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Proyecto Fin de Carrera Estrategias para combatir la podredumbre ocasionada por Monilinia spp. en post-cosecha de frutos de hueso Autor: Miguel Broto Joven Director/es: Dª. María Eugenia Venturini Crespo D. Domingo Blanco Parmo Escuela Politécnica Superior de Huesca Ingeniero Agrónomo 2013 AGRADECIMIENTOS En primer lugar, quisiera agradecer todo esfuerzo, tiempo y dedicación de mis directores de proyecto, la Dra. Mº Eugenia Venturini Crespo y el Dr. Domingo Blanco Parmo. Muchas gracias por todo lo aprendido, por haberme iniciado en este mundo tan complejo y extenso de la microbiología y sobretodo agradecer el trato recibido durante este periodo de tiempo. Muchas gracias a todos los profesores, compañeros y personal del departamento de Bromatología de la Facultad de Veterinaria por esta etapa tan agradable y por todos los buenos momentos vividos. A mis padres y mi hermana por apoyarme y animarme en todos estos años junto a ellos, por toda su paciencia y esfuerzo, gracias de todo corazón. A mi familia en general por todo el interés mostrado. A mis amigos, estén cerca o lejos, siempre están ahí. Por todos los buenos momentos vividos y por vuestro apoyo a lo largo de todos estos años. Y por último, cómo no agradecer a María todo lo que ha tenido que aguantar, todas las charlas sobre frutos de hueso, mohos, experimentos…etc. Muchas gracias por toda tu confianza, apoyo y comprensión. ÍNDICE DE GRÁFICAS ÍNDICE DE TABLAS ÍNDICE DE IMÁGENES ÍNDICE DE FIGURAS RESUMEN 1 ABSTRACT 2 1. INTRODUCCIÓN, OBJETIVOS Y DESARROLLO EXPERIMENTAL 4 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 8 2.1. LOS FRUTOS DE HUESO 9 2.1.1. Clasificación botánica y origen 9 2.1.2. Producción anual y superficie cultivada 11 2.1.2.1. En España 12 2.1.2.2. En Aragón 15 2.2. LA MONILIOSIS O PODREDUMBRE MARRÓN EN LOS FRUTALES DE HUESO 17 2.2.1. El género Monilinia. Características culturales y microscópicas 18 2.2.2. La podredumbre marrón 21 2.2.3. La moniliosis en España y en el mundo (pérdidas, distribución, especies…) 24 2.3. ESTRATEGIAS PARA REDUCIR LA INCIDENCIA POST-COSECHA DE MONILINIA 27 2.3.1. Estrategias pre-cosecha 27 2.3.1.1. Prácticas culturales 27 2.3.1.2. Fungicidas 27 2.3.2. Estrategias post-cosecha 32 2.3.2.1. Métodos físicos 33 2.3.2.2. Métodos químicos 35 2.3.2.3. Control biológico 40 3. MATERIAL Y MÉTODOS 46 3.1. ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE ENZIMAS PROCEDENTES DE PENICILLIUM PURPUROGENUM FRENTE A MONILINIA LAXA Y MONILINIA FRUCTICOLA. 47 3.1.1. Obtención de los extractos enzimáticos 47 3.1.1.1. Microorganismos utilizados 47 3.1.1.2. Preparación de la pared celular 49 3.1.1.3. Inducción de la actividad β-1,3-glucanasa de P. purpurogenum 50 3.1.1.4. Purificación de la suspensión enzimática al 95% con (NH 4 ) 2 SO 4 51 3.1.2. Actividad antifúngica in vitro en medio sólido 51 3.1.2.1. Método difusión en agar 52 3.1.2.2. Método del agar enriquecido con adición de soluciones enzimáticas 54 3.1.3. Actividad antifúngica in vitro en medio líquido 56 3.1.3.1. Medio líquido enriquecido con adición de soluciones enzimáticas 56 3.1.3.1.a. Curva de crecimiento de M. laxa. 56 3.1.3.1.b. Determinación de la actividad antifúngica 58 3.1.4. Actividad antifúngica in vivo sobre melocotones y brotes de cerezo 58 3.1.4.1. Determinación de la actividad antifúngica en melocotones 59 3.1.4.2. Determinación de la actividad antifúngica en brotes de cerezo 60 3.1.5. Determinación de la actividad enzimática de las soluciones enzimáticas 61 3.1.6. Tabla resumen 63 3.2. ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE METABOLITOS PROCEDENTES DE FRUTOS DEL ACLAREO FRENTE A M. LAXA Y M. FRUCTICOLA 64 3.2.1. Obtención de los extractos acuosos y metanólicos 65 3.2.2. Obtención de los aceites esenciales 66 3.2.3. Actividad antifúngica in vitro en medio sólido 70 3.2.3.1. Método de difusión en agar con extractos acuosos y metanólicos 70 3.2.3.2. Método de difusión en agar con aceites esenciales 70 3.2.3.3. Método del agar enriquecido con adición de extractos acuosos y metanólicos 71 3.2.3.4. Método del medio enriquecido con adición de aceites esenciales 72 3.2.4. Actividad antifúngica in vitro en medio líquido 73 3.2.4.1. Medio líquido enriquecido con adición de extractos acuosos y metanólicos 73 3.2.4.2. Medio líquido enriquecido con adición de aceites esenciales 73 3.2.5. Actividad antifúngica in vivo en melocotones 74 3.2.6. Tablas resumen 75 3.3. ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE UNA CEPA BACTERIANA DE PAENIBACILLUS POLYMYXA AISLADA DE MIEL 78 3.3.1. Identificación de la cepa de microbiana aislada 78 3.3.2. Actividad antifúngica in vitro en medio sólido 80 3.3.2.1. Método de difusión en agar 80 3.3.3. Actividad antifúngica in vivo en melocotones 80 3.3.4. Tabla resumen 81 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 82 4.1. ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE ENZIMAS PROCEDENTES DE PENICILLIUM PURPUROGENUM FRENTE A MONILINIA LAXA Y M. FRUCTICOLA 83 4.1.1. Actividad antifúngica in vitro en medio sólido 83 4.1.1.1. Método de difusión en agar con soluciones enzimáticas 83 4.1.1.2. Método del agar enriquecido con adición de soluciones enzimáticas 84 4.1.2. Actividad antifúngica in vitro en medio líquido 86 4.1.2.1. Medio líquido enriquecido con adición de soluciones enzimáticas 86 4.1.3. Actividad antifúngica in vivo sobre melocotones y brotes de cerezo 89 4.1.3.1. Determinación de la actividad antifúngica en melocotones 89 4.1.3.2. Determinación de la actividad antifúngica en brotes de cerezo 89 4.1.4. Determinación de la actividad de las soluciones enzimáticas 90 4.2. ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE METABOLITOS PROCEDENTES DE FRUTOS DE ACLAREO FRENTE A M. LAXA Y M. FRUCTICOLA 93 4.2.1. Actividad antifúngica in vitro en medio sólido 93 4.2.1.1. Método de difusión en agar con extractos acuosos y metanólicos 93 4.2.1.2. Método de difusión en agar con aceites esenciales 94 4.2.1.3. Método del agar enriquecido con adición de extractos acuosos y metanólicos 114 4.2.3.4. Método del agar enriquecido con adición de aceites esenciales 117 4.2.2. Actividad antifúngica in vitro en medio líquido 119 4.2.2.1. Medio líquido enriquecido con adición de extractos acuosos y metanólicos 120 4.2.2.2. Medio líquido enriquecido con adición de aceites esenciales 123 4.2.3. Actividad antifúngica in vivo en melocotones 124 4.3. ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE UNA CEPA BACTERIANA DE PAENIBACILLUS POLYMYXA AISLADA DE MIEL 126 4.3.1. Actividad antifúngica in vitro en medio sólido 126 4.3.1.1. Método de difusión en agar 126 4.3.2. Actividad antifúngica in vivo en melocotones 127 5. CONCLUSIONES 130 6. BIBLIOGRAFÍA 133 INDICE DE GRÁFICAS Gráfica 2.1: Evolución de la superficie cultivada de los principales frutales de hueso en España. Años 2001-2011 13 Gráfica 2.2: Evolución de la producción de los principales frutales de hueso en España. Años 20012011. 14 Gráfica 2.3: Evolución de las exportaciones de las principales frutas de hueso en España. Años 20002010. 14 Gráfica 2.4: Importaciones de las principales frutas de hueso en España. Años 2000-2010. 15 Gráfica 2.5: Porcentaje de incidencia de la podredumbre marrón tras la aplicación pre-cosecha de diferentes fungicidas (Adaskaveg et al., 2006) 31 Gráfica 3.1: Curva de crecimiento de M. laxa en caldo ZMCZB-E 57 Gráfica 3.2: Curva de crecimiento de M. fructicola en caldo ZMCZB-E 57 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 2.1: Especies y nombres científico de los principales frutales de hueso 10 Tabla 2.2: Producción en toneladas de los principales frutos de hueso en Aragón. 16 Tabla 2.3: Pautas para diferenciar las distintas especies de Monilinia crecidas sobre medio PDA a 22º C. 21 Tabla 2.4: Fungicidas permitidos contra Monilinia spp. en frutales de hueso 30 Tabla 3.1: Composición por litro de MM. 50 Tabla 3.2: Tabla resumen de los ensayos realizados para determinar la actividad antifúngica de enzimas procedentes de P. purpurogenum 63 Tabla 3.3: Tabla resumen de los ensayos realizados para determinar la actividad antifúngica de extractos acuosos y metanólicos procedentes de frutos de aclareo. 75 Tabla 3.4: Tabla resumen de los ensayos realizados para determinar la actividad antifúngica de aceites esenciales (A.E.) procedentes de frutos de aclareo con el método de difusión en agar. 76 Tabla 3.5: Tabla resumen de los ensayos realizados para determinar la actividad antifúngica de aceites esenciales procedentes de frutos del aclareo. 77 Tabla 3.6: Tabla resumen de la actividad antifúngica de una cepa bacterinana de P. polymyxa frente a Monilinia spp. 81 Tabla 4.1: Evolución del diámetro colonial de M. laxa en placas con agar patata dextrosa enriquecido (PDA-E) adicionado o no (control) con diferentes soluciones enzimáticas al 2% e incubadas a 25ºC / 16 días. 85 Tabla 4.2.: Peso del micelio seco obtenido en caldo ZMCZB-E adicionado con diferentes soluciones enzimáticas al 2%, inoculados con M. laxa e incubado a 25º C / 10 días. *Los valores seguidos de la misma letra no presentan diferencias significativas (p > 0,05) 87 Tabla 4.3.: Peso del micelio seco obtenido en caldo ZMCZB-E adicionado con diferentes soluciones enzimáticas al 2 y 4%, inoculados con M. laxa e incubado a 25º C / 10 días. *Los valores seguidos de la misma letra no presentan diferencias significativas (p > 0,05) 87 Tabla 4.4: Tabla resumen de los aceites esenciales extraídos de melocotón de aclareo y su actividad antifúngica frente a M. laxa y/o M. fructicola medida según Davidson y Parish, (1989) como: (R) Resistente; (P.S.): Poco Sensible; (M.S.): Medianamente Sensible; y (S): Sensible. 112 Tabla 4.5: Tabla resumen de los aceites esenciales extraídos de nectarina, paraguayo, cereza, albaricoque y una mezcla de cereza y melocotón de aclareo y su actividad antifúngica frente a M. laxa y/o M. fructicola medida según Davidson y Parish, (1989) como: (R) Resistente; (P.S.): Poco Sensible; (M.S.): Medianamente Sensible; y (S): Sensible. 113 Tabla 4.6: Evolución del diámetro colonial de M. laxa sembrada en placas PDA-E de 85 mm de diámetro adicionando extractos acuosos y metanólicos procedentes de frutos de aclareo e incubados a 25º C / 16 días. 115 Tabla 4.7: Evolución del diámetro colonial de M. laxa y M. fructicola sembradas superficialmente en botón en placas de PDA-E sin adición (control) o con adición de aceites esneciales de melocotón y 118 Resumen/Abstract 2 Por otra parte, la elevada actividad antifúngica mostrada por P. polymyxa frente a M. laxa en el método de difusión en agar con halos de inhibición de 40 mm, no se vio confirmada por los ensayos in vivo realizados sobre melocotones comerciales, donde sólo se apreció un ligero retraso en el crecimiento fúngico en el 25% de las incisiones practicadas. ABSTRACT Brown rot caused by species of Monilinia genus (M. laxa, M. fructicola and M. fructigena), produces serious losses during the postharvest conservation of stone fruits. The use of pesticides in the post-harvest phase are not allowed, so new control methods have to be developed. Among them, the biological control appears promising. In this study we have evaluated the antifungal activity of the lytic enzymes, such as chitinase and β-1,3-glucanase, produced by Penicillium purpurogenum, that degrade the fungal cell wall components (Melgarejo and Larena, 1993; 1996). This activity has also been determined in aqueous and metanolic extracts and essential oils obtained from fruit thinning, which have demonstrated to have a high level of phenolic compounds (Redondo et al., 2012) and therefore may have a notable antimicrobial effect. Also, the antifungal activity of a bacterial strain (Paenibacillus polymyxa), isolated from a routine microbiological analysis of different samples of honey, has been studied as it was observed that their colonies inhibited the growth of the molds present in that food. This work has been divided in two different parts: in vitro trials to determine the antifungal activity of the different extracts or substances in laboratory culture media; and in vivo trials where that activity was evaluated on stone fruits. It was not detected any antifungal activity neither with aqueous and metanolic extracts, nor lytic enzymes. However, in vitro trials using some essential oils have demonstrated an inhibitory effect of the growth of M. laxa and M. fructicola. In the agar diffusion method we have obtained the following inhibition halo diameters: 12-17 mm with peach essential oil, 13-35 with apricot essential oil, and 1221 with cherry essential oil. The peach essential oil obtained the highest antifungal activity, with percentages of inhibition between 55 and 62% on solid medium, and Resumen/Abstract 3 between 23,5 to 46,5% on liquid medium. Unfortunately, in vivo trials did not confirm these results, as no inhibition of brown rot was detected. The bacterial strain P. polymyxa showed a high antifungal activity against M. laxa in the agar diffusion method with an inhibition halo diameter of 40 mm but, this effect was not confirmed in in vivo trials where it was observed a soft delay on the fungal growth on the 25% of inoculations practiced in commercial peaches, but no sign of inhibition for brown rot was appreciated. 1. Introducción, Objetivos y Desarrollo Experimental 4 1. INTRODUCCIÓN, OBJETIVOS Y DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. Introducción, Objetivos y Desarrollo Experimental 5 1. INTRODUCCIÓN, OBJETIVOS Y DESARROLLO EXPERIMENTAL La podredumbre marrón ocasionada por distintas especies del moho Monilinia (M. laxa, M. fructigena y M. fructicola), ocasiona enormes pérdidas durante la conservación post-cosecha de frutos de hueso, especialmente en melocotón, albaricoque y nectarina. En España la principal especie responsable de la aparición de podredumbres es M. laxa, mientras que en otros territorios, Estados Unidos, Sudámerica y Nueva Zelanda, la especie predominante es M. fructicola. Sin embargo, en los últimos años se ha detectado la presencia de esta última especie en el Valle del Ebro. Los daños que este moho produce en flores, brotes y tejidos leñosos son poco importantes aunque pueden conllevar un debilitamiento del árbol que conduce a una menor producción y en ocasiones hasta la muerte del mismo. Este moho coloniza los frutos desde el envero y conforme el fruto madura va aumentando su susceptibilidad a la infección. Por tanto, la aparición de la podredumbre es máxima durante el periodo de conservación y comercialización, cuando se dan las condiciones ambientales óptimas de temperatura y humedad relativa para el desarrollo fúngico. Este hecho unido a la imposibilidad de aplicación de sustancias fungicidas en la post-cosecha de frutos de hueso hace necesaria la búsqueda de métodos alternativos de control. Entre ellos han sido ampliamente investigados los tratamientos con agua caliente solos o combinados con bicarbonato (Casals et al., 2010; Spadoni et al., 2013) y más recientemente con radiofrecuencias (Casals et al., 2010; Sisquella et al., 2014), diversos aceites esenciales obtenidos de plantas (Lazar-Baker et al., 2011; Hassani et al., 2012), bacterias antagonistas como Bacillus subtilis (Casals et al., 2010; Yánez-Mendizábal et al., 2012), Pantoea agglomerans y Citrobacter freundii (Janisiewicz et al., 2013)., o levaduras como Aureobasidium pullulans (Mari et al., 2012; Holb y Kunz, 2013). Todas estas estrategias están en sintonía con la tendencia actual en el sector hortofrutícola de sustitución de los pesticidas de síntesis por tratamientos naturales y que no dejen residuos en el producto. En este proyecto, y siguiendo estas líneas de investigación, se ha estudiado la actividad antifúngica frente a M. laxa y M. fructicola de: 1ºEnzimas exocelulares generados por el metabolismo de Penicillium purpurogenum 1. Introducción, Objetivos y Desarrollo Experimental 6 2ºExtractos acuosos y metanólicos y aceites esenciales obtenidos de frutos de aclareo 3ºLa bacteria esporulada Paenibacillus polymyxa Tras realizar una extensa revisión bibliográfica con el objetivo de encontrar microorganismos cuya actividad frente a Monilinia estuviese científicamente probada, seleccionamos el moho Penicillium purpurogenum, en concreto la cepa ATCC 66107. Esta cepa fue aislada por Paloma Melgarejo e Inmaculada Larena, dos investigadoras del Departamento de Protección Vegetal del CIT-INIA, las cuales demostraron que sus extractos exo-celulares tenían actividad frente a M. laxa. Sus estudios confirmaron que esta actividad se debía en gran parte a las chitinasas y β-1,3-glucanasas excretadas y que producían la destrucción de la pared celular de las células hifales de Monilinia. La utilización de extractos naturales aislados de diversas plantas como antimicrobianos también ha sido objeto de múltiples investigaciones en los últimos años. En este proyecto se han empleado extractos acuosos y metanólicos y aceites esenciales obtenidos de frutos del aclareo. Partiendo de la premisa de que el contenido fenólico en algunas frutas es mayor cuanto menor índice de madurez presentan (Celli et al., 2011) es de suponer que a partir de los frutos procedentes del aclareo, en los que el desarrollo madurativo está muy poco avanzado, se podrían llegar a obtener extractos con altos niveles de compuestos fenólicos. Este hecho ha sido confirmado recientemente en diversos estudios (Redondo et al., 2012 a, b) realizados en el grupo de investigación “Alimentos de origen Vegetal” de la Universidad de Zaragoza. Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de sustancias químicas, considerados metabolitos secundarios de las plantas, con diferentes estructuras químicas y actividades (Martínez-Valverde et al., 2000). A los compuestos fenólicos se les relaciona con numerosos beneficios para la salud, debido sobre todo a que pueden actuar como antioxidantes, pero también está demostrada su actividad antimicrobiana (Mason y Wasserman, 1987; Scalbert, 1991). Por último, se ha testado la actividad antifúngica de una cepa bacteriana aislada en unos análisis rutinarios de miel. Las colonias de esta cepa daban lugar a fuertes halos de inhibición del crecimiento de las colonias de mohos presentes en dicha matriz alimentaria. Este microorganismo fue identificado como Paenibacillus polymyxa, 1. Introducción, Objetivos y Desarrollo Experimental 7 especie, muy cercana filogenéticamente a Bacillus subtilis, uno de los microrganismos cuya actividad antibacteriana y antifúngica está más estudiada y del que ya se disponen productos antimicrobianos comerciales como Serenade Max®. Actualmente, en la Universidad de Lleida están trabajando con la cepa CPA-8 de Bacillus subtilis, cuya actividad frente a Monilinia ya está demostrada (Yanez-Mendizábal et al. 2011) La búsqueda de una sustancia o estrategia eficaz frente a un moho implica una serie de estudios de laboratorio, estudios in vitro y estudios sobre el propio fruto, in vivo. Para establecer la eficacia antimicrobiana in vitro se seleccionaron las dos especies de Monilinia presentes en nuestro país, M. laxa y M. fructicola, aunque en algunos de los ensayos realizados también se han incluido otros mohos causantes de alteración en frutas como Penicillium expansum, Rhizopus stolonifer y Alternaria alternata. Los métodos in vitro incluyeron, por este orden, el método de difusión en agar, la inhibición del crecimiento radial en medio sólido suplementado con las sustancias a ensayar o inoculado con la cepa de P. polymyxa y estudios de inhibición en medio líquido. Una vez realizada esta primera fase las sustancias con mayor actividad fueron testadas in vivo mediante inoculaciones experimentales en melocotones comerciales. 2. Revisión bibliográfica 8 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2. Revisión bibliográfica 9 2.1. LOS FRUTOS DE HUESO 2.1.1. Clasificación botánica y origen. En España como bien sabemos, predomina el clima mediterráneo en gran parte de su territorio, con inviernos suaves y veranos calurosos. Estas condiciones climáticas permiten una agricultura a gran escala. Los principales cultivos en nuestro país son el olivo, cebada, trigo, remolacha azucarera, maíz, patatas, centeno, avena, arroz, tomates y cebollas (MAGRAMA 2012). Los frutales en España también tienen una elevada importancia, además de para el autoconsumo, para el comercio exterior, porque gran parte de la producción es exportada. Las llamadas frutas de hueso son aquellas que contienen en su interior un hueso, como pueden ser el melocotón, la nectarina, el albaricoque, la cereza, la ciruela o el paraguayo. Los frutales donde se desarrollan, se cultivan en climas moderados y la maduración se produce en verano y en otoño. Prácticamente, todos los frutales de hueso tienen la misma clasificación botánica, diferenciándose a nivel de especie: Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Rosales Familia: Rosaceae Subfamilia: Amygdaloideae Tribu: Amygdaleae Género: Prunus Especie: La tabla 2.1 muestra las especies de los principales frutales de hueso y su nombre binomial: 2. Revisión bibliográfica 10 FRUTAL NOMBRE CIENTÍFICO Melocotonero Prunus persica (L.) Batsch Nectarino Prunus persica var. nectarina (L.) Albaricoquero Prunus armeniaca (L.) Cerezo Prunus avium (L.) Ciruelo Prunus domestica (L.) Tabla 2.1: Especies y nombres científico de los principales frutales de hueso En cuanto al origen de los frutales, todos provienen del continente asiático. El melocotonero (Imagen 2.1) y nectarino son originarios de China, de donde pasaron a Persia, de aquí a Grecia y después a toda Europa durante la Edad Media por medio de los griegos y los romanos. (Fálder Rivero, 2003). El albaricoquero parece ser originario del Turkestán chino. Su cultivo comenzó en China, desde donde se expandió a Asia central, Irán, Asia menor, Armenia y Siria (Crossa-Raynaud y Audergon, 1987). A Europa llegó en el siglo I a.C., procedente de Armenia a través de Grecia e Italia (Rodrigo y Herrero, 2000). El cerezo y ciruelo sin embargo, son originarios de Persia, de donde llegaron a Grecia y se extendieron por toda Europa. (Fálder Rivero, 2003). Todas las drupas producidas por los frutales mencionados, están caracterizados por tener un hueso en su interior. Las diferencias visuales entre unas y otras están en la forma, color y aspecto de la piel. Los melocotones y las nectarinas proceden de la misma especie, siendo estas últimas, una mutación natural caracterizada por la ausencia de tomentosidad en la piel del fruto. Los albaricoques son similares a los melocotones, pero de tamaño más pequeño y de color amarillo o pálido anaranjado. Las ciruelas son Imagen 2.1: Melocotonero en flor 2. Revisión bibliográfica 11 redondeadas u ovales y presentan colores amarillos, rojos o violáceos. Las cerezas son las más pequeñas y son drupas de color rojo negruzco y presentan formas redondeadas o acorazonadas. 2.1.2. Producción anual y superficie cultivada. Los principales frutos de hueso cultivados en nuestro país son el melocotón, la nectarina, el albaricoque, la cereza y el ciruelo. A continuación se detallan datos, para cada uno de ellos, en cuanto a extensión y producción mundial y el lugar que ocupa en España (FAO, 2011). Melocotonero y nectarino En cuanto al área de melocotoneros y nectarinos cultivados en 2011, hay una extensión mundial de 1 . 570.562 ha. donde cabe destacar China con 767.346 ha. seguido de Italia (88.580 ha.) y España (81.500 ha.). La producción mundial en 2011 fue de 21.528.690 t., donde China acapara el 53% con 11.528.801 t., seguido de Italia (1.636.750 t.) y España (1.335.600 t.). Albaricoquero La superficie mundial cultivada de albaricoqueros en 2011 es de 485.747 ha., de las cuales 59.696 ha. pertenecen a Turquía, seguida por Irán (50.177 ha.) y Uzbekistán (36.500 ha.). España se sitúa en 8º lugar con una extensión de 18.727 ha. En cuanto a producción, son los tres mismos países los que están al frente al igual que en la extensión. Con una producción mundial total de 3.834.475 t., destaca Turquía con 676.138 t, seguido de Irán y Uzbekistán, con producciones de 452.988 t. y 356.000 t., respectivamente. España ocupa el puesto 13º con una producción de 86.889 t. Cerezo La superficie mundial cultivada de cerezos en 2011 es de 380.674 ha., de las cuales 45.246 pertenecen a Turquía, 34.326 pertenecen a EEUU y 30.207 se encuentran en Italia. España ocupa el 5º lugar con una extensión de cerezos de 24.933 ha. 2. Revisión bibliográfica 18 2.2.1. El género Monilinia. Características culturales y microscópicas La podredumbre y el momificado de los frutales de hueso está causada por dos especies del género Monilinia: M. laxa y M. fructicola. La clasificación de Monilinia ha variado en los últimos años en función del propio género o de las distintas clasificaciones de los hongos. Actualmente, siguiendo a Ericsson (2006), podemos clasificar taxonómicamente a estos mohos de la siguiente manera: Dominio: Eucariotas Reino: Fungi Filo: Ascomycota Subfilo: Pezizomycotina Clase: Leotiomycetes Subclase: Leotiomycetidae Orden: Helotiales Familia: Sclerotiniaceae Género: Monilinia Especie: El género Monilinia, inicialmente se consideró como Monilia y estaba caracterizado por conidióforos y conidios moniliformes. Desde el momento que se conoció su fase sexual, el género pasó a denominarse Monilinia. Dentro del Gº Monilinia, se contemplan cuatro especies: M. laxa, M. fructicola, M. fructigena y M. polystroma, siendo esta última la menos común de las cuatro. Monilinia fructicola (G. Winter) Honey: El estado anamorfo, o forma asexual, presenta hifas primarias con una o varias ramificaciones antes del primer septo, formadas en cadenas, con la espora más joven al final. Los conidios son elipsoidales, ovoides o alimonados y miden de 8-25 x 5-19 µm. El micelio es hialino con aspecto grisáceo en masa, con abundante esporulación de color crema. Monilinia laxa (Aderhold & Ruhl.) Honey ex Whetzel (Monilinia laxa (Ehrenb.) Sacc.): El anamorfo, o forma asexual, presenta un micelio hialino, y al envejecer forma 2. Revisión bibliográfica 19 una costra estromática grisácea. Los macroconidios formadas en la reproducción asexual son elipsoidales, ovoides o alimonados. Forman cadenas cortas y miden 5-23 x 4-16 µm (Imagen 2.3). Imagen 2.3: Macrocoinidos de M. laxa vistas al microscopio (1000 X) Monilinia fructigena (Aderhold & Ruhl.) Honey ex Whetzel (Monilinia fructigena Pers.): El anamorfo tiene también micelio hialino y al envejecer forma una costra oscura. Los macroconidios son también elipsoidales, ovoides o alimonados y miden de 12-34 x 6-15 µm. Se encuentran en cadenas ramificadas, agrupadas en esporodoquios de color blanco crema a pardo. En la imagen 2.4 se muestran las tres especies de Monilinia más importantes. Para facilitar su diferenciación, en la tabla 2.3 se recogen algunas características macro y microscópicas. 2. Revisión bibliográfica 20 Imagen 2.4: Especies de Monilinia crecidas sobre PDA: M. laxa (A), M. fructicola (B), M. fructigena (C). Fuente: Pests And Diseases Image Library (PADIL) 2. Revisión bibliográfica 21 Tabla 2.3: Pautas para diferenciar las distintas especies de Monilinia crecidas sobre medio PDA a 22º C. Fuente: Pests And Diseases Image Library (PADIL) Característica M. laxa M. fructicola M. fructigena Color de la colonia Avellana-grisáceo Avellana-grisáceo Blanquecino-crema Diámetro crecimiento en 24 horas 2-11 mm 9-20 mm 0-12 mm Esporulación Escasa Abundante Escasa Anillos concéntricos de esporas No Si A veces Patrón de crecimiento en forma de rosetón Sí Muy rara vez No Dimensión de los conidios 5-23 x 4-16 µm 8-25 x 5-19 µm 12-34 x 6-15 µm Ramificación del tubo germinativo Ramificación cerca de las conidias Tubo germinativo no ramificado Tubo germinativo largo antes de ramificar 2.2.2. La podredumbre marrón Las cuatro especies de Monilinia pueden persistir en los frutos caídos en el suelo o en los que han sido atacados y continúan momificados en el árbol. Sus conidios son dispersados por el viento, la lluvia y/o los insectos, contaminando los frutos sanos. Este hecho hace que una vez se presenta la enfermedad en los árboles frutales, sea muy difícil de eliminar. Como ya hemos reseñado, los frutos de hueso afectados presentan podredumbres de color gris-marrón, de forma circular, que son producidas por grupos de conidios. 2. Revisión bibliográfica 22 De las cuatro especies, M. laxa es la que más problemas suele dar en el momento de la floración. La infección se suele iniciar en este proceso de floración y se suele manifestar antes de la recolección. En el momento de la floración, los órganos florales más sensibles a la enfermedad son el estambre y el estigma. Si además se dan unas condiciones de humedad del 80% o superiores, los pétalos y sépalos son rápidamente invadidos por el hongo. Después, el hongo penetra en las ramas más pequeñas, produciendo un chancro de forma elíptica con una masiva formación de gomosis que avanza paulatinamente. Los brotes y las yemas se infectan generalmente a partir de las flores o de otros brotes infectados (Imagen 2.5). Imagen 2.5: Brote infectado por Monilinia spp. Fuente: www.plantwise.com Los frutos colonizados presentan una podredumbre marrón que los invade rápidamente, apareciendo en su superficie una capa pulverulenta de tonalidad gris o beige y manteniéndose en el árbol durante todo el otoño (Imagen 2.6) 2. Revisión bibliográfica 23 Imagen 2.6: Fruto momificado en el árbol (a) y nectarina afectada por Monilinia (b) Fuente: Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) M. laxa se mantiene en invierno en forma de micelio vegetativo en los chancros y órganos momificados. Sobre estos órganos contaminados se producen en abundancia las conidias durante el invierno y las primaveras húmedas, siempre que la temperatura supere los 10º C. Se producen nuevas esporas sobre los tejidos muertos, que se extienden a otros brotes, tallos y frutos. Si la madera infectada no se poda, los chancros son una fuente de inóculo, puesto que son capaces de generar una abundante esporulación durante varios años. El fruto puede ser contaminado en cualquier momento de su desarrollo, pero normalmente, en estadíos inmaduros, es más resistente a la enfermedad, por la presencia de sustancias naturales inhibidoras, que van desapareciendo con la madurez (Smith et al., 1992; Ogawa et al., 1995; De Cal y Usall, 2000). Conforme el fruto va madurando, la susceptibilidad a la infección va aumentando hasta la post-cosecha, que es cuando se dan las condiciones óptimas para el crecimiento del moho, siendo necesarias solamente de 3 a 5 horas a 20º C y humedades relativas elevadas para provocar una grave infección. Además, si hay alguna pequeña herida en la superficie del fruto, por minúscula que sea, la contaminación progresa más rápidamente. El fruto puede descomponerse completamente al cabo de unos días. Los frutos que se mantienen suspendidos en el árbol pierden humedad y se arrugan transformándose en una momia; ésta puede caer al suelo y persistir así durante dos o más años (Agrios, 1999). a b 2. Revisión bibliográfica 24 2.2.3. La moniliosis en España y en el mundo (pérdidas, distribución, especies…) La moniliosis es la enfermedad que produce los daños más cuantiosos en la postcosecha de los frutales de hueso cuando las condiciones climáticas le son favorables. También afecta, aunque en menor medida, a los frutales de pepita. Las temperaturas entre 22 y 25º C son las óptimas para el desarrollo del hongo. El rango varía entre los 4 y los 30º C, lo que no significa que las infecciones a flores o frutos se inhiban con temperaturas fuera de ese rango. Por otra parte, la presencia de agua en las flores, frutos y ramas ya sea por agua de lluvia, humedad del ambiente o por el riego, favorece enormemente el desarrollo del moho. En el Valle del Ebro, por ejemplo, es muy fácil encontrar estas condiciones. M. laxa (Aderhold & Ruhland) Honey y M. fructigena Honey son las especies de Monilinia que causan la podredumbre marrón en España. M. laxa es la especie más importante (85-90% de los aislados de podredumbre en frutos) (Sampayo y Palazón, 1977; Larena et al., 2005), mientras que el 10-15% restante lo causa M. fructigena. La distribución mundial de M. laxa se extiende por toda Europa, Marruecos, países de Oriente Próximo, La India, China, Japón, zona Norte de EEUU y algunos países de Sudamérica como Brasil, Argentina y Chile. (plantwise, 2011) La figura 2.1, muestra un mapa de distribución de la especie M. laxa, aunque no resulta muy fiable puesto que no aparecen zonas donde debería indicar su presencia. Figura 2.1: Mapa de distribución de la especie M. laxa. Fuente: www.discoverlife.org 2. Revisión bibliográfica 25 M. fructicola se puede encontrar como especie causal predominante de la podredumbre marrón en Australia, Sudáfrica, Japón, República de Corea, India y todo el continente americano. En Europa se encuentra en la lista A2 de organismos en cuarentena. M. fructicola fue encontrada en Europa por primera vez en 2001, en Francia (Lichou et al., 2002), declarándose posteriormente en Austria (NPPO of Austria, 2002), República Checa (Duchoslavova et al., 2007) y en Hungría y Suiza en frutos importados desde España e Italia (Bosshard et al., 2006; Petroczy et al., 2006). Figura 2.2: Mapa de distribución de M. fructicola. Fuente: CABI/EPPO, 2010. 2. Revisión bibliográfica 26 Respecto a M. fructigena se ha encontrado en el sur y oeste de Europa, en los países de la antigua Unión Soviética, en países del Oriente Próximo, la India, en el Norte de África y por último también en el continente asiático. La figura 2.3 muestra su distribución. = Present, no further details = Widespread = Localised = Confined and subject to quarantine = Occasional or few reports = Evidence of pathogen = Last reported... = Presence unconfirmed = See regional map for distribution within the country Figura 2.3: Mapa de distribución de M. fructigena. Fuente: www.cabi.org 2. Revisión bibliográfica 27 2.3. ESTRATEGIAS PARA REDUCIR LA INCIDENCIA PRECOSECHA Y POST-COSECHA DE MONILINIA. 2.3.1. Estrategias pre-cosecha 2.3.1.1. Prácticas culturales Para tratar de reducir la incidencia de las podredumbres por Monilinia en frutales de hueso se llevan a cabo prácticas culturales, que tratan ante todo de evitar su propagación; entre ellos se encuentran la retirada de frutos podridos, la poda de madera infectada y la limpieza del suelo alrededor de los árboles y de la parcela afectada. La enfermedad se propaga por la producción de conidias en los tejidos infectados. Además de atacar frutos, también forman chancros en los brotes o en las ramas, y si no se podan las ramas infectadas del árbol, los chancros pueden seguir desarrollándose durante años, aumentando de esta forma el tamaño de la herida y siendo un punto de entrada para otros patógenos. Como prácticas culturales también podemos destacar el manejo cuidadoso durante la cosecha para evitar traumatismos y heridas en los frutos. Como ya hemos mencionado antes, cualquier herida en el fruto por minúscula que sea, puede facilitar enormemente el desarrollo de la enfermedad. 2.3.1.2. Fungicidas Otra estrategia para reducir la incidencia de la podredumbre marrón es la aplicación de fungicidas. Aunque es la más efectiva (imagen 2.7), hay cada vez más rechazo por parte de los consumidores y de las normativas legales a la aplicación de estas sustancias en alimentos. Sin embargo, combatir la podredumbre marrón sin el uso de estas sustancias es prácticamente imposible, especialmente en años con pluviometrías elevadas. 2. Revisión bibliográfica 34 patógenos microbianos en productos como zanahoria, mango y pimiento (Terry et al., 2004) Actualmente la luz ultravioleta se aplica para la potabilización del agua en plantas depuradoras de moluscos, para el ablandamiento de carnes, la maduración de quesos, la prevención de crecimiento fúngico en la superficie de productos de panadería, la purificación del aire en plantas embotelladoras, establecimientos de procesado y manipulación de alimentos y en las cubas de encurtidos, entre otros usos en la industria alimentaria. Agua caliente A pesar de las dificultades que entraña el tratamiento acuoso de las frutas (calidad higiénica del agua, secado posterior,…) su uso ya es habitual en algunas centrales hortofrutícolas. Dentro de los tratamientos que se pueden aplicar destaca el uso de agua caliente. La utilización del agua caliente ha sido ampliamente estudiada en multitud de productos hortofrutícolas, tanto para inhibir el desarrollo de podredumbres postcosecha (Barkai-Golan and Phillips 1991; Lurie 1998; Margosan et al., 1997; Couey, 1989), como para aumentar la resistencia de algunas frutas al daño por el frío durante la conservación (Rodov et al., 1995). El tratamiento de pimientos con agua caliente a 53º C durante 4 minutos y su posterior conservación en plásticos de polietileno a 8º C redujo la incidencia de podredumbres y mantuvo las características organolépticas durante 28 días (González-Aguilar et al., 1998). En manzanas Golden Delicious el pretratamiento con agua caliente disminuye la severidad de las podredumbres causadas por B. cinerea y P. expansum (Fallik . 1996; Klein et al., 1997; Lurie et al., 1998). En cítricos, el desarrollo de resistencia a los fungicidas utilizados habitualmente (imazalil, tiabendazol y sodio ortofenil fenato) en Penicillium digitatum y Penicillium italicum, ha potenciado la búsqueda de tratamientos alternativos como el agua caliente sola o combinada con carbonato de sodio o bicarbonato de sodio (Palou et al., 2001). La aplicación de agua caliente en melocotones y nectarinas ha resultado muy efectiva para inactivar esporas de Monilinia y Rhizopus (Sommer et al., 1967). También podemos citar estudios recientes como los de Spadoni et al. (2013), que evaluan la capacidad del agua caliente para inhibir Monilinia spp. en frutas como melocotones y 2. Revisión bibliográfica 35 nectarinas infectadas de forma natural. Con una temperatura de 55º C y una exposición de 1 minuto, consiguieron inhibir completamente la germinación de esporas y, en líneas generales, controlaron la enfermedad un 78%. Radiofrecuencias/ Microondas El calentamiento por radiofrecuencia/microondas incluye la interacción directa entre la energía cedida por la radiofrecuencia y las propiedades dieléctricas de la fruta. En estos tratamientos el aumento de la temperatura interna de la fruta es mucho más rápido que en los tratamientos convencionales de agua caliente. De este modo además, si la infección por Monilinia spp. permanece de forma latente en el interior del fruto, se puede eliminar de forma más eficaz (Casals, et al., 2010) Para la correcta aplicación de esta tecnología, también hay que tener en cuenta las dimensiones de la fruta y el medio que la rodea (Birla et al., 2008). Como ejemplos de aplicaciones de radiofrecuencia podemos citar trabajos recientes de Sisquella et al. (2013 y 2014, pendiente de publicación), en los que someten melocotones y nectarinas artificialmente inoculadas con diferentes concentraciones de esporas de M. fructicola. La radiofrecuencia se aplicó con una frecuencia de 27,12 MHz y detectaron inhibición de la podredumbre con todos los tiempos de exposición y temperaturas ensayadas, siendo el más eficaz el de 4,5 minutos a 40º C. En frutas contaminadas con esporas de Monilia de forma natural, la infección fue reducida de un 92 % a un 26% en melocotones y en un 100% en nectarinas. 2.3.2.2. Métodos químicos Etanol Otra sustancia utilizada en el tratamiento post-cosecha de frutas y hortalizas ha sido el etanol, especialmente para disminuir la hidrofobicidad de la piel de frutas y hortalizas, mejorando la eficacia del lavado con cloro, pero su uso se restringe por sus efectos sobre las propiedades organolépticas de muchos productos (Adams et al., 1989; Zhang and Farber, 1996). Los alcoholes son líquidos incoloros, inflamables, miscibles 2. Revisión bibliográfica 36 en agua y disolventes de numerosos compuestos orgánicos. Entre los alcoholes, los que tienen una evidente actividad antimicrobiana son el etanol y el isopropanol. Aunque no se sabe bien cuál es el mecanismo de acción de los alcoholes, se cree, por su incremento de eficacia en presencia de agua, que causan daño en la membrana y desnaturalizan rápidamente las proteínas que interfieren con el metabolismo y la lisis celular (McDonell and Russell, 1999). La presentación etanólica más efectiva frente a los microorganismos es al 70%, puesto que tiene una elevada capacidad de penetración, ejerciendo la acción en el interior de la célula e impidiendo la actividad enzimática. Si el porcentaje es superior se evidencia una deshidratación en la célula que actúa como preventivo de la penetración del producto en el interior de la célula, disminuyendo su efecto antimicrobiano. Galán (2003) establece un tiempo de contacto de 5 minutos para que el etanol al 70% pueda ser efectivo. Himathongkham et al. (1999) utilizan un método para desinfectar huevos inoculados con Salmonella enteriditis, que consiste en sumergirlos en una solución de etanol al 75% durante 5 minutos; su eficacia resultó ser del 100%. Asimismo, Guo et al., (2001) utilizan etanol 70% durante 2 minutos en tomates frescos. En melocotones y nectarinas, Margosan et al. (1997), aplican etanol al 10% y al 20% durante distintos periodos de tiempo (1 a 8 minutos) y a temperaturas de 46 y 50º C para optimizar el tratamiento. Estos investigadores seleccionan los tratamientos de etanol 10 % a 50º C durante 2,5 minutos y etanol 20% a 46º C durante 1,5 minutos para el control de M. fructicola y R. stolonifer. Por tanto, el etanol es reconocido como un claro inhibidor de mohos (Legan, 1993). Este efecto fungicida se puede obtener mediante aplicación directa del producto en solución, o bien mediante la utilización de vapores ya que Dao et al. (2008) comprueban que ambos procedimientos son válidos para inactivar conidios de Penicillium chrysogenum, P. digitatum, y P. italicum. Lukšiene et al. (2007) estudian el empleo de soluciones de etanol como tratamientos descontaminantes de semillas de trigo y Gangneux et al., (2004) comprueban la eficacia del etanol 70% en superficies de frutas y pimienta negra contaminadas con Aspergillus fumigatus. 2. Revisión bibliográfica 37 También, Bouix et al., (2002) señalan la actividad antimicrobiana que puede ejercer el etanol frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas, así como ante esporas, mohos y levaduras. Ácido peracético Diveros estudios han utilizado el ácido peracético como sustancia química para el control de la podredumbre marrón. Recientemente, Sisquella et al. (2013), testaron este ácido a concentraciones de 200 mg/L junto con agua caliente a 40º C durante 40 s. Como resultados, obtuvieron que la podredumbre se controlaba al 100% cuando la fruta era tratada al mismo tiempo que inoculada. Sin embargo, cuando la fruta era inoculada 24, 48 ó 72 horas antes, no consiguieron controlar la enfermedad. En melocotones contaminados de forma natural, la infección se redujo en un 61% para melocotones “Roig d´Albesa” y en un 36%, para melocotones “Placido”. Aceites esenciales Además de los compuestos químicos ya citados, podemos incluir dentro de este tipo de control, sustancias químicas presentes de forma natural en algunos elementos de la naturaleza que nos rodea. Es conocido el uso de aceites esenciales procedentes de hierbas aromáticas como compuestos antifúngicos. Estos aceites son metabolitos secundarios, mezclas de componentes volátiles, mayoritariamente terpenos y sus derivados oxigenados, producidos en pequeñas cantidades por muchas especies de plantas como mecanismo químico de defensa frente a microorganismos e insectos fitopatógenos (Rosenthal y Jansen, 1979). Estos aceites se han utilizado como agentes saborizantes y odorizantes en las industrias farmacéuticas, cosméticas y alimentarias, y por sus propiedades trapéuticas y curativas en la medicina tradicional y en la aromaterapia. Sin embargo, fueron su carácter antiséptico y su acción conservante las propiedades conocidas y las más ampliamente estudiadas. Las investigaciones en esta dirección han logrado identificar los componentes de un mismo extracto. El componente responsable de la actividad antimicrobiana se encuentra generalmente en la fracción oleica. Los fenoles son los componentes de aceites esenciales con mayor actividad antimicrobiana y dentro de este grupo destacan el timol y el eugenol. Por ejemplo, el componente responsable de la actividad antimicrobiana del aceite esencial de ajo es la alicina (2-propenil-2- 2. Revisión bibliográfica 38 propenetiol sulfinato), que presenta actividad incluso a concentraciones tan bajas como 1:85000 (Cavallito y Bailey, 1944). Los componentes de los aceites esenciales en los que se ha detectado mayor actividad antimicrobiana, centrándonos sobretodo en la actividad antifúngica, han sido el timol, el citral, el eugenol, el cineol, la vanilina, el carvacrol y el cinamalehído. Lazar-Baker et al. (2011) evaluaron la actividad frente a M. fructicola de varios aceites esenciales obtenidos del mirto limón (Backhousia citriodora), corteza de canela, (Cinnamomum zeylanicum), orégano (Origanum vulgare), tomillo (Thymus vulgaris); clavo (Eugenia caryophyllata), valeriana (Valeriana officinalis) y árbol del té australiano (Melaleuca alternifolia). El aceite esencial del mirto limón fue el más efectivo de todos los aceites testados consiguiendo controlar el crecimiento del micelio a bajas concentraciones (200-500 µL/L.) Las investigaciones de Caccioni et al., (1994) valoraron la inhibición de la germinación y del crecimiento de hongos patógenos en la post-cosecha con diferentes compuestos de aceites esenciales. Como resultado, obtuvieron que el componente más efectivo fue el carvacrol; a concentraciones de 125 ppm, inhibió por completo el crecimiento miceliar de Botrytis cinerea, M. laxa, Mucor piriformis, Penicillium digitatum, , Penicillium expansum y Rhizopus stolonifer. Además también inhibió la germinación de esporas de M. laxa, M. piriformis y R. stolonifer. Por otro lado, Neri et al. (2007) investigaron el potencial antifúngico de los componentes volátiles de 9 plantas frente a M. laxa. Los ensayos in vitro mostraron que los mejores resultados se obtuvieron con el trans-2-hexenal y el carvacrol. La concentración mínima inhibitoria del primero fue de 12,3 µL/L, mientras que la del segundo fue de 6,1 µL/L. Los ensayos in vivo confirmaron que el componente más efectivo era el trans-2-hexenal con inhibiciones de germinación de esporas del 46,2% e inhibiciones del crecimiento miceliar del 80,3%, mientras que la eficacia fue menor para el carvacrol con 40 y 39,2% respectivamente. En sintonía con esta línea de investigación el Grupo de Investigación “Alimentos de Origen Vegetal” de la Universidad de Zaragoza ha estudiado la composición química de extractos procedentes de frutos de aclareo. Se partió además de la premisa de que el contenido fenólico en algunas frutas es mayor cuanto menor es su índice de madurez 2. Revisión bibliográfica 39 (Celli y col. 2011); es de suponer por tanto que en los frutos procedentes del aclareo, en los que el desarrollo madurativo está poco avanzado, se encuentran altos niveles de estos compuestos. En las frutas, los compuestos fenólicos o polifenoles son muy importantes y constituyen un amplio grupo de sustancias químicas, con diferentes estructuras químicas y actividades (Martínez-Valverde et al. 2000). Químicamente poseen un anillo bencénico (con uno o más grupos hidróxilo) que incluyen además, derivados funcionales como ésteres, metil ésteres, glicósidos, etc. (Martínez-Navarrete et al. 2008). Es por ello que su clasificación es muy compleja debido al gran número de compuestos que la forman, dividiéndose en diferentes grupos: fenoles simples, ácidos benzoicos, ácidos cinámicos, flavonoides, etc. Todos ellos están relacionados con la calidad sensorial de los alimentos de origen vegetal; son los responsables del color de ciertas frutas, de la formación de quinonas durante la reacción de pardeamiento enzimático, de la astringencia y el sabor amargo que presentan muchas frutas antes de alcanzar el grado de madurez óptimo (Martínez-Valverde et al. 2000). También se les relaciona con numerosos beneficios para la salud, debido sobre todo a que pueden actuar como antioxidantes y antimicrobianos. Así, el estragón y el tomillo contienen ácido cafeíco, que es efectivo frente a virus, bacterias y hongos (Duke 1985). El catecol y el pirogalol son dos fenoles hidroxilados que han mostrado ser tóxicos para los microorganismos. El catecol tiene dos grupos OH y el pirogalol tres; el lugar y el número de grupos hidroxilo en el anillo fenólico parece ser que está relacionado con la toxicidad, en el sentido de que a mayor hidroxilación mayor poder antimicrobiano. Además algunos autores han demostrado que cuanto más oxidado está el fenol mayor actividad inhibitoria posee (Scalbert 1991). Los flavonoides son también sustancias fenólicas hidroxiladas que se presentan con un grupo C 6 -C 3 unido a un anillo aromático y que se sintetizan en las plantas como respuesta a una invasión microbiana (fitoalexinas); no es sorprendente que posean un amplio espectro de actividad antimicrobiana. Dentro de este grupo de flavonoides merecen especial mención las catequinas, presentes en el té verde y que han sido ampliamente estudiados debido a que desde hace tiempo se sabe que esta infusión posee actividad antimicrobiana (Toda et al., 1989). Estas catequinas poseen actividad 2. Revisión bibliográfica 40 antibacteriana in vitro frente a Streptococccus mutans (Sakanaka y col. 1992), Vibrio cholerae O1 (Borris 1996) y Shigella (Vijaya y col. 1995) entre otras. 2.3.2.3. Control biológico El control biológico consiste en el control de plagas, enfermedades y malezas que mediante el uso de organismos vivos antagónicos. En el caso de las frutas, el biocontrol consiste limitar, reducir o inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos y alterantes utilizando otros microorganismos que actúen como antagonistas; la acción antagónica puede deberse a procesos de antibiosis y lisis enzimática, a la competencia por el espacio o por los nutrientes, a las interacciones biológicas directas con el patógeno, por ejemplo microparasitismos, o a la inducción de resistencia. Principales microorganismos utilizados en biocontrol. Las investigaciones de los últimos 20 años se han centrado en la búsqueda y aplicación de agentes microbianos efectivos frente a las principales enfermedades postcosecha de la fruta. Sin embargo, pocos de ellos han sido lo suficientemente eficaces como para crear un producto comercial. Los productos que se encuentran disponibles en el mercado actualmente para combatir distintas enfermedades en distintos frutos (generalmente protegidos por patentes), son los formulados a base de los siguientes microorganismos: a) Bacterias: -Pseudomonas syringae en el control de podredumbre en cítricos, cerezas, manzanas y peras (Janisiewicz et al., 2002). -Pantoea aglomerans, para la podredumbre de cítricos y frutas de pepita (Nunes et al., 2002; Plaza et al., 2004; Cañamás et al., 2008a). -Bacillus subtilis frente a M. fructicola en melocotón (Pusey y Wilson, 1984). b) Levaduras: - Aureobasidium pullulans contra podredumbres de cítricos, uva, fresas, frutas de pepita y de hueso (Kurtzman et al. 2001). 2. Revisión bibliográfica 41 -Candida oleophila, frente a P. expansum y B. cinerea en manzan y pera. (Wisniewski et al., 1995). -Candida sake CPA-1, para enfermedades de frutas de pepita (Viñas et al., 1998; Usall et al., 2001). Mecanismos de acción del antagonista en biocontrol Resulta complicado determinar con exactitud los mecanismos que intervienen en las interacciones entre los antagonistas y los patógenos sobre la planta. Además no suele darse únicamente un mecanismo de acción, sino que pueden concurrir varios, reduciendo así las posibilidades de crear resistencia. Se han descrito varios modos de acción de los antagonistas para controlar el desarrollo de patógenos sobre frutas (Cook and Baker, 1983): • Antibiosis Se refiere a la producción por parte de un microorganismo de sustancias tóxicas para otros microorganismos. Es deseable que la antibiosis no sea el principal mecanismo de acción de un antagonista, puesto que, existe riesgo de la aparición de resistencias. Un claro ejemplo de este tipo de resistencia fue la aparición de cepas de Agrobacterium tumesfaciens (causante de la agalla de la corona de las plantas) resistentes al Agrosin 84, un antibiótico producido por una cepa de Agrobacterium radiobacter (Campbell, 1989). Sin embargo, la eficacia de la antibiosis como método de control comparada con el uso de agroquímicos, deja mucho que desear, puesto que no se puede comprar la liberación de una sustancia a escala microbiana con el uso masivo de agroquímicos. • Competencia Otro de los posibles mecanismos de acción antagónica es la competencia. Se puede definir competencia como el desigual comportamiento de dos o más organismos ante un mismo requerimiento, siempre y cuando la utilización del mismo por uno de los microorganismos reduzca la cantidad disponible para los demás. Si hay exceso de un elemento, no hay competencia. La competencia más común es por nutrientes, oxígeno o espacio. 2. Revisión bibliográfica 42 • Interacción directa con el patógeno Existen dos tipos de interacciones directas entre los antagonistas y los patógenos (parasitismo y predación). El parasitismo se refiere al hecho de que un microorganismo parasite a otro. Consiste en la utilización del patógeno como alimento por su antagonista. Generalmente se ven implicadas las enzimas extracelulares tales como quitinasas, celulasas, β-1,3glucanasas y proteasas que lisan las paredes de las hifas, conidios o filamentos miceliares (Melgarejo 1989, Ulhoa 1996). El ejemplo más claro lo encontramos en el presente proyecto. Testaremos las enzimas producidas por Penicillium purpurogenum frente a mohos patógenos como del género Monilinia. En el caso de la predación, el antagonista se alimenta con materia orgánica entre la cual se encuentra ocasionalmente el patógeno. Los estudios más conocidos citan la presencia de amebas en suelos con potencial antifúngico, las cuales se alimentan de las hifas de hongos patógenos entre otras fuentes de alimento (Campbell, 1989) • Inducción de resistencia A lo largo de su existencia, las plantas han desarrollado mecanismos de defensa muy poderosos contra sus invasores. Estos son mecanismos bioquímicos, físicos o estructurales de resistencia. Se ha demostrado que algunas levaduras utilizadas para el biocontrol de patógenos de post-cosecha además de competir por espacio y nutrientes, son capaces de inducir resistencia en la planta. Tal es el caso de Pichia guillermondii (US-7), la cual ha mostrado ser inductora de la producción de fitoalexinas en frutos cítricos (Wilson et al., 1994). Como ventajas del biocontrol podemos citar las siguientes: • Complejo modo de acción y bajo riesgo de desarrollo de resistencia. No solo interviene un mecanismo de acción, sino que son varios los que actúan frente a un patógeno, con lo que es más difícil que se desarrolle resistencia frente al antagonista. • Reducción o eliminación de residuos químicos. Los productos del biocontrol son el futuro próximo para el control de plagas y enfermedades. 2. Revisión bibliográfica 43 • Seguridad para los trabajadores y el medio ambiente. El uso de agentes de biocontrol reduciría la exposición por parte de los trabajadores a los tóxicos químicos. Además son biodegradables, no dejan residuos químicos y no contaminan ni el medio ambiente, ni el agua de los campos. Aunque también debemos reseñar algunas desventajas: • Requieren un especial manejo, supervisión y una serie de restricciones. Algunos agentes de biocontrol no pueden ser mezclados con otros fungicidas porque éstos, podrían matar al agente biológico empleado. Además a la hora de aplicar el agente de biocontrol, hay que saber cuándo hacerlo, puesto que los microorganismos antagonistas empleados, deben ser aplicados antes o al mismo tiempo que el patógeno para ser eficaz. Esto, reduce la viabilidad de los agentes en almacenes o plantas de envasado. • Eficacia. Los informes de eficacia son variados y contradictorios, en gran parte, porque los usuarios esperan poder utilizar un producto de biocontrol como si fuera un químico, sin considerar sus limitaciones. • Estabilidad. Algunos agentes de biocontrol no producen esporas y consisten sólo en células bacterianas o micelios fúngicos, y como resultado la vida útil de un producto de biocontrol no podría equipararse a un producto químico. Acabamos de ver las limitaciones del biocontrol en el control de plagas y enfermedades. Sin embargo, la efectividad de estos tratamientos aumenta si se combinan con otros métodos. Se han desarrollado diversos estudios para conocer la eficiencia biológica de los antagonistas; por ejemplo, al analizar el comportamiento de cuatro levaduras antagonistas (Trichosporon pullulans, Cryprtococcus laurentii, Rhodotorula glutinis y Pichia membranefaciens), se encontró que fueron efectivas contra importantes patógenos post-cosecha como A. alternata, P. expansum, B. cinerea y R. stolonifer en cerezas almacenadas a 25º C. Sin embargo, a bajas temperaturas y en condiciones de atmósfera controlada se suprimió el crecimiento de T. pullulans y P. membranefaciens (Qin et al., 2004). Pero también se ha encontrado el efecto inverso, ya que en estudios realizados en melocotones para controlar las podredumbres causadas 3. Material y métodos 50 3.1.1.3. Inducción de la actividad β-1,3-glucanasa de P. purpurogenum Para la inducción de la actividad β-1,3-glucanasa de P. purpurogenum se utilizaron los siguientes sustratos: o Paredes celulares en polvo obtenido a partir de M. laxa, M. fructicola, P. expansum, A. alternata y R. stolonifer (epígrafe 2.1.1.2) o Laminarina del alga Laminaria digitata (Sigma-Aldrich, ref. L9634) o Alga deshidratada de Laminaria ochroleuca (adquirida en El Corte Inglés) o Extracto de laminarina en polvo suministrado por la empresa Arvensis Agro S.A. o Glucosa como control. En tubo de PDA inclinado con cultivo de P. purpurogenum se adicionaron 6 mL de Mineral Medium (MM) estéril preparado por nosotros (Arie Geerlof – Helmholtz Center Munich) (Tabla 3.1); posteriormente la superficie del agar fue raspada con un asa de siembra para separar el micelio y las esporas. Tras homogeneizar el tubo en vortex se filtró el líquido a través de 4 capas de gasa estéril y se realizó el recuento del número de esporas mediante microscopio. En todos los casos se obtuvo una concentración de 10 5 esporas/mL. COMPOSICIÓN POR LITRO DE MINERAL MEDIUM Reactivo Cantidad Agua destilada 867 mL Solución de sales M9 100 mL 1M MgSO 4 1 mL 1M CaCl 2 0,3 mL Biotina 1 mL Tiamina 1 mL Solución de oligoelementos 10 mL La composición original del MM, lleva también 20 mL de glucosa al 20%. Sin embargo no fue añadido al medio, ya que lo que se pretendía era que las soluciones enzimáticas utilizaran los distintos extractos secos y no la glucosa como fuente de carbono. Tabla 3.1: Composición por litro de MM. 3. Material y métodos 51 En matraces de 100 mL conteniendo 20 mL de MM estéril se añadieron los extractos secos obtenidos de las paredes celulares y la laminarina del alga L. digitata hasta obtener una concentración final de 0,5 mg/mL. En el caso de L. ochroleuca deshidratada y del extracto de laminarina obtenida por Arvensis Agro S.A. se prepararon concentraciones de 5, 25 y 50 mg/mL. La glucosa se empleó como control a una concentración de 0,5 mg/mL. A continuación, cada matraz se inoculó con 1 mL de la suspensión de esporas de P. purpurogenum, se agitó hasta disolver el extracto seco y se incubó en agitación (50 rpm) durante 10 días a 28º C. Transcurrido este periodo de incubación se filtró el contenido de los matraces a través de papel Whatman nº1 y se guardaron en tubos de centrífuga a 4º C, finalizando así la obtención de las soluciones enzimáticas. 3.1.1.4. Purificación de la suspensión enzimática al 95% con (NH 4 ) 2 SO 4 El objetivo de este paso fue purificar las soluciones enzimáticas obtenidas en el paso anterior, mediante la utilización de sulfato de amonio (NH 4 ) 2 SO 4 . El sulfato de amonio se emplea como floculante y además, como un reactivo de purificación de proteínas ya que precipita las solubles. Un volumen de 10 mL de las soluciones enzimáticas obtenidas a partir de la glucosa, M. laxa, M. fructicola, laminarina (Sigma-Aldrich), L. ochroleuca y extracto de laminarina (Arvensis Agro S.A.) se ajustó al 95% de saturación con (NH 4 ) 2 SO 4 (Larena y Melgarejo, 1996). Se adicionaron 7,29 g de (NH 4 ) 2 SO 4 a los 10 mL de solución enzimática y se homogeneizaron en Vibromatic (300 rpm) durante 2 h a 4º C. Seguidamente se centrifugó a 15.000 g durante 20 min a 4º C. Se eliminó el sobrenadante y se suspendió el pellet en agua destilada estéril agitando de nuevo en Vibromatic (300 rpm) durante 2 h a 4º C. Finalmente se volvió a centrifugar a 30.000 g durante 20 min a 4º C. Las soluciones o los pellets así obtenidos se conservaron a 4º C hasta su uso. 3.1.2. Actividad antifúngica in vitro en medio sólido En este capítulo se testó la capacidad de los compuestos enzimáticos obtenidos anteriormente para la inhibición de M. laxa in vitro. Además, también se evaluó el potencial inhibitorio de estos extractos frente a M. fructicola, P. expansum, A. alternata 3. Material y métodos 52 y R. stolonifer pero sólo en medio sólido. Para ello, se empleó el método de difusión en agar. 3.1.2.1 Método de difusión en agar Este método consiste en depositar un disco de celulosa estéril impregnado con la solución enzimática en una placa de agar PDA previamente inoculada superficialmente con las esporas del moho a testar. Se trata de un método cualitativo que determina la sensibilidad de un microorganismo ante una determinada sustancia y concentración. En función de esta sensibilidad el microorganismo se clasifica como resistente, poco sensible, medianamente sensible o sensible (Davidson y Parish, 1989) (figura 3.1). En la figura 3.2, se representa el protocolo seguido en la realización del método de difusión en agar. Figura 3.1: Tipos de inhibición que se pueden detectar con el método de difusión en agar 3. Material y métodos 53 Se testó la actividad antimicrobiana frente a M. laxa, M. fructicola, P. expansum, A. alternata y R. stolonifer con las soluciones enzimáticas obtenidas a partir de glucosa, M. laxa, M. fructicola, P. expansum, A. alternata y R. stolonifer, laminarina (L. digitata, Sigma-Aldrich), L. ochroleuca deshidratada y extracto de laminarina (Arvensis Agro S.A.) sin purificar y saturadas al 95% con (NH 4 ) 2 SO 4 . Se preparó una suspensión esporal de cada uno de los mohos a testar. Las placas de PDA se inocularon con la suspensión de esporas depositando 0,2 mL en el centro de la placa en el caso de M. laxa y M. fructicola y 0,1 mL para el resto de mohos. Por la misma razón anteriormente expuesta, se decidió en el caso de Monilinia aumentar el volumen del inóculo. Finalmente se colocaron tres o cuatro discos de celulosa estériles por placa impregnados de las soluciones enzimáticas. Las Figura 3.2: Desarrollo esquemático del método de difusión en agar. 3. Material y métodos 54 placas se incubaron en posición invertida y en aerobiosis durante 10 días a 25º C (Imagen 3.3). 3.1.2.2 Método del agar enriquecido con adición de soluciones enzimáticas El agar enriquecido, consiste en añadir al medio de cultivo agarado los nutrientes necesarios para posibilitar el crecimiento de ciertos microorganismos. En el presente proyecto, hablaremos de agar enriquecido con adición de extractos como aquél, al que le añadimos un 0,1% de extracto de levadura y un 0,1% de caseína y además, los extractos o soluciones enzimáticas obtenidos en cada ensayo para establecer su poder antimicrobiano. La figura 2.4 muestra el desarrollo esquemático de éste método. El objetivo principal del enriquecimiento del PDA (PDA-E) es posibilitar la esporulación de M. laxa. Imagen 3.3: Placas de PDA inoculadas con M. laxa y con los discos de celulosa impregnados en las soluciones enzimáticas. 3. Material y métodos 55 En este caso se ensayaron las soluciones enzimáticas o extractos antifúngicos obtenidas a partir de M. laxa, de M. fructicola y de Laminarina (Sigma-Aldrich) que se añadieron a una concentración del 4% (PDA-E+S.E.). Además se incluyó un control negativo (medio enriquecido sin adición de extractos). El estudio se realizó por triplicado. Siembra en botón de M. laxa Una vez solidificado el PDA-E+S.E., se procedió a la siembra de M. laxa. Para ello, se utilizó una placa de PDA con crecimiento manifiesto de M. laxa. Con la ayuda de un bisturí y pinzas estériles, se cortaron pequeños cuadrados de aproximadamente 1 cm 2 , que se situaron en el centro de las placas con el medio PDA-E+S.E.. A continuación, fueron incubadas en oscuridad a 25º C. Figura 3.3: Desarrollo esquemático del método del agar enriquecido con adición de extractos 3. Material y métodos 56 La inhibición del crecimiento del moho respecto al control se evaluó diariamente hasta que en las placas control el microorganismo fitopatógeno ocupaba toda la superficie. 3.1.3. Actividad antifúngica in vitro en medio líquido 3.1.3.1. Medio líquido enriquecido con adición de soluciones enzimáticas En este experiental, se estudió la actividad antifúngica de las soluciones enzimáticas obtenida a partir de M. laxa y de laminarina de Sigma-Aldrich frente a M. laxa, en medio líquido con el fin de facilitar un contacto más íntimo entre extracto y moho. Como medio líquido se utilizó un medio compuesto por un 50% de zumo de melocotón y un 50% de caldo Czapeck a doble concentración enriquecido con un 0,1% de caseína y un 0,1% de extracto de levadura. En lo sucesivo será denominado como ZMCZB-E. Se utilizó este medio, ya que se detectó que M. laxa no producía micelio fértil o conidios en un medio sin zumo añadido. 3.1.3.1.a. Curva de crecimiento de M. laxa En primer lugar y para determinar el día de máximo crecimiento del moho, se realizó una curva de crecimiento de M. laxa en medio ZMCZB-E. Para ello, se emplearon 30 matraces con 50 mL de dicho medio y se inocularon con 1 mL de la suspensión esporal. Cada día y hasta cumplir 15 días de incubación a 25º C, se filtraban 2 matraces a través de papel Whatman nº 4, previamente pesado; posteriormente era desecado en estufa a 80º C durante 48 horas y pesado de nuevo. Las diferencias obtenidas entre el peso del papel antes de ser utilizado y después de la filtración y desecación, nos permitió determinar la curva de crecimiento de M. laxa. (Gráfica 3.1) 3. Material y métodos 57 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Día Peso micelio seco (g) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Día Peso micelio seco (g) Gráfica 3.1: Curva de crecimiento de M. laxa en caldo ZMCZB-E También se realizó la curva de crecimiento de M. fructicola (Gráfica 3.2) Gráfica 3.2: Curva de crecimiento de M. fructicola en caldo ZMCZB-E El crecimiento máximo de P. expansum, A. alternata y R. stolonifer se estableció en 9, 12 y 8 días respectivamente (Venturini, 2004). 3. Material y métodos 58 3.1.3.1.b. Determinación de la actividad antifúngica La determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos enzimáticos se llevó a cabo por duplicado en matraces de 250 mL con un volumen de 50 mL de ZMCZB-E. A los matraces utilizados para el tratamiento, se les añadió 1 ó 2 mL de solución enzimática y 1 mL de solución de esporas de M. laxa. Tras su homogenización, se incubaron a 25º C durante 10 días. Además se incluyeron dos matraces control contaminados con M. laxa, pero sin extracto enzimático. En la imagen 3.5 se puede observar el aspecto de los matraces tras la inoculación y la incubación. Transcurrido el periodo de incubación, se filtró el contenido de todos los matraces (control y tratamientos) a través de papel Whatman nº 4 y se desecó el papel de filtro en estufa a 80º C durante 48 h. Por diferencia de pesada, comparando con los controles, se determinó la actividad antifúngica de cada tratamiento. 3.1.4. Actividad antifúngica in vivo sobre melocotones y brotes de cerezo Tras la determinación de la actividad antimicrobiana in vitro, se testó la actividad de las soluciones enzimáticas in vivo sobre brotes de cerezo y melocotones. El objetivo de estos experimentos era determinar la actividad de los extractos en dos situaciones reales: la infección por M. laxa en árboles frutales (pre-cosecha) y el biodeterioro en frutos ya recolectados (post-cosecha). a b c Imagen 3.5: Imágenes de los matraces inoculados tras la incubación: (a) Control sin tratamiento; (b) Tratamiento con 2 mL sol. enzimática de M. laxa; (c) Tratamiento con 1 mL sol. enzimática de M. laxa. 3. Material y métodos 59 3.1.4.1. Determinación de la actividad antifúngica en melocotones Las soluciones enzimáticas estudiadas fueron las obtenidas a partir del micelio de M. laxa y de la laminarina de Sigma-Aldrich esterilizadas por filtración y saturadas al 95% con (NH 4 ) 2 SO 4 . Todos los tratamientos se testaron por duplicado además de un control positivo contaminado solo con M. laxa (Imagen 3.6). La suspensión esporal de M. laxa se preparó de la misma manera indicada en el apartado 3.1.1.1. La superficie del melocotón a inocular se descontaminó previamente con un hisopo de algodón impregnado en etanol 80%. Se realizaron tres pequeñas incisiones equidistantes en la epidermis próxima a la zona peduncular con una punta de micropipeta estéril de 1 mm de profundidad; en cada uno de ellos se inocularon 10 µl de la suspensión de esporas de M. laxa. Tras mantener los melocotones inoculados durante 2 horas para favorecer la aclimatación esporal, a temperatura ambiente y en cabina de flujo laminar, se aplicó el tratamiento inyectando 15 µl y 45 µl de cada solución enzimática. Los frutos fueron conservados a 20º C durante 10 días, tiempo tras el cual se procedió a registrar el porcentaje de heridas o incisiones infectadas y el diámetro de éstas. Imagen 3.6.. Melocotones inoculados con M. laxa y tratados con los extractos enzimáticos. 3. Material y métodos 66 3.2.2 Obtención de los aceites esenciales En este caso fueron numerosos los ensayos realizados hasta dar con el procedimiento más eficaz. Todos ellos se realizaron con el fruto de aclareo que más abundaba, el melocotón. Tras seleccionar el proceso óptimo, se testó el potencial antimicrobiano del resto de frutos del aclareo. En primer lugar se probó una hidrodestilación empleando grandes cantidades de melocotón triturado, dada la escasa presencia de aceites esenciales en estas matrices alimentarias. Sin embargo, no se consiguió el objetivo propuesto. Ensayo 1 Posteriormente se efectuó una extracción más potente mediante el Soxtec (Soxtec System HT 2, Tecator). Debido a sus dimensiones, la cantidad de muestra a emplear estaba limitada por el vaso que contenía el líquido extractor. Para que el aparato funcionase de manera óptima, la cantidad de líquido a emplear fue estimada en unos 80 mL. En el artículo publicado por Eikani et al. (2012), se indica que para un volumen determinado de líquido, la muestra a emplear es 10 veces menor. Es por ello que se emplearon 8 g de melocotón triturado. Como líquido extractor se emplearon los mencionados 80 mL de hexano. La temperatura de extracción la marcaba la temperatura de ebullición del hexano, la cual se consiguió ajustando la máquina a 118º C. Una vez alcanzado el punto de ebullición, se mantuvo la extracción durante 2 horas. Como resultado se obtuvo una solución compuesta por hexano y el supuesto aceite esencial disuelto en él (Imagen 3.9). 3. Material y métodos 67 Esta solución fue concentrada en Turbovap (Zymark), a unas condiciones de presión de 0,5 bares y temperatura de 45º C durante 30 minutos, hasta eliminar por completo el disolvente, quedando únicamente el aceite esencial. Sin embargo y debido a la viscosidad tan elevada que tenía, era complicado extraerla de los matraces específicos del Turbovap. En principio se trató de recuperar el aceite calentando con agua caliente para reducir la viscosidad. Sin embargo, al tratar de recuperarlo con una pipeta, volvía a solidificar, quedando atrapado en las paredes, e impidiendo su recuperación. Únicamente se consiguió recoger en un vial transparente una sola gota de aceite. El siguiente paso, fue recoger el aceite del matraz del Turbovap con una espátula; pero a pesar de raspar todo lo posible, la mayor parte del aceite aun permanecía pegado en las paredes del matraz y la recuperación era muy escasa. La cantidad que se consiguió recoger se añadió al vial donde previamente guardamos el aceite obtenido en el paso anterior. a b c Imagen 3.9: Imagen completa del Sistema Soxtec HT 2, Tecator (a), aspecto de la solución al comienzo de la extracción del aceite esencial del melocotón (b) y aspecto tras 2 horas de funcionamiento (c). 3. Material y métodos 68 Se decidió entonces aumentar la consistencia del aceite esencial conservándolo a 4º C durante 1 hora. Transcurrido este tiempo, se intentó su recuperación nuevamente por raspado con una espátula, consiguiendo nuevamente cantidades muy escasas y añadiéndolas al mencionado vial de recogida. Todo el “aceite puro” recuperado en las 3 primeras extracciones realizadas, se guardó, como hemos indicado, en el mismo vial obteniendo una cantidad muy discreta de aceite esencial de 0,01 g. Esta cantidad fue resuspendida en 900 µL de agua destilada estéril y Tween 20 al 5%. El aceite así resuspendido se utilizó para determinar su actividad antimicrobiana frente a M. laxa y M. fructicola. Ensayo 2 En una nueva extracción, la recuperación del aceite se hizo nuevamente con espátula al igual que anteriormente. El aceite puro obtenido y guardado en un nuevo vial transparente, se resuspendió en 900 µL de agua destilada estéril y Tween 20 al 5%, tratando de homogenizar con la propia espátula. Antes de testar el nuevo aceite así obtenido, se concentró en baño termostático a 65º C durante 1 hora, tras la cual se hicieron nuevas pruebas de actividad antifúngica frente a M. laxa y M. fructicola, siendo el segundo ensayo. Ensayo 3 En este caso, la recuperación del aceite puro se hizo añadiendo los 900 µL de agua destilada estéril directamente en el matraz del Turbovap y raspando con espátula. De este modo, la recuperación fue ligeramente superior que en ensayos anteriores, puesto que el aceite se separaba más fácilmente de las paredes del matraz. La suspensión se recogió con micropipeta y fue llevada a un nuevo vial transparente. Se introdujo un imán, y se homogeneizó en agitador magnético (BasicMagMix, OVAN) a una temperatura de 50º C durante 15 minutos. Tras su homogeneización, se concentró en baño de termostático a 65º C durante 2 horas. Este aceite se testó frente a M. laxa, M. fructicola, P. expansum, A. alternata y R. stolonifer. 3. Material y métodos 69 Ensayo 4 Para el cuarto ensayo se actuó de la misma manera que en el anterior, con la excepción del tiempo de concentración en baño termostático que se incrementó hasta las 4 horas. Los mohos testados fueron M. laxa y M. fructicola. Ensayo 5 En el quinto ensayo, el procedimiento fue el mismo, pero para estandarizar el proceso, se calcularon las concentraciones finales. En este caso, el aceite permaneció en baño termostático a 65º C hasta que se concentró un 50%. El tiempo de concentración fue de unas 6 horas. Transcurrido dicho tiempo, se hicieron pruebas frente a M. laxa, M. fructicola, P. expansum, A. alternata y R. stolonifer impregnando el disco con 20 µL. Debido a la densidad de la solución obtenida y con el fin de que se difundiera de manera óptima alrededor del disco, se hizo una segunda prueba, sólo frente a M. laxa, e impregnando los discos con 25 µL. En lo sucesivo, los discos serán impregnados con este volumen de aceite esencial. Ensayo 6 Puesto que el rendimiento de la recuperación del aceite seguía siendo escaso, se decidió optar por un nuevo método de recuperación: concentrar en Turbovap hasta una cantidad aproximada de 5 mL. Este volumen fue fácilmente recuperable con una pipeta con la que se vertió el contenido en un vial transparente, donde se concentraría hasta pesada constante mediante un concentrador menos potente que el Turbovap, el Tembloc (Selecta). De este modo, fue posible concentrar directamente sobre el vial, quedando el 100% de aceite extraído en el vial en el que posteriormente se resuspendería. Este último proceso de suspensión se hizo de la misma manera que anteriormente, es decir, añadiendo 900 µL de agua destilada estéril y Tween 20 al 5%. El proceso de homogenización en agitador magnético se realizó a 50º C durante 20 minutos. Posteriormente se concentró en baño termostático a 65º C hasta 3 concentraciones distintas (25, 50 y 75%) y se hicieron pruebas para cada una de ellas. Los microorganismos testados en este ensayo fueron M. laxa y M. fructicola. 3. Material y métodos 70 Este último proceso de extracción, resuspensión y concentración pareció ser el más eficaz, por lo que todas las extracciones posteriores se realizaron de acuerdo al mismo. 3.2.3 Actividad antifúngica in vitro en medio sólido 3.2.3.1 Método de difusión en agar con extractos acuosos y metanólicos Se ha estudiado la actividad antifúngica de los extractos procedentes de los frutos del aclareo frente a los mohos M. laxa, M. fructicola y A. alternata. Este experimento fue realizado en placas de Petri con dos medios agarados distintos: PDA para A. alternata y una mezcla de PDA y zumo de melocotón para M. laxa y M. fructicola, con el objetivo de facilitar su esporulación. Este último medio fue preparado mezclando 50% de PDA a doble concentración, 50% de zumo de melocotón y enriquecido con un 0,1% de extracto de levadura y un 0,1% de caseína (ZMPDA-E). En primer lugar, se preparó una suspensión esporal de cada moho a testar. Las placas con el medio ZMPDA-E fueron sembradas con M. laxa y M. fructicola añadiendo 0,2 mL de dicha suspensión y extendiendo con asa de Drigalski. Las placas con el medio PDA fueron sembradas añadiendo 0,1 mL de la solución de esporas de Alternaria y extendiendo con asa de Drigalski. Una vez sembradas las placas con el correspondiente moho, se procedió a colocar los discos impregnados en los doce extractos obtenidos. Cada tratamiento se realizó por duplicado. Las placas sembradas con A. alternata se incubaron a 28º C durante 7 días y las placas de M. laxa y M. fructicola a 25º C durante 10 días. 3.2.3.2 Método de difusión en agar con aceites esenciales Las placas de PDA se sembraron con 0,2 mL de la suspensión esporal, en el caso de M. laxa y M. fructicola, y 0,1 mL en el caso de P. expansum, R. stolonifer y A. alternata y se extendieron con asa de Drigalski. Una vez inoculadas, se colocó en el 3. Material y métodos 71 centro de la placa un disco de celulosa estéril impregnado en 25 µL del aceite esencial a testar. Las placas se incubaron a 25º C en oscuridad, y se observaron diariamente. 3.2.3.3 Método del agar enriquecido con adición de extractos acuosos y metanólicos Los extractos utilizados fueron los mismos que para el método de difusión en agar. Sin embargo, en base a los resultados obtenidos, se consideró oportuno reducir su número. Finalmente se seleccionaron 5 extractos metanólicos (melocotón, albaricoque, paraguayo, ciruela y cereza) y 2 extractos acuosos (nectarina y ciruela). Además se incluyeron dos controles, el control negativo (agar enriquecido sin extractos) y control con metanol, con el fin de demostrar que no es el metanol el que inhibe el crecimiento del moho. Se realizaron 5 réplicas de cada tratamiento y cada control. Preparación del agar enriquecido con los extractos procedentes de frutos del aclareo. El medio agarado utilizado fue ZMPDA-E. Una vez esterilizado y atemperado, se procedió a añadir el extracto a una concentración final del 4%. Este medio se denominará en lo sucesivo ZMPDA-E+Ex. Siembra en botón de M. laxa Una vez solidificado el agar, se procedió a la siembra de M. laxa. Para ello, se utilizó una placa de PDA con crecimiento manifiesto de M. laxa. Con la ayuda de un bisturí y pinzas estériles, se cortaron pequeños cuadrados de cultivo de aproximadamente 1 cm 2 , que se situaron en el centro de las placas con el medio ZMPDA-E+Ex (Imagen 3.10). Una vez sembradas, fueron incubadas en oscuridad a 25º C. 3. Material y métodos 72 La inhibición del crecimiento del moho respecto al control se evaluó diariamente hasta que en las placas control el microorganismo fitopatógeno ocupaba toda la superficie. Se pudo observar que el agar ZMPDA-E+Ex perdía viabilidad rápidamente (se deshidrataba y resquebrajaba quedando inutilizado a los pocos días). Por tanto, se decidió repetir el experimental con el mismo medio privado del zumo de melocotón PDA-E+Ex. La concentración final del extracto también fue del 4%. 3.2.3.4 Método del agar enriquecido con adición de aceites esenciales Se seleccionaron los aceites que mejores resultados habían dado en el método por difusión en agar (melocotón y cereza). Preparación del agar enriquecido con los extractos procedentes de frutos del aclareo. El medio agarado consistió en PDA enriquecido con un 0,1% de extracto de levadura y 0,1% de caseína (PDA-E), al que se le añadió una concentración del 2% del aceite esencial a testar, quedando el medio denominado como PDA-E+A.E. Al igual que en el ensayo anterior, se sembró M.laxa en botón en el centro de la placa y éstas fueron incubadas a 25º C. El experimento se realizó por duplicado. Imagen 3.10: Siembra en botón de M. laxa sobre medio ZMPDA-E+Ex. 3. Material y métodos 73 3.2.4 Actividad antifúngica in vitro en medio líquido 3.2.4.1. Medio líquido enriquecido con adición de extractos acuosos y metanólicos En esta fase, se valoró la actividad antifúngica de los 12 extractos obtenidos (acuosos y metanólicos) frente a M. laxa, en medio de cultivo líquido que posibilita un contacto más íntimo entre el extracto y el moho. Como medio líquido se utilizó el caldo ZMCZB-E y la suspensión esporal de M. laxa se preparó del mismo modo que en ensayos anteriores. Los tratamientos se llevaron a cabo por duplicado en matraces de 250 mL con un volumen de 50 mL de ZMCZ-E. A aquellos matraces utilizados para el tratamiento, se les añadió 1 mL del extracto y 1 mL de la suspensión esporal de M. laxa y tras su homogeneización, se incubaron a 25º C durante 10 días (Imagen 3.11). Transcurrido ese tiempo, se procedió a su filtración con papel Whatman nº4. Todos los papeles Whatman nº4 se desecaron en estufa a 80º C durante 48 h y por diferencia de pesada, comparando con los controles (caldo ZMZCB-E inoculado con M. laxa sin extracto), se determinó la actividad antifúngica o el porcentaje de inhibición de cada extracto. 3.2.4.2. Medio líquido enriquecido con adición de aceites esenciales Con el mismo objetivo se repitió la experiencia en este caso con los aceites esenciales procedentes de los frutos del aclareo. b a b Imagen 3.11: Matraces con caldo ZMCZB-E inoculados con M. laxa e incubados a 25º C / 10 días; (a): sin adición de extractos (control); (b): con 1 mL de extracto metanólico de melocotón. 3. Material y métodos 74 La escasa cantidad disponible de albaricoque del aclareo, solo permitió llevar a cabo el estudio con aceites esenciales de melocotón y cereza. El medio líquido utilizado fue caldo Czapek enriquecido con un 0,1% de extracto de levadura y un 0,1% de caseína (CZB-E). Los aceites esenciales se añadieron a matraces de 250 mL con un volumen de 50 mL de CZB-E y a una concentración del 2% (CZB-E+A.E.). La metodología seguida fue idéntica a la descrita en el apartado anterior. 3.2.5. Actividad antifúngica in vivo en melocotones Tras la determinación de la actividad antimicrobiana in vitro, se valoró dicha actividad sobre melocotones de calidad comercial. En este caso, se decidió aplicar el aceite esencial procedente de melocotones del aclareo. Los mohos testados en este experimento fueron M. laxa y M. fructicola. La preparación de los inóculos fúngicos y la descontaminación de la superficie de los melocotones, se efectuó como se ha señalado en apartados anteriores. A continuación, se realizaron dos pequeñas incisiones en la epidermis de la zona peduncular con una punta de micropipeta estéril de 1 mm de profundidad. Estas incisiones fueron inoculadas con 15 µL de la suspensión esporal. Tras mantener los melocotones inoculados durante 2 horas a temperatura ambiente y en cabina de flujo laminar para favorecer la implantación del moho, se aplicó el tratamiento inyectando 15 µL de aceite esencial de melocotón en cada incisión. Se dejó también un lote control de melocotones inoculados, pero sin tratamiento con el aceite esencial. Todos los frutos fueron mantenidos en estufa a 25º C y se hizo un seguimiento diario del porcentaje de incisiones infectadas y diámetro de la lesión. 3. Material y métodos 75 3.2.6. Tablas resumen La tabla 3.3 resume los medios empleados, métodos ensayados, extractos acuosos y metanólicos utilizados y mohos testados en este apartado. Las tablas 3.4 y 3.5 resumen todos los ensayos realizados con los aceites esenciales procedentes de frutos del aclareo y su actividad frente a los mohos testados. Tabla 3.3: Tabla resumen de los ensayos realizados para determinar la actividad antifúngica de extractos acuosos y metanólicos procedentes de frutos de aclareo. Medio Método de determinación de la actividad Extracto acuoso (Ac.) o metanólico (Met.) Concentración en el medio Moho testado (inóculo) ENSAYOS IN VITRO Melocotón Ac. − Melocotón Met. − Nectarina Ac. − Nectarina Met. − Albaricoque Ac. − Albaricoque Met. − Paraguayo Ac. − Paraguayo Met. − Ciruela Ac. − Ciruela Met. − Cereza Ac. − Agar PDA Difusión en agar (disco) Cereza Met. − M. laxa M. fructicola A. alternata (suspensión esporal homogeneizada con asa de Drigalski) Melocotón Met. 4% Albaricoque Met. 4% Paraguayo Met. 4% Ciruela Met. 4% Cereza Met. 4% Nectarina Ac. 4% Agar PDA-E+Ex. Adición de extractos en medio sólido Ciruela Ac. 4% M. laxa (botón) Melocotón Met. 2% Albaricoque Met. 2% Paraguayo Met. 2% Ciruela Met. 2% Cereza Met. 2% Nectarina Ac. 2% Caldo ZMCZB-E+Ex. Adición de extractos en medio líquido Ciruela Ac. 2% M. laxa (suspensión esporal) 4. Resultados y discusión 82 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4. Resultados y discusión 83 4.1. ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE ENZIMAS PROCEDENTES DE PENICILLIUM PURPUROGENUM FRENTE A MONILINIA LAXA Y M. FRUCTICOLA 4.1.1. Actividad antifúngica in vitro en medio sólido La actividad antifúngica in vitro de los extractos enzimáticos se determinó en medio sólido empleando el método de difusión en agar y método del agar enriquecido con adición de soluciones enzimáticas. 4.1.1.1 Método de difusión en agar con soluciones enzimáticas Como ya se ha reseñado anteriormente este método nos informa de la existencia o no de sensibilidad por parte del microorganismo ante la sustancia o solución inhibidora. En función del diámetro del halo de inhibición detectado el microorganismo se puede clasificar como resistente, poco sensible, medianamente sensible o sensible. La lectura de estos halos de inhibición se realizó diariamente y en ningún caso se obtuvo inhibición del crecimiento de ninguno de los cinco mohos estudiados. Además, es importante señalar que se observó, en un número elevado de placas, una contaminación, aparentemente bacteriana, alrededor de los discos de celulosa. Por este motivo, y a pesar de que en el artículo de Melgarejo et al. (1996) no se contemplaba este paso, se procedió a esterilizar por filtración todas las soluciones enzimáticas con filtro de jeringa de 0,22 µm. Las soluciones enzimáticas obtenidas a partir de L. ochroleuca y laminarina proporcionada por Arvensis Agro S.A., no pudieron esterilizarse por filtración debido a la inmediata colmatación del filtro. Por tanto, se repitió el experiental en este caso con las soluciones enzimáticas esterilizadas por filtración (las obtenidas a partir de paredes celulares de M. laxa, M. fructicola, P. expansum, A. alternata y R. stolonifer, laminarina Sigma-Aldrich y glucosa). Tampoco se observó ningún halo de inhibición del crecimiento de los mohos estudiados, aunque sí se consiguió eliminar la contaminación alrededor de los discos de celulosa impregnados en la solución enzimática. 4. Resultados y discusión 84 4.1.1.2 Método del agar enriquecido con adición de soluciones enzimáticas En este ensayo se procedió a determinar la inhibición del crecimiento en un medio agarado enriquecido al que se le adicionaba 1 mL de las distintas soluciones enzimáticas. Para determinar la actividad antifúngica se medía el diámetro de las colonias de M. laxa tanto en las placas control como en las placas portadoras de las soluciones enzimáticas. Se ensayaron las soluciones enzimáticas obtenidas a partir de M. laxa, de M. fructicola y de Laminarina (Sigma). En el transcurso de este experimental observamos que en las placas de PDA-E a las que se les había adicionado las soluciones enzimáticas, pero que no habían sido inoculadas con microorganismos, aparecía un crecimiento fúngico en toda la superficie del agar. La razón estaba en que las soluciones enzimáticas no habían sido esterilizadas por filtración. Hubo por tanto que preparar nuevos extractos y someterlo a esterilización por filtración con filtro de jeringa de 0,22 µm. La tabla 4.1 detalla el diámetro colonial de M. laxa tras 16 días de incubación a 25º C. Como muestra la imagen 4.1., no se observó inhibición del crecimiento fúngico para ninguna de las tres soluciones. Sí que es cierto que en la réplica 3 del tratamiento con solución enzimática de M. fructicola podemos observar un menor crecimiento fúngico, pero no fue significativo, puesto que en sus dos réplicas el crecimiento fue total. 4. Resultados y discusión 85 Tabla 4.1: Evolución del diámetro colonial de M. laxa en placas con agar patata dextrosa enriquecido (PDA-E) adicionado o no (control) con diferentes soluciones enzimáticas al 2% e incubadas a 25ºC / 16 días. Diámetro colonial (mm) Día de incubación Control Sol. Enz. M. laxa Sol. Enz. M. fructicola Sol. Enz. Laminarina 5 19,3 ± 3,2 9,0 ± 0,0 11,0 ± 2,6 10,3 ± 0,6 6 22,7 ± 4,0 11,0 ± 1,0 12,7 ± 2,9 12,7 ± 0,6 7 27,0 ± 5,2 15,3 ± 2,5 14,3 ± 4,0 14,3 ± 1,2 8 42,0 ± 22,6 20,7 ± 1,5 21,3 ± 1,5 20,7 ± 0,6 9 36,7 ± 10,2 31,3 ± 1,2 27,3 ± 2,5 28,7 ± 1,5 10 43,7 ± 11,8 42,0 ± 6,1 43,0 ± 8,7 39,0 ± 4,4 12 48,3 ± 14,2 57,0 ± 5,3 50,0 ± 9,5 47,3 ± 4,6 13 51,7 ± 15,3 63,7 ± 5,3 58,0 ± 10,6 55,7 ± 7,5 14 64,7 ± 2,0 70,0 ± 4,4 66,0 ± 14,0 64,0 ± 3,6 15 66,7 ± 1,2 72,3 ± 4,2 74,0 ± 5,3 68,3 ± 3,8 16 68,3 ± 1,2 77,3 ± 2,3 76,7 ± 4,9 73,0 ± 2,0 % inhibición ‒ 0 % 0 % 0 % 4. Resultados y discusión 86 a b c 4.1.2. Actividad antifúngica in vitro en medio líquido 4.1.1.2.1. Medio líquido enriquecido con adición de soluciones enzimáticas A pesar de no detectar ningún efecto inhibidor en medio sólido se procedió a determinar si existía algún tipo de actividad antimicrobiana en medio de cultivo líquido (ZMCZB-E), ya que de esta forma, el contacto de la solución inhibidora con el microorganismo es más íntimo. En este caso únicamente se estudió la actividad antifúngica de la solución enzimática obtenida a partir de M. laxa y de laminarina de Sigma-Aldrich y únicamente frente a M. laxa. La tabla 4.2. nos muestra que el porcentaje de inhibición alcanzado en los ensayos conteniendo 1 mL de la solución enzimática obtenida a partir de laminarina fue del 25%, no mostrando diferencias significativas (p>0,05) frente al control. Sin embargo, sí que fue significativa (p<0,05) la inhibición obtenida con la solución enzimática obtenida a partir de micelio de M. laxa cuya inhibición fue del 35%. Imagen 4.1.: Crecimiento de M. laxa sobre agar patata dextrosa enriquecido (PDA-E) y adicionado con soluciones enzimáticas de M. laxa (a), M. fructicola (b) y Laminarina Sigma (c) tras 16 días de incubación a 25º C 4. Resultados y discusión 87 Tabla 4.2.: Peso del micelio seco obtenido en caldo ZMCZB-E adicionado con diferentes soluciones enzimáticas al 2%, inoculados con M. laxa e incubado a 25º C / 10 días. *Los valores seguidos de la misma letra no presentan diferencias significativas (p > 0,05) Medio Peso micelio seco (g) % inhibición* ZMCZB-E + S.E. Laminarina Sigma 1,5 ± 25 a ZMCZB-E + S.E. M. laxa 1,3 ± 35 b ZMCZB-E (Control) 2,0 ± 0,1 0,0 a Se repitió el ensayo con 1 mL y 2 mL de extractos de las dos soluciones enzimáticas. Sorprendentemente, y a pesar de haber duplicado la concentración, no se observó ningún tipo de inhibición significativa (Tabla 4.3). Además, en las muestras tratadas con 1 mL de solución, se observó un mayor crecimiento del moho que en los controles negativos (Imagen 4.2). Tabla 4.3.: Peso del micelio seco obtenido en caldo ZMCZB-E adicionado con diferentes soluciones enzimáticas al 2 y 4%, inoculados con M. laxa e incubado a 25º C / 10 días. *Los valores seguidos de la misma letra no presentan diferencias significativas (p > 0,05) Medio Volumen tto.(mL) Peso micelio seco (g) % inhibición* 1 1,8 ± 0,0 a ZMCZB-E + S.E. Laminarina Sigma 2 1,7 ± 2,5 a 1 1,9 ± 0,1 0,0 a ZMCZB-E + S.E. M. laxa 2 1,7 ± 0,2 4,9 a ZMCZB-E (Control) 0 1,8 ± 0,1 0,0 a 4. Resultados y discusión 88 d b c Imagen 4.2: Crecimiento de M. laxa en medio líquido enriquecido (ZMCZB-E) adicionado con: soluciones enzimáticas de Laminarina (Sigma-Aldrich) al 4% (1A) y al 2% (1B) (a); solución enzimática de M. laxa al 4% (b) y al 2% (c); y ZMCZB-E (Control) (d) incubado a 25º C / 10 días. La razón de estos valores tan dispares respecto al ensayo anterior, podría ser la pérdida de la actividad enzimática por cuestión de tiempo y de inadecuada conservación. Las soluciones enzimáticas, una vez preparadas fueron empleadas para el primer ensayo y después, fueron guardadas en congelación a -18º C. Para ensayos posteriores, fueron descongeladas, atemperadas y nuevamente congeladas. Estas variaciones constantes de temperaturas pudieron hacer que se perdiera su actividad enzimática, lo que explicaría que incluso con el doble de concentración no consiguiera inhibir el crecimiento fúngico. Por la misma razón se pueden explicar los porcentajes de inhibición nulos en agar enriquecido con adición de las soluciones enzimáticas, puesto que cronológicamente, fue el último ensayo realizado con estas soluciones. a 4. Resultados y discusión 89 4.1.3. Actividad antifúngica in vivo sobre melocotones y brotes de cerezo Se realizaron dos experimentos para determinar la posible aplicación práctica en la lucha contra Monilinia de los extractos enzimáticos obtenidos, una sobre melocotones ya recolectados (aplicación post-cosecha) y otra, en brotes de cerezo (aplicación precosecha). 4.1.3.1. Determinación de la actividad antifúngica en melocotones En la imagen 4.3 se puede observar el aspecto de los melocotones inoculados con la solución de esporas de M. laxa y posteriormente tratados con las soluciones enzimáticas obtenidas con paredes de M. laxa y con laminarina de Sigma tras 3 días de incubación. Diariamente se procedió a la medida del diámetro de la lesión alrededor de la incisión realizada para la inoculación, pero no se observó que ningún tratamiento inhibiera el crecimiento del moho. Imagen 4.3.: Aspecto de melocotones comerciales inoculados con una suspensión esporal de M. laxa. (a): Control; (b): tratados con solución enzimática de Laminarina; (c): tratados con solución enzimática de M. laxa. Incubación a 25º C / 3 días. 4.1.3.2. Determinación de la actividad antifúngica en brotes de cerezo La imagen 4.4 nos muestra el aspecto de los brotes de cerezo, una vez realizada la incisión y la inoculación con M. laxa (izquierda); posteriormente el brote era protegido con papel de aluminio para facilitar el crecimiento del moho (derecha). a b c 4. Resultados y discusión 90 Imagen 4.4. Detalle de la incisión realizada (izquierda) en un brote de cerezo en la que se inoculó una suspensión esporal de M. laxa y de otro brote protegido con papel de aluminio tras la inoculación (derecha). En un principio se estableció una duración del experimento de 4 semanas con una periodicidad de aplicación del tratamiento antifúngico de 2 veces por semana. Sin embargo, a mitad del mismo, se decidió interrumpir la prueba ya que no se detectó crecimiento de M. laxa en ninguno de los brotes inoculados, invalidando por tanto cualquier resultado. Además, debemos tener en cuenta que el objetivo era obtener un tratamiento curativo y no profiláctico. Tras reproducir fielmente los ensayos realizados por Larena y Melgarejo (1993 y 1996), observamos que nuestros resultados difieren totalmente de los suyos. Como ya se ha reseñado anteriormente, es posible que la actividad enzimática de las soluciones obtenidas, hayan perdido su potencial antifúngico debido a frecuentes variaciones de temperaturas. 4.1.5. Determinación de la actividad de las soluciones enzimáticas En base a los malos resultados obtenidos, consideramos oportuno tratar de medir la actividad de las soluciones enzimáticas y compararlas con la actividad medida por Larena y Melgarejo (1996), para saber si el problema está en las propias soluciones, o por el contrario, no tienen efecto alguno sobre el desarrollo fúngico, pese a los resultados de sus estudios. 4. Resultados y discusión 91 Para el cálculo de la actividad se utiliza la ecuación Y = MX + C (Figura 4.1) Donde: Y = actividad malta β-glucanasa (en U/kg de malta) M = pendiente de la recta de calibración X = absorbancia de la reacción a 590 nm C = punto de corte con el eje Y Figura 4.1. Curva estándar de la malta β-glucanasa en Azo barley glucan a pH 4,6 y 30ºC durante 10 min, utilizando 3 ml de solución precipitante A Establecida la recta de calibración, basta con introducir el valor de absorbancia obtenido en la lectura en el espectrofotómetro de la muestra problema, en la siguiente ecuación: Y (U/Kg) = 574 x Absorbancia + 2,5 El resultado obtenido tras la lectura de absorbancia fue 0 en todos los duplicados de las soluciones enzimáticas, a excepción de una réplica de la solución obtenida a partir del micelio de M. laxa, que dio una lectura de 0,0375. Al sustituir este valor en la ecuación mencionada: Y = 574 x 0,0375 + 2,5 = 24,025 U/kg 4. Resultados y discusión 98 a b Imagen 4.8: Placas de PDA inoculadas superficialmente con M. laxa e incubadas a 25º C / 10 días / aerobiosis. (a): Reverso de ambas réplicas y (b): anverso. (c): Detalle de halo de inhibición. Los discos de celulosa fueron impregnados con aceite esencial de melocotón de aclareo. Como conclusión de este último ensayo, parece ser que el duplicar el tiempo de concentración del aceite esencial en baño termostático de 2 a 4 horas no supone un incremento de la actividad antifúngica. Ensayo 5: Aceite esencial obtenido de melocotón de aclareo mediante extracción con Soxtec, concentración en Turbovap, homogeneización en agitador magnético y posterior concentración en baño termostático 65º C hasta reducir su volumen un 50% Microorganismos ensayados: M. laxa, M. fructicola, P. expansum, A. alternata y R. stolonifer Impregnación de los discos de celulosa: se hizo una primera prueba impregnando los discos de celulosa con 20 µL. Debido a la densidad de la solución obtenida y con el fin de que difundiera de manera óptima alrededor del disco, se hizo una segunda prueba, sólo frente a M. laxa e impregnando los discos con 25 µL. c Reverso Anverso 4. Resultados y discusión 99 a b c d Resultados: Solo se observó inhibición frente a M. laxa, aunque los halos no fueron concéntricos. La imagen 4.9. nos muestra el primer ensayo realizado con M. laxa donde el disco se impregnó con 20 µL. Los halos de inhibición en este caso fueron de 14 y 12 mm, respectivamente. La imagen siguiente (4.10) recoge el segundo ensayo con los discos impregnados con 25 µL; en este caso los halos de inhibición fueron de 14 y 13 mm de diámetro. No se encontraron por tanto diferencias entre impregnar los discos con 20 ó con 25 µL. Imagen 4.9: Placas PDA inoculadas superficialmente con M. laxa e incubadas a 25º C / 10 días / aerobiosis. (a): Reverso de ambas réplicas y (b): anverso; (c): detalle halo inhibición réplica 1 y (d): réplica 2. Los discos de celulosa fueron impregnados con 20 µL de aceite esencial de melocotón de aclareo. Anverso Reverso 4. Resultados y discusión 100 a b c d Imagen 4.10: Placas PDA inoculadas superficialmente con M. laxa e incubadas a 25º C / 10 días / aerobiosis. (a): Reverso de ambas réplicas y (b): anverso; (c): detalle halo inhibición réplica 1 y (d): réplica 2. Los discos de celulosa fueron impregnados con 25 µL de aceite esencial de melocotón de aclareo. Hasta ahora, M. laxa es la única especie que ha resultado ser sensible o inhibida por el aceite esencial de melocotón; sí que es cierto, que depende del tipo de extracto (acuoso, metanólico o aceite esencial) y del tipo de extracción y concentración. Por otra parte, el aumentar el volumen de aceite al impregnar los discos, tampoco supuso ninguna mejora en cuanto a la inhibición del crecimiento fúngico. Ensayo 6: Aceite esencial obtenido de melocotón de aclareo mediante extracción con Soxtec, concentración primero con Turbovap, segundo con Tembloc hasta pesada constante, homogeneización con agitador magnético y posterior concentración en baño termostático 65º C hasta un 25, 50 y 75%. Microorganismos ensayados: M. laxa Impregnación de los discos de celulosa: los discos de celulosa (6 mm de diámetro) estériles se impregnaron con 25 µL de aceite. Reverso Anverso 4. Resultados y discusión 101 a b c Resultados: Tres concentraciones de aceite esencial inhibieron el crecimiento de M. laxa alrededor del disco. Los halos no fueron ni muy manifiestos ni muy definidos pero suficientes para considerar la presencia de inhibición. Además podemos observar (Imagen 4.11) que no hay mucha diferencia entre concentrar los aceites al 25% ( halos de 12 y 14 mm de diámetro) o, al 50 % ( 13 y 14 mm de diámetro) o, al 75% (ligeramente mayores con 15 y 17 mm). Imagen 4.11: Placas de PDA inoculadas superficialmente con M. laxa e incubados a 25º C / 7 días / aerobiosis. Los discos fueron impregnados con aceite esencial de melocotón de aclareo concentrado al 25% (a), 50% (b) y 75% (c). Ensayo 7: Aceite esencial obtenido de nectarina de aclareo mediante extracción con Soxtec, concentrado primero con Turbovap, segundo con Tembloc hasta pesada constante, homogeneización con agitador magnético y posterior concentración en baño termostático 65º C hasta un 40%. Microorganismos ensayados y método de siembra: M. laxa, M. fructicola, P. expansum, A. alternata y R. stolonifer Impregnación de los discos de celulosa: los discos de celulosa (6 mm de diámetro) estériles se impregnaron con 25 µL. Resultados: No se aprecia ningún halo de inhibición sobre los microorganismos testados; parece observarse una menor densidad de crecimiento en los ensayos con M. laxa, M. fructicola y R. stolonifer. 4. Resultados y discusión 102 Ensayo 8: Aceite esencial obtenido de nectarina de aclareo mediante extracción con Soxtec, concentrado primero con Turbovap, segundo con Tembloc hasta pesada constante, homogeneización con agitador magnético y posterior concentración en baño termostático 65º C hasta un 25, 50 y 75% Microorganismos ensayados: M. laxa Impregnación de los discos de celulosa: los discos de celulosa (6 mm de diámetro) estériles se impregnaron con 25 µL. Resultados: No se apreció inhibición en ningún caso. Solamente se detectó una menor densidad de crecimiento miceliar de M. laxa para la concentración del 50%. Ensayo 9: Aceite esencial obtenido de paraguayo de aclareo mediante extracción con Soxtec, concentrado primero con Turbovap, segundo con Tembloc hasta pesada constante, homogeneización con agitador magnético y posterior concentración en baño termostático 65º C hasta un 25, 50 y 75% Microorganismos ensayados: M. laxa y M. fructicola Impregnación de los discos de celulosa: los discos de celulosa (6 mm de diámetro) estériles se impregnaron con 25 µL. Resultados: No se aprecia ningún halo de inhibición significativo; solo pudimos distinguir una pequeña zona de inhibición alrededor del disco en el caso de los aceites concentrados al 25% y 50% frente a M. laxa (Imagen 4.12). 4. Resultados y discusión 103 a b Imagen 4.12: Placas PDA inoculadas superficialmente con M. laxa e incubadas a 25º C / 9 días / aerobiosis. Los discos fueron impregnados con aceite esencial de paraguayo de aclareo concentrado al 25% (a) y al 50% (b). Ensayo 10: Aceite esencial obtenido de cereza de aclareo mediante extracción con Soxtec, concentrado primero con Turbovap, segundo con Tembloc hasta pesada constante, homogeneización con agitador magnético y posterior concentración en baño termostático 65º C hasta un 25, 50 y 75% Microorganismos ensayados: M. laxa y M. fructicola Impregnación de los discos de celulosa: los discos de celulosa (6 mm de diámetro) estériles se impregnaron con 25 µL. Resultados: se obtuvieron halos de inhibición frente a ambas especies y con las tres concentraciones de aceite esencial de cereza ensayadas. Los halos de inhibición obtenidos frente a M. laxa, aunque no alcanzan un gran diámetro, son más definidos que los obtenidos hasta ahora con otros aceites esenciales (Imagen 4.13). Los halos correspondientes a la concentración del 25% son de 17 mm para ambas réplicas. Para la concentración del 50% los diámetros medidos fueron de 15 y 13 mm y para la del 75% 15 mm en ambas réplicas. En el caso de M. fructicola la inhibición fue mucho más enérgica con la casi total ausencia de crecimiento miceliar alrededor de los discos (Imagen 4.14). Los diámetros Reverso Anverso 4. Resultados y discusión 104 a b c de los halos fueron de 35 y 24 mm, cuando la concentración del aceite fue del 25%; con la del 50% los halos fueron de 30 y 23 mm; y con la del 75% fueron de 32 y 22 mm. Imagen 4.13: Placas PDA inoculadas superficialmente con M. laxa e incubadas a 25º C / 7 días / aerobiosis. Los discos fueron impregnados con aceite esencial de cereza de aclareo concentrado al 25% (a); al 50% (b); y al 75% (c). Parece ser por tanto que el que determina el grado de inhibición, es el tipo de fruto de aclareo del que procede el aceite y no el grado de concentración. Así como el aceite esencial de melocotón y el de cereza producen inhibición de M. laxa, cuantificada como poco o medianamente sensible, no conseguimos tal efecto con el de paraguayo, considerando el moho como resistente a este aceite esencial. Reverso Anverso 4. Resultados y discusión 105 a b c Imagen 4.14: Placas PDA inoculadas superficialmente con M. fructicola e incubadas a 25º C / 7 días / aerobiosis. Los discos fueron impregnados con aceite esencial de cereza de aclareo concentrado al 25% (a); al 50% (b); y al 75% (c). El aceite esencial de cereza es el único, hasta ahora, que ha conseguido una inhibición significativa del crecimiento miceliar de M. fructicola, considerándola como medianamente sensible frente a este aceite. Ensayo 11: Aceite esencial obtenido de albaricoque de aclareo mediante extracción con Soxtec, concentrado primero con Turbovap, segundo con Tembloc hasta pesada constante, homogeneización con agitador magnético y posterior concentración en baño termostático 65º C hasta un 25, 50 y 75% Microorganismos ensayados y método de siembra: M. laxa y M. fructicola Impregnación de los discos de celulosa: los discos de celulosa (6 mm de diámetro) estériles se impregnaron con 25 µL. Resultados: se obtuvo inhibición del crecimiento en todos los ensayos realizados. En el caso de M. laxa (Imagen 4.15) los halos de inhibición de crecimiento fueron de 14 mm Reverso Anverso 4. Resultados y discusión 106 a b c en ambas réplicas para la concentración del 25%, 16 y 15 mm para el 50% y 12 y 14 para el aceite al 75%. También se observó disminución del crecimiento del micelio de M. fructicola alrededor de los discos para la concentración del 50%, siendo los diámetros medidos de 19 y 21 mm (Imagen 4.16). Imagen 4.15: Placas PDA inoculadas superficialmente con M. laxa e incubadas a 25º C / 7 días / aerobiosis. Los discos fueron impregnados con aceite esencial de albaricoque de aclareo concentrado al 25% (a); al 50% (b); y al 75% (c). En este ensayo se ha podido comprobar claramente cómo el grado de concentración del aceite no ha sido determinante en la inhibición de M. laxa. La mayor concentración, la del 75%, apenas ha mostrado potencial antifúngico, comparado con las concentraciones inferiores. Sin embargo, este hecho, también se podría explicar con que a mayor concentración del aceite esencial, mayor dificultad a la hora de difundir en el medio agarado. Reverso Anverso 4. Resultados y discusión 107 a b c Imagen 4.16: Placas PDA inoculadas superficialmente con M. fructicola e incubadas a 25º C / 7 días / aerobiosis. Los discos fueron impregnados con aceite esencial de albaricoque de aclareo concentrado al 25% (a); al 50% (b); y al 75% (c). También cabe destacar, el retraso en el crecimiento de M. fructicola en el entorno próximo del disco. El ejemplo gráfico más claro, lo encontramos en la concentración del aceite esencial al 50%, puesto que a los 4 días de incubación, solo se observa crecimiento fúngico en la periferia de la placa, es decir, en las zonas más alejadas de la misma. A los 7 días comienza a crecer M. fructicola en zonas más próximas al disco de celulosa (Imagen 4.17). Reverso Anverso Resultados y discusión 114 4.2.1.3. Método del agar enriquecido con adición de extractos acuosos y metanólicos En un primer ensayo se utilizó un medio agarado enriquecido con adición de extractos acuosos y metanólicos, y con zumo de melocotón (ZMPDA-E+Ex.) para facilitar la esporulación del moho. Sin embargo, la inclusión del zumo provocó la rápida deshidratación del medio durante la incubación invalidando los resultados. Un segundo ensayo se realizó con extractos acuosos de ciruela y nectarina y metanólicos de albaricoque, cereza, ciruela, melocotón y paraguayo. El crecimiento fúngico se midió diariamente estando prevista la finalización del ensayo cuando en las placas control el moho alcanzara la periferia de las mismas (85 mm). La imagen 4.21 nos muestra el crecimiento del moho en este ensayo. En la tabla 4.6 se exponen los resultados obtenidos. Como se puede observar en las placas control, el moho no llega a alcanzar la periferia, quedándose estancado en el día 16 con una media de 68,3 mm. En algunos tratamientos el crecimiento fúngico sí que alcanzó la periferia, es decir, los 85 mm de diámetro. No se detectó por tanto ninguna inhibición del crecimiento de M. laxa en este ensayo aunque si observamos que en los primeros días de incubación, el crecimiento fúngico en las placas control fue mayor que en las placas tratadas. Sin embargo, con el paso de los días, el crecimiento de M. laxa en los medios enriquecidos se aceleró, llegando a extenderse completamente. En base a los resultados obtenidos, indicar que no es que se ha generado un efecto antifúngico, sino que parece ser todo lo contrario: la adición de extractos acuosos y metanólicos al medio PDA-E potencia el crecimiento de M. laxa a excepción del extracto metanólico de melocotón. Resultados y discusión 115 Tabla 4.6: Evolución del diámetro colonial de M. laxa sembrada en placas PDA-E de 85 mm de diámetro adicionando extractos acuosos y metanólicos procedentes de frutos de aclareo e incubados a 25º C / 16 días. Diamétro colonial de M. laxa (mm) Tiempo de incubación Control + Control Metanol Albaricoque Metanólico Cereza Metanólico Ciruela Acuoso Ciruela Metanólico Melocotón Metanólico Nectarina Acuoso Paraguayo Metanólico Día 5 19,3 ± 3,2 - 9,3 ± 0,6 8,3 ± 1,5 28 ± 2 9,7 ± 3,8 8,3 ± 0,6 24 ± 1 13 ± 1 Día 6 22,7 ± 4,0 6,7 ± 0,6 12 ± 1 11,7 ± 2,1 38 ± 3 13,3 ± 4,0 10,7 ± 0,6 30,7 ± 2,1 14,7 ± 0,6 Día 7 27 ± 5,2 8,7 ± 0,6 16,3 ± 1,5 13,7 ± 1,5 47 ± 2 17,7 ± 4,6 12 ± 1 36,7 ± 5,0 19 ± 1 Día 8 42 ± 22,6 10,3 ± 0,6 22,3 ± 2,5 13,7 ± 2,9 59 ± 4 23,3 ± 6,6 13,7 ± 1,2 42,3 ± 4,5 24 ± 1 Día 9 36,7 ± 10,2 15 ± 2 29 ± 3 27,3 ± 2,3 67,3 ± 3,2 30,7 ± 10,7 17,3 ± 2,5 46,3 ± 3,1 31 ± 2 Día 10 43,7 ± 11,8 21,3 ± 4,2 39 ± 3 35,7 ± 3,8 72,3 ± 1,2 41 ± 14 23,3 ± 2,3 51,7 ± 6,8 42,3 ± 3,1 Día 12 48,3 ± 14,2 31 ± 8,9 52,3 ± 4,2 50,7 ± 4,0 79,3 ± 3,8 54,7 ± 15,0 32,3 ± 4,0 62 ± 4 58,7 ± 7,1 Día 13 51,7 ± 15,3 37 ± 9,6 60 ± 3,6 60,7 ± 4,6 85 ± 0 65,3 ± 17,1 41,3 ± 7,5 68 ± 7,9 67,3 ± 4,6 Día 14 64,7 ± 2,1 43 ± 12,2 69,7 ± 5,0 71 ± 4 85 ± 0 71 ± 12,2 49 ± 7 71,7 ± 6,4 79,7 ± 3,5 Día 15 66,7 ± 1,2 47,7 ± 13,3 80,3 ± 4,5 80,7 ± 4,4 85 ± 0 78 ± 6,6 57,7 ± 7,2 73,3 ± 5,8 85 ± 0 Día 16 68,3 ± 1,2 52,3 ± 15,3 84 ± 1,7 85 ± 0 85 ± 0 82,7 ± 3,2 67,7 ± 6,4 76, 3 ± 4,9 85 ± 0 % INHIBICIÓN − −− − 23,4 0 0 0 0 1,0 0 0 5. Conclusiones 116 Imagen 4.21: Placas de PDA-E adicionadas de extracto metanólico de paraguayo (a), de metanol (b), y sin extracto ni metanol, inoculadas superficialmente en botón con M. laxa e incubadas a 25º C / 16 días / aerobiosis Al igual que en el método de difusión en agar, los escasos porcentajes de inhibición de obtenidos empleando los extractos acuosos y metanólicos podría deberse a la progresiva volatilización del metanol del medio agarado. De este modo se explicaría el retraso en el crecimiento fúngico los primeros días, y su exponencial desarrollo una vez el metanol se volatilizaba. a) b) c) 5. Conclusiones 117 4.2.3.4. Método del agar enriquecido con adición de aceites esenciales En este caso, al medio agarado enriquecido se le adicionaron aceites esenciales de los dos frutos (cereza y melocotón) que mayor potencial antifúngico habían mostrado en el ensayo de difusión en agar. La tabla 4.7 recoge los diámetros coloniales de M. laxa y M. fructicola durante los 15 días del ensayo. El aceite esencial de cereza no demostró potencial inhibitorio sobre ninguno de los dos mohos. Incluso parece ser que posibilita un crecimiento más rápido de M. laxa ya que este moho alcanza el 100 % de crecimiento en el 10º día, 3 días antes que las placas control la presencia del aceite. Por el contrario, el aceite esencial de melocotón sí que produjo una ligera inhibición ya que mientras los controles en ambas especies alcanzaron su máximo crecimiento (85mm), las placas enriquecidas adicionadas con este aceite consiguiendo como máximo un diámetro de 65 mm para M. laxa y 45,5 mm para M. fructicola (Imagen 4.22). 5. Conclusiones 118 Tabla 4.7: Evolución del diámetro colonial de M. laxa y M. fructicola sembradas superficialmente en botón en placas de PDA-E sin adición (control) o con adición de aceites esenciales de melocotón y cereza de aclareo al 2% e incubadas a 25º C / 15 días. Nuevamente el aceite esencial de melocotón de aclareo produce inhibición en el crecimiento de Monilinia spp. confirmando así, su posible actividad antifúngica. Sin embargo, el aceite esencial de cereza no ha mostrado tales efectos inhibitorios, discrepando así con los resultados obtenidos empleando el método de difusión en agar. Diámetro colonial de Monilinia spp. M. laxa M. fructicola Tiempo de incubación 25º C Control A.E. Melocotón A.E. Cereza Control A.E. Melocotón A.E. Cereza Día 3 10,0 ± 1,4 12,5 ± 0,7 15,0 ± 0 − −− − − − Día 4 15,0 ± 5,7 17,5 ± 0,1 21,5 ± 0,7 − −− − − − Día 5 22,5 ± 12,0 24,5 ± 0,7 29,0 ± 1,4 15,5 ± 0,7 − − Día 6 28,0 ± 14,1 32,5 ± 0,7 38,5 ± 0,7 33,5 ± 0,7 10,0 ± 2,8 15,5 ± 0,7 Día 7 36,0 ± 15,6 40,5 ± 0,7 47,0 ± 1,4 49,0 ± 0 20,0 ± 2,8 30,5 ± 0,7 Día 8 72,5 ± 0,7 60,5 ± 6,4 75,5 ± 0,7 85,0 ± 0 45,5 ± 4,9 74,0 ± 0 Día 9 76,5 ± 2,1 63,5 ± 4,9 83 ± 0 85,0 ± 0 53,5 ± 4,9 81,5 ± 2,1 Día 10 79 ± 1,4 65,0 ± 7,1 85 ± 0 85 ± 0 62,5 ± 3,5 85 ± 0 Día 11 81 ± 1,4 65,0 ± 7,1 85 ± 0 85 ± 0 62,5 ± 3,5 85 ± 0 Día 12 83 ± 0 65,0 ± 7,1 85 ± 0 85 ± 0 62,5 ± 3,5 85 ± 0 Día 13 85 ± 0 65,0 ± 7,1 85 ± 0 85 ± 0 62,5 ± 3,5 85 ± 0 Día 14 85 ± 0 65,0 ± 7,1 85 ± 0 85 ± 0 62,5 ± 3,5 85 ± 0 Día 15 85 ± 0 65,0 ± 7,1 85 ± 0 85 ± 0 62,5 ± 3,5 85 ± 0 % inhibición 0 23,5 0 0 46,5 0 5. Conclusiones 119 Imagen 4.22: Placas de PDA-E sin adición (a, control) o con adición de aceites esenciales de melocotón (b) y cereza (c) al 2% e inoculadas superficialmente en botón con M. fructicola e incubadas a 25º C / 13 días / aerobiosis. 4.2.4. Actividad antifúngica in vitro en medio líquido El siguiente paso, al igual que en el caso de los extractos enzimáticos, fue determinar la actividad antifúngica en medio líquido y favoreciendo así el contacto entre la sustancias inhibidora y el moho. a b c 5. Conclusiones 120 4.2.4.1. Medio líquido enriquecido con adición de extractos acuosos y metanólicos En un primer ensayo se determinó la actividad antifúngica de todos los extractos acuosos y metanólicos añadiendo 1 mL de extracto al medio de cultivo líquido (50 mL). El porcentaje de inhibición obtenido, medido como disminución del peso del extracto seco en comparación con el lote control, se muestra en la tabla 4.8. Tabla 4.8: Inhibición del crecimiento de M. laxa inoculada en medio ZMCZB-E con adición de extractos acuosos y metanólicos procedentes de diferentes frutos de aclareo al 2% y tras incubación a 25º C / 10 días Tratamiento Peso micelio seco (g) % inhibición Melocotón acuoso 1,2 ± 0,6 37,8 Melocotón metanólico 1,2 ± 0,1 42,6 Nectarina acuoso 1,2 ± 0,7 42,1 Nectarina metanólico 1,0 ± 0,3 52,1 Albaricoque acuoso 1,4 ± 0,4 32,2 Albaricoque metanólico 1,0 ± 0,1 49,2 Paraguayo acuoso 1,4 ± 0,2 28,0 Paraguayo metanólico 1,0 ± 0,3 52,2 Ciruela Acuoso 1,2 ± 0,3 42,1 Ciruela Metanólico 0,7 ± 0,1 65,2 Cereza Acuoso 1,4 ± 0,4 27,6 Cereza Metanólico 0,6 ± 0,1 69,2 Control M. laxa 2,0 ± ±± ± 0,3 − −− − Podemos observar que el peso del micelio seco obtenido difiere notablemente de unos extractos a otros. Los extractos que mayor potencial antimicrobiano han sido los extractos metanólicos y especialmente, los de cereza, ciruela, paraguayo y nectarina. En un segundo plano estarían los extractos metanólicos de melocotón y albaricoque y los acuosos de nectarina y ciruela. Al aplicar un análisis de varianza de una vía se comprueba que todos los extractos han producido una inhibición significativa del crecimiento de M. laxa excepto los extractos acuosos de albaricoque, paraguayo y cereza. Aplicando un análisis t-student no se observan diferencias estadísticas (p>0,05) entre la inhibición obtenida por los extractos acuosos frente a los metanólicos. 5. Conclusiones 121 Comparando los resultados obtenidos en este ensayo con los obtenidos en el medio sólido, observamos una discrepancia total entre ambos. La causa en el ensayo en medio sólido, puede residir en la volatilización del metanol del medio agarado, siendo este compuesto, el principal responsable de la inhibición de crecimiento colonial de M. laxa (Control metanol 23,4%). En los ensayos en medio líquido, todos los matraces fueron tapados con papel de aluminio, creando unas condiciones de anaerobiosis, donde no se produjo tal volatilización. Por otra parte, la búsqueda necesaria de un modo de cuantificación en el ensayo en medio líquido (cuantificación por pesada) empleando un caldo de cultivo compuesto por zumo de melocotón natural, puede encaminarnos hacia resultados falsos. Cabe destacar, que en algunos matraces se observó claramente la presencia masiva de crecimiento miceliar sobre la superficie del medio líquido, mientras que en otros, la ausencia era evidente (Imagen 4.23). De este modo, los datos por pesada de papeles de filtro desecados, puede falsear los resultados, ya que el papel puede recoger otros compuestos típicos del zumo de melocotón, y no únicamente el micelio crecido sobre medio líquido. Por tanto, la única manera de determinar si hubo crecimiento miceliar era bajo su observación. 5. Conclusiones 122 La imagen 4.24 muestra el aspecto de los papeles de filtro a través de los cuales se realizó la filtración del contenido de los matraces tras 10 días de incubación. La imagen es suficientemente clara como para apreciar en qué matraces hubo crecimiento fúngico, pese a que los resultados por pesada indicasen lo contrario. Imagen 4.23: Aspecto de matraces con caldo ZMCZBE inoculados con M. laxa y adicionados de distintos extractos de frutos de aclareo e incubados a 25º C / 10 días. (a): ausencia de micelio; (b): ligera presencia de micelio; (c): notable presencia de micelio. a b c 5. Conclusiones 123 Imagen 4.24: Papel de filtro tras haber sido desecado en estufa a 80º C durante 48 horas. (a) Presencia notable de micelio fúngico; (b) ausencia de micelio fúngico seco sobre papel de filtro. 4.2.4.2. Medio líquido enriquecido con adición de aceites esenciales En la tabla 4.9 se detallan los resultados obtenidos en la valoración de la actividad antifúngica en medio líquido de los aceites esenciales obtenidos de frutos de aclareo. Solo se evaluó la eficacia de los dos aceites que mejores resultados habían obtenido en los métodos de determinación de la actividad antifúngica realizados en medio sólido, el aceite esencial de melocotón y el de cereza. En el caso de M. laxa tanto el aceite esencial de cereza como el de melocotón consiguen una inhibición significativa de su crecimiento, con un 36,3 y un 55 %, respectivamente. En M. fructicola, la inhibición generada por el aceite esencial de melocotón es incluso mayor (62%); el aceite esencial de cereza parece no tener efecto alguno (porcentaje de inhibición de 6,9%). a b 5. Conclusiones 130 5. CONCLUSIONES 5. Conclusiones 131 5. CONCLUSIONES PRIMERA Los extractos enzimáticos obtenidos de distintos substratos nutricionales (glucosa, pared celular de diferentes especies de mohos y tres extractos diferentes del alga Laminarina spp.) inoculados con Penicillium purpurogenum no han demostrado actividad antifúngica frente a ninguno de los mohos ensayados (Monilinia laxa y Monilinia fructicola). Solo se detectó una inhibición ligera ( ≈ 25%) del crecimiento de M. laxa en medio líquido, pero que desaparece en ensayos posteriores. SEGUNDA No se han podido reproducir con éxito los estudios de Larena y Melgarejo que demuestran la inactivación de M. laxa por exoenzimas generados por P. purpurogenum, a pesar de haber seguido con detalle todas las instrucciones reseñadas por estos autores y de haber utilizado la misma cepa de P. purpurogenum. TERCERA A pesar del elevado contenido en compuestos fenólicos de los frutos inmaduros del aclareo, sus extractos acuosos y metanólicos carecen de potencial antifúngico frente a Monilinia; incluso parece potenciar su crecimiento. CUARTA Los aceites esenciales obtenidos de diferentes frutos de aclareo (melocotón, nectarina, albaricoque, ciruela y cereza) carecen, en general, de antibiosis frente a Monilinia spp. siguiendo la metodología de difusión en agar. Solamente el procedente de melocotón parece tener cierto efecto, quedando confirmado en ensayos en medio líquido, mostrando una reducción del crecimiento del 55%. QUINTA Cuando la determinación del potencial antifúngico de los aceites esenciales obtenida de frutos de aclareo se lleva a cabo en medios de cultivo líquidos, se evidencia una mayor actividad antimicrobiana. Es probable que el contacto más directo entre esporas fúngicas y aceites esenciales favorezca o potencie la antibiosis de éstos. 5. Conclusiones 132 SEXTA Los aceites esenciales que han presentado un mayor potencial antimicrobiano in vitro han sido los procedentes de melocotón, cereza y albaricoque. Parece ser que dicha actividad antifúngica está más ligada al tipo de fruto que a la concentración. SÉPTIMA Cuando la valoración de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales se traslada a melocotones comerciales, se observa que ninguno de ellos es capaz de inhibir la podredumbre marrón. Quizás el traumatismo tan manifiesto, como son las incisiones efectuadas en la zona calicílica de los melocotones, impide o contrarresta la acción de cualquier agente antimicrobiano. OCTAVA La cepa de Paenibacillus polymyxa utilizada en este estudio ha demostrado un manifiesto potencial antifúngico in vitro frente a M. laxa, pero que no se vió reflejado cuando el estudio se efectuó directamente sobre melocotones. 6. Bibliografía 133 6. BIBLIOGRAFÍA 6. Bibliografía 134 6. BIBLIOGRAFÍA Abbasi, H., Rezaei, K. and Rashidi, L. 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