactación, a menudo la calidad de estos es todavía ampliamente mejorable. De igual modo  Los parámetros de fermentación ruminal estimados in vitro varían entre las raciones suministradas en los dos estados fisiológicos, siendo mayores los valores de la producción potencial de gas, el ratio AGV:MOF y AGV’S en las raciones de preparto con respecto a las de inicio de lactación. Aunque no se encontraron diferencias en la emisión de metano por gramo de MOI ni MOF entre estados, los valores de digestibilidad de la materia orgánica y los parámetros de síntesis de biomasa microbiana (FP24,SBM24, ESM24) fueron mayores en las raciones de inicio de lactación, indicando una mayor eficiencia en el proceso de degradación, fermentación y partición del sustrato encaminado hacia la incorporación y síntesis microbiana que hacia la producción de gas.  Las estrategias de mitigación de emisiones de metano planteadas en el presente trabajo han puesto de manifiesto el efecto favorable de la utilización de forrajes de mayor calidad frente a los de baja calidad, así como la introducción de alimentos que aumentan el contenido de grasa en la ración, pues se genera una reducción de metano en términos de emisión por gramo de MOF al incubar un heno de alta calidad y un nivel de grasa en la ración del 5%. 86 Getachew, G., DePeters, E.J., Robinson, P.H., Fadel, J.G., 2005a. 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