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FACULTAD DE VETERINARIA, UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Inactivación de Listeria monocytogenes por Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje en zumos. Memoria Trabajo Fin de Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Natalia Escursell Arcega 2012-2013 Datos personales: Avd/ Salvador Allende nº 16 1ºB; 73012993-E; 675320841; [email protected] ÍNDICE RESUMEN ........................................................................................................................................... 1 SUMMARY .......................................................................................................................................... 1 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................ 2 1.1 Mecanismo de acción de los PEAV ............................................................................................ 3 1.2. Factores que afectan a la inactivación microbiana por PEAV ................................................... 4 1.2.1 Parámetros de procesado ..................................................................................................... 4 1.2.2 Características del microorganismo ................................................................................... 10 1.2.3. Características del medio de tratamiento .......................................................................... 10 1.3 Inactivación microbiana en alimentos líquidos ......................................................................... 12 2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ................................................................................................. 13 3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................................ 14 3.1. Medios y reactivos ................................................................................................................... 14 3.2. Microorganismos ..................................................................................................................... 14 3.2.1. Obtención de la suspensión .............................................................................................. 14 3.2.2. Curvas de crecimiento ...................................................................................................... 15 3.3 Determinaciones de resistencia al calor .................................................................................... 16 3.4. Tratamiento de PEAV .............................................................................................................. 17 3.4.1. Generador de pulsos eléctricos ......................................................................................... 17 3.4.2. Cámaras de tratamiento .................................................................................................... 19 3.4.3 Configuración del equipo para el tratamiento en flujo continuo ....................................... 21 3.5. Metodología para la aplicación de los tratamientos de PEAV ................................................. 21 3.5.1 Metodología seguida para el tratamiento de PEAV en flujo estático ................................ 21 3.5.2 Metodología seguida para el tratamiento de PEAV en flujo continuo .............................. 22 3.6. Incubación y recuento de supervivientes ................................................................................. 23 3.6.1. Recuento de supervivientes .............................................................................................. 23 3.7 Análisis estadísticos de los resultados ...................................................................................... 23 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................... 24 4.1. Inactivación por calor. ............................................................................................................. 25 4.2. Inactivación por PEAV y temperatura en condiciones estáticas. ............................................. 26 4.3 Inactivación por PEAV y temperatura en condiciones de flujo continuo. ................................ 28 5CONCLUSIONES .......................................................................................................................... 36 CONCLUSIONS ................................................................................................................................ 37 6. APORTACIONES .......................................................................................................................... 37 7. EVALUACIÓN Y SUGERENCIAS DE MEJORA ....................................................................... 39 8. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 39 1 RESUMEN La creciente demanda por parte de los consumidores de alimentos seguros con propiedades nutritivas y organolépticas similares al producto fresco está haciendo que se investiguen nuevos métodos de inactivación microbiana no térmicos que puedan sustituir a los tratamientos por calor. Una de estas tecnologías son los pulsos eléctricos de alto voltaje (PEAV) ya que permite destruir las células vegetativas de microorganismos patógenos sin apenas afectar a las características organolépticas del producto aspecto fundamental en alimentos sensibles al calor como son los zumos y en especial el de naranja. Si bien existen muchos datos sobre la eficacia letal de los PEAV sobre microorganismos, son escasos los trabajos realizados en zumo de naranja con el objetivo de destruir patógenos como Listeria monocytogenes, bacteria patógena para el humano y de extendida ubicuidad, responsable de infecciones alimentarias por consumo de zumos entre otros alimentos. Es decir, no hay datos concluyentes que permitan conocer la eficacia letal de los PEAV sobre este microorganismo en el zumo de naranja. Así pues, el objetivo principal de este trabajo ha sido investigar la eficacia letal de los tratamientos PEAV sobre L. monocytogenes tratada en zumo de naranja y establecer las condiciones de procesado necesarias para garantizar la inocuidad del producto en relación a este microorganismo. Los resultados obtenidos han permitido observar que la aplicación de PEAV a temperatura ambiente apenas inactiva a este microorganismo. Sin embargo, la aplicación de estos tratamientos a temperaturas de 30, 35 y 40ºC ha permitido incrementar la eficacia letal de los PEAV. En base a esta combinación de PEAV y temperaturas subletales, se han podido definir, mediante el desarrollo de modelos matemáticos predictivos, condiciones de procesado mediante la tecnología PEAV que permiten garantizar la destrucción de más de 4 ciclos logarítmicos de L. monocytogenes en el zumo de naranja con tiempos de tratamiento PEAV de aproximadamente 1 segundo y temperaturas inferiores a 60ºC. SUMMARY The growing demand by consumers for safe food with nutritional and organoleptic properties similar to the fresh product is making investigation into new non-thermal methods of microbial inactivation that could replace treatments by heat. One of these 2 technologies are electric pulses of high voltage (PEAV) enabling you to destroy the vegetative cells of pathogenic microorganisms without hardly affect the organoleptic characteristics of the product fundamental aspect in heat-sensitive foods such as juices and especially the Orange. While there are many details about the deadly effectiveness of the PEAV on microorganisms, are scarce work in orange juice in order to destroy pathogens such as Listeria monocytogenes, pathogenic bacteria for human and extended ubiquity, responsible food consumption of juices among other food infections. I.e., there is no conclusive data that allow to know the deadly effectiveness of the PEAV on this microorganism in the orange juice. Thus, the main objective of this work has been investigating lethal effectiveness of treatments PEAV on Listeria monocytogenes treated in orange juice and establish processing conditions to ensure the safety of the product in relation to this organism. The results have allowed to observe PEAV applying to temperature environment hardly inactive this microorganism. However, the application of these treatments at temperatures of 30, 35 and 40 ºc has allowed to increase the lethal effectiveness of the PEAV. Based on this combination of PEAV and sublethal temperatures, you have failed to define, through the development of predictive mathematical models, processing technology PEAV conditions that guarantee the destruction of more than 4 logarithmic cycles of Listeria monocytogenes in orange juice with treatment times PEAV of approximately 1 second and temperatures below 60 ° C. 1. INTRODUCCIÓN El tratamiento por pulsos eléctricos de alto voltaje (PEAV, o PEF del inglés Pulsed Electric Fields) consiste en la aplicación intermitente de campos eléctricos de alta intensidad y corta duración (μs) a un material colocado entre dos electrodos (Barbosa Cánovas et al., 1998). Estos tratamientos provocan un fenómeno denominado electroporación, que consiste en la permeabilización transitoria o permanente de la membrana citoplasmática tanto de células eucariotas como procariotas. La electroporación de las membranas celulares de los tejidos animales o vegetales se está investigando con objeto de mejorar distintos procesos de la industria alimentaria, en los que se produce una transferencia de masa a través de estas membranas, como la extracción de distintos componentes intracelulares de interés, o la deshidratación (Knorr y Angersbach, 1998; Ade-Omowaye et al., 2001; Vorobiev y Lebovka, 2006). Por otro lado, la permeabilización irreversible de las membranas de las células vegetativas de los 3 microorganismos provoca su inactivación a temperaturas inferiores a las que se utilizan en el procesado térmico de los alimentos. El aumento de la demanda por parte de los consumidores de alimentos seguros con propiedades nutritivas y organolépticas similares a las del producto fresco, está haciendo que se investigue con más interés nuevos métodos de inactivación microbiana no térmicos que puedan sustituir a los tratamientos por calor. Por ello, los PEAV son considerados, en la actualidad, como una de las tecnologías emergentes para pasteurización de alimentos especialmente sensibles al calor como los zumos de frutas y especialmente el de naranja por su notable sensibilidad al calor (Toepfl., 2012). La utilización de los PEAV como sistema de pasteurización de zumos requiere entre otros aspectos, conocer los principales factores que condicionan la muerte microbiana por esta tecnología así como el mecanismo implicado en la misma. 1.1 Mecanismo de acción de los PEAV El mecanismo por el cual actúan los PEAV inactivando a los microorganismos es el de la electroporación, es decir, la formación de poros en las envolturas celulares que producen la salida del material intracelular produciendo la muerte del microorganismo. Una de las teorías para explicar el mecanismo por el cual se produce la electroporación de las membranas por la aplicación de un campo eléctrico es la teoría electromecánica, la cual asume que, las fuerzas de atracción que se establecen entre los iones cargados localizados a ambos lados de la membrana como consecuencia de la aplicación de un campo eléctrico provocan la compresión de la membrana. Cuando las fuerzas de atracción son superiores a las fuerzas viscoelásticas de la propia membrana se produce la formación de poros y como consecuencia el incremento de la permeabilidad de la membrana (Zimmermann et al.. 1974). Figura 1.1. Esquema del mecanismo de permeabilización mediante PEAV según los “modelos electromecánicos”. E es el campo eléctrico aplicado y Ec es el campo eléctrico crítico. (extraído de Saldaña 2011 – Tesis Doctoral). E Electrodo positivo Electrodo negativo Célula + + + + - - - - Electrocompresión E < Ec E > Ec Célula intacta Electroporación E Electrodo positivo Electrodo negativo Célula + + + + - - - - Electrocompresión E < Ec E > Ec Célula intacta Electroporación 4 1.2. Factores que afectan a la inactivación microbiana por PEAV Igual que ocurre con otras tecnologías que actúan inactivando microorganismos, la resistencia microbiana a los PEAV depende de muchos factores. Con objeto de establecer las condiciones de procesado que permitan obtener alimentos estables y seguros es necesario conocer cómo influyen estos factores en la inactivación microbiana. Dichos factores se pueden clasificar en tres grupos: parámetros de procesado, características de los microorganismos y características del medio de tratamiento. 1.2.1 Parámetros de procesado Son varios los parámetros de procesado que determinan la eficacia letal de los tratamientos de PEAV, siendo la intensidad del campo eléctrico, el tiempo de tratamiento y la energía específica los principales parámetros de control durante el proceso (Raso, J; Heinz, V; 2006). Otros aspectos que es necesario considerar a la hora de aplicar los tratamientos en la práctica son el tipo de cámara utilizada, la distancia entre los electrodos, la resistencia eléctrica de la cámara de tratamiento, que depende de la conductividad del medio de tratamiento, y en los procesos en flujo continuo, el tiempo de residencia, que depende del volumen de la cámara de tratamiento y del caudal utilizado (Wouters et al., 2001a). Intensidad del campo eléctrico La intensidad del campo eléctrico (E) se define como la diferencia de potencial, aplicada entre dos electrodos donde se coloca el alimento, dividido por la distancia (d), existente entre ellos y se suele expresar en kV/cm: (Ec. 1.1) E = v / d Para lograr la inactivación de microorganismos alterantes y patógenos en los alimentos, es necesario aplicar tratamientos por encima de los 10 kV/cm, aunque, generalmente, para conseguir una inactivación significativa son necesarios valores de al menos 20 kV/cm. Esta definición del campo eléctrico varía en función del tipo de cámara de tratamiento que se utiliza para aplicar el tratamiento. El cálculo del campo eléctrico en cámaras de electrodos paralelos, que es la utilizada en esta investigación y que se decribe en la sección de metodología, se realiza a partir de la ecuación 1.1. La utilización de este tipo de cámaras permite aplicar una distribución uniforme del campo 5 eléctrico dentro de la cámara de tratamiento, la mejor de todas las configuraciones de cámara existentes. Forma del pulso Los dos tipos de pulsos eléctricos más habituales utilizados en el procesado de los alimentos por PEAV son los pulsos de caída exponencial y los pulsos de onda cuadrada. En los pulsos de caída exponencial, una vez alcanzado el máximo voltaje, éste disminuye progresivamente a lo largo del tiempo, y parte de la energía utilizada se aplica a un voltaje que no tiene efecto letal. Se trata, por tanto, de una energía que únicamente contribuye al calentamiento del producto. En los pulsos de onda cuadrada, toda la energía utilizada se aplica al valor máximo de voltaje seleccionado (GóngoraNieto et al., 2002). Desde un punto de vista práctico, los pulsos de onda cuadrada son más adecuados que los pulsos de caída exponencial ya que permiten un perfecto control del tiempo y voltaje aplicado, y por esta razón son los utilizados en este trabajo. Tiempo de tratamiento El tiempo de tratamiento (t) se define como el tiempo total efectivo durante el cual se aplica el campo eléctrico. Matemáticamente, se calcula multiplicando el número de pulsos (n) aplicados por la anchura del pulso (τ): (Ec. 1.2) t = τ * n Generalmente, tanto el tiempo de tratamiento como la anchura del pulso se expresan en microsegundos (μs). Frecuencia La frecuencia se corresponde con el número de pulsos aplicados por unidad de tiempo, y se expresa en hertzios (Hz). Los estudios de inactivación microbiana por PEAV se han llevado a cabo generalmente a frecuencias entre 0,5 y 500 Hz. En las cámaras estáticas, se suelen aplicar frecuencias entre 0,5 y 5 Hz para evitar el aumento de temperatura excesivo en la muestra (Raso et al., 2000). En los tratamientos en flujo continuo, la frecuencia del tratamiento, junto con el caudal, determinan el número de pulsos aplicado, y por tanto, el tiempo de tratamiento. Resistencia eléctrica de la cámara de tratamiento La resistencia eléctrica de la cámara de tratamiento es un parámetro que condiciona la forma del pulso, la máxima diferencia de potencial alcanzada entre los electrodos 6 durante la descarga del equipo o el calentamiento del producto al paso de la corriente eléctrica. La resistencia eléctrica (R) de la cámara, medida en Ohmios (Ω) depende de su geometría y de la conductividad del medio de tratamiento. Es directamente proporcional a la resistitividad del medio de tratamiento (ρ) y a la distancia existente entre los electrodos (d) e inversamente proporcional a su área (A): (Ec. 1.3) R = ρ * d / A La resistividad del medio de tratamiento es el valor inverso de su conductividad eléctrica (σ). La conductividad es una medida de la capacidad de un material para conducir la corriente eléctrica y depende de su fuerza iónica. En el S.I., la conductividad eléctrica se expresa en Siemens dividido por metro (S/m), aunque en la literatura se suele expresar con mayor frecuencia en miliSiemens dividido por centímetro (mS/cm). La conductividad del alimento tratado es un parámetro a tener en cuenta dado que aumenta con la temperatura y condiciona la intensidad del voltaje a aplicar y, por tanto, el coste energético del proceso como se discute posteriormente. Energía del pulso La energía eléctrica de un pulso (W), aplicada sobre un producto, durante un tratamiento de PEAV se puede calcular teóricamente a partir de la siguiente expresión: (Ec. 1.4) W = V ⋅ I ⋅ t donde V es la diferencia de potencial aplicada entre los electrodos de la cámara de tratamiento; I es la intensidad de corriente (A) y t es la duración del pulso (s). Con objeto de conocer el coste energético del proceso, se utiliza el parámetro energía específica (W’) que se calcula dividiendo la energía aplicada por la masa (m) de producto procesado, multiplicado por el número (n) total de pulsos. W’ = W * n / m Temperatura Aunque los tratamientos de inactivación microbiana por PEAV se aplican a temperaturas por debajo de las consideradas letales para los microorganismos, sus efectos letales aumentan de forma sinérgica al hacerlo la temperatura del medio de tratamiento (Álvarez et al., 2006). Este incremento ha sido observado tanto a temperaturas no letales (Heinz et al., 2003; Fleischman et al., 2004; Saldaña, 2010) como letales (Sepúlveda et al., 2004). Esta mayor sensibilidad de los microorganismos a los PEAV al aumentar la temperatura del medio de tratamiento se ha atribuido a la 7 modificación de la fluidez de los fosfolípidos que favorece la electroporación de la membrana. La ventaja del efecto sinérgico de esta combinación es la posibilidad de reducir la intensidad del tratamiento de PEAV para alcanzar un determinado nivel de inactivación microbiana (Heinz et al., 2003; Álvarez y Heinz, 2007). Generalmente, los estudios realizados sobre la influencia de la temperatura en la inactivación microbiana por PEAV se han realizado utilizando cámaras de tratamiento en flujo continuo. En estos estudios, se modificaba la temperatura de entrada del producto en la cámara de tratamiento y la temperatura de salida dependía de la energía específica total aplicada al producto al pasar por la cámara de tratamiento. Por lo tanto, en flujo continuo, la temperatura de tratamiento no es constante por lo que es difícil cuantificar su efecto. Recientemente el grupo de investigación de Nuevas Tecnologías de Procesado de Alimentos de la Universidad de Zaragoza ha diseñado una cámara estática de electrodos paralelos con los electrodos termostatados que permite investigar la inactivación microbiana por PEAV a distintas temperaturas en condiciones prácticamente isotérmicas (Saldaña et al., 2010). Por lo tanto, la aplicación de los PEAV a temperaturas superiores a la temperatura ambiente, pero inferiores a las de los actuales tratamientos térmicos abre la posibilidad de aplicación de esta tecnología para la pasteurización de los alimentos líquidos. Si bien se han presentado los principales parámetros de procesado, a la hora de aplicar los tratamientos PEAV, estos están interrelacionados y cualquier modificación de uno de ellos condiciona los otros. De forma resumida, se presenta a continuación las relaciones entre estos parámetros. Interdependencia entre los diferentes parámetros en el tratamiento PEAV La aplicación de un voltaje entre los electrodos genera un campo eléctrico, parámetro fundamental en esta tecnología (1). El campo eléctrico depende, además del voltaje aplicado de la configuración y diseño de la cámara de tratamiento. Como se ha indicado, en una cámara de electrodos paralelos el campo eléctrico es homogéneo y la intensidad se calcula en base a la Ec. 1.1. La aplicación de un voltaje (U) produce una corriente eléctrica (I) debido a la conductividad eléctrica del medio situado entre los electrodos según la ecuación: V = I * R. 14 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Medios y reactivos El agar tripticasa-soja (TSA) y el caldo tripticasa-soja (TSB) fueron suministrados por la casa Oxoid (Basingtok, Hampshire, England) y se prepararon siguiendo las indicaciones del fabricante. Para los cultivos microbianos estos medios se enriquecieron con un 0,6% de extracto de levadura (TSA+YE y TSB+YE, respectivamente) suministrado por la misma casa comercial. El agua de peptona se preparó a partir de peptona de carne (Oxoid) disolviendo un 0,1% (p/v) en agua destilada. Todos los medios, una vez preparados, se esterilizaron 20 minutos a 121ºC en autoclave (Darlab K-400, Terrassa, Barcelona), y se almacenaron a 4±2ºC hasta su uso. El medio utilizado para la aplicación de los tratamientos PEAV y de calor fue zumo de naranja (marca comercial?) comprado en un supermercado local. El pH del zumo, medido con un pH-metro con compensación automática de temperatura (modelo basic 20+, Crison Instrumental, Barcelona, España), era de 3,5. Y la conductividad eléctrica del mismo, 3,5 mS/cm medido con un conductivímetro (mod. 524, Crison Instrumental, Barcelona, España) a temperatura ambiente. 3.2. Microorganismos Para llevar a cabo esta investigación, se utilizó la cepa de Listeria monocytogenes CECT 5672, suministrada por la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Dicha cepa se eligió por su especial resistencia a los tratamientos de PEAV (Saldaña et al., 2009). 3.2.1. Obtención de la suspensión La suspensión se preparó siguiendo las etapas que se muestran en la figura 3.1. En esta figura también se indican los diferentes medios, temperaturas y tiempos de cultivo utilizados para el microorganismo. Para la preparación de la suspensión, se partió del correspondiente criovial que se almacenó a -80ºC. La cepa congelada se revitalizó en primer lugar en TSB+YE y, a continuación, se sembró en placas de TSA+YE por agotamiento en estría que se incubaron durante 24 h a 37ºC y, posteriormente, se almacenaron en nevera (4±2ºC). Esta operación se realizó semanalmente para tener disponibilidad permanente de cultivo fresco. A partir de una colonia aislada de las placas de TSA+YE, se sembraron tubos de ensayo que contenían 5 ml de TSB+YE estéril y se incubaron en estufa durante 18 horas 15 (Hotcold UL, Selecta, Abrera, España). Tras determinar la concentración celular del precultivo mediante recuentos microscópicos (Y-FL, Nikkon, Tokio, Japón) en cámara de Thoma (ServiQuimia, Constantí, España), se inocularon frascos con 50 ml de TSB+YE estéril atemperados a 37ºC, con un volumen suficiente para alcanzar una concentración microbiana inicial de 106 UFC/ml. Los cultivos se incubaron en estufa con agitación orbital (Agitador vibramax 100, Heidolph Instruments, Acwabach, Alemania) a 37ºC. Para establecer los tiempos de incubación para obtener las suspensiones microbianas se elaboró la correspondiente curva de crecimiento. Figura 3.1. Esquema del procedimiento para la obtención de la suspensión microbiana. 3.2.2. Curvas de crecimiento La curva de crecimiento se elaboró tomando 0,1ml de la suspensión cultivada a 37ºC a intervalos determinados de tiempo. Tras realizar las diluciones correspondientes en agua de peptona estéril, se sembraron por duplicado alícuotas de 0,1ml en placas de TSA+YE, por homogeneización en masa y se cultivaron a 37ºC/48h. La curva de crecimiento se elaboró representando el logaritmo decimal del número de unidades formadoras de colonias (UFC) por mL frente al tiempo (t) de incubación (figura 3.2). Con el fin de caracterizar esta curva de crecimiento, ésta se ajustó al modelo de Gompertz (Zweitering et al., 1990) obteniéndose la siguiente ecuación: Almacenamiento en criovial -80ºC Revitalización TSB+YE 37ºC/24 h TSBYEnnn Aislamiento en estría TSA+YE 37ºC/48 h Precultivo TSB+YE 37ºC/18h 5mL de medio líquido Recuento en Cámara de Thoma Incubación TSB+YE 37ºC/40h 106 UFC/mL en 50mL de medio líquido 16 Esta ecuación permite conocer la concentración de L. monocytogenes a 37ºC a cualquier tiempo de cultivo hasta las 50 h de incubación. Debido a que la fase de crecimiento es uno de los factores que puede influir en la inactivación a los PEAV, siendo más sensible los microorganismos en la fase exponencial de crecimiento, resultados previos indicaron que la resistencia de L. monocytogenes a los PEAV era máxima y constante a partir de las 34 h de incubación a 37ºC (Condón, 2013). A la vista de estos resultados, se decidió realizar esta investigación con un cultivo con 40 horas de incubación para Listeria monocytogenes 5672 . Figura 3.2. Curva de crecimiento a 37ºC de L. monocytogenes 5672 descrita mediante el modelo de crecimiento de Gompertz. 3.3 Determinaciones de resistencia al calor Las determinaciones de resistencia al calor se realizaron en el termorresistómetro TR-SC (Condón y col., 1993), que permite el control de las condiciones de temperatura y presión aplicadas durante los tratamientos. El equipo consiste en un vaso de acero inoxidable con una capacidad de 350 ml donde se encuentra el medio de tratamiento líquido. Dispone de un sistema de agitación que garantiza un flujo turbulento durante el tratamiento consiguiendo de este modo una temperatura uniforme en todo el volumen tratado, de un sistema de termostatación con lo que se controla la temperatura del medio de tratamiento y un sistema de toma de muestras automático conectado a una válvula solenoide que actúa de cierre. Una entrada de presión dotada de un manómetro y un 6 7 8 9 10 11 0 10 20 30 40 50 60 Log Rcto Tiempo (h) Listeria monocytogenes 5672 Valores reales Valores predichos por el modelo 17 manorreductor permite trabajar tanto a presión ambiente como a sobrepresión para aplicar tratamientos por encima de los 100ºC. Antes y después de cada sesión de trabajo se esterilizaron (5 minutos, 125ºC) tanto el equipo como el medio de tratamiento (zumo de naranja). Antes de inyectar el microorganismo, 1 mL de zumo era contaminado con el microorganismo que se almacenaba a temperatura ambiente durante 20 minutos. Con ello, se pretendía adaptar el microorganismo al medio ácido para evitar un choque ácido al introducirlo en el zumo a la temperatura del tratamiento térmico. Una vez el medio estaba estabilizado a la temperatura de tratamiento se inyectaron 0,2 ml del zumo contaminado con el microorganismo adaptado en la cámara de tratamiento mediante una jeringuilla estéril. Durante el tratamiento y a intervalos determinados de tiempo se extrajeron muestras de 0,1 ml, depositándolas directamente en placas de Petri estériles, a las que inmediatamente se les añadió el medio de crecimiento estéril, fundido y a 45ºC, para su posterior incubación. Figura 3.4. Equipo utilizado para la determinación de resistencia al calor 3.4. Tratamiento de PEAV 3.4.1. Generador de pulsos eléctricos El estudio se realizó con un generador de pulsos eléctricos suministrado por la empresa Scandinova (modulator PG, Scandinova, Uppsala, Suecia) cuyo esquema eléctrico se muestra en la figura 3.3. El equipo consta de un transformador (DCPS D10400, Scandinova) que convierte la corriente trifásica alterna de la red eléctrica (380V 16A ) en corriente continua de 1kV. Una señal eléctrica externa controla la apertura y el cierre de seis interruptores IGBT (Switch rack SR-6, Scandinova). Los pulsos de onda cuadrada de un voltaje de 1kV generados por los interruptores se amplifican por un transformador en la señal de alto voltaje deseada. Con este circuito, el equipo es capaz de generar pulsos de onda cuadrada de 3µs de duración, de hasta 30kV de voltaje y 200A de intensidad, a una frecuencia de hasta 200Hz. 18 Figura 3.5. Configuración eléctrica del equipo de PEAV El equipo está diseñado para trabajar en condiciones óptimas con una resistencia en la cámara de tratamiento de entre 100 y 170 Ω. En estas condiciones, se consigue un pulso cuadrado en el que el voltaje aumenta hasta el valor establecido a una velocidad de 47 kV/µs, y una vez transcurridos los 3 µs la velocidad de de caída es de 56 kV/µs. Sin embargo, cuando la resistencia de la cámara es menor de 100 Ω o mayor de 170 Ω la forma del pulso cambia y el control de las condiciones de tratamiento, tales como la intensidad del campo eléctrico, el tiempo de tratamiento y la energía específica, es menos preciso. La necesidad de trabajar en este rango de resistencias obliga a ajustar las dimensiones de la cámara de tratamiento en función de la conductividad de la muestra que se desee tratar. El equipo cuenta con un sistema de refrigeración con aceite dieléctrico de baja conductividad donde está sumergido el transformador. Este aceite se enfría en un intercambiador de calor por el que circula agua a temperatura ambiente. El flujo mínimo del intercambiador debe ser 9 L/min, a una presión de entre 3 y 8 bares. El control del equipo se realiza mediante un software específico diseñado por la empresa fabricante (K1-15m, Scandinova). Además, el equipo cuenta con un interruptor manual de seguridad que desconecta el circuito y permite manipular con seguridad los diferentes componentes externos. Para conocer y registrar el voltaje y la intensidad de corriente realmente aplicados, y así conocer las condiciones reales de tratamiento, el sistema se completa con una sonda de alto voltaje (P6015A, Tektronix, Wilsonville, Oregon, EE.UU.) y otra de intensidad de corriente (Stangenes Industries, Palo alto, California, EE.UU.) conectadas a un osciloscopio digital de dos canales (TDS 220, Tektronix). 6 interruptores IGBT Circuito de conexión a tierra Pantalla táctil Osciloscopio Sonda de intensidad de corriente Sonda de alto voltaje Unidad de control Transformado r Generador de corriente continua Cámara de tratamiento 19 2,5mm 40mm Ø 16 mm 3.4.2. Cámaras de tratamiento 3.4.2.1 Cámara de tratamiento en condiciones estáticas. Dados los objetivos de esta investigación, fue necesario utilizar un sistema de termostatación de la cámara de tratamiento que permitiera aplicar tratamientos a distintas temperaturas en condiciones isotérmicas. Para ello, se utilizó la cámara de tratamiento descrita por Saldaña et al. (2010) modificándose el sistema de termostatación y el procedimiento para la aplicación de los tratamientos, según estudios anteriores realizados en este centro (Condón, 2013), para poder evaluar la influencia de la temperatura en el efecto letal de los PEAV en un amplio rango de trabajo. La cámara está constituida por un tubo de polietileno cerrado en sus extremos por dos cilindros de acero inoxidable de 1,6 cm de diámetro y 4 cm de longitud. La distancia de separación entre los electrodos era de 2,5 mm, lo que da un volumen efectivo de tratamiento de unos 0,5ml. El interior de los electrodos es hueco, de manera que se pueden atemperar haciendo circular aceite dieléctrico de baja conductividad (1,4 µS/cm) a distintas temperaturas. La descripción y caracterización del sistema de termostatación de la cámara de tratamiento PEAV en condiciones isotérmicas se describe en el Anexo I y constituyó una parte de este trabajo de fin de grado. Figura 3.6. Esquema de la cámara de tratamiento estática de electrodos paralelos termostatados (Saldaña, 2012). 3.4.2.2. Cámara de tratamiento en flujo continuo Para realizar los estudios de la eficacia letal de los PEAV en flujo continuo, se utilizó una cámara de electrodos paralelos cuyas características principales se muestran en la Tabla 3.2. Esta cámara, diseñada por el grupo de investigación Nuevas Tecnologías de Conservación de Alimentos de la Universidad de Zaragoza, consta de dos electrodos planos de acero inoxidable separados 5,73 mm por una pieza aislante de Teflón. Uno de 20 los electrodos está conectado a la señal pulsante de alto voltaje generada por el equipo de pulsos de onda cuadrada anteriormente descrito, mientras que el otro está conectado a tierra. Esta configuración crea una zona de tratamiento de sección cuadrada de una anchura de 5,73 mm, una altura de 0,5 cm y una longitud de 3,9 cm en la que el campo eléctrico generado es perpendicular a la dirección de flujo del producto. El volumen total de tratamiento es de 1,17 mL. Utilizando un flujo de producto de 3 L/h, el tiempo de residencia medio del producto en la zona de tratamiento es de 1,44 s. En estas condiciones, el número máximo de pulsos que es posible aplicar es de 260. Es en esta investigación la primera vez que se utilizó esta cámara de tratamiento. Debido a que se diseñó para productos con una conductividad eléctrica de 2,1 a 2,5 mS/cm, el zumo de naranja (3,5-3,7 mS/cm) tuvo que ser diluido mediante la adición de con tampón pH 3,5 y 1mS/cm de conductividad, hasta conseguir una conductividad de 2,2 mS/cm en el medio de tratamiento. Como se ha indicado en la introducción, este cambio de conductivdad eléctrica no condiciona la eficacia letal de los tratamientos PEAV aplicados. Según los límites máximos de voltaje y de intensidad de corriente del generador de PEAV (30 kV y 200 A), el campo eléctrico máximo que se podría aplicar para tratar el zumo de naranja de 2,2 mS/cm es de 30 kV/cm, aunque en esta investigación nunca fue mayor de 21 kV/cm debido a la formación de arcos eléctricos a campos más elevados. Figura 3.7. Esquema de la cámara de tratamiento PEAV en flujo continuo. 21 Tabla 3.2. Características de la cámara de electrodos paralelos utilizada en flujo continuo en este estudio. Distancia entre los electrodos 5,7 mm Longitud del electrodo 3,9 cm Área de tratamiento 1,95 cm2 Volumen total de tratamiento 1,1 mL Tiempo de residencia 1,4 s Rango de conductividad 2,1 a 2,5 mS/cm Campo eléctrico máximo 30 kV/cm Número de pulsos máximo 260 pulsos de 3μs 3.4.3 Configuración del equipo para el tratamiento en flujo continuo La instalación para la aplicación de los tratamientos de PEAV en flujo continuo consistió en un depósito de 2 L que contenía el medio de tratamiento (zumo de naranja), una bomba de impulsión, un intercambiador de calor, la cámara de tratamiento y un depósito de 3 L con agua y hielo para enfriar el medio de tratamiento hasta su recogida posterior inmediata (Figura 3.8). Una bomba peristáltica de ocho cabezales (Ismatec, Glattbrugg, Suiza) impulsaba el medio de tratamiento hacia el intercambiador de calor a través de un tubo de silicona de 3 mm de diámetro interno. El intercambiador de calor consistió en un tubo en espiral de acero inoxidable (Øinterno 2 mm, Øexterno 3mm, 230 cm longitud) sumergido en un baño termostático (modelo K12-mpc-NR, Huber, Offenburg, Alemania). Una vez atravesado el intercambiador, el producto atemperado circulaba hacia la cámara donde recibía el correspondiente tratamiento PEAV. El producto tratado circulaba hasta un vaso con hielo y agua donde se enfriaba para ser recogido inmediatamente en tubos Eppendorf estériles. La temperatura del medio de tratamiento se medía con sondas termopar tipo “K” (Testo GmbH, Lenzkirch, Alemania) colocadas a la entrada y salida de la cámara de tratamiento. 3.5. Metodología para la aplicación de los tratamientos de PEAV 3.5.1 Metodología seguida para el tratamiento de PEAV en flujo estático Para la aplicación de los tratamientos de PEAV a distintas temperaturas, 10 µl de la suspensión microbiana se añadían a 990 µl del medio de tratamiento previamente atemperado a la temperatura de trabajo en un incubador de placas microtiter (Incubador FX, A.F. ingeniería S.L., Valencia). De esta manera, se conseguía un calentamiento prácticamente instantáneo de los microorganismos a la temperatura de trabajo. La 22 suspensión atemperada se introducía con una jeringuilla estéril en la cámara de tratamiento que, a su vez, tenía los electrodos atemperados a la temperatura de trabajo. De esta manera, en un tiempo de alrededor de 30 segundos, la suspensión microbiana estaba acondicionada a la temperatura a la que se aplicaban los tratamientos de PEAV a distintas temperaturas. Tras el correspondiente tratamiento de PEAV, se extraía el contenido de la cámara de tratamiento con una jeringuilla estéril y se procedía a su dilución con el diluyente a temperatura ambiente. El esquema de esta metodología se presenta en la figura 1 del Anexo II. Para este estudio, se aplicaron entre 1 y 30 pulsos de 3 µs de anchura de pulso a una frecuencia de 0,5 Hz y campos eléctricos de 30 kV/cm. El medio de tratamiento era zumo de naranja termostatado a 20, 30 y 40ºC. Figura 3.8. Esquema del equipo de PEAV en flujo continuo 3.5.2 Metodología seguida para el tratamiento de PEAV en flujo continuo Para los tratamientos en flujo continuo, se centrifugaron 2 mL de suspensión microbiana a 10000 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en 2 L de zumo de naranja. El zumo inoculado con la suspensión microbiana a una concentración de 106 UFC/mL, se bombeaba hacia la cámara de tratamiento para recibir el correspondiente tratamiento de PEAV. Tras recorrer la sección de enfriamiento, se recogía 1 mL de muestra en tubos Eppendorf estériles. Para la investigación, se aplicó un tratamiento de intensidad de campo eléctrico de 21 kV/cm, a distintos tiempos de tratamiento que variaban entre 23 y 105 μs, modificando para ello la frecuencia de aplicación de los pulsos, desde 3 a 19 Hz, utilizando un caudal 23 de 3 L/h. La temperatura inicial del medio de tratamiento a la entrada en la cámara de tratamiento se estableció a 30, 35 y 40ºC. En estas condiciones de tratamiento de PEAV, la temperatura del medio de tratamiento a la salida de la cámara de tratamiento varió desde 35 a 60 ±1ºC. Aunque el objetivo era aplicar campos eléctricos de hasta 30 kV/cm para comparar los resultados con los obtenidos en condiciones estáticas, no fue posible superar los 21 kV/cm sin que se produjese la ruptura dieléctrica del medio de tratamiento. 3.6. Incubación y recuento de supervivientes Tras realizar las correspondientes diluciones decimales de las muestras en agua de peptona, se sembraron 0,1 ml en placas Petri a las que se adicionaba TSA+EL. Tras la siembra, las placas se incubaron a 36±1ºC durante 48 horas. Tiempos más largos de incubación no afectaban al número de microorganismos recuperados tras el tratamiento. 3.6.1. Recuento de supervivientes El recuento de los microorganismos se efectuó mediante un contador automático de colonias (mod. Protos, Analytical Measuring Systems, Cambridge, Reino Unido), adaptado para el contaje de placas densamente pobladas en anteriores investigaciones (Condón et al., 1996). Figura 3.9. Contador automático de colonias 3.7 Análisis estadísticos de los resultados La letalidad de los tratamientos aplicados (PEAV y calor) se determinó a partir del logaritmo decimal de la fracción de supervivientes. Dicha fracción de supervivientes se obtuvo como el cociente entre los recuentos de los microorganismos supervivientes en las muestras tratadas y en las no tratadas. En el caso de los tratamientos térmicos, a partir de los datos obtenidos para un determinado tratamiento térmico, se obtuvieron las correspondientes gráficas de supervivencia para los microorganismos seleccionados, representando el número de ciclos logarítmicos de inactivación frente al tiempo de tratamiento. La letalidad de los tratamientos térmicos se determinó con el valor del tiempo de reducción decimal (valor DT), el cual se define como los minutos de tratamiento, a una determinada temperatura 30 Figura 4.6. Efecto de la temperatura inicial en la inactivación del tratamiento por PEAV en L. monocytogenes. Debido a que uno de los objetivos de esta investigación era evaluar el efecto de la temperatura en la muerte por PEAV y determinar en el proceso combinado la contribución del calor y de los PEAV en la muerte microbiana, se trató de investigar este punto. Como se observa en las figuras anteriores, durante los tratamientos PEAV, se alcanzan temperaturas finales que pueden resultar letales según los datos de resistencia al calor. Es decir, en los datos de inactivación obtenidos puede haber un porcentaje de muerte por calor, más aún sabiendo que desde que el zumo sale de la cámara de tratamiento hasta que se enfría, se pueden pasar por temperaturas letales durante algunos segundos. A modo de ejemplo, la figura 4.7 muestra un perfil de temperaturas (línea azul) en el circuito utilizado para aplicar los PEAV mostrando en la figura 3.8, en este caso por ejemplo para un tratamiento PEAV a una temperatura inicial de 40ºC. Como se observa, se alcanzan temperaturas durante el tratamiento que pueden ser letales (en el ejemplo, hasta 57ºC a la salida de la cámara y permanece a ésta durante 4” hasta que entra en la sección de enfriamiento). En base al modelo de muerte por calor (Ec. 4.1), se puede determinar la muerte debido al calor en este circuito considerando los tiempos y temperaturas a los que está el zumo. Como se observa, el calor durante esos tiempos y temperaturas apenas reduce 0,3 Log10 de L. monocytogenes. Sin embargo, cuando se considera la muerte con PEAV a las distintas temperaturas, se observa claramente el incremento de la eficacia letal del proceso combinado basado en los PEAV. La aplicación de 21,5 kV/vm y 26 pulsos (78 µs) iniciado a 40ºC y -4,5 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 30 35 40 45 50 55 60 65 Ciclos de inactivación Temperatura (ºC) 30 ºC 35 ºC 40ºC 31 finalizado a 57ºC, permitió inactivar 4 Log10. El mismo tratamiento PEAV en estático sin incrementar apenas la temperatura redujo 0,4 Log10 (figura 4.3). Es decir, se observó un efecto sinérgico de 3,3 Log10 de inactivación al aplicar PEAV a temperaturas subletales. Estos resultados se muestran más claramente en la figura 4.8. Este efecto sinérgico podría ser debido a que al aumentar la temperatura, se produciría una modificación de la fluidez de la membrana citoplasmática que haría más sensible a los microorganismos frente a los PEAV. Figura 4.7. Perfil de temperaturas en el circuito (línea azul) utilizado para aplicar los PEAV en continuo, aplicando una temperatura inicial de 40ºC, inactivación debida al calor (línea roja) y a los PEAV (línea verde) de L. monocytogenes en zumo de naranja. 1. Entrada a la sección de precalentamiento. 2. Entrada cámara PEAV. 3. Salida cámara PEAV. 4. Entrada a la sección enfriamiento. 5. Salida de la sección de enfriamiento. Teniendo en cuenta los datos de muerte obtenidos por PEAV y calor mostrados en la figura 4.5 y la muerte producida por el calor en todo el circuito, se puede determinar lo que matarían sólo los pulsos (descontando la muerte por calor) por diferencia entre ambas inactivaciones como se muestra en la Figura 4.9. Como se observa, a partir de una determinada temperatura, la muerte debida a los PEAV (en verde) se reduce ya que la muerte por el calor aumenta predominando a temperaturas de 60ºC. La gráfica corresponde a la inactivación cuando la temperatura inicial es de 30ºC. Gráficas similares se pueden obtener a las otras temperaturas iniciales. -4,5 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0 10 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Log Fracción supervivientes Temperatura (ºC) Tiempo (segundos) TEMPERATURA CALOR PEF Y CALOR 2 1 3 4 5 32 Figura 4.8. Inactivación por calor de L. monocytogenes a lo largo de todo el circuito, por PEAV en estático (21,5 kV/cm 78 µs) y por PEAV en continuo (21,5 kV/cm 78 µs) para una temperatura inicial de 40ºC y final de 57ºC. Figura 4.9. Inactivación de L. monocytogenes en función del calor (rojo), PEAV y temperatura (azul) y sólo PEAV (verde). Gracias a la Ec. 4.1 que describe la muerte por calor, se puede representar de nuevo la Figura 4.5 descontando la inactivación producida por el calor y, por tanto, obtener la letalidad de L. monocytogenes en zumo sólo por el efecto de los PEAV aplicado a las distintas temperaturas. Las conclusiones que se puedan obtener de esta gráfica son las mismas que las ya indicadas. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 CALOR PEAV PEAV + CALOR Ciclos Log de inactivación -4,5 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 30 35 40 45 50 55 60 65 Log fracción supervivientes Temperatura (ºC) PEAV + CALOR CALOR PEAV 33 Figura 4.10. Inactivación de L. monocytogenes en zumo de naranja mediante un tratamiento PEAV en flujo continuo a diferentes temperaturas sin considerar el efecto térmico. En base a estos nuevos datos, se puede determinar el efecto de los parámetros temperatura inicial (Tini), energía aplicada (W), el tiempo (t) y temperatura final (Tf) en la muerte (L) por PEAV de L. monocytogenes en zumo. Para ello y mediante regresión múltiple, se obtuvieron las siguientes ecuaciones matemáticas que relacionaban estos parámetros (la bondad del ajuste de los modelos anteriores queda reflejada por los índices estadísticos obtenidos): Log10 L = -0,0232-0,00168*Tini*W+0,000196*W2; R2=0,98, ECM=0,145 (Ec. 4.2) Log10 L = -0,0232-0,00015*t2-0,00149*t* Tini; R2=0,98, ECM=0,146 (Ec. 4.3) Log10 L =0,194+0,0103*Tini2-0,014*Tini*Tf+0,0033*Tf2; R2=0,98, ECM=0,142 (Ec. 4.4) A partir de estas ecuaciones, se pueden obtener gráficas de superficie-respuesta (Figura 4.11ABC) que permiten ver la interacción de los parámetros en la inactivación por PEAV de L. monocytogenes en zumo de naranja. Como se observa, para una misma temperatura inicial, la muerte aumenta con la energía PEAV aplicada en mayor medida cuando la temperatura inicial es mayor (Fig. 4.11A). O para un mismo nivel PEAV de energía, la inactivación es mayor cuando la temperatura inicial es mayor. Conclusiones similares se pueden obtener con la gráfica 4.11B donde la inactivación aumenta con el tiempo de tratamiento siendo mayor cuando la temperatura inicial era superior. Finalmente, la muerte fue mayor al alcanzarse las temperaturas finales más elevadas. Este efecto fue ligeramente superior al aumentar la temperatura inicial de los PEAV. -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Log fracción supervivientes Energía (kJ/kg) 30ºC 35ºC 40ºC 34 A partir de las ecuaciones desarrolladas, se pueden obtener las condiciones de tratamiento para conseguir un determinado nivel de inactivación de L. monocytogenes en zumo de naranja. A modo de ejemplo, se muestra la figura 4.12 en la que se representa la energía específica a aplicar a 21,5 kV/cm y la temperatura inicial del tratamiento para conseguir distintos niveles de inactivación de L. monocytogenes. Como se ha indicado en la introducción, para garantizar la seguridad sanitaria de un producto, hay que alcanzar 5 Log10, según la FDA, del microorganismo patógeno de referencia. Según este trabajo, considerándose L. monocytogenes el microorganismo objeto de estudio en este zumo de naranja, las condiciones para alcanzar ese objetivo variarían desde los 90 kJ/kg y 40ºC de temperatura inicial hasta los 125,8 kJ/kg y 35ºC de temperatura inicial aplicando PEAV de 21,5 kV/cm. Figura 4.11. Gráficas de superficie-respuesta obtenida a partir de las ecuaciones 4.2, 4.3 y 4.4 que relacionan la inactivación de L. monocytogenes únicamente por el tratamiento PEAV (21,5 kV/cm; 78 µs) en continuo a distintas energías, temperaturas iniciales y finales, y tiempo. 35 Figura 4.12. Condiciones de contorno para conseguir distintos niveles de inactivación de L. monocytogenes mediante PEAV (21,5 kV/cm) en zumo de naranja. Por tanto, estas serían las condiciones de procesado para asegurar la inocuidad de este zumo de naranja frente a L. monocytogenes. Para que estas condiciones pudiesen considerarse de referencia para pasteurizar zumo de naranja, habría que comprobar con otros microorganismos patógenos como Escherichia coli O157:H7, Salmonella, etc. la letalidad de estos tratamientos y determinar si también se conseguirían los 5 Log10 recomendados por la FDA. De ser estos los tratamientos recomendados, habría que determinar la vida útil del zumo procesado así como evaluar si realmente la calidad del producto fresco mantenía el aspecto último esperable ya que los tratamientos PEAV aplicados son muy cortos; en esta investigación, de 1,4 segundos. Si tras esos estudios los tratamientos propuestos siguen siendo los adecuados para la pasteurización del zumo, Sampedro et al. (2013) estimaron aplicando tratamientos similares, el coste total del proceso PEAV que se estimaría en unos 0,03€/L, 1,7 veces superior al del procesado tradicional por el calor estimados para una producción anual de 16500 Tm al año y 5500 h/año de producción. De ese coste, el 54% procedería del equipo, 35% correspondería al propio procesado y el 11% restante al gasto en electricidad. Energía (kJ(kg) Temperatura inicial (ºC) 36 5. CONCLUSIONES 1. La inactivación de L. monocytogenes en zumo de naranja por PEAV dependió de la intensidad del campo eléctrico, del tiempo, energía y temperatura de tratamiento aplicados. 2. La letalidad del proceso incrementó con la temperatura, observándose un efecto sinérgico en la letalidad entre los PEAV y temperaturas subletales. 3. Desde un punto de vista práctico, interesa aumentar la temperatura inicial del tratamiento ya que el coste energético del proceso PEAV es menor para conseguir la misma eficacia letal. 4. Se han desarrollado modelos matemáticos que han permitido describir la muerte de L. monocytogenes en zumo de naranja por calor y por PEAV a distintas temperaturas. 5. Se han definido condiciones de procesado basados en los PEAV que podrían reducir varios ciclos logarítmicos de L. monocytogenes en zumo de naranja con tiempos de tratamiento de 1,4 segundos. 5. CONCLUSIONS 1. Inactivation of Listeria monocytogenes in orange juice by PEAV juice it depended on the intensity of the electric field, the time, energy and temperature of treatment applied. 2. The lethality of the process increased with temperature, with a synergistic effect in lethality between the PEAV and sublethal temperatures. 3. From a practical point of view, are interested in the initial treatment temperature increases since the energy cost of the process PEAV is less to get the same lethal efficiency. 4. Have been developed mathematical models that have allowed to describe the death of Listeria monocytogenes in at different temperatures for heat and PEAV orange juice. 5. Processing conditions have been defined based on the PEAV which could reduce several logarithmic cycles of Listeria monocytogenes in orange juice with treatment of 1.4 seconds times. 37 6. APORTACIONES Con la realización de este proyecto he podido mejorar el desarrollo de algunas competencias transversales, las cuáles considero útiles para mi formación y posterior incorporación al mercado laboral, estas son: -Capacidad de adaptación a situaciones nuevas. La elaboración de un proyecto como estudiante me ha supuesto el enfrentarme a situaciones como nuevos ambientes de trabajo. -Capacidad de organización y planificación autónoma del trabajo -Dominio de aplicaciones informáticas relativas al ámbito de estudio. Para desarrollar los resultados he tenido que utilizar softwares informáticos, es el caso del programa Essential Regression de Excel, del cual había adquirido conocimientos muy básicos durante asignaturas anteriores. -Capacidad de comunicación correcta oral y escrita en castellano y capacidad de leer en inglés. Parte de la literatura científica consultada para la redacción de este proyecto se encontraba en inglés lo que me ha hecho ampliar mis conocimientos en el idioma. -Capacidad de aplicación de los conocimientos teóricos a situaciones experimentales. Una de las principales consignas para poder trabajar en el laboratorio es haber adquirido antes los conocimientos teóricos necesarios, los cuales me han sido aportados durante estos años por las asignaturas de esta titulación. -Capacidad de transmitir información. La elaboración de un informe científico principalmente persigue el objetivo de transmitir información y es por lo que esta competencia queda justificada. -Adquisición de nuevos conocimientos en un área específica de mi titulación. La Tecnología de los Alimentos es una rama de la titulación que se divide en varios campos, en mi caso, la tecnología de los Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje me ha permitido adquirir conocimientos basados en tecnologías para conservar alimentos alternativas a las más tradicionales, como pueden ser el calor, el frío o la deshidratación. - Capacidad de realización y planificación de una propuesta científica. Junto con mi director de proyecto desarrollé una metodología experimental para llevar a cabo este trabajo en el laboratorio; considerando todos los parámetros necesarios para conseguir los objetivos de este trabajo. 38 - Capacidad de interpretación de resultados. Esta es una de las competencias más trabajadas a los largo de la titulación, ya que en asignaturas previas he tenido que realizar informes de los resultados obtenidos en prácticas y en prototipos de alimentos (Practicum Planta Piloto). Con este trabajo he tenido la oportunidad de profundizar en la adquisición de ciertas competencias específicas de los 6 perfiles profesionales de la titulación: 1. Procesado de alimentos: - Identificar y valorar los problemas asociados a los diferentes alimentos y a su procesado y proponer aquellas medidas necesarias para solventarlos. - Conocer e interpretar los fundamentos de los procesos de la industria alimentaria, así como los aspectos técnicos más novedosos de cada proceso y/o producto, relacionados con su composición, funcionalidad, procesado, etc. - Elaborar, transformar, higienizar y conservar alimentos. 3. Seguridad alimentaria: - Identificar los agentes de peligro que pueden intervenir en cualquiera de las fases de la cadena alimentaria y los sistemas de prevención y control. Analizar, evaluar y gestionar los riesgos sanitarios en la cadena alimentaria. 4. Desarrollo e innovación de procesos y productos en el ámbito alimentario: - Diseñar y elaborar nuevos procesos y productos para satisfacer necesidades y demandas sociales. - Conocer los aspectos científicos y técnicos más novedosos de cada producto, relacionados con su composición, valor nutritivo y propiedades saludables, funcionalidad, procesado, seguridad, vida útil, etc. 5. Asesoría legal, científica y técnica en el ámbito alimentario: - Elaborar y emitir informes científicos y técnicos relacionados con la industria alimentaria. 6. Docencia e investigación en el ámbito alimentario: - Recopilar y analizar información, elaborar hipótesis, diseñar y llevar a cabo experimentos, interpretar los resultados y elaborar conclusiones. 39 7. EVALUACIÓN Y SUGERENCIAS DE MEJORA Esta asignatura, desde mi punto de vista, supone una de las partes más interesantes del plan de estudios ofertado en el Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos ya que permite elegir entre amplia variedad de propuestas el tema que más se ajusta a las preferencias personales de cada alumno, desarrollarlas y poder adquirir nuevos conocimientos en el tema elegido. Esto supone un aliciente para elaborar un buen proyecto. Además de lo anterior, creo de gran importancia desarrollar habilidades orientadas a un campo más profesional, que no se pueden conseguir únicamente en las aulas (manejo de equipos e instrumental, libertad de movimiento en el laboratorio y responsabilidad en la toma de decisiones entre ellas). La asignatura se cursa en el último cuatrimestre de la titulación, lo que es lógico ya que se tienen que poner en marcha los conocimientos adquiridos hasta entonces, y junto a ella se presenta otra de las asignaturas más complejas de la titulación “Practicum Planta Piloto”, ya que requiere una elevada inversión de horas. Siendo prácticamente la primera vez que se trabaja de forma autónoma en un laboratorio, el riesgo de que surjan problemas en los ensayos es mayor, lo que requiere una garantía temporal suficiente que en ocasiones limita la presentación del Trabajo Fin de Grado en la primera convocatoria. 8. BIBLIOGRAFÍA - Álvarez, I; Pagán, R; Condón, S; and Raso, J. 2003. The influence of process parameters for the inactivation of Listeria monocytogenes by pulses electric fields. Int. J. Food Microbiol. 87: 87-95. - Buckow, Roman; Ng, Sieh; Toepfl, Stefan; German Institute of Food Technologies. 2013. Pulses electric field processing of citrus juices. Journal of Food Science. - Cebrián, G. 2009. Mecanismos de inactivación y Resistencia de Staphylococcus aureus a diferentes procesos de conservación de los alimentos. Tesis doctoral, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza. - Condón, S. 2013. Resistencia a los pulsos eléctricos de alto voltaje, aplicados a diferentes temperaturas, de microorganismos patógenos en medios de diferente pH. Trabajo Fin de Máster, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza.