Repositorio Institucional de Documentos

Trabajo Fin de Máster Inactivación de Escherichia coli presente en aguas de salida de depuradora mediante cloración y procesos de oxidación avanzada Autor/es Sarah Mendiara Co Director/es Rosa Mosteo Abad Escuela de Ingeniería y Arquitectura 2013 Agradecimientos Agradezco a Rosa la ayuda prestada desde el comienzo y las dudas que me ha resuelto en todo el desarrollo de este proyecto. Gracias a todos los compañeros con los que he convivido este tiempo, Noelia, Silvia, José, Jorge, Cistina, Elena, Diego, Soazig… por sus consejos y los buenos ratos pasados en el laboratorio y en los numerosos cafés; también a Carlos, por estar siempre animando el laboratorio de microbiología y por los pequeños descansos entre experimentos, y sobre todo a Pilar, por estar dispuesta en cualquier momento a despejar dudas, enseñar y compartir conocimientos. Quiero agradecer a J. el tiempo y esfuerzo invertido, y especialmente su apoyo, ha sido de gran ayuda. Finalmente, a mi Madre, a mi Padre, a José y a mis Yayos, que me han acompañado y motivado durante todo el transcurso del máster, muchas gracias por todo. Inactivación de Escherichia coli presente en aguas de salida de depuradora mediante cloración y procesos de oxidación avanzada. Resumen El agua es un recurso escaso y debe ser gestionado de una manera eficiente con el objetivo de cubrir la creciente demanda que existe sobre ella. Por ello, para optimizar su uso se está extendiendo la técnica de reutilización de aguas de salida de depuradora con diversos fines. Las aguas residuales después de ser tratadas aún presentan carga microbiológica que puede suponer un riesgo de transmisión de enfermedades, por lo que la legislación ha establecido, entre otros, criterios de calidad microbiológicos que deben ser cumplidos para poder reutilizar el agua. El objetivo del presente trabajo es determinar el poder bactericida de diferentes técnicas aplicables en la regeneración de aguas de salida de depuradora y la influencia del tiempo y dosis del tratamiento sobre el indicador bacteriano Escherichia coli. Las técnicas aplicadas se basan en tratamientos convencionales, como la cloración, y en procesos de oxidación avanzada tales como la ozonización, el sistema peroxona (O3/H2O2), la fotólisis (H2O2/radiación UV/visible), la fotocatálisis (TiO2/ radiación UV/visible) y la fotocatálisis combinada con peróxido de hidrógeno. Además, mediante el estudio de cinéticas de inactivación bacteriana se comparan los resultados de desinfección de Escherichia coli con los obtenidos mediante la aplicación de los mismos tratamientos sobre Enterococcus sp., en el grupo de Investigación, Calidad y Tratamiento de Aguas de la Universidad de Zaragoza. Finalmente, se realiza un estudio económico para evaluar los costes de los procesos de desinfección aplicados en este trabajo. El proceso de cloración fue el más eficaz y rentable económicamente de los tratamientos aplicados, logrando una inactivación de Escherichia coli completa tras 20 minutos de tratamiento con 3,8 mg Cl2· L-1. El aumento de la dosis de cloro a 15 mg Cl2· L-1 aumentó la velocidad de inactivación logrando a los 5 minutos la desinfección de 8,35 unidades logarítmicas. Entre los tratamientos basados en ozono, en 15 minutos se lograron inactivar más de 6 unidades logarítmicas mediante la ozonización y el sistema peroxona con 1,4 mg H2O2· L-1, con consumos de 71,0 y 84,4 mg O3 · L-1 respectivamente. La eficacia del sistema peroxona con 20 mg H2O2· L-1 fue menor, inactivando 3 unidades logarítmicas de Escherichia coli con un consumo de 78,5 mg O3 · L-1. Los modelos de inactivación mostraron una mayor cinética en el sistema peroxona con 1,4 mg H2O2· L-1, siendo su coste económico el menor entre los procesos con ozono estudiados. En los tratamientos basados en radiación UV/visible la adición de H2O2 supuso un aumento en la velocidad de inactivación de Escherichia coli. En los ensayos TiO2/radiación UV/visible se observó un efecto sinérgico mediante la adición de dosis de peróxido de hidrógeno 20 mg H2O2· L-1. Los estudios con radiación UV/visible y 680 mg H2O2· L-1 presentaron valores de inactivación mayores, si bien, la combinación del tratamiento con TiO2 no mostró una mejora significativa en la desinfección. En tratamientos H2O2 /radiación UV/visible es la dosis de H2O2 el principal gasto, que puede disminuirse aumentando el tiempo de tratamiento. La utilización de TiO2 no es rentable. En las mismas condiciones de operación, Escherichia coli presentó una mayor sensibilidad que Enterococcus sp., a excepción del sistema peroxona con 20 mg H2O2· L-1 en los que los parámetros cinéticos fueron similares, debido posiblemente a la interacción entre el H2O2 y el O3 observada solo en el caso de los tratamientos con Escherichia coli. Índice i INDICE GENERAL Índice de Anexos ...................................................................................................................................... ii Índice de Tablas........................................................................................................................................ iii Índice de Figuras...................................................................................................................................... iv 1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................................................. 1 1.1. Contexto: la necesidad de nuevos métodos que garanticen la salubridad para la reutilización del agua ................................................................................................................. 1 1.2. Objetivos ...................................................................................................................................... 2 2. AGUAS RESIDUALES Y CONTROL MICROBIOLÓGICO .................................................................... 3 3. TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN ................................................................................................... 5 3.1. Cloración ..................................................................................................................................... 5 3.2. Procesos de oxidación avanzada ............................................................................................ 6 3.2.1. Tratamientos basados en ozono .................................................................................... 6 3.2.2. Tratamientos basados en radiación UV/visible ............................................................ 7 4. MATERIALES Y METODOLOGÍA ........................................................................................................ 10 4.1. Metodología analítica.............................................................................................................. 10 4.1.1. Análisis de parámetros físico-químicos ........................................................................ 10 4.1.2. Análisis microbiológicos ................................................................................................. 11 4.2. Muestras de agua ..................................................................................................................... 12 4.3. Tratamientos de desinfección aplicados.............................................................................. 14 4.3.1. Cloración ........................................................................................................................ 14 4.3.2. Tratamientos basados en ozono .................................................................................. 15 4.3.3. Tratamientos basados en radiación UV/visible .......................................................... 16 4.4. Tratamientos de datos: modelos cinéticos de inactivación bacteriana .......................... 17 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................................... 19 5.1. Inactivación de Escherichia coli ............................................................................................ 19 5.1.1. Cloración ........................................................................................................................ 19 5.1.2. Tratamientos basados en ozono .................................................................................. 21 5.1.3. Tratamientos basados en radiación UV/visible .......................................................... 23 5.2. Modelización cinética ............................................................................................................. 25 5.2.1. Cloración ........................................................................................................................ 25 5.2.2. Tratamientos basados en ozono .................................................................................. 26 5.2.3. Tratamientos basados en radiación UV/visible .......................................................... 29 5.3. Estudio económico .................................................................................................................. 30 5.3.1. Cloración ........................................................................................................................ 30 Índice ii 5.3.2. Tratamientos basados en ozono .................................................................................. 31 5.3.3. Tratamientos basados en radiación UV/visible .......................................................... 32 6. CONCLUSIONES ................................................................................................................................ 34 7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................... 36 ANEXOS Anexo I. Criterios de calidad del agua reutilizada según sus usos ................................................... 40 Anexo II. Principales agentes etiológicos potencialmente presentes en aguas residuales .......... 46 Anexo III. Metodología de los análisis físico-químicos ......................................................................... 47 III.I. pH ................................................................................................................................................ 47 III.II. Turbidez ....................................................................................................................................... 47 III.III. Conductividad .......................................................................................................................... 47 III.IV. Sólidos en suspensión totales.................................................................................................. 47 III.V. Carbono orgánico total .......................................................................................................... 47 III.VI. Demanda química de oxígeno ............................................................................................. 49 III.VII. Peróxido de hidrógeno .......................................................................................................... 49 III.VIII. Cloro residual .......................................................................................................................... 49 III.IX. Demanda de cloro .................................................................................................................. 49 Anexo IV. Metodología microbiológica ............................................................................................... 51 IV.I. Medios de cultivo ...................................................................................................................... 51 IV.II. Fortificación de muestras ........................................................................................................ 52 IV.III. Tinción gram ............................................................................................................................. 52 IV.IV. Diluciones decimales seriadas .............................................................................................. 54 IV.V. Métodos de siembra ............................................................................................................... 54 Anexo V. Ozonización............................................................................................................................. 56 V.I. Descripción de la instalación de ozonización ........................................................................ 56 V.II. Calibración del ozonizador ...................................................................................................... 56 V.III. Método yodométrico .............................................................................................................. 56 V.IV. Recta de calibrado ................................................................................................................. 57 Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación bacteriana................................................................. 58 VI.I. Descripción de modelos .......................................................................................................... 58 VI.II. Ajuste de datos experimentales e índice de error ............................................................... 61 Anexo VII. Resultados .............................................................................................................................. 64 VII.I. Resultados de inactivación de los tratamientos basados en ozono ................................. 64 VII.II. Modelización cinética ............................................................................................................ 65 Índice iii INDICE DE TABLAS Tabla 1. Características físico-químicas y microbiológicas del efluente de una EDAR ..................... 3 Tabla 2. Composición del agua de alimentación de la planta piloto .............................................. 10 Tabla 3. Equipos utilizados para los análisis microbiológicos y función .............................................. 11 Tabla 4. Composición del agua de alimentación de la planta piloto............................................... 13 Tabla 5. Valores medios de las características físico-químicas del agua de salida de la planta piloto .............................................................................................................................................. 13 Tabla 6. Modelos cinéticos de inactivación bacteriana aplicados ................................................. 18 Tabla 7. Valores de recuento e inactivación de E. coli a diferentes dosis de Cl2 y tiempos de tratamiento. ................................................................................................................................... 19 Tabla 8. Valores de recuento de E. coli y consumo de ozono a diferentes tiempos de tratamiento ......................................................................................................................................................... 21 Tabla 9. Valores de recuento e inactivación de E. coli en tratamientos de 30 minutos con radiación UV/visible ...................................................................................................................... 23 Tabla 10. Valores de recuento e inactivación de E. coli en tratamientos con radiación UV/visible, H2O2 y TiO2 a diferentes tiempos .................................................................................................. 24 Tabla 11. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento de cloración 3,8 mg Cl2·L-1 ............................................................................................................................................... 25 Tabla 12. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento de cloración 15 mg Cl2·L-1 ......................................................................................................................................................... 26 Tabla 13. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento de ozonización. ............. 27 Tabla 14. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento peroxona con 1,4 mg H2O2·L-1 ............................................................................................................................................ 28 Tabla 15. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento peroxona con 20 mg H2O2· L-1 ........................................................................................................................................... 28 Tabla 16. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli en el tratamiento de UV/visible con 680 mg H2O2· L-1 ............... 29 Tabla 17. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento TiO2/radiación UV/visible con 680 mg H2O2· L-1 ..................................................................................................................... 30 Tabla 18. Coste del tratamiento de cloración para inactivar 1 unidad logarítmica de Escherichia coli................................................................................................................................................... 31 Tabla 19. Coste de los tratamientos basados en ozono para inactivar 1 unidad logarítmica de Escherichia coli .............................................................................................................................. 32 Tabla 20. Coste de los tratamientos con radiación UV/visible y valor de inactivación de E. coli tras 30 minutos de tratamiento .................................................................................................... 32 Tabla 21. Coste de los tratamientos con radiación UV/visible, H2O2 y TiO2 para inactivar 1 unidad logarítmica de Escherichia coli .................................................................................................. 33 Índice iv INDICE DE FIGURAS Figura 1. Micrografía de microscopio electrónico de barrido de E. coli .......................................... 4 Figura 2. Mecanismo general de la fotocatálisis ................................................................................. 9 Figura 3. Colonias de E. coli en agar MacConkey ............................................................................ 11 Figura 4. Planta piloto de lodos activos .............................................................................................. 13 Figura 5. Esquema de la instalación de ozonización ........................................................................ 15 Figura 6. Cámara solar Atlas Suntest CPS+/XLS .................................................................................. 16 Figura 7. Espectro solar natural y espectro simulado ........................................................................ 16 Figura 8. Curvas de supervivencia microbiana ................................................................................. 17 Figura 9. Inactivación de E. coli durante tratamientos de cloración con distintas dosis .............. 20 Figura 10. Inactivación de E. coli en los tratamientos de cloración en función al parámetro CT ....................................................................................................................................................... 20 Figura 11. Curvas de supervivencia de E. coli en función del ozono consumido ......................... 22 Figura 12. Curvas de supervivencia de E. coli a diferentes tiempos en tratamientos basados en ozono .......................................................................................................................................... 23 Figura 13. Curvas de supervivencia de E. coli a diferentes tiempos en tratamiento UV/visible y TiO2/UV/visible con 680 mg H2O2 · L-1. ....................................................................................... 24 MEMORIA Introducción 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Contexto: la necesidad de nuevos métodos que garanticen la salubridad para la reutilización del agua. El agua es un recurso natural imprescindible para la vida pero escaso, la cantidad total de agua dulce accesible es menor al 1% (Shiklomanov y Rodda, 2003). En las últimas décadas existe un incremento en su demanda debido al rápido crecimiento de la población mundial, del nivel de vida y de las distintas actividades humanas que a su vez contribuyen a la contaminación de dicho recurso. Por ello existe la necesidad de optimizar los recursos existentes, gestionando el agua de una manera eficiente, siendo la reutilización de aguas de salida de depuradora una alternativa cada vez más extendida. Dicha técnica permite aumentar los recursos hídricos, mejorar la calidad del agua para usos agrícolas, urbanos, industriales, medioambientales y recreativos y, además, asegura una continuidad en la reutilización. La principal preocupación asociada a la reutilización de las aguas residuales tratadas es el potencial de transmisión de enfermedades infecciosas por bacterias patógenas. Este hecho consiste en uno de los principales obstáculos para la recuperación y reutilización del agua (Schaefer et al., 2004) y es por esto que el control microbiológico del agua y su desinfección adquiere una importancia máxima. En España, el Real Decreto 1620/2007 del 7 de diciembre establece el régimen jurídico de la reutilización de las aguas depuradas y diferencia distintas calidades de agua en función de su destino (agrícola, recreativo, urbano, industrial y ambiental). Dependiendo de su uso final, el agua puede ser sometida a diferentes tratamientos de regeneración (tratamientos terciarios) con el objetivo de cumplir la legislación vigente. Entre los parámetros microbiológicos para determinar dicha calidad se encuentra la bacteria Escherichia coli, que actúa como indicadora de la contaminación fecal. Para garantizar la salubridad del agua existen diferentes métodos. Entre estos, la cloración se puede considerar como el método tradicional y más común en la desinfección de aguas (Koivunen y Heinonen-Tanski, 2005). El cloro posee un poder oxidante muy elevado que favorece la destrucción de la materia orgánica y un alto poder germicida con bajo coste. Sin embargo, cada vez es mayor la preocupación por los compuestos organoclorados, como los trihalometanos, formados por la reacción del cloro con la materia orgánica presente en el agua (Rook, 1974) y que resultan dañinos para la salud (Nikolaou et al., 2004). Es por todo esto que se están investigando y desarrollando nuevos métodos que garanticen la salubridad del agua, tales como los procesos de oxidación avanzada. El objetivo de estos procesos es generar especies reactivas del oxígeno, como el radical hidróxilo, con gran capacidad oxidante y germicida, capaces de mineralizar la materia orgánica y eliminar la carga biológica presente en el agua (Glaze et al., 1987). Entre los más utilizados se encuentran la ozonización, el sistema peroxona, la irradiación ultravioleta, la fotocatálisis heterogénea y el proceso Fenton. Para que las técnicas de oxidación avanzada puedan aplicarse como alternativa o tratamiento complementario a la desinfección convencional su eficacia debe ser estudiada permitiendo asegurar que el posterior uso del agua no tenga asociado ningún riesgo patológico. Tratamientos de desinfección 8 La radiación UVA no es suficientemente energética para provocar daños sobre las bases de los ácidos nucleicos, pero sí puede bloquear la cadena de transporte celular (Jagger, 1972). Además, la desinfección se produce por acción fotolítica directa, alterando los componentes moleculares esenciales en sus funciones vitales, y activando sustancias fotosensibles presentes que pueden reaccionar con el oxígeno produciendo especies reactivas en el agua y en el interior de las células (Blanco et al., 2009). Se puede producir un efecto sinérgico en la velocidad de inactivación de bacterias cuando la temperatura supera los 50 °C (Wegelin et al., 1996). En un tratamiento por radiación UV/visible influyen principalmente la intensidad de la radiación, el tiempo de exposición y las características del agua. En general, a mayor intensidad y tiempo de exposición más eficaz es el tratamiento. En cuanto a las características del agua, tiene especial importancia la presencia de partículas que pueden afectar a la eficiencia de desinfección protegiendo a los microorganismos de la radiación y de la dispersión de la luz. Al igual que la turbidez producida por partículas, los agregados de microorganismos pueden ejercer el mismo efecto. Esta técnica no produce subproductos mutagénicos o carcinógenos, y la formación de los subproductos puede considerarse despreciable. Además, los métodos basados en irradiación con luz solar son más baratos al aprovechar la energía del sol, incluso pueden ser muy sencillos y su uso se está extendiendo en países en desarrollo con escasez de agua potable. Radiación solar con H2O2 El proceso H2O2/radiación UV/visible está generando interés en la inactivación de patógenos presentes en el agua debido a la sinergia entre el H2O2 y la radiación solar. La irradiación del H2O2 con fotones de longitud de onda menores a 300 nm produce •OH mediante el proceso de fotolisis (reacción 3.7). H2O2 + → 2 •OH [3.7] La radiación solar que llega a la superficie terrestre no contiene los fotones mencionados, por lo que es ineficiente en la generación de •OH por esta vía. Sin embargo, se logra un efecto bactericida combinado, incluyendo daños sobre los microorganismos asociados al H2O2 por la generación de •OH mediante reacciones Fenton intracelulares debido al contenido natural de hierro y la difusión de H2O2 a través de la membrana (García-Fernández et al., 2012). En general, mayores dosis de H2O2 contribuirán a una mayor inactivación celular. Sin embargo, al igual que en el sistema peroxona, es importante llegar a un compromiso en las concentraciones de peróxido de hidrógeno para evitar su actuación como secuestrador de radicales hidroxilo. Fotocatálisis El catalizador semiconductor más estudiado es el dióxido de titanio (TiO2) por sus características (i.e. alta fotoactividad, bajo coste, estabilidad química y biológica e inocuidad) (Mills et al., 1993). El TiO2 presenta dos zonas electrónicas, la banda de valencia y la banda de conducción, que presentan una alta y baja densidad de electrones respectivamente. Entre ambos niveles existe una diferencia de energía, llamado salto de energía, de 3,2 eV. Cuando el catalizador es irradiado con luz UV a longitudes de onda entre 300 y 390 nm (equivalente al salto de energía) los electrones de la banda de valencia se excitan pasando a la banda de conducción, dejando un hueco en la banda de valencia. De esta forma se generan en la superficie del catalizador estructuras duales electrón-hueco (e-/h+), a partir de ellas se inician reacciones de oxidación y Tratamientos de desinfección 9 Figura 2. Mecanismo general de la fotocatálisis (Robert y Malato, 2003) reducción en su superficie dando lugar a la formación de ROS, como el radical hidroxilo (Figura 2). Se puede producir una recombinación de los pares e-/h+ por lo que es necesario que exista un oxidante que actúe como aceptor de electrones. Las ROS generadas causaran daños celulares y estrés oxidativo. También las partículas de TiO2 tienen vía libre para introducirse en las células dañadas, ya que tienen un tamaño 30 veces inferior, lo que lleva al ataque directo de los componentes intracelulares, acelerando su muerte (Huang et al., 2000). Las mayores ventajas de este POA son que trabaja a presión y temperatura ambiente, la posibilidad de utilizar la luz solar para la irradiación y el bajo coste del catalizador. Sin embargo, presenta desventajas importantes como las dificultades a mayor escala para conseguir alcanzar una radiación uniforme en toda la superficie del catalizador o la necesidad de un tratamiento posterior de separación para recuperar el catalizador en suspensión, lo cual encarece el proceso. Una de las limitaciones del proceso TiO2/radiación UV/visible es la recombinación de los pares e-/h+ que provoca una disminución de la efectividad del proceso. Para inhibir dicho efecto pueden adicionarse oxidantes auxiliares, como el peróxido de hidrógeno, incrementando la concentración de •OH en la superficie del catalizador (Robert y Malato, 2003). La adición de H2O2 en dosis adecuadas aumenta la velocidad de reacción, aumentado la inactivación bacteriana, y permitiendo la utilización de foto-reactores de dimensiones menores reduciendo así el coste del proceso. Sin embargo, este oxidante puede actuar como secuestrador de radicales y un exceso de H2O2 puede formar peroxocompuestos en la superficie del TiO2 perjudicando el proceso fotocatalítico, ya que son menos reactivos (Kositzi et al., 2004). Los mecanismos de desinfección mediante este método incluyen los descritos en la radiación solar, su combinación con el peróxido de hidrógeno y la fotocatálisis. Materiales y metodología 10 4. MATERIALES Y METODOLOGÍA 4.1. Metodología analítica 4.1.1. Análisis de parámetros físico-químicos En la Tabla 2 se presentan los parámetros físico-químicos del agua que se han analizado en el presente proyecto de Máster, así como los métodos analíticos y la instrumentación utilizada. Una información más extensa de estos métodos se encuentra disponible en el Anexo III de este documento. Tabla 2. Instrumentación utilizada para la caracterización de las muestras de agua, metodología, rango de medida y error. Parámetro Método Instrumento Marca y modelo Rango de medida Error pH 4500-HB Standard Methods pH-metro CRISON GLP 21 1-14 ± 0,02 Conductividad UNE-EN-ISO 27888 Conductímetro CRISON Basic 30 0,01 - 19999 µS/cm ± 0,02 µS/cm Turbidez ISO 7027 Turbidímetro HANNA Instruments LP 2000 0-1000 UNT ± 0,5 UNT Sólidos en suspensión totales (SST) 2540D Standard Methods Espectofotómetro Hach LANGE DR 2800 5 – 750 mg/L ± 0,1 mg/L Demanda química de oxígeno (DQO) 410.4 EPA (adaptado) Fotómetro multiparamétrico de sobremesa HANNA instruments HI 83099 0-150 mg/L ± 1 mg/L Reactor de DQO HANNA instruments HI 839800 - - Carbono orgánico total (COT) 5310 B Standard Methods Analizador de COT SHIMADZU TOC-VCSH CT: 0 – 25000 mg/L CI: 0 – 300000 mg/L - H2O2 Colorimétrico Test indicador de peróxidos Merckoquant 0 - 100 mg/L 100-1000 mg/L - Nitrógeno amoniacal (N-NH3) D1426-92 Manual ASTM (adaptado) Fotómetro multiparamétrico de sobremesa HANNA instruments HI 83099 0 – 10 mg/L ±0,05mg/L Demanda de cloro (DC) 5710 B Standard Methods Valoración volumétrica - - - Cloro libre residual Colorimétrico Test indicador de cloro Merckoquant 0 – 500 mg/L - Materiales y metodología 11 4.1.2. Análisis microbiológico Tal y como se ha comentado en los objetivos de este trabajo, el microorganismo objeto de estudio es el indicador de contaminación fecal Escherichia coli. Todo el material utilizado en el análisis microbiológico es esterilizado, con el fin de evitar la posible contaminación por otros organismos. La esterilización se realiza mediante temperaturas de 121 °C y 1 bar de presión durante 15 minutos. Equipos Los equipos utilizados en los análisis microbiológicos se muestran en la Tabla 3. Tabla 3. Equipos utilizados para análisis microbiológicos y función. Instrumento Marca Modelo Funcion Autoclave J.P. Selecta 437-P Esterilización de material Baño termostático J.P. Selecta PRECISTEM 20 L Mantenimiento del medio de cultivo en estado líquido Agitador Vortex Velp Scientifica ZX3 Homogeneización de soluciones en tubos de ensayo Rampa de filtración Millipore Sistema Microfil Siembra por filtración Estufa de cultivo J.P. Selecta INCUDIGIT 36 L Incubación bacteriana Contador de colonias manual Interscience Scan 100 Recuento de colonias bacterianas Mechero bunsen - - Crear ambiente de esterilidad Medio de cultivo Los medios de cultivo son ambientes artificiales diseñados para favorecer el crecimiento microbiano en el laboratorio. Para asegurar el desarrollo óptimo de Escherichia coli se utiliza el agar selectivo MacConkey (Scharlau). Las colonias de E. coli adquieren un color rosa-violeta con un halo turbio alrededor causado por la precipitación de sales biliares consecuencia de una disminución del pH en el medio. En el Anexo IV se describen la composición y preparación del medio de cultivo. Figura 3. Colonias de E. coli en agar MacConkey. Materiales y metodología 12 Métodos de siembra El análisis de E. coli se realiza siguiendo dos procedimientos. El método de filtración por membrana de la Norma Española UNE-EN ISO 9308-1 “Detección y recuento de Escherichia coli y de bacterias coliformes” y el método normalizado de siembra en superficie 9215 C (Clesceri et al., 2005). La elección de uno de los dos métodos depende de la concentración bacteriana presente en la muestra. Así, cuando la población bacteriana no es muy elevada se utiliza el método de filtración por membrana. Sin embargo, cuando la población es significativa se utiliza el método de siembra en superficie. Este último método requiere la realización de diluciones decimales seriadas de la muestra. En el anexo IV se explican detalladamente los métodos de siembra y la preparación de diluciones decimales seriadas. Incubación Las placas sembradas se incuban en la estufa a 42 °C (± 2 °C) durante 24 horas. Para un correcto desarrollo bacteriano las placas se colocan en la estufa invertidas (es decir la tapa haciendo de base), con el fin de evitar que el agua condensada caiga sobre el agar y las bacterias permanezcan fijas en el sustrato. Al finalizar el periodo de incubación se procede a su recuento. Recuento El recuento en placa, o recuento de viables, se basa en la suposición de que cada bacteria crece y se divide para producir una sola colonia. Esto no siempre es cierto porque las bacterias con frecuencia crecen unidas en cadenas o en agrupaciones. Por consiguiente, a menudo una colonia se produce como resultado de segmentos cortos de una cadena o de un agregado bacteriano. Por otro lado, pueden existir células que no sean capaces de formar colonias. Por tanto, para reflejar esta realidad los recuentos en placa se informan como unidades formadoras de colonias (UFC) (Tortora et al, 2007) y los datos de cada tratamiento realizado se expresan en UFC· 100 mL-1. Para un recuento correcto el número de colonias presente en las placas no debe ser muy alto, ya que algunas colonias pueden fusionarse, ni muy bajo para que la cantidad de colonias sea significativa. En el método de filtración se realiza el recuento de placas con 20 -200 UFC, y en el método de siembra en superficie con 30 - 300 UFC (Clesceri et al., 2005). En el caso de no detectar actividad microbiana en la placa sembrada en superficie el valor tomado es 1 UFC· 100 mL -1. El recuento bacteriano se obtiene aplicando la ecuación 4.1, donde Fd es el factor de dilución, que se obtiene realizando la inversa de la dilución de la placa seleccionada. C 100 m C m muestra analizados d 100 m .1 4.2. Muestras de agua Las muestras utilizadas para estudiar los diferentes tratamientos de desinfección se obtienen mediante la depuración de agua residual sintética en una planta piloto de lodos activos a escala de laboratorio ( igura ) situada en el laboratorio del grupo de investigación de “Calidad y Tratamientos de Aguas”, perteneciente al Departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente de la Universidad de Zaragoza. Materiales y metodología 13 El agua a depurar se prepara en el laboratorio adicionando diversos compuestos (Tabla 4), según la Directiva 82/243/CEE del año 1982. Tabla 4. Composición del agua de alimentación de la planta piloto (Directiva 82/243/CEE). Compuesto Glucosa Peptona de carne Extracto de carne Urea (CO(NH2)2) NaCl CaCl2· 2H2O MgSO4· 7 H2O K2HPO4 Concentración (mg/L) 200 160 110 30 7 4 2 28 La planta piloto consta de un reactor biológico con capacidad de 2 litros y un decantador de 3 litros. El agua residual sintética es alimentada a un caudal aproximado de 1 L· h-1 al reactor biológico. A éste se le proporciona oxígeno, mediante aireación constante, necesario para los microorganismos encargadas de la depuración. A su vez, este proceso de aireación homogeneíza los fangos. La reacción general que tiene lugar en el reactor se describe en la ecuación 4.2: Materia orgánica + O2 + nutrientes  CO2 + NH3 + otros productos [4.2] A continuación, el agua pasa al decantador donde sedimentan los fangos; parte de ellos son recirculados al reactor para mantener una concentración adecuada de microorganismos (entre 3000-3500 mg· L-1). El agua clarificada rebosa en la parte superior del decantador y es recogida, contando ya con unas características que simulan al agua tratada en una depuradora convencional (Tabla 5). Tabla 5. Valores medios de las características físico-químicas del agua de salida de la planta piloto. Parámetro Valor pH 7,5 Conductividad 767 µS/cm Turbidez 26,0 UNT Figura 4. Planta piloto de lodos activos Materiales y metodología 14 Parámetro Valor DQO 38,8 mg/L O2 DBO5 19,7 mg/L O2 SST 7,3 mg/L NH3 5,7 mg/L NH4+ Carbono orgánico total 7,2 mg/L Demanda de cloro 39,4 mg/L Cl2 Antes de empezar con los experimentos de desinfección las muestras de agua recogidas a la salida de la depuradora se autoclavan en botellas de vidrio, con el objetivo de eliminar la carga microbiana presente. A continuación, una vez que las muestras se encuentran a temperatura ambiente, se realiza el proceso llamado fortificación, que consiste en aumentar de manera artificial la población bacteriana de una muestra. Para ello, se preparan suspensiones bacterianas concentradas a partir de cultivos puros de Escherichia coli y posteriormente se añaden a las muestras de agua. El procedimiento de fortificación de muestras se encuentra explicado en el anexo IV. En este caso se fortifica hasta una concentración de E. coli de 107 – 108 UFC· 100 mL -1. 4.3. Tratamientos de desinfección aplicados Los tratamientos escogidos coinciden con los estudiados por Valero (2013) para la desinfección de Enterococcus sp., con el objetivo de comparar su eficacia en la inactivación de Escherichia coli. El cálculo de la inactivación bacteriana necesario para evaluar la eficacia de un tratamiento de desinfección se realiza con unidades logarítmicas, utilizando la expresión 4.3, donde Nt es la población que sobrevive a un tiempo determinado y N0 la población inicial. Inactivación bacteriana log10 t 0 . 4.3.1. Cloración Los ensayos de cloración se realizan sobre 300 mL de muestra fortificada en reactores de 600 mL. El desinfectante que se aplica es hipoclorito sódico (NaClO, 5%, Panreac) adicionando a la muestra distintas dosis de cloro (3,8, 15 y 30 mg Cl2· L-1). La dosis de 3,8 mg Cl2· L-1 se corresponde con la demanda de cloro de un agua natural (Lanao, 2012) y la de 30 mg Cl2· L-1 con la demanda de cloro de la muestra utilizada. Durante el tratamiento la muestra clorada se mantiene en agitación a 100 r.p.m. para favorecer su homogeneización. A partir del instante en el que se adiciona el reactivo se toman alícuotas a distintos intervalos (0,5; 1; 3; 5; 10; 20 y 30 minutos) para valorar el efecto del cloro sobre la población de estudio en el tiempo. El cloro residual de las muestras extraídas se neutraliza con tiosulfato sódico (Na2S2O3·5H2O, 99,5%, Panreac) para evitar que el cloro sigua ejerciendo su efecto bactericida sobre las poblaciones supervivientes. El análisis microbiológico se realiza inmediatamente una vez finalizado el experimento. Materiales y metodología 15 4.3.2. Tratamientos basados en ozono Los tratamientos aplicados basados en ozono son la ozonización y el sistema peroxona. En ambos tratamientos el ozono fue generado in situ mediante un ozonizador (Fischer 500). El equipo consta de dos electrodos entre los que se establece un alto voltaje y por los que fluye una corriente de oxígeno puro (Figura 5). En la descarga eléctrica que se produce se consigue descomponer la molécula en oxígeno elemental, estos átomos se combinan con moléculas de oxígeno intactas dando lugar a moléculas de ozono. La descripción completa de la instalación se encuentra en el Anexo V. El flujo de ozono introducido al reactor se mantiene constante (888 mg O3· h-1) y es calculado mediante la calibración del equipo (Anexo V). Todo el ozono producido no llega a consumirse en la reacción, por lo que el exceso debe ser destruido. Para ello se conectan en serie al reactor varios borboteadores con una disolución de yoduro potásico al 2% (Figura 5). El ozono reacciona con el yoduro reduciéndose a oxígeno y el yoduro se oxida a yodo (I2) según la reacción 4.4: O3 + H2O + 2 e-  O2 + 2 OH2 I- + + 2 e-  I2 [4.4] O3 + H2O + 2 I-  O2 + I2 + 2 OHEl ozono no consumido se calcula por valoración con tiosulfato de sodio (método yodométrico) descrito en detalle en el Anexo V. El O3 consumido por la muestra se calcula mediante la ecuación 4.5: O3 consumido = O3 introducido – (O3 no consumido + O3 residual disuelto) [4.5] La cantidad de ozono residual disuelto en la muestra puede ser desestimada, ya que resulta despreciable en comparación con la cantidad de ozono no consumido. Se tratan volúmenes de muestra de 1 L en un reactor de vidrio de 2 L de capacidad a temperatura ambiente. Tanto en la ozonización como en los tratamientos peroxona se realizan análisis microbiológicos a diferentes tiempos: 0,5; 1; 3; 6; 9 y 15 minutos. De esta forma se aplican Figura 5. Esquema de la instalación de ozonización. (1. Oxígeno, 2. Silica gel, 3. Ozonizador, 4. Reactor, 5. Borboteadores). Materiales y metodología 16 distintas dosis a las muestra según el tiempo seleccionado, pudiéndose relacionar la inactivación de E. coli con el ozono consumido por la muestra. En los tratamientos peroxona se añade peróxido de hidrógeno (H2O2, 30% p/v, Panreac) en distintas dosis: 1,4 y 20 mg H2O2· L-1. Tras su adición se procede a la aplicación del ozono de forma inmediata. Las dosis coinciden con las aplicadas por Valero (2013) en aguas residuales para la inactivación de Enterococcus sp. Se añade tiosulfato sódico (99,5%, Panreac) para neutralizar los efectos bactericidas del ozono y el peróxido de hidrógeno. 4.3.3. Tratamientos basados en radiación UV/visible Los métodos estudiados basados en radiación consisten en irradiación con radiación UV/visible, irradiación combinada con H2O2, irradiación catalizada con dióxido de titanio (fotocatálisis) y la fotocatálisis combinada con H2O2. Con el fin de llevar a cabo todos estos métodos se emplea como fuente de irradiación una cámara solar Atlas Suntest CPS+/XLS (Figura 6). La cámara está provista de una lámpara de xenón que emite a longitudes de onda entre 290 y 800 nm. Mediante dos filtros que cubren la lámpara, uno de cuarzo y un filtro adicional de ventana (Xenochrome 320) se consigue una emisión situada entre 320 y 800 nm que comprende las radiaciones UVA y visible, eliminando el rango del UVB, lo que permite simular la radiación solar que alcanza la superficie terrestre, e impide que las radiaciones más energéticas inactiven de forma directa las bacterias (Figura 7). Figura 6. Cámara solar Atlas Suntest CPS+/XLS Figura 7. Espectro solar natural y espectro simulado (a. sin filtro de ventana, b. con filtro de ventana) (Miguel, 2010). Materiales y metodología 17 Para realizar todos los tratamientos basados en radiación UV/visible se colocan 150 mL de muestra en reactores de vidrio de cuarzo de 250 mL. Los reactores se introducen en la cámara solar y se someten a agitación, con el objetivo de homogeneizar y airear la muestra. La intensidad seleccionada de irradiación para los experimentos es de 500 W· m-2, que corresponde al 50% de la intensidad de la radiación solar natural ecuatorial al medio día y utilizada por diversos autores en sus estudios (Miguel, 2010; Lanao, 2012). La temperatura máxima alcanzada en los distintos experimentos es de 37 °C. En el caso de los experimentos realizados con peróxido de hidrógeno se añaden distintas dosis de éste: 1,4; 20; 200 y 680 mg H2O2· L-1 (H2O2, 30% p/v, Panreac), y seguidamente se procede a encender la cámara solar. Una vez finalizado el periodo de irradiación se neutraliza la acción del H2O2 añadiendo catalasa (Sigma Aldrich). Para los ensayos de fotocatálisis se utiliza como catalizador TiO2 comercial en forma de polvo (Degussa P25) en dosis de 1 g· L-1, tal y como aconsejan distintos autores en tratamientos de fotocatálisis (Rincón y Pulgarín, 2003; Cho et al., 2004; Ibarz, 2008). Los experimentos basados en radiación tienen una duración de 30 minutos, excepto en aquellos en los que se utilizaron dosis de 680 mg H2O2· L-1 en los que se realizan análisis microbiológicos a 5, 15, 30 y 45 minutos. 4.4. Tratamiento de datos: modelos cinéticos de inactivación microbiana La microbiología predictiva pretende conocer la respuesta de las poblaciones microbianas a cualquier factor que pueda afectar a su supervivencia, con el fin de desarrollar modelos matemáticos que permitan predecir el ritmo de inactivación de los microorganismos de una población bajo unas condiciones determinadas. Las curvas de supervivencia son gráficas que representan la relación entre la concentración de organismos supervivientes y la población inicial, en escala logarítmica, frente al tiempo. Se utilizan para representar los datos de inactivación bacteriana e interpretarlos (Figura 8). La inactivación puede producirse de forma lineal, pero frecuentemente atiende a curvas convexas, cóncavas o sigmoideas. Figura 8. Curvas de supervivencia microbiana (Gyürek y Finch, 1998) Resultados y discusión 24 Figura 13. Curvas de supervivencia de E. coli a diferentes tiempos en tratamiento UV/visible y TiO2/UV/visible con 680 mg H2O2 · L-1. N0 =4,1·108 UFC· 100 mL-1. Es interesante comprobar el efecto sinérgico de la fotocatálisis con TiO2 al utilizar dosis de 20 mg H2O2· L-1, que se tradujo en una inactivación superior a la suma de ambos tratamientos por separado, logrando la eliminación de 3 unidades logarítmicas, lo que corrobora la importancia de la adición de especies oxidantes en este tipo de tratamientos. En cambio, los resultados obtenidos al aumentar la dosis de peróxido de hidrógeno a 200 mg H2O2 · L-1 no mostraron sinergismo en el proceso de desinfección, que pudo ser provocado por reacciones competitivas entre el reactivo y los radicales hidroxilo (Malato et al., 2009). En la Tabla 10 se presentan los recuentos bacterianos y datos de inactivación en tratamientos de H2O2/radiación UV/visible y TiO2/radiación UV/visible con 680 mg H2O2· L-1 a diferentes tiempos de tratamiento (5, 15, 30 y 45 minutos). Tabla 10. Valores de recuento (Nt) e inactivación de E. coli en tratamientos con radiación UV/visible, H2O2 y TiO2 a diferentes tiempos. UV/vis + 680 mg H2O2/L UV/vis + 680 mg H2O2 + 1 g TiO2/L Tiempo (min) Nt (UFC/100 mL) Log(Nt/N0) Nt (UFC/100 mL) Log(Nt/N0) 0 4,1·108 0 4,1·108 0 5 9·107 -0,66 1,7·107 -1,38 15 6,9·103 -4,77 2,4·104 -4,23 30 <10 -7,61 <10 -7,61 45 0 -8,61 0 -8,61 En los tratamientos con 680 mg H2O2· L-1, los resultados mostraron pocas diferencias al añadir 1 g· L-1 dióxido de titanio. A los 5 minutos de tratamiento, la utilización de TiO2 mejoró la inactivación microbiana en 0,7 log10. Sin embargo, al aumentar el tiempo de tratamiento la disminución de la población en los dos procesos fue similar (Figura 13). En este caso, el aumento a dosis elevadas de peróxido de hidrógeno en la fotocatálisis no provocó una mejora significativa en la desinfección de E. coli. -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 UV/visible + 680 mg H2O2/L TiO2/UV/visible + 680 mg H2O2/L log (Nt/N0) Tiempo (min) Resultados y discusión 25 5.2. Modelización cinética Los resultados obtenidos en los diferentes tratamientos aplicados se analizaron mediante los diferentes modelos cinéticos recogidos en la Tabla 6, con el objetivo de confirmar el efecto de las diferentes condiciones de los ensayos sobre la inactivación de Escherichia coli presente en el agua de salida de depuradora. A su vez, se comparan los resultados con los obtenidos por Valero (2013) mediante los mismos tratamientos para Enterococcus sp. En el Anexo VII se muestran las curvas de inactivación obtenidas para Escherichia coli con los tratamientos estudiados sobre los modelos matemáticos aplicados, y la representación de los valores experimentales obtenidos frente a los estimadas por cada modelo. 5.2.1. Cloración Los modelos cinéticos aplicados en el caso de los tratamientos de cloración son el modelo bifásico, el modelo de Mafart, el modelo de Hom modificado y el modelo de Geeraerd. El modelo de Hom no fue utilizado, ya que no se ajusta a las condiciones experimentales en este tipo de ensayos por considerar que la concentración de desinfectante es constante. En la Tabla 11 se muestran los parámetros cinéticos y el ajuste mediante el coeficiente de determinación (R2) y el error cuadrático medio (ECM) de cada uno de los modelos a los resultados experimentales obtenidos. El índice ECM indicó que el modelo más ajustado a la cinética de inactivación de E. coli fue el de Hom modificado, con un valor de ECM de 0,33. A su vez, el coeficiente de determinación mostró un valor de 0,99. Este modelo asume que la población bacteriana se inactiva a lo largo del tratamiento (k) conforme el desinfectante se va descomponiendo (k’). Tabla 11. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento de cloración 3,8 mg Cl2· L-1. 3,8 mg Cl2/L Modelo bifásico Bacteria p k1(min-1) k2(min-1) ECM R2 Escherichia coli 0,9999595 1,31 0,33 0,57 0,97 Enterococccus sp. 0,9326589 1,35 0,15 0,16 0,98 Modelo de Mafart Bacteria δ p ECM R2 Escherichia coli 0,47 0,53 0,7 0,97 Enterococccus sp. 2,56 0,47 0,14 0,98 Modelo de Hom modificado Bacteria k (min-1) k’(min-1) m n ECM R2 Escherichia coli 0,9 0,6 0,87 0,108 0,33 0,99 Enterococccus sp. 0,634 0,428 0,47 0,001 0,14 0,98 Modelo de Geeraerd Bacteria Kmáx(min-1) SI Log (Nres) ECM R2 Escherichia coli 0,65 - - 1,17 0,89 Resultados y discusión 26 A su vez, el modelo de Hom modificado explicó la cinética de inactivación adecuadamente en el del estudio realizado por Valero (2013) con Enterococcus sp., si bien en la tasa de inactivación mediante cloración presentó valores menores a los de E. coli (0,634 y 0,9 min-1 respectivamente). El modelo de Hom modificado también fue el que mejor describió la inactivación de E. coli al utilizar dosis de cloro de 15 mg Cl2 · L-1 (Tabla 12), mostrando este tratamiento una constante de desinfección mayor que en la cloración con 3,8 mg Cl2· L-1. En el caso de Enterococcus sp., fue el modelo bifásico, reconociendo la existencia de dos poblaciones bacterianas con distinta resistencia al cloro y respondiendo ambas a una cinética de primer orden. Tabla 12. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento de cloración 15 mg Cl2 · L-1. 15 mg Cl2/L Modelo bifásico Bacteria p k1 k2 ECM R2 Escherichia coli 0,999998 0,75 0,19 6,12 0 Enterococccus sp. 0,9999995 1,52 0,11 0,32 0,99 Modelo de Mafart Bacteria δ(min) p ECM R2 Escherichia coli 0,0001 0,17 1,04 0,91 Enterococccus sp. 0,72 0,47 0,99 0,89 Modelo de Hom modificado Bacteria k (min-1) k’(min-1) m n ECM R2 Escherichia coli 1,511 0,297 0,39 0,497 0,21 0,995 Enterococccus sp. 1,450 0,806 0,50 0,002 1,02 0,89 Modelo de Geeraerd Bacteria Kmáx(min-1) SI Log (Nres) ECM R2 Escherichia coli 12,09 - 0,27 0,86 0,94 5.2.2. Tratamientos basados en ozono Los modelos aplicados para los tratamientos con ozono coinciden con los utilizados en el caso de la cloración, sustituyendo el modelo de Hom modificado por el modelo de Hom, ya que el ozono se aplicó de manera constante al reactor a lo largo de los experimentos, por lo que no se produjo una disminución en su concentración. Los valores de los distintos parámetros y del ajuste de los datos obtenidos a los modelos aplicados en la ozonización se presentan en la Tabla 13. En este caso, los mejores ajustes de la cinética de E. coli se obtuvieron en el modelo de Hom y en el de Geeraerd, con valores de ECM aproximados (0,44 y 0,5 respectivamente). El coeficiente de determinación fue ligeramente mayor en el caso del modelo de Geeraerd, que reconoce una fase inicial en forma de hombro (SI, forma convexa) seguida de una desinfección lineal sin fenómeno de cola (Nres). Resultados y discusión 27 Tabla 13. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento de ozonización. Ozonización Modelo bifásico Bacteria p k1(min-1) k2(min-1) ECM R2 Escherichia coli 0 - - - - Enterococccus sp. 1,000000 0,903 0,903 0,50 0,95 Modelo de Mafart Bacteria δ(min) p ECM R2 Escherichia coli 2,90 1,15 0,56 0,97 Enterococccus sp. 3,231 1,18 0,46 0,96 Modelo de Hom Bacteria Kap (mg· min-1· L-1) m ECM R2 Escherichia coli 0,231 1,23 0,44 0,97 Enterococccus sp. 0,249 1,18 0,46 0,96 Modelo de Geeraerd Bacteria Kmáx(min-1) SI Log (Nres) ECM R2 Escherichia coli 1,15 1,87 - 0,5 0,97 Enterococccus sp. 2,23 4,81 - 0,31 0,99 En las Tablas 14 y 15 se muestran los resultados de los parámetros calculados para cada modelo en los dos tratamientos peroxona aplicados. En ambos sistemas los 4 modelos presentaron una buena adecuación a los valores experimentales. Atendiendo al ECM y al R2 el modelo con más ajuste a los datos obtenidos fue el de Hom. El parámetro kap mostró valores superiores en el caso del sistema peroxona 1,4 mg H2O2· L-1, por lo que la cinética de inactivación sobre E. coli fue mayor que en el peroxona 20 mg H2O2· L-1 y que en la ozonización (Kap de 0,538, 0,399 y 0,231 respectivamente). Los resultados del parámetro m en ambos tratamientos peroxona fueron menores a la unidad, visualizándose un efecto cola, generado por una disminución bacteriana más lenta al final del tratamiento. En los dos tratamientos peroxona realizados el modelo de Geeraerd no indicó la presencia de una fase de hombro al comienzo de tratamiento, a diferencia de la ozonización, ni un efecto cola, por lo que quedó simplificado a un modelo de inactivación lineal, con menor ajuste en el caso del sistema peroxona 20 mg H2O2· L-1. El modelo de Mafart también resultó apropiado para describir la cinética de inactivación de este tipo de tratamientos, donde el parámetro δ presentó su mayor valor en el tratamiento peroxona con 20 mg H2O2· L-1. Dicho parámetro informa del tiempo necesario para inactivar una unidad logarítmica, corroborando la menor efectividad de ese sistema al aumentar la dosis de peróxido de hidrógeno. El modelo con mayor ajuste a la cinética de inactivación de Enterococcus sp. en todos los tratamientos con ozono fue el de Geeraerd, que en todos los casos mostró un fenómeno de hombro. Dicho fenómeno puede ser debido a un retraso en la difusión del desinfectante a los puntos bacterianos o una resistencia inicial de la población bacteriana. El parámetro δ en la desinfección por el sistema peroxona con 20 mg H2O2· L-1 fue similar en ambas especies microbianas, ya que en el estudio realizado por Valero (2013) con Enterococcus sp. no se Resultados y discusión 28 observó ninguna interacción entre el ozono y el peróxido de hidrógeno añadido, al contrario que en el caso de E. coli. Tabla 14. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento peroxona con 1,4 mg H2O2· L-1. Peroxona 1,4 mg H2O2/L Modelo bifásico Bacteria p k1(min-1) k2(min-1) ECM R2 Escherichia coli 0,759600 1,76 0,90 0,29 0,99 Enterococccus sp. 1,000000 0,951 0,951 0,53 0,91 Modelo de Mafart Bacteria δ(min) p ECM R2 Escherichia coli 1,84 0,89 0,28 0,99 Enterococccus sp. 3,622 1,34 0,68 0,92 Modelo de Hom Bacteria Kap (mg· min-1· L-1) m ECM R2 Escherichia coli 0,538 0,92 0,22 0,99 Enterococccus sp. 0,178 1,34 0,68 0,92 Modelo de Geeraerd Bacteria Kmáx(min-1) SI Log (Nres) ECM R2 Escherichia coli 0,991 - - 0,28 0,988 Enterococccus sp. 3,01 5,47 - 0,14 0,999 Tabla 15. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento peroxona con 20 mg H2O2· L-1. Peroxona 20 mg H2O2/L Modelo bifásico Bacteria p k1(min-1) k2(min-1) ECM R2 Escherichia coli 0,92362 0,68 0,31 0,14 0,99 Enterococccus sp. 1,00000 0,894 0,894 0,53 0,96 Modelo de Mafart Bacteria δ(min) p ECM R2 Escherichia coli 3,32 0,77 0,14 0,99 Enterococccus sp. 3,354 1,21 0,46 0,96 Modelo de Hom Bacteria Kap(mg· min-1· L-1) m ECM R2 Escherichia coli 0,399 0,77 0,10 0,99 Enterococccus sp. 0,231 1,21 0,46 0,96 Modelo de Geeraerd Bacteria Kmáx(min-1) SI Log (Nres) ECM R2 Escherichia coli 0,48 - - 0,186 0,979 Enterococccus sp. 1,98 4,16 - 0,12 0,999 Resultados y discusión 29 5.2.3. Tratamientos basados en radiación UV/visible Los modelos matemáticos aplicados para explicar la respuesta de inactivación de E. coli en los tratamientos con luz solar simulada son los mismos que los utilizados en los basados en ozono. Los tratamientos utilizados para realizar la modelización cinética son la radiación UV/visible con 680 mg H2O2· L-1 y la fotocatálisis con 680 mg H2O2· L-1, con el fin de realizar la comparación de los resultados obtenidos con los de Valero (2013) sobre Enterococcus sp. Los valores de los distintos parámetros y los ajustes obtenidos a los diferentes modelos se encuentran en las Tablas 16 y 17. Tabla 16. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli en el tratamiento de radiación UV/visible con 680 mg H2O2· L-1. UV/visible + 680 mg H2O2/L Modelo bifásico Bacteria p k1(min-1) k2(min-1) ECM R2 Escherichia coli 0,99997 0,73 0,22 0,92 0,99 Modelo de Mafart Bacteria δ(min) p ECM R2 Escherichia coli 1,69 0,68 1,15 0,96 Modelo de Hom Bacteria Kap (W· min-1· m-2) m ECM R2 Escherichia coli 0,580 0,727 0,63 0,96 Modelo de Geeraerd Bacteria Kmáx(min-1) SI Log (Nres) ECM R2 Escherichia coli 0,64 - 0,16 0,74 0,98 Los modelos que mejor describieron la inactivación provocada por el tratamiento de radiación UV/visible son el de Hom y el de Geeraerd (Tabla 16). El modelo de Hom presentó un valor de m menor a la unidad, lo que permite visualizar el efecto cola. Este efecto también se manifestó en el modelo de Geeraerd, aunque con un valor bajo (0,16 log). A su vez la velocidad de inactivación de E. coli es similar en ambos modelos. El efecto cola puede producirse por la agrupación de microorganismos, por la presencia de subpoblaciones resistentes o por la disminución del desinfectante en la muestra. En el caso de TiO2/radiación UV/visible con dosis de peróxido de hidrógeno de 680 mg H2O2· L-1 se observó que los valores de inactivación de E. coli se ajustaron correctamente al modelo de Geeraerd y al modelo bifásico (Tabla 17). En el caso del modelo de Geeraerd, la constante de inactivación presentó un valor aproximado al del tratamiento en ausencia de catalizador (0,59 min-1). Este modelo también mostró la presencia de una población residual o cola, pero con un valor menor que en el caso anterior, de 0,02 log. El modelo bifásico indicó la posible presencia de dos poblaciones bacterianas, con constantes de inactivación de 0,66 y 0,23 min-1. En el estudio de Enterococcus sp. la inactivación por fotocatálisis se ajustó mejor al modelo de Hom, si bien su cinética fue mucho menor a la obtenida para E. coli. Enterococcus sp. también presentó una curva de inactivación con cola (m<1). Resultados y discusión 30 La adición de dióxido de titanio bajo las condiciones establecidas en los experimentos no mejoró significativamente la cinética de desinfección de las muestras, como se puede observar atendiendo a los valores de las constantes de inactivación y del parámetro δ. Tabla 17. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados y ajuste de los resultados a la inactivación de E. coli y Enterococcus sp. en el tratamiento TiO2/radiación UV/visible con 680 mg H2O2·L-1. UV/visible + 680 mg H2O2 + 1 g TiO2/L Modelo bifásico Bacteria p k1(min-1) k2(min-1) ECM R2 Escherichia coli 0,999969 0,66 0,23 0,37 0,99 Enterococccus sp. 1 0,16 0,16 0,54 0,97 Modelo de Mafart Bacteria δ(min) p ECM R2 Escherichia coli 1,70 0,68 0,74 0,98 Enterococccus sp. 18,87 1,11 0,36 0,98 Modelo de Hom Bacteria Kap (W· min-1· m-2) m ECM R2 Escherichia coli 0,622 0,71 0,40 0,98 Enterococccus sp. 0,037 0,90 0,23 0,98 Modelo de Geeraerd Bacteria Kmáx(min-1) SI Log (Nres) ECM R2 Escherichia coli 0,59 - 0,02 0,23 0,99 5.3. Estudio económico La estimación de los costes económicos de un tratamiento es también un factor importante a la hora de decidir cuál utilizar en un proceso de regeneración de aguas a escala real. Para evaluar de forma precisa la rentabilidad coste-efectividad de un tratamiento se deben tener en cuenta diversos factores: cantidad y calidad de agua a tratar, costes de inversión y operación, configuración del sistema, grado de descontaminación, etc. Con el objetivo de estimar los costes de los distintos tratamientos utilizados en el presente trabajo se consideraron exclusivamente los costes relativos al agente desinfectante aplicado. Para poder compararlos entre sí se calcularon los costes asociados a la desinfección de un ciclo logarítmico, que corresponde a un 90% de inactivación, en 1 m3 de muestra. 5.3.1. Cloración El cálculo de la dosis de cloro necesaria para inactivar una unidad logarítmica de Escherichia coli se realizó considerando el parámetro CT (Figura 10). Según el modelo de Hom modificado, se necesitan 2,44 mg Cl2· min· L-1, utilizando los parámetros de aquel que mostró mayor ajuste al proceso de cloración (dosis de15 mg Cl2· L-1). Fijando un tiempo de tratamiento de 5 minutos, la cantidad de hipoclorito sódico necesaria es de 0,48 mg Cl2· L-1. El reactivo empleado en la cloración es hipoclorito sódico al 15% p/v, con un precio de venta según la empresa Ercros de 97€· Tm-1 (Lanao, 2012). Resultados y discusión 31 Para realizar el cálculo se aplicó la expresión 5.1: Coste aClO € m Dosis Cl2 mg Cl2 ·1000 1 m ·1 aClO 150000 mg Cl2 ·1 15 kg aClO 1 aClO ·97 € 1000 kg aClO 5.1 El coste del tratamiento de cloración se presenta en la Tabla 18. Tabla 18. Coste del tratamiento de cloración para inactivar 1 unidad logarítmica de Escherichia coli. Tratamiento Coste calculado (€/m3) Cloración (0,48 mg Cl2/L) 0,00036 5.3.2. Tratamientos basados en ozono Para la estimación del coste de los diferentes tratamientos basados en ozono se tiene en cuenta el coste del ozono generado (según el tiempo necesario para inactivar 1 unidad logarítmica) y el del peróxido de hidrógeno en el caso de los sistemas peroxona. Para el cálculo del coste del ozono se consideran el consumo de oxígeno realizado en los ensayos y el coste de la electricidad asociado en las condiciones en las que se realizaron los tratamientos (ecuación 5.2). Coste O € m Coste O2 € m Coste electricidad € m 5.2 El precio del oxígeno (5.3) se calculó para un caudal del ozonizador de 50 L O2· h-1, con un coste de 0,025 €· kg-1 O2 (Lucas, 2010). Para valorar el coste energético del proceso (5.4) se estableció un consumo del ozonizador de 12 W· h· g-1 O3 producido (Lucas, 2010), generando 888 mg O3· h-1. El coste de la energía es de 0,1 0728 €· kW-1· h-1 establecido por la empresa Iberdrola (2013). Coste O2 € m Tiempo (min) 1 · 1000 1 m ·50 O2 60 min ·0 001 kg O2 1 O2 ·0 025€ 1 kg O2 5. Coste electricidad € m Tiempo (min) 1 · 1000 1 m ·0 888 g O 60 min ·12 W 1 g O ·0 1 0728 € 1000 W 5. Para la estimación de los costes de los tratamientos peroxona se sumó al coste del ozono el precio del peróxido de hidrógeno en función de las dosis utilizadas (5.5). El precio del mencionado reactivo es de 0’21€ kg-1 H2O2 al 30% p/v, según la empresa suministradora FCM Foret Zaragoza (Lanao, 2012). Coste H2O2 € m Dosis mg H2O2 1 · 1000 1 m ·1 H2O2 00000 mg H2O2 ·1 1 kg H2O2 1 H2O2 ·0 21 € H2O2 1 kg H2O2 5.5 El tiempo necesario para la inactivación de 1 log10 en los tratamientos basados en ozono se obtuvo a partir del modelo de Hom, que fue el que presentó mayor adecuación a la cinética de inactivación de E. coli. En la Tabla 19 se muestran los costes de los distintos tratamientos, entre ellos el sistema peroxona con 1,4 mg H2O2· L-1 es el más económico. Resultados y discusión 32 Tabla 19. Coste de los tratamientos basados en ozono para inactivar 1 unidad logarítmica de Escherichia coli. Tratamiento Tiempo inactivación 1 log (min) Coste O3 (€/m3) Coste H2O2 (€/m3) Coste total (€/m3) Ozonización 3,28 0,1710 - 0,1710 Peroxona 1,4 mg H2O2/L 1,97 0,1036 0,0011 0,1047 Peroxona 20 mg H2O2/L 3,30 0,1721 0,0154 0,1875 5.3.3. Tratamientos basados en radiación UV/visible Los procesos basados en radiación UV/visible fueron configurados para imitar a la luz solar natural, por lo que en el cálculo de los costes asociados a los tratamientos realizados con radiación no se tienen en cuenta los gastos energéticos de la cámara solar, ya que a escala real se realizarían en presencia de luz natural. Por tanto, solo se consideran aquellos costes derivados de la adición de los distintos reactivos. En los experimentos realizados en la presente investigación se utilizaron diferentes dosis de H2O2 y 1 g· L-1 de TiO2 en el caso de los tratamientos de fotocatálisis. En la Tabla 20 se muestran los costes de los distintos tratamientos realizados durante 30 minutos, según las cantidades de reactivo aplicadas en cada uno así como la inactivación de E. coli alcanzada. La estimación del coste del peróxido de hidrógeno se realiza según la expresión 5.5. El coste del dióxido de titanio se calculó mediante la expresión 5.6, con un precio de 1’55 €· kg-1, según la empresa Degussa Ibérica S.A. (Lanao, 2012). Coste TiO2 € m 1 g TiO2 1 · 1000 1 m ·1 55 € 1000 g TiO2 5.6 Tabla 20. Coste de los tratamientos con radiación UV/visible y valor de inactivación de E. coli tras 30 minutos de tratamiento. Tipo de tratamiento UV/vis (t=30 min) Log(Nt/N0) Coste TiO2 (€/m3) Coste H2O2 (€/m3) Coste total (€/m3) Fotólisis -0,31 - - - 1,4 mg H2O2/L -0,46 - 0,0011 0,0011 20 mg H2O2/L -0,67 - 0,0154 0,0154 200 mg H2O2/L -3,78 - 0,1540 0,1540 TiO2* -1,64 1,55 - 1,5500 20 mg H2O2/L + TiO2* -3,06 1,55 0,0154 1,5654 200 mg H2O2/L + TiO2* -5,42 1,55 0,154 1,7400 *[TiO2]= 1g/L El tiempo necesario para inactivar 1 unidad logarítmica en el tratamiento UV/visible con 680 mg H2O2· L-1 según el modelo de Hom fue de 2,22 minutos, y en el caso del tratamiento TiO2/UV/visible con 680 mg H2O2· L-1 se logró en 2,58 minutos atendiendo al modelo de Geeaerd. El coste de los dos procesos se encuentra en la Tabla 21. Resultados y discusión 33 Tabla 21. Coste de los tratamientos con radiación UV/visible, H2O2 y TiO2 para inactivar 1 unidad logarítmica de Escherichia coli. Tratamiento Tiempo inactivación 1 log (min) Coste TiO2 (€/m3) Coste H2O2 (€/m3) Coste total (€/m3) UV/visible + 680 mg H2O2/L 2,2185 - 0,5236 0,5236 UV/visible + 680 mg H2O2 + 1 g TiO2/L 2,5760 1,55 0,5236 2,0736 La combinación de TiO2/UV/visible con 680 mg H2O2· L-1 no sale rentable, ya que la inactivación lograda en las mismas condiciones sin utilizar dióxido de titanio es similar, y este compuesto encarece mucho el proceso. El tratamiento más rentable es la cloración, con un coste 0,000 6 €· m-3. Entre los tratamientos basados en ozono, el sistema peroxona con 1,4 mg H2O2· L-1 es el que tiene menor coste, 0,1047 €· m-3. Sin embargo es muy superior al de la cloración, ya que el precio del peróxido de hidrógeno es mayor al del hipoclorito sódico. Los tratamientos basados en radiación UV/visible tienen la ventaja de utilizar la luz solar natural, por lo que permite ahorrar en costes energéticos. La combinación de la fotocatálisis con dosis bajas de peróxido de hidrógeno mostró buenos resultados de inactivación en tratamientos de 30 minutos, sin embargo, el coste del fotocatalizador provoca que el proceso resulte económicamente excesivo. Pese a que la cloración es el tratamiento de desinfección más barato, debe tenerse en cuenta el daño a la salud que conlleva este tipo de tratamientos. La formación de THM mediante este proceso depende de la materia orgánica presente en el agua, que es mayor en el caso de aguas residuales que las naturales, y su concentración aumenta con la dosis de cloro y el tiempo de exposición (Sun et al., 2005), por ello es importante reducir la dosis y el tiempo de contacto sin perder efectividad en la desinfección. Los tratamientos basados en ozono evitan la formación de THM, especialmente si se favorece la creación de radicales hidroxilo capaces de atacar las sustancias precursoras de los THM, como ocurre en los sistemas peroxona (USEPA, 1999), aunque su coste es más elevado. Anexo I. Criterios de calidad del agua reutilizada 40 ANEXO I. Criterios de calidad del agua reutilizada según sus usos. Tabla I. Criterios de calidad de reutilización de las aguas para usos urbanos. . Anexo I. Criterios de calidad del agua reutilizada 41 Tabla II. Criterios de calidad de reutilización de las aguas para usos agrícolas (1). Anexo I. Criterios de calidad del agua reutilizada 42 Tabla III. Criterios de calidad de reutilización de las aguas para usos agrícolas (2). Anexo I. Criterios de calidad del agua reutilizada 43 Tabla IV. Criterios de calidad de reutilización de las aguas para usos industriales. Anexo I. Criterios de calidad del agua reutilizada 44 Tabla V. Criterios de calidad de reutilización de las aguas para usos recreativos. Anexo I. Criterios de calidad del agua reutilizada 45 Tabla VI. Criterios de calidad de reutilización de las aguas para usos ambientales. Anexo II. Principales agentes etiológicos potencialmente presentes en aguas residuales 46 ANEXO II. Principales agentes etiológicos potencialmente presentes en agua residuales Tabla VII. Principales agentes etiológicos potencialmente presentes en el agua residual y su enfermedad asociada. Agente etiológico Enfermedad asociada Bacterias Aeromonas spp. Gastroenteritis Campylobacter jejuri/coli Gastroenteritis, sindroma de Guillain-Bamé Clostridium perfringens Gangrena gaseosa Escherichia coli Sindrome urémico hemolítico E. coli enteropatogénica Enfermedades respiratorias (legionelosis) Legionella sp. Enfermedades vías respiratorias Mycobacterium avium complex Gastroenteritis Pseudomonas aeruginsa Infecciones en heridas, quemaduras y tracto urinario Salmonella typhi/paratyphi Fiebre tifoidea y paratifoidea Salmonella sp. Gastroenteritis (salmonelosis) Shigella sp. Disenteria bacilar (shigelosis) Vibrio cholera Cólera Yersina enterocolitica Gastroenteritis, septicema (yersinasis) Virus Adenovirus Inespecífica, encefalitis Adenovirus (40 y 41) Gastroenteritis Agente Norwalk Gastroenteritis Astrovirus Gastroenteritis Calicivirus Gastroenteritis Echovirus Meningitis Enterovirus tipo 68-71 Meningoencefalitis Hepatitis A y B Hepatitis Poliovirus Poliomielitis Rotavirus Gastroenteritis, encefalitis Small round virus (SRV) Gastroenteritis Protozoos Acanthamoeba sp. Meningoencefalitis, lesiones en ojos, piel y vías respiratorias Blanditi coli Disenteria (balantidiasis) Cryptosporodium parvum Gastroenteritis (criptosporidiasis) Giardia intestinalis Gastroenteritis (giardiasis) Helmintos Ancylostoma duodenale Anemia, gastroenteritis Schistosoma sp. Esquistosomiasis (bilharziosis) Taenia sp. Teniasis Trichuris trichiura Tricuriosis Ascaris lumbricoides Sindrome Loeffer,s, gastroenteritis (ascariasis) Bibliografía Alcalde L. “Evaluación y gestión del riesgo asociado a la reutilización de aguas naturales”. Tesis doctoral. Universidad de Barcelona, 2012. Anexo III. Metodología de los análisis físico-químicos 47 ANEXO III. Metodología de los análisis físico-químicos III.I. pH El pH es la medida del grado de acidez o alcalinidad de una disolución acuosa y se define como el logaritmo negativo de la concentración de iones H+. Para determinar el pH de las muestras acuosas se utiliza un pH-metro marca CRISON, modelo GLP 21, previamente calibrado con disoluciones tampón de pH 7,00 y 4,01. El método utilizado es el 4500-HB de Standard Methods (Clesceri et al., 2005). III.II. Turbidez La turbidez se define como la reducción de la transparencia de un líquido originada por la presencia de materias sin disolver. Para medir la turbidez se utiliza un turbidímetro marca HANNA Instruments modelo LP 2000, de acuerdo a la norma ISO 7027:1999. Los turbidímetros constan de una fuente de luz para iluminar la muestra y detectores fotoeléctricos que miden la intensidad de la luz dispersada a 90o respecto a la fuente. El procedimiento consiste en medir la intensidad de la radiación dispersada por la muestra a una determinada longitud de onda y compararla con la de la disolución patrón. Los resultados se expresan en unidades nefelométricas de turbidez: UNT. III.III. Conductividad La conductividad es la expresión numérica de la capacidad de un agua para transportar la corriente eléctrica. Indica la concentración total de iones en el agua. Su determinación se realiza utilizando un conductímetro CRISON modelo Basic 30, provisto de una célula de dos electrodos (constante de la célula 1 cm-1) y de acuerdo a la norma UNE-EN ISO 27888:1994 que consiste en introducir la célula en la muestra, agitarla y esperar unos minutos antes de tomar el valor. Los resultados se expresan en mS· cm-1 o en µS· cm-1 según el rango de trabajo. III.IV. Sólidos en suspensión totales (SST) Los sólidos en suspensión totales se analizan mediante un espectrofotómetro de marca Hach Lange, modelo DR 2800. Se empleó el método 2540D de Standard Methods (Clesceri et al., 2005), en el que los sólidos en suspensión totales se miden a 810 nm. III.V. Carbono orgánico total (COT) La medida del Carbono Orgánico Total (COT) sirve para cuantificar la materia orgánica presente en el agua. Se analiza de acuerdo al método 5310B de Standard Methods (Clesceri et al., 2005) utilizando un equipo SHIMADZU, modelo TOC-VCSH (Figura I). Anexo III. Metodología de los análisis físico-químicos 48 Figura I. Analizador de carbono orgánico total SHIMADZU, modelo TOC-VCSH Fundamento del equipo En el agua están presentes dos tipos de carbono: carbono orgánico y carbono inorgánico. El carbono orgánico (COT) corresponde a los compuestos orgánicos, mientras que el carbono inorgánico (CI) se encuentra disuelto en el agua como CO2, o bien en forma de compuestos como los carbonatos y bicarbonatos. Conjuntamente, ambos tipos de carbonos constituyen el carbono total, CT, y por lo tanto cumplen la relación: COT=CT–CI. El equipo utilizado se basa en esta relación para medir el COT. Material y reactivos - Equipo SHIMADZU, modelo TOC-VCSH. - Viales de 50 mL - Unidad de filtración de plástico de 250 mL. - Filtros de 0,45 µm de diámetro de poro. - Ácido fosfórico. - Ácido clorhídrico. - Agua milli-Q. Procedimiento y cálculo Se filtra el agua a analizar utilizando un filtro de 0,45 µm para no obstruir la aguja de inyección de la muestra en el equipo. Una vez filtrada la muestra se introduce en los viales y se programa el equipo con las rectas de calibrado que mejor se ajusten, según los valores esperados de COT. Validación del método La validación del método para la medición de carbono orgánico total (COT) y las rectas de calibrado utilizadas se muestran en la Tabla VIII. Tabla VIII. Validación de la metodología para la medición de COT. Límite de detección Límite de cuantificación Rango de medida Rectas de calibrado Carbono total 1 mg/L 3 mg/L 0-25000 mg/L 0-100 mg/L Carbono inorgánico 1 mg/L 2 mg/L 0-30000 mg/L 0-100 mg/L Anexo III. Metodología de los análisis físico-químicos 49 III.VI. Demanda química de Oxígeno (DQO) La DQO es la cantidad de oxígeno consumido por las especies reductoras presentes en el agua. Este parámetro se determina mediante una adaptación del Método 410.4 EPA, en un fotómetro multiparámetro marca Hanna Instruments, modelo HI 83099. Este método se basa en que los compuestos orgánicos oxidables reducen el ión dicromato (naranja) a ión cromo (III) (verde). Se determina la cantidad de cromo formada, utilizando para ello una lámpara de tungsteno con filtro de interferencia de banda estrecha a 420 nm. III.VII. Peróxido de hidrógeno (H2O2) La concentración de peróxidos se determina semicuantitativamente por comparación colorimétrica mediante un test indicador de peróxidos marca Merckoquant. La peroxidasa transfiere el oxígeno del peróxido a un indicador redox orgánico, formándose un producto de oxidación azul (0 -100 mg· L-1) o amarillo (100-1000 mg· L-1). A continuación, la zona de reacción de la tira de ensayo se compara visualmente con una escala colorimétrica. III.VII. Cloro residual La concentración cloro se determina semicuantitativamente por comparación colorimétrica mediante un test indicador de cloro marca Merckoquant. El cloro oxida un compuesto orgánico presente en las tiras formándose un producto de oxidación violeta. La zona de reacción de la tira de ensayo se compara visualmente con una escala colorimétrica. III.IX. Demanda de cloro La demanda de cloro (DC) se define como la cantidad mínima de cloro que se necesita añadir a la muestra para satisfacer el consumo de desinfección y oxidación de los compuestos presentes. Para determinar este parámetro se utiliza el método estándar 5710 B (Clesceri et al., 2005). El método consiste en adicionar un exceso de cloro (D0) a la muestra y analizar el cloro residual (R) no consumido después de un mínimo de 4 horas, siendo la demanda de cloro (DC) la diferencia de ambos valores en mg·L-1, como indica la ecuación I: DC= D0 – R [I] Para determinar D0 se añaden 5 mL de hipoclorito sódico comercial de 50.000 mg· L-1 Cl2 diluido al 10%, en un frasco de 350 mL con tapón de vidrio y se completa hasta rebose con agua destilada. Del contenido de este frasco se valoran 100 mL en un erlenmeyer con tiosulfato sódico 0,025 N (Na2S2O4·5H2O, 99%, Panreac), incluyendo en el contenido 5 mL de ácido acético (99,8%, Panreac), 1 g de yoduro potásico (99%, Panreac) y 2 mL de almidón (Scharlau) como indicador hasta la desaparición del color. La dosis de cloro exacta suministrada a la muestra se calcula según la ecuación II, donde Vv es el volumen del agente valorante (tiosulfato sódico) consumido en la valoración, N es la normalidad del mismo (0,025 N) y Vm es el volumen de muestra valorado (100 mL). D0 mg Cl2 Vv· · 5 5·1000 Vm II Anexo V. Ozonización 56 ANEXO V. Ozonización V.I. Descripción general de la instalación de ozonización El oxígeno es aportado al ozonizador desde una botella de gas comprimido conectada al equipo. La generación de ozono aumenta con el caudal de oxígeno introducido, por lo que debe regularse el flujo mediante una válvula situada en el frontal del equipo. Entre la botella de gas y el ozonizador, debe colocarse un lecho de sílica gel que por sus propiedades higroscópicas elimine la humedad de la corriente de O2 antes de entrar en el ozonizador. El ozonizador se conecta a un reactor cerrado que funciona en régimen semicontinuo, continuo respecto al gas y discontinuo respecto al líquido. El ozono gas se trasfiere a la muestra por la parte superior del reactor a través de un difusor poroso (O3 introducido) que produce un burbujeo que proporciona agitación a la muestra, favoreciendo el contacto ozono-agua. V.II. Calibración del ozonizador Para conocer la cantidad de ozono que se aplicó en las muestras se realizaron una serie de ensayos a diferentes tiempos, determinándose en cada caso la cantidad de ozono que se genera. Para ello se conectaron dos borboteadotes en serie directamente a la salida del ozonizador conteniendo cada uno 250 mL de KI (Panreac) al 2%. Durante un tiempo fijado, se hace pasar por el ozonizador un caudal de oxígeno de 50 L· h-1, utilizando una potencia de ozonización de 1,5 W y aplicando una presión de oxígeno de 1 bar. V.III. Método yodométrico La cantidad de ozono presente en los borboteadores se calcula por el método yodométrico (Kolthoff y Belcher, 1957). Este método se utiliza tanto en la calibración del equipo para conocer el ozono generado, como en la realización de experimentos con el fin de determinar el ozono no consumido. El método yodométrico consiste en tomar muestras de la disolución de KI de los borboteadotes para cada tiempo y proceder a su valoración con tiosulfato sódico. Cuando el ozono reacciona con el yoduro, el ozono se reduce a oxígeno y el yoduro se oxida a yodo (I2). La cantidad de ozono producida corresponde estequiométricamente con la cantidad de yodo generada en la disolución de KI. El procedimiento analítico consiste en la valoración del yodo formado con una disolución de tiosulfato sódico (Na2S2O3·5H2O, 99,5%, Panreac). Se añaden entre 5 y 10 mL de ácido sulfúrico 1N, ya que se requiere medio ácido para la valoración. Se comienza a valorar hasta que el color pardo rojizo que aparece como consecuencia del I2 formado se torna amarillo pálido. En ese momento se añade el indicador de almidón, puesto que si se añadiera a la muestra inicial, en la que la cantidad de yodo es muy superior, se formaría un complejo que impediría valorar el yodo correctamente. Al añadir el almidón, aparece un color morado que vira a incoloro al alcanzarse el punto de equivalencia. La cantidad de ozono, en mg, se calcula según la ecuación V, donde V es el volumen del agente valorante consumido (tiosulfato sódico), N es la normalidad del tiosulfato sódico (0,025N), V’ es el volumen de yoduro potásico utilizado en la valoración, y 24, el peso equivalente del ozono. Si se trabaja con borboteadores en serie, la cantidad de ozono total es la suma de los mg de O3 retenidos por cada uno de ellos. Anexo V. Ozonización 57 Figura VII. Recta de calibrado del ozonizador mg O V· ·250 V · 2 V El agente valorante, tiosulfato sódico, al no ser patrón primario, se debe estandarizar con dicromato potásico para determinar exactamente su concentración (Clesceri et al., 2005). Para ello, se toman 80 mL de agua destilada a la que se añade 1 mL de H2SO4 96%, 1 g de KI y 10 mL de K2Cr2O7 0,1 N. Esta mezcla debe permanecer 6 minutos en oscuridad antes de ser valorada con la disolución de tiosulfato que se va a estandarizar. Igualmente, se valora hasta que el color pardo rojizo pasa a amarillo y tras la adición del almidón, se valora hasta la desaparición del color morado. La normalidad real del tiosulfato sódico se calcula según la ecuación VI. a2S2O 1 m a2S2O VI V.IV. Recta de calibrado En la Figura VII se muestra la recta obtenida del calibrado del ozonizador, que representa el ozono generado en mg en función del tiempo de tratamiento. y = 15,087x - 1,6444 R² = 0,9997 0 50 100 150 200 250 0 2 4 6 8 10 12 14 16 O3 generado (mg) Tiempo (min) Bibliografía - Clesceri L.S., Eaton A.D., Rice E.W. “Standard Methods for the examination of Water and Wastewater”. 21ª edición. APHA, AWWA, WE , 2005. - Kolthoff I. M., Belc er R. “Volumetric analysis III”. Ed. ew York: Interscience, 1957. Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación bacteriana 58 ANEXO VI. Modelos cinéticos de inactivación bacteriana VI.I. Descripción de modelos La microbiología predictiva es una parte esencial de la microbiología que pretende conocer la respuesta de las poblaciones microbianas frente a diversas condiciones ambientales o tratamientos. Su objetivo es desarrollar modelos matemáticos que describan y permitan predecir el ritmo de inactivación de los microorganismos de una determinada población, sometidos a condiciones tecnológicas o medioambientales determinadas. Este estudio de investigación se centra en los modelos de inactivación, modelos que estudian el ritmo de mortandad de las poblaciones bacterianas a lo largo de un proceso. La inactivación bacteriana en aguas ha sido bastante estudiada en la última década aplicando una gran variedad de modelos cinéticos de desinfección (Lee y Nam, 2002). Mediante la modelización cinética se consigue obtener una expresión matemática que facilite el diseño adecuado de un sistema de desinfección. Durante la mayor parte del siglo XX, en los sistemas de desinfección, solía emplearse un exceso de desinfectante para cumplir así con los requisitos de calidad del agua exigidos. Sin embargo, en la actualidad, se considera que el diseño óptimo y el funcionamiento correcto de un sistema de desinfección exigen el desarrollo previo de modelos cinéticos que puedan ser fácilmente incorporados a las distintas configuraciones de los reactores que se emplean en el campo del tratamiento de aguas. Los modelos cinéticos desarrollados en la literatura tratan de representar la acción de un desinfectante y su particular modo de actuación sobre los microorganismos presentes en el agua, bajo las condiciones específicas del sistema que se estudia. En 1908 Chick formula la primera cinética de inactivación de primer orden para la modelización de las gráficas de inactivación lineales. Con ella intenta explicar el proceso de desinfección como si de una reacción química se tratara. Considera que este proceso es análogo a una reacción química de primer orden en la que la velocidad de la reacción depende de las concentraciones relativas del desinfectante y los microorganismos, estando el desinfectante en exceso. Este modelo se expresa mediante la ecuación VII donde Nt es el número de bacterias supervivientes en el instante t, N0 es el número de bacterias inicial (t=0) y k es la constante de velocidad de la reacción. Nk dt dN ·  tk N N Ln t 0 [VII] En el mismo año Watson (1908) incluye una modificación al modelo de Chick, incorporando el efecto de la concentración del desinfectante en el proceso de desinfección. El modelo de Chick-Watson se representa por la ecuación VIII, donde C es la concentración del desinfectante y n es el número de moléculas de desinfectante necesarias para la inactivación microbiana, también descrito como coeficiente de dilución, un factor empírico que suele considerarse la unidad (Pernitsky et al., 1995). NCk dt dN ··  tCk N N Ln n t 0 [VIII] Estas cinéticas sencillas asumen que todos los microorganismos de la población presentan la misma sensibilidad al agente letal por lo que, cuando se representa su inactivación frente al tiempo de tratamiento, bajo una intensidad constante, se obtiene una línea recta. Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación bacteriana 59 Sin embargo, estos modelos lineales no permiten explicar desviaciones observadas en muchos procesos de inactivación microbiana, como se refleja en la Figura VIII. La curva de inactivación A representa la cinética de primer orden o muerte exponencial, en la que la velocidad de inactivación es constante e independiente del tiempo de tratamiento. La curva B muestra un hombro inicial (shoulder) o fase “lag” en la que una fracción de microorganismos supervivientes se mantiene constante en los primeros instantes del tratamiento, produciéndose seguidamente un descenso lineal de los mismos. Se atribuye a una mezcla inadecuada del desinfectante en la muestra, un retraso en la difusión del desinfectante a los puntos de acción bacterianos o a una resistencia inicial de los microorganismos al ataque del desinfectante. Las curvas C se caracterizan por una fase de inactivación lineal inicial rápida seguida de una disminución de las poblaciones lenta, lo que se traduce en la formación de una cola o tailing-off (Gyürék y Finch, 1998). Del mismo modo que en el fenómeno de los hombros, existen varias teorías acerca de la aparición de colas. Puede ser debido a agrupaciones de microorganismos, a la presencia de subpoblaciones con una resistencia variable al desinfectante, bien de carácter innato o como respuesta a una adaptación al medio, o también, a que se produzca una disminución en la concentración del desinfectante durante el tratamiento. Finalmente, las curvas D presentan ambas desviaciones lineales, mostrando una fase inicial de hombro seguida de una fase lineal de inactivación y finalizando con un fenómeno de cola (curvas sigmoideas). A partir de estas teorías se desarrollan cinéticas alternativas que permiten describir curvas de supervivencia no lineales y que han sido aplicados por numerosos autores para describir el comportamiento de diversos microorganismos en el campo de la desinfección. La Tabla 6 de la memoria recoge los modelos matemáticos utilizados para describir las gráficas de inactivación obtenidas en el presente trabajo de investigación. La selección de estos modelos se realiza en base al principio de parsimonia según el cual los modelos han de ser tan simples como sea posible, es decir, con el menor número de parámetros posible (Lanao, 2012). La bondad del ajuste puede mejorar en gran medida añadiendo más parámetros al modelo; sin embargo, en ocasiones, aumentar mucho el número de parámetros puede llevar a que las predicciones no tengan sentido. Figura VIII. Curvas de supervivencia microbiana (Gyürek y Finch, 1998) Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación bacteriana 60 A continuación se desarrollan con más detalle cada uno de los modelos matemáticos seleccionados. VI.I.i. Modelo de Hom (1972) Hom, tras analizar los resultados de diversos experimentos de cloración sobre sistemas algalesbacterianos y observar que respondían a cinéticas curvilíneas más que a lineales, generalizó de manera empírica la ley de Chick-Watson mediante la ecuación IX, donde k es la constante de velocidad de inactivación de primer orden, C es la concentración del desinfectante, n el coeficiente de dilución y m una constante empírica del modelo (Pernitsky et al., 1995). En el caso de que la concentración sea constante, el modelo se simplifica integrándose esta concentración en una constante de velocidad aparente (kap= k· Cn) dando lugar a la ecuación X, siendo esta kap una constante de pseudo-primer orden (min-1) (Malato et al., 2009). Este modelo no considera que el agua tenga una demanda de desinfectante y por tanto, que la concentración del mismo disminuya a lo largo del tratamiento. 1mn tNCmk dt dN    mn ttCk N N Log  0 [IX] m ap ttk N N Log  0 [X] El nivel de inactivación predicho por el modelo de Hom es una función no lineal de C y t, que dependen de los parámetros del modelo n y m, respectivamente. Este modelo puede describir las curvas A-D de la Figura VIII y se simplifica al modelo Chick-Watson para m=1. Cuando m es menor que la unidad, se visualiza un efecto de cola. VI.I.ii. Modelo de Hom modificado (1994) Años más tarde, Haas y Joffe en 1994 modifican el modelo de Hom estableciendo que la concentración del desinfectante puede cambiar con el tiempo, debido a la demanda de los microorganismos o de otros componentes presentes en el agua. Si la descomposición del desinfectante residual es de primer orden, como frecuentemente se observa para la descomposición del cloro y ozono, se establece una relación entre la concentración residual y el tiempo según la ecuación XI donde C0 es la concentración inicial y k, la constante de velocidad de descomposición del desinfectante (min-1). tk eCC ' 0   [XI] A partir de las ecuaciones IX y XI, se obtiene el modelo de Hom modificado, ecuación XII. Este modelo añade una constante al modelo de Hom, k, considerando la demanda del desinfectante por parte de la muestra. m m tnk n m teCk nk m N N Log                     ' 0 0 1 ' [XII] VI.I.iii. Modelo bifásico de Pruitt y Kamau (1993) En 1993, Pruitt y Kamau establecen un modelo bifásico basado en la existencia de dos poblaciones microbianas que presentan una sensibilidad al tratamiento diferente, siguiendo en Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación bacteriana 61 ambos casos una cinética de inactivación de primer orden. La expresión matemática del modelo se define por la ecuación XIII, donde P significa la fracción de microorganismos supervivientes correspondientes a la subpoblación 1, (1-P) es la fracción de supervivientes de la subpoblación 2, k1 representa la constante de inactivación de la población sensible y k2 es la constante de inactivación de la población resistente.     tktk tePePLog N N Log ·· 0 21 ·1·   [XIII] VI.I.iv. Modelo de Mafart (2002) Este modelo asume que la inactivación microbiana se debe a la incapacidad de la célula para resistir las duras condiciones impuestas por algún tipo de estrés, después de cierto tiempo; también asume que la población es heterogénea, es decir, que cada célula tarda un tiempo diferente en morirse. En definitiva, es un modelo que implica la existencia de una distribución de resistencias dentro de la población microbiana. La resistencia sigue una distribución de probabilidad de Weibull, definida por la ecuación XIV. La distribución de Weibull es una distribución de probabilidades diseñada para describir el comportamiento de sistemas que tienen cierto grado de variabilidad.   n b t ne b t b n tf                1 [XIV] Mafart (2002) modifica la ecuación de Weibull según la ecuación XV, donde δ es el parámetro de escala y se corresponde con el tiempo necesario para reducir el primer ciclo logarítmico decimal de la población bacteriana y p es el parámetro de forma e indica la forma de la curva de la ecuación, ya que ésta toma formas convexas cuando n es mayor que 1 y cóncavas cuando es menor que 1. p tt N N Log         0 [XV] VI.I.v. Modelo de Geeraerd (2000) Este modelo matemático se basa en diversos argumentos que describen el comportamiento de los microorganismos cuando se presentan fenómenos de hombro, una fase de inactivación lineal y cola, es decir, cuando describen curvas sigmoideas (Geeraerd et al., 2000). La incorporación de cada fenómeno se engloba en la ecuación XVI, donde Nres es la concentración de bacterias supervivientes, kmax es la velocidad específica de inactivación y SI es el parámetro que representa la duración del hombro.     res tkSIk SIk tk rest N ee e eNNN              maxmax max max ·11 ·· · 0 [XVI] VI.II. Ajuste de datos experimentales e índices de error Para obtener los coeficientes cinéticos de cada modelo descritos anteriormente, es necesario ajustar los valores experimentales a las correspondientes ecuaciones mediante técnicas de regresión no lineal. Los parámetros de los modelos se ajustan a ecuaciones mediante algoritmos Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación bacteriana 62 interactivos basados en el método de mínimos cuadrados (Pernistky et al., 1993). En la actualidad, muchos programas informáticos estadísticos permiten realizar estos ajustes. Entre ellos, en este trabajo experimental se utilizó la herramienta Solver y el complemento GInaFiT (Geeraerd and Van Impe Inactivation Model Fitting Tool) del programa Microsoft Excel. Para evaluar la calidad de los ajustes de los modelos a los datos experimentales obtenidos se utilizaron dos índices: el coeficiente de determinación (R2) y el error cuadrático medio (ECM). También se utilizó con este propósito la representación gráfica de los valores estimados frente a los obtenidos experimentalmente. El cálculo de R2 y ECM se realizó con el programa Excel (Microsoft). El coeficiente de determinación, R2, se utiliza como una medida global de la calidad del ajuste. Este coeficiente informa sobre la proporción de variabilidad total de la variable dependiente que es explicable por el modelo. Cuanto más cercano sea el valor R2 a 1, mejor es la precisión predictiva del modelo, y por tanto, más concuerdan los valores predichos con los valores observados. La ecuación del coeficiente de determinación viene descrita por la ecuación XVII, donde i y ~ son los valores estimados y es la media de los valores reales.            1 2 1 2 2 i i n i i yy yy R ~ [XVII] El error cuadrático medio, ECM, se define como la raíz cuadrada de la media del cuadrado de los residuos (diferencia entre los valores observados y los valores estimados) y viene determinado por la ecuación XVIII, donde n es el tamaño de la muestra. Un valor de ECM igual a 0 indica que existe un perfecto acuerdo entre los valores predichos y los valores reales. n yy ECM n i i    1 2 ) ~ ( [XVIII] Para comparar modelos diferentes se representan gráficamente los valores observados frente a los valores estimados. Si el modelo se ajusta perfectamente a los datos, los puntos se encuentran distribuidos a lo largo de la línea de equivalencia. La bondad del modelo es mayor cuanto más próximos están los puntos a dicha línea. Bibliografía  Chick H. “An investigation of t e laws of disinfection”. Journal of Hygiene 8, 92-158, 1908.  Geeraerd A.H., Herremans, C.H., Van Impe, J. . “Structural model requirements to describe microbial inactivation during a mild eat treatment”. International Journal of ood Microbiology 59, 185-209, 2000.  Gyürek L.L., Finch, G.R. “Modelling water treatment c emical disinfection kinetics”. Journal of Environmental Engineering 124, 783-793, 1998.  Haas C. ., Joffe J. “Disinfection under dynamic conditions: modification of Hom,s model for decay”. Environmental Science and Technology 28, 1367-1369, 1994.  Hom L.W. “Kinetics of c lorine disinfection in an ecosystem”. Journal of Sanitary Engineering Division 98, 183-193, 1972. Anexo VI. Modelos cinéticos de inactivación bacteriana 63  anao M. “Investigación de la inactivación de Clostridium perfringens y Enterococcus sp. en aguas mediante procesos convencionales y avanzados de oxidación”. Tesis Doctoral. Universidad de Zaragoza, 2012.  Lee Y., Nam S. “Reflection on kinetic models to t e c lorine disinfection for drinking water production”. T e Journal of Microbiology 0, 119-124, 2002.  Mafart P., Couvert O., Gaillard S., Leguerinel I. “On calculating sterility in thermal preservation met ods: application of t e Weibull frequency distribution model”. International Journal of Food Microbiology 72, 107-113, 2002.  Malato S., Fernández P., Maldonado M.I., Blanco J., Gernjak W. “Decontamination and Disinfection of Water by Solar P otocatalysis: Recent Overview and Trends”. Catalysis Today 147, 1-59, 2009.  Pernitsky D.J., inc G.R., Huck P.M. “Disinfection kinetics of heterotrophic plate-count bacteria in biologically treated potable water”. Water Researc 29, 12 5-1241, 1995.  Pruitt K.M., Kamau D.N. “Mat ematical models of bacteria growt , in ibition and deat under combined stress conditions”. Journal of Industrial Microbiology 12, 221-231, 1993.  Watson H.E. “A note on t e variation of t e rate of disinfection wit change in the concentration of e disinfectant”. Jounal of Hygiene 8, 5 6-542, 1908. Anexo VII. Resultados 64 ANEXO VII. Resultados VII.I. Resultados de inactivación de los tratamientos basados en ozono. En las Tablas XI, XII y XIII se presentan los resultados de inactivación de E. coli durante los tratamientos basados en ozono, así como el control de ozono durante el proceso. Tabla XI. Inactivación de Escherichia coli en el tratamiento de ozonización. Ozonización Tiempo (min) mg O3 generado mg O3 no consumido mg O3 consumido Nt (UFC/100 mL)) Log Nt Log(Nt/N0) 0 0 0 0 9,6·108 8,98 0,00 0,5 5,9 0,30 5,60 8,7·108 8,94 -0,04 1 13,4 0,90 12,86 8,6·108 8,93 -0,05 3 43,6 21,00 22,60 3,2·108 8,51 -0,48 6 88,9 57,75 31,15 2,2·107 7,34 -1,64 9 134,1 91,50 42,60 4·104 4,60 -4,38 15 224,7 153,75 70,95 5,75·102 2,76 -6,22 Tabla XII. Inactivación de Escherichia coli en el tratamiento peroxona 1,4 mg H2O2· L-1. Peroxona 1,4 mg H2O2/L Tiempo (min) mg O3 generado mg O3 no consumido mg O3 consumido Nt (UFC/100 mL)) Log Nt Log(Nt/N0) 0 0 0 0 3,3·108 8,52 0,00 0,5 5,9 0,30 5,60 2,3·108 8,36 -0,16 1 13,4 0,75 12,65 1,6·108 8,20 -0,31 3 43,6 13,13 30,81 5,6·106 6,75 -1,77 6 88,9 45,75 43,15 3,6·105 5,56 -2,96 9 134,1 73,88 60,23 7,1·104 4,85 -3,67 15 224,7 144,00 84,41 1·102 2,00 -6,52 Tabla XIII. Inactivación de Escherichia coli en el tratamiento peroxona 20 mg H2O2· L-1. Peroxona 20 mg H2O2/L Tiempo (min) mg O3 generado mg O3 no consumido mg O3 consumido Nt (UFC/100 mL)) Log Nt Log(Nt/N0) 0 0 0 0 4,5·108 8,65 0,00 0,5 5,9 0,30 5,60 2,1·108 8,32 -0,33 1 13,4 0,90 12,50 2·108 8,30 -0,35 3 43,6 11,25 32,35 8,1·107 7,91 -0,74 6 88,9 34,50 55,68 8·106 6,90 -1,75 9 134,1 70,54 63,56 3,1·106 6,49 -2,16 15 224,7 146,25 78,45 3,1·105 5,49 -3,16 Anexo VII. Resultados 65 Figura IX. Ajuste de los modelos matemáticos a la curva de inactivación de E. coli en el tratamiento de cloración con 3,8 mg Cl2· L-1. Figura X. Representación de los valores estimados frente a los observados en el tratamiento de cloración 3,8 mg Cl2· L-1. VII.II. Cinéticas de inactivación VI.II.i. Cloración En la Figura IX se representa el ajuste de los datos experimentales a los distintos modelos matemáticos durante el proceso de cloración con 3,8 mg Cl2· L-1. Los valores observados frente a los estimados por cada modelo se pueden observar en la Figura X. -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 5 10 15 20 25 30 Observados Hom modificado Bifásico Geeraerd Mafart log (Nt/N0) Tiempo (min) -9 -6 -3 0 -9 -6 -3 0 Estimados Observados 3,8 mg Cl2· L-1: Hom modificado -9 -6 -3 0 -9 -6 -3 0 Estimados Observados 3,8 mg Cl2· L-1: Mafart -9 -6 -3 0 -9 -6 -3 0 Estimados Observados 3,8 mg Cl2· L-1: Bifásico -9 -6 -3 0 -9 -6 -3 0 Estimados Observados 3,8 mg Cl2· L-1: Geeraerd