Repositorio Institucional de Documentos

Proyecto Fin de Carrera DESARROLLO DE PROTOCOLO DE CONFINAMIENTO DE HIDROGELES PARA CULTIVO CELULAR 3D EN SISTEMAS MICROFLUÍDICOS Marco Alejandro Moreno Mínguez Director: José María Ayuso Ponente: Luis José Fernandez Ledesma Escuela de Ingeniería y Arquitectura 2014 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es RESUMEN Este proyecto fin de carrera forma parte de un proyecto muy amplio cuyo objetivo final el desarrollo de un sistema microfluídico para el cultivo celular en entorno tridimensional (3D). En la investigación biomédica el cultivo celular convencional tiene lugar en placas de plástico, llamadas placas Petri. Los sistemas microfluídicos suponen una mejora importante con respecto a estas placas Petri, ya que, en primer lugar, permiten una reducción drástica de los reactivos empleados. Por otro lado, estos sistemas microfluídicos permiten recrear con mayor acierto las condiciones fisiológicas que se dan en los tejidos biológicos. El objetivo concreto para este proyecto es la generación de un cultivo celular 3D sometido a un gradiente de concentración de nutrientes y oxígeno. En los tejidos biológicos dichas condiciones se dan con frecuencia durante el desarrollo tumoral. Mediante fotolitografía se fabricarán chips microfluídicos destinados al cultivo celular 3D. Estos chips microfluídicos poseen una microcámara central dónde se alojarán las células, que estarán embedidas en un hidrogel 3D de colágeno. Por los laterales de esta microcámara central se encuentran dos microcanales laterales, quedando separados de la microcámara por una serie de pilares. A través de estos laterales se podrá hacer fluir el medio de cultivo que se desee. Para generar el gradiente de oxígeno y nutrientes se pretende bloquear un microcanal, mientras que por el otro se perfundirá continuamente medio de cultivo nuevo. De este modo, las células al consumir oxígeno y nutrientes generarán un gradiente de los mismos en la microcámara central. Sin embargo, para lograr las condiciones antes mencionadas debe garantizarse que el hidrogel queda confinado en la microcámara central y que no invade los microcanales laterales, ya que bloquearía el paso del medio de cultivo. Una vez desarrollado un protocolo de confinamiento eficaz, se pasó a comprobar la biocompatibilidad del chip microfluídico y determinar las condiciones óptimas de cultivo. Finalmente, se llevaron a cabo ensayos de cultivo celular 3D bajo un gradiente de oxígeno y nutrientes. Cultivo celular Proyecto - 1 - ÍNDICE GENERAL ÍNDICE GENERAL ……………………………………………………………………1 Índice de figuras ………………………………………………………………………3 MEMORIA ……………………………………………………………………………..5 CAPÍTULO 1. Introducción …………………………………………………………..6 CAPÍTULO 2. Sistema microfluídico ………………………………………………..9 2.1 Chip microfluídico ……………………………………………………….11 2.2 Encapsulado……………………………………………………………...13 2.3 Reservorio ………………………………………………………………..13 2.4 Manorreductor …………………………………………………………...14 2.5 Llaves de paso …………………………………………………………..15 2.6 Sensor de flujo …………………………………………………………..15 CAPÍTULO 3. Confinamiento del hidrogel de colágeno en microchips prefundidos ………………………………………………………….17 3.1 Montaje del sistema para el confinamiento …………………………..18 3.2 Elección del sistema de inyección del hidrogel ………………………19 3.2.1 Inyección con jeringuilla ……………………………………...20 3.2.2 Inyección con micropipeta ……………………………………21 3.2.3 Inyección por presión hidrostática …………………………..21 3.3 Testeo del protocolo de confinamiento en ensayos de cultivo celular 3D …………………………………………………………………………23 CAPÍTULO 4. Confinamiento del hidrogel de colágeno en microchips secos..26 CAPÍTULO 5. Modelización del proceso de confinado ………………………….30 5.1 Fundamento teórico del proceso de confinamiento …………………30 5.2 Análisis del proceso de confinamiento ………………………………..33 CAPÍTULO 6. Desarrollo de un protocolo alternativo para confinamiento ……36 6.1 Principios físicos del protocolo alternativo ……………………………36 6.2 Protoclo alternativo ……………………………………………………...39 6.3 Conclusión ……………………………………………………………….40 Cultivo celular Proyecto - 2 - CAPÍTULO 7. Formación de gradientes bioquímicos dentro del chip microfluídico …………………………………………………………41 7.1 Protocolo para la formación de gradientes …………………………..42 7.2 Inestabilidad en la formación de gradientes ………………………...43 CAPÍTULO 8. Desarrollo de cultivo celular 3D en chips microfluídicos ……...47 8.1 Resultados de viabilidad en hidrogeles de colágeno macroscópicos …………………………………………………………..48 8.2 Método y resultados de cultivo celular 3D en chips microfluídicos en estático ……………………………………………………………….......52 8.3 Bioestadística de viabilidad celular en microchips en estático ……56 8.4 Ensayos de cultivo celular 3D en microchips con paso de flujo contínuo ………………………………………………………………….58 8.5 Resultados del cultivo celular 3D en flujo ……………………….......61 CAPÍTULO 9. Conclusiones y trabajo futuro …………………………………….63 ANEXOS ……………………………………………………………………………..66 ANEXO A. Protocolo de preparación del hidrogel de colágeno ……………….66 ANEXO B. Protocolo de preparación de ensayos de cultivo celular 3D macroscópicos en placa petri …………………………………………69 ANEXO C. Protocolo de tripsinización de células ………………………………70 ANEXO D. Protocolo de contaje celular ………………………………………….72 ANEXO E. Protocolo de tinción de células …………………………………........73 BIBLIOGRAFÍA ……………………………………………………………………..74 Cultivo celular Proyecto - 3 - ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Sistema microfluídico …………………………………………………….10 Figura 2: Chip microfluídico ………………………………………………………...12 Figura 3: Encapsulado ……………………………………………………………...13 Figura 4: Reservorio ………………………………………………………………...14 Figura 5: Manorreductor …………………………………………………………….14 Figura 6: Llaves de paso ……………………………………………………………15 Figura 7: Sensor de flujo ……………………………………………………………16 Figura 8: Encapsulado y llaves de tres vías unidas a los tubos ……………….19 Figura 9: Fuga del hidrogel a los microcanales laterales por inyección con jeringuilla ……………………………………………………………………………..20 Figura 10: Sistema de inyección por presión hidrostática ………………………22 Figura 11: Confinado del microchip de un hidrogel por presión hidrostática …23 Figura 12: Confinamiento mediante inyección con presión hidrostática …….24 Figura 13: Pérdida por sedimentación celular debido a la lenta velocidad de inyección ……………………………………………………………………………..25 Figura 14: Confinamiento del hidrogel en la microcámara central en microchip seco …………………………………………………………………………………...27 Figura 15: Problemática en la salida microfluídica ……………………………...28 Figura 16: Sucesión de imágenes de la retracción del gel …………………….29 Figura 17: Comportamiento físico del hidrogel mientras se confinan en la cámara central ……………………………………………………….......................31 Figura 18: Gráfica que representa la diferencia de presión entre columnas y ancho de la microcámara central …………………………………………………33 Figura 19: Gráfica que representa la diferencia de presión frente al espacio entre columnas variando el ángulo de contacto ………………………………..34 Figura 20: Simulación confinado de hidrogel mediante el nuevo protocolo ..38 Figura 21: Resultados del nuevo protocolo de confinado ……………………..40 Figura 22: Gradiente de color en la microcámara central del microchip ……..43 Figura 23: Esquema del microchip ……………………………………………….44 Figura 24: Esquema de los ensayos que se llevarán a cabo en el microchip de cultivo celular 3D …………………………………………………………………....48 Cultivo celular Proyecto - 4 - Figura 25: : Cultivo celular 3D macro a densidad de 1 millón de células/ml y una concentración de hidrogel de 1,2 mg/ml ………………………………………….49 Figura 26: : Cultivo celular 3D macro a densidad de 3 millones de células/ml y una concentración de hidrogel de 1,2 mg/ml ……………………………………..50 Figura 27: Cultivo celular 3D macro a densidad de 10 millones de células/ml y una concentración de hidrogel de 1,2 mg/ml ……………………………………..50 Figura 28: Cultivo celular 3D macro a densidad de 1 millón de células/ml y una concentración de hidrogel de 2,4 mg/ml ………………………………………….50 Figura 29: Cultivo celular 3D macro a densidad de 3 millones de células/ml y una concentración de hidrogel de 2.4 mg/ml ……………………………………..51 Figura 30: Cultivo celular 3D macro a densidad de 10 millones de células/ml y una concentración de hidrogel de 2.4 mg/ml ……………………………………..51 Figura 31: Cultivo celular 3D en estático a densidad de 1 millón de células/ml y una concentración de hidrogel de 1.2 mg/ml ……………………………………..54 Figura 32: Cultivo celular 3D en estático a densidad de 3 millones de células/ml y una concentración de hidrogel de 1.2 mg/ml …………………………………..54 Figura 33: Cultivo celular 3D en estático a densidad de 10 millones de células/ml y una concentración de hidrogel de 1.2 mg/ml ………………………54 Figura 34: Cultivo celular 3D en estático a densidad de 1 millón de células/ml y una concentración de hidrogel de 2.4 mg/ml ……………………………………..55 Figura 35: Cultivo celular 3D en estático a densidad de 3 millones de células/ml y una concentración de hidrogel de 2.4 mg/ml …………………………………..55 Figura 36: Cultivo celular 3D en estático a densidad de 10 millones de células/ml y una concentración de hidrogel de 2.4 mg/ml ………………………55 Figura 37: Diagrama del % de la viabilidad en microchips en estático ……….57 Figura 38: Cultivo celular 3D en chip microfluídico con flujo …………………..61 Figura 39: Hemocitómetro ……………………………………………………….....71 Figura 40: Esquema de las 4 celdas del hemocitómetro ……………………….72 Cultivo celular Proyecto - 5 - MEMORIA Cultivo celular Proyecto - 6 - APÍTULO 1 INTRODUCCIÓN El presente proyecto fin de carrera se enmarca dentro un proyecto de mayor envergadura, cuyo objetivo final es el desarrollo de nuevas herramientas microfluídicas dedicadas al cultivo celular. El rápido avance de la investigación biomédica durante las últimas décadas ha sido posible, en gran medida, gracias a la implantación de técnicas de cultivo celular. Dichas técnicas también han ido evolucionando para tratar de reproducir con mayor fidelidad la fisiología de los organismos vivos. En su expresión más básica el cultivo celular consiste en crecer células en placas de plástico, estando las células adheridas a la base de la misma. Sin embargo, y a pesar de su probada utilidad, estos sistemas no reproducen el ambiente tridimensional en el que se encuentran las células dentro del tejido vivo. En este contexto, los sistemas de cultivo tridimensionales son de gran importancia, ya que numerosas evidencias han demostrado que el comportamiento celular entre sistemas bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) es considerablemente diferente (Ref.1-2-3). Para estudiar el comportamiento celular en tres dimensiones se recurre al empleo de hidrogeles: soluciones proteicas que ante determinadas condiciones polimerizan y forman una matriz de soporte que mantiene a las células en un ambiente 3D. Estos modelos celulares 3D “in vitro” proporcionan una mejora, ya que permiten estudiar la migración celular en tres dimensiones y también las C Cultivo celular Proyecto - 13 - 2.2 ENCAPSULADO Debido a sus reducidas dimensiones el manejo del chip microfluídico es complicado, por lo que se diseñó un encapsulado cuyo objetivo es alojar al chip microfluídico y permitir así una fácil manipulación. El encapsulado está dotado de una serie de canales internos que permiten el perfecto acoplamiento con las entradas microfluídicas del chip, facilitando al usuario establecer el flujo a través de todo el sistema. La conexión entre los canales del encapsulado y las entradas del chip se sella mediante juntas tóricas (“o-rings”) de silicona, asegurando la estanqueidad del sistema. En la figura 3 se puede ver la imagen de dos encapsulados de diferente diseño fabricados por el grupo GEMM y utilizados en el proyecto. FIGURA 3: ENCAPSULADOS. (A) Encapsulado fabricado por prototipado rápido empleando “FULLCURE 720”, (B) Encapsulado fabricado por inyección empleando poliuretano. 2.3 EL RESERVORIO El reservorio es una botella de “pyrex” de 250 ml de volumen con tapón de plástico, modelo GL45, con diferentes conexiones en él. Estas conexiones se emplearán para introducir una serie de tubos y conectar el reservorio con el resto del sistema. La función del reservorio es almacenar el medio de cultivo que se hará fluir a través del sistema. Este reservorio debe estar cerrado A B Cultivo celular Proyecto - 14 - completamente para evitar escapes de aire o la contaminación biológica del medio. En la figura 4 se observa una imagen de este elemento. FIGURA 4: RESERVORIO. 2.4 MANORREDUCTOR Es el dispositivo que tiene como función regular la presión aplicada al reservorio para generar el flujo de medio dentro del chip microfluídico. En la figura 5 se muestra una imagen de este elemento. FIGURA 5: MANORREDUCTOR. Cultivo celular Proyecto - 15 - 2.5 Llaves de paso Por otro lado, en caso de ser necesarias se acoplaron llaves de tres vías a algunos de los tubos del sistema. Estas llaves de tres vías, o de “todo o nada”, permiten la conexión entre los distintos tubos en el sistema. En la figura 6 se muestra en (A) la llave de tres vías al natural y (B) el sistema con las llaves incorporadas al encapsulado mediante tubos. FIGURA 6: (A) LLAVE DE TRES VÍAS, (B) SISTEMA CON LLAVES INCORPORADAS. 2.5 SENSOR DE FLUJO El sensor de flujo empleado es un sensor comercial de Sensirion modelo LG160430. Este elemento tiene como función medir el flujo de medio de cultivo dentro del sistema. Regulando la presión aplicada al sistema a través del manorreductor, y con ayuda del sensor de flujo, podemos aplicar el flujo deseado al sistema. Se visualizan los datos de flujo (flujo en ȝl/minuto) en el PC mediante el software proporcionado por el fabricante. En la figura 7, se muestra el sensor real (A), otra que muestra el software utilizado por el fabricante (B) y (C) mostrando gráfica de flujo prácticamente constante entorno a 2,2 µl con el tiempo que da el sistema neumático. A B Cultivo celular Proyecto - 16 - FIGURA 7. (A) Sensor de flujo. (B) Software comercial del sensor. (C) Gráfico representando el flujo durante un experimento. A B C Cultivo celular Proyecto - 17 - APÍTULO 3 CONFINAMIENTO DEL GEL DE COLÁGENO EN CHIPS PERFUNDIDOS En este capítulo, se describe el desarrollo de un primer protocolo de confinamiento del hidrogel en la microcámara central del chip microfluídico. Una técnica de confinamiento eficiente debería permitir la inyección de una disolución acuosa cualquiera (en nuestro caso un hidrogel con células embebidas) dentro del chip microfluídico de tal modo que esta quede localizada exclusivamente en la microcámara central. De este modo, una vez inyectado y polimerizado el hidrogel, los microcanales laterales quedarían libres para hacer fluir diferentes disoluciones. En una primera aproximación se ideó un protocolo de confinamiento basado en el comportamiento laminar de los fluidos dentro de los sistemas microfluídicos. En un sistema de flujo laminar los procesos de mezclado entre dos fluidos se limitan casi exclusivamente a los debidos a la difusión. Por lo tanto, se ideó un protocolo de confinamiento basado en esta propiedad. El fundamento del protocolo consistiría en sellar las entradas de los microcanales laterales, y perfundir el hidrogel en la microcámara central. Debido al flujo laminar, y al diseño del chip, el hidrogel debería atravesar la microcámara central sin invadir los laterales. El proceso de polimerización de la mayoría de los hidrogeles dura apenas unos minutos, por lo que la difusión de moléculas entre la microcámara C Cultivo celular Proyecto - 18 - central y los microcanales laterales no debería afectar gravemente a la composición del hidrogel. 3.1 MONTAJE DEL SISTEMA PARA EL CONFINAMIENTO A continuación se describe en detalle el protocolo de montaje del sistema para el protocolo de confinamiento en chips perfundidos: 1. Se introduce el chip microfluídico dentro del encapsulado, quedando las juntas tóricas ajustadas a las salidas microfluídicas del chip, finalmente se cierra el encapsulado para garantizar la estanqueidad al chip. 2. Se acoplan tubos de silicona de 0.8 mm de diámetro interno y de unos 10 cm de largo en cada una de las salidas del encapsulado. Se coloca una llave de tres vías en cada tubo de silicona para abrir o cerrar el paso del flujo según se desee. Este elemento se utiliza porque permite un fácil control del paso de flujo sin provocar apenas cambios de volumen dentro del sistema. 3. Con una jeringuilla de 2 ml, se inyecta agua destilada en el chip a través de los diferentes tubos. Se intenta que el sistema quede sin burbujas de aire, ya que durante la posterior inyección del hidrogel estas burbujas pueden comprimirse y provocar cambios internos de volumen. Para intentar garantizar la ausencia de burbujas se examina el sistema con un microscopio conectado a un ordenador vía USB. 4. Una vez que dentro del sistema no se aprecian burbujas, se cierran las llaves de tres vías colocadas en los tubos laterales y se dejan abiertas las centrales (Figura 8). Cultivo celular Proyecto - 19 - FIGURA 8: ENCAPSULADO Y LLAVES DE TRES VÍAS UNIDAS A LOS TUBOS. Se indica con una “C” aquellas llaves que se encuentras cerradas y con una “A” aquellas que están abiertas. 5. Se procede a preparar el hidrogel de colágeno según protocolo A, con la excepción de que se incorpora un colorante, azul de toluidina al 2% v/v. Este colorante se añade al hidrogel para poder distinguirlo del agua dentro del sistema. Tanto los compuestos a utilizar, como las puntas de pipeta se introducen en un baño de hielo para evitar la polimerización del hidrogel antes de que sea introducido en el sistema. Al trabajar con volúmenes tan pequeños, una vez fuera del hielo el hidrogel se atemperará en cuestión de segundos y polimerizará muy rápidamente. 3.2 ELECCIÓN DELSISTEMA DE INYECCIÓN DE HIDROGEL La inyección de hidrogel de colágeno dentro del chip microfluídico resultó ser un paso clave para lograr el confinamiento mediante este protocolo, por lo que se fueron testando diferentes métodos. C C A A C C Cultivo celular Proyecto - 20 - 3.2.1 INYECCIÓN CON JERINGUILLA Se comenzó usando una jeringuilla de 2 ml, suficiente volumen para llenar la cámara central y hacer salir el hidrogel por el tubo del otro extremo. El hidrogel se carga dentro de la jeringuilla y esta se acopla al tubo de silicona central y se empieza a impulsar el hidrogel tratando de hacerlo lentamente. Una vez introducido el hidrogel en la cámara central, se procede a retirar la jeringuilla. FIGURA 9: FUGA DEL HIDROGEL A LOS MICROCANALES LATERALES POR INYECCIÓN CON JERINGUILLA. Como se puede ver en la figura 9, este protocolo de inyección no fue capaz de confinar apropiadamente el hidrogel. La mínima velocidad de inyección que se puede alcanzar manualmente es muy elevada (superior al flujo máximo de 55 µl/min que es capaz de detectar el sensor) para las dimensiones del sistema. Además es complicado mantener un flujo de inyección constante, experimentando cambios bruscos en el flujo durante la inyección. Estos flujos tan altos hacen que se produzcan fugas de hidrogel a los canales laterales. Es más, al retirar la jeringuilla del tubo, se generan bruscos cambios de volumen dentro del sistema y el hidrogel se dispersa por todo el chip microfluídico. Cultivo celular Proyecto - 21 - En conclusión, este sistema de inyección se descartó debido a flujos de inyección muy elevados y los cambios de volumen internos provocados. 3.2.2 INYECCIÓN CON MICROPIPETA Tras descartar el uso de jeringuillas se propuso sustituirlas por micropipetas, ya que estas permiten una inyección mucho más lenta y controlada. Se empleó la micropipeta de mayor precisión disponible, en un intento de disminuir lo máximo posible la velocidad de inyección. Se carga el hidrogel dentro de la micropipeta y la punta de esta se introduce en el tubo de silicona central. Se empieza a impulsar el hidrogel con cuidado, intentando mantener un flujo bajo y constante. Posteriormente, una vez el hidrogel está dentro de la cámara del chip microfluídico, se procede a retirar la micropipeta con cuidado. Sin embargo, a pesar de haber reducido considerablemente la velocidad de inyección, esta sigue siendo demasiado elevada y el hidrogel no queda completamente localizado en la microcámara central. Por otro lado, los desplazamientos de líquido que tienen lugar tanto al introducir como al retirar la micropipeta continúan ocasionando un fuerte desplazamiento del hidrogel y por consiguiente la pérdida del confinamiento. 3.2.3 INYECCIÓN POR PRESIÓN HIDROSTÁTICA Debido a los problemas sufridos con los anteriores sistemas, se desarrolló un sistema de inyección de baja velocidad basado en diferencias de presión hidrostática. Se procede del siguiente modo: el tubo central de entrada al sistema se ceba con el hidrogel y se cubre con hielo para evitar su polimerización mientras se prepara el resto del sistema. Al extremo libre del tubo de entrada se acopla una columna de líquido compuesta por un segmento de tubo acoplado a su vez a un tubo Eppendorff lleno con 1 ml de agua destilada. En la figura 10 puede verse este montaje. Cultivo celular Proyecto - 22 - FIGURA 10: SISTEMA DE INYECCIÓN POR PRESIÓN HIDROSTÁTICA. Para generar la presión que forzará al hidrogel a entrar en el sistema se sitúa el Eppendorff a una altura mayor que el resto del sistema Regulando dicha altura se podrá controlar la presión ejercida sobre el volumen de hidrogel y por lo tanto se regula también su velocidad de entrada. La llave de tres vías acoplada a la columna de líquido permite generar o bloquear el flujo de hidrogel sin causar cambios de volumen internos. Con esta metodología logramos obtener flujos estables de 1 µl/min. El flujo es constante y no se aprecian movimientos del hidrogel bruscos dentro de la cámara central ni tampoco se aprecian fugas a los canales laterales durante la inyección. En la figura 11, se muestra una foto de gel de colágeno teñido con azul de toluidina al 2% mediante el confinado por presión hidrostática. C C C C A A Cultivo celular Proyecto - 29 - En la figura 16 se pueden ver imágenes de cómo ocurre este proceso. FIGURA 16: SUCESIÓN DE IMÁGENES DE LA RETRACCIÓN DEL GEL. (A) Empieza a retraerse desde el “o-ring”, (B) Continua avanzando por el microcanal central, y (C) Alcanza a la microcámara central provocando pérdida total del confinamiento. En conclusión, este protocolo permitía obtener un confinamiento muy preciso, reproducible y más rápido que el usado en el capítulo 3. Además, este protocolo, en teoría, permitiría obtener una interfase entre el hidrogel y el medio muy definida, lo que sería interesante para ciertos experimentos, como yuxtaponer dos hidrogeles diferentes uno al lado de otro y estudiar el comportamiento celular. No obstante, experimentábamos problemas de retracción del hidrogel que no lográbamos explicar, por lo que en los siguientes capítulos tratamos de analizar en detalle este proceso. A B C Cultivo celular Proyecto - 30 - APÍTULO 5 MODELIZACIÓN DEL PROCESO DE CONFINADO Debido a la aparente dificultad para lograr un confinamiento eficiente, se analizó en detalle este proceso. Actualmente, existen algunos dispositivos microfluídicos que están siendo usados para el cultivo celular 3D, y en términos generales comparten un diseño común: poseen una microcámara central, en la que tendrá lugar la localización del gel, y dos microcanales laterales. Los canales laterales están separados de la cámara por una serie de columnas espaciadas regularmente. 5.1 FUNDAMENTO TEÓRICO DEL PROCESO DE CONFINAMIENTO En general, los dispositivos empleados para el cultivo celular en 3D se fabrican en PDMS, ya que presenta buenas propiedades en términos de biocompatibilidad, transparencia y precio. Durante la inyección del hidrogel dentro de estos chips microfluídicos, la presión ejercida por el émbolo de la pipeta (¨P p ) va impulsando el líquido a lo largo del dispositivo. Cuando este líquido llega a la cámara central, se forman C Cultivo celular Proyecto - 31 - diferentes interfaces líquido/aire entre los pilares, tal y cómo se muestra en la sucesión de imágenes de la figura 17. A) B) Cultivo celular Proyecto - 32 - C) FIGURA 17: COMPORTAMIENTO FÍSICO DEL HIDROGEL MIENTRAS SE CONFINA EN LA CÁMARA CENTRAL. (A) Paso del hidrogel por las primeras columnas y el ángulo que forma la interfase líquido/aire, (B) Ángulos que forma el hidrogel al salir de las primeras columnas y la interfase, (C) Diferencia de presión entre interfases (¨P gap y ¨P width ) y sus ángulos correspondientes. La ecuación de Young-Laplace permite analizar la diferencia de presión estas interfases: ¸ ¹ · ¨ © §+−=∆ hw P cc θθ γ coscos 2 Dónde ¨P describe la caída de presión a través de la interfase (Po - Pi) como una función de la tensión superficial (ı), del ángulo de contacto (șc) y del ancho (w) y alto (h) de la interfase. La mayoría de los hidrogeles están compuestos esencialmente por agua, por lo que la tensión superficial se asume igual a la del agua (0,072 N/m 2 ), mientras que el ángulo de contacto depende del material del chip microfluídico. Para el SU-8 este ángulo oscila entre 72 o y 86 o , mientras que para el PDMS varía entre 110 o y 140 o . La anchura y altura de la interfase las determina la geometría del propio dispositivo, y por lo tanto calcular la diferencia de presión en estas interfases es una tarea sencilla. Cultivo celular Proyecto - 33 - En este contexto, ¨P w equivale a la mínima presión requerida para hacer avanzar el líquido a través de la cámara central. Mientras que ¨P g equivale a la máxima presión que el sistema puede soportar antes de que las interfases laterales comiencen a avanzar entre los pilares y ocurran fugas. Por lo tanto, para garantizar el confinamiento debe cumplirse que la presión de inyección del gel sea mayor que ¨P w y menor que ¨P g . 5.2 ANÁLISIS DE PROCESO DE CONFINAMIENTO . Para satisfacer que ¨P w < ¨P p < ¨P g , el diseño del chip microfluídico puede optimizarse y así tratar de maximizar la diferencia entre ¨P g y ¨P w . Cómo ejemplo, en la figura 18, se representa cómo varía esta diferencia (¨Pgap - ¨Pwidth) al modificar el espacio entre columnas o la anchura de la cámara. Diferencia de presión entre espacio de una columna y ancho de la microcámara central -450 -400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 0 50 100 150 200 250 300 350 Espacio entre columnas (micras) Diferencia de presión (Pa) 400 micras width 800 micras width 1000 micras width 2000 micras width FIGURA 18: GRÁFICA QUE REPRESENTA LA DIFERENCIA DE PRESIÓN ENTRE COLUMNAS Y ANCHO DE LA MICROCÁMARA CENTRAL. En esta gráfica se ve como varía la diferencia de presión (¨Pgap - ¨Pwidth) frente al espacio entre columnas para diferentes anchuras de la cámara central. Cultivo celular Proyecto - 34 - Se trabaja para un rango de valores de espacio entre columnas de 25 a 300 ȝm, dando valores de diferencia de presión, en un rango de (-450 a 0) Pa. En este caso, las diferencias de presión son negativas porque nuestro chip está hecho de SU-8, material ligeramente hidrofílico con un ángulo de contacto de entre (72-86 º). Por otra parte, se puede observar como al aumentar el espacio entre columnas, aumenta la diferencia de presión considerablemente. En cuanto a la variación de la anchura de la cámara no es de gran relevancia el cambio en la diferencia de presión. En la figura 19 se representa la diferencia de presión (¨Pgap - ¨Pwidth) variando el espacio entre columnas y el ángulo de contacto. Diferencia de presión frente espacio entre columnas -3000 -2000 -1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 0 50 100 150 200 250 300 350 Espacio entre columnas ( micras) Diferencia de presión (Pa) 86 º 70 º 126 º 150 º FIGURA 19: GRÁFICA QUE REPRESENTA LA DIFERENCIA DE PRESIÓN FRENTE AL ESPACIO ENTRE COLUMNAS VARIANDO EL ÁNGULO DE CONTACTO. En esta gráfica se muestra como varía la diferencia de presión (¨Pgap - ¨Pwidth) frente al espacio entre columnas para diferentes ángulos de contacto. Esta figura pone de manifiesto que dependiendo de si el ángulo de contacto es mayor o menor de 90 o , el signo de la diferencia de presión cambia. Para ángulos de contacto por encima de 90º, como es el caso del PDMS usado en la literatura, las diferencias de presión son positivas y permiten confinar el Cultivo celular Proyecto - 35 - hidrogel siempre que el espacio entre columnas sea menor que la anchura de la microcámara central. Por otro lado, cuando el ángulo de contacto está por debajo de 90 o , como ocurre en el SU-8, la situación cambia dramáticamente y de hecho la invasión de los canales laterales está favorecida. En conclusión, al trabajar con SU-8, que es ligeramente hidrofílico, el protocolo confinamiento en seco empleado en otros dispositivos hidrófobos, resulta ser imposible, porque la diferencia de presión (¨Pgap - ¨Pwidth) tiende a ser negativa en cualquier caso. Cultivo celular Proyecto - 36 - APÍTULO 6 DESARROLLO DE UN PROTOCOLO ALTERNATIVO PARA CONFINAMIENTO Tras ver los resultados obtenidos mediante el protocolo de confinamiento empleado para dispositivos hidrofóbicos en nuestro dispositivo, se intentó modificar dicho protocolo para adaptarlo a dispositivos hidrofílicos. Finalmente se pudo obtener un protocolo modificado que resultó ser una alternativa sencilla y simple en cuanto a material y proceso para inyectar el hidrogel. 6.1 PRINCIPIOS FÍSICOS DEL PROTOCOLO ALTERNATIVO Como se ha explicado previamente, el carácter ligeramente hidrofílico del SU-8 hace que los líquidos se comporten de manera distinta en comparación con los dispositivos hidrofóbicos hechos en PDMS. En nuestro dispositivo hidrófilo, una vez que la solución de hidrogel ha comenzado a entrar en un microcanal (Figura 20A), el proceso de llenado continuará de forma espontánea debido a esta hidrofilicidad. Una vez que el hidrogel llega a la cámara central, la anchura del microcanal comienza a aumentar, llegando hasta las 1000 ȝm. En los dos vértices que delimitan este ensanchamiento de la microcámara central la interfase líquido-aire se queda detenida. Esto se debe a que en estos vértices las paredes del dispositivo han cambiado de dirección, haciendo que el ángulo de contacto con el líquido también cambie (Figura 20B). En este punto la interfase forma un ángulo con las paredes del microcanal de 90º, y por lo tanto, C Cultivo celular Proyecto - 37 - según la ecuación de Young-Laplace, la diferencia de presión es nula. Por lo tanto, la presión que inducía el llenado del chip desaparece y este proceso de llenado espontáneo se detiene. Para que el proceso continúe debe aplicarse una presión externa, ejercida con la micropipeta, y obligar a esta interfase a curvarse hasta que alcance un ángulo de contacto con las nuevas paredes similar al ángulo de contacto nativo (en torno a 80º para el SU-8 y el agua) (Figura 20C). Una vez que la interfase ha alcanzado este ángulo, el proceso de llenado vuelve a ser espontáneo hasta que la interfase alcanza los primeros pilares (Figura 20D). En este punto la situación es similar a la que ocurría a la entrada de la cámara, pero en esta ocasión existen dos interfases laterales y una central de mayor anchura. Para forzar el avance del hidrogel debe ejercerse de nuevo una presión suficiente como para que alguna de las nuevas interfases alcance una curvatura equivalente al ángulo de contacto nativo (80 o ) (Figura 20D). Tal y cómo se ha descrito previamente, la ecuación de YoungLaplace establece que ante una presión determinada la curvatura adoptada por una interfase depende de su altura y anchura. En la figura 20D puede observarse que las interfases laterales poseen una anchura mucho menor que la principal, y por lo tanto ante una presión determinada su ángulo de contacto será menor que para la interfase principal. Esto causa que la presión necesaria para hacer avanzar la interfase principal sea menor que en las interfases laterales, y por lo tanto se favorece el llenado de la microcámara central sin provocar la fuga a los microcanales laterales (Figura 20E). Esta situación se repetirá a lo largo de todos los pilares, y finalmente se habrá logrado llenar la microcámara central mientras que los laterales permanecen libres de líquido (Figura 20F). Cultivo celular Proyecto - 38 - A) B) C) D) E) F) FIGURA 20: SIMULACIÓN CONFINADO DE HIDROGEL MEDIANTE EL NUEVO PROTOCOLO. (A) Depósito de la gota, (B) Entrada del hidrogel por diferencias de presión a la microcámara central, (C) menisco cóncavo entrando en la microcámara, (D) Menisco convexo confinado la primera columna, (E) Hidrogel confinado mitad de la microcámara y percepción de las interfases tanto en la microcámara como en los microcanales laterales y columnas y (F) Confinado completo del hidrogel en la microcámara y sin percepción de fugas. Cultivo celular Proyecto - 45 - resistencias del microcanal antes de llegar a la microcámara central. 4 R Y 5 R son las resistencias que ofrecen los microcanales y tubos después de la microcámara central. Y finalmente 3 R, es la resistencia que ofrece el hidrogel de colágeno confinado en la microcámara central. Para explicar como se divide el flujo que pasa por el microcanal lateral izquierdo, hay que atender a la siguiente ecuación: T T t RR R II + ⋅= 4 1 Siendo 1 I el flujo que pasa a través del canal lateral izquierdo, 4 R es la resistencia ofrecida por la salida del microcanal lateral izquierdo y T R , la resistencia total que ofrece el resto del sistema. Para el caso del flujo que sale por el canal lateral derecho, se utiliza la misma ecuación de antes pero ahora quedaría: T T t RR R II + ⋅= 5 2 En teoría, el hidrogel es un elemento que genera gran resistencia al paso del flujo, aunque el valor exacto dependerá de la concentración de hidrogel empleada. Para definir las resistencias ofrecidas por los canales laterales, se utiliza la siguiente fórmula: 4 d k R= Dónde “k” es una constante y “d” es el diámetro del canal por donde pasa el flujo elevado a su cuarta potencia. Cómo se puede ver el elemento dominante al calcular la resistencia de un conducto circular es su diámetro. Cultivo celular Proyecto - 46 - En principio asumimos que R 1 = R 2 y R 4 = R 5 . Debido a la presencia del hidrogel, R 3 es mucho mayor que el resto de resistencias, lo que hará que la mayor parte del flujo continúe por el microcanal lateral en lugar de desviarse a través de la microcámara. Sin embargo, por pequeño que sea, siempre habrá un flujo transversal a través de la microcámara central, y hará que tarde o temprano uno de los colores domine por completo. Para que esto no ocurriese debería garantizarse que la presión con que ambos líquidos alcanzan la microcámara central es exactamente la misma, lo que debido al error instrumental o imperfecciones de los materiales no es posible. En conclusión, aunque hemos podido demostrar la formación de un gradiente químico a través de la microcámara, mantener dicho gradiente durante tiempos muy prolongados es complicado sin reajustar manualmente la presión en cada lado. Cultivo celular Proyecto - 47 - APÍTULO 8 DESARROLLO DE CULTIVO CELULAR 3D EN CHIPS MICROFLUÍDICOS Como se ha comentado al principio del presente proyecto, el comportamiento celular es muy diferente en una matriz extracelular 3D respecto de un microambiente 2D. Tanto las propiedades mecánicas, como las características químicas de estos microambientes 3D juegan un papel muy importante en la ingeniería de tejidos. En este capítulo se detallará el proceso de cultivo celular en un microambiente 3D y su viabilidad dentro de chips microfluídicos. El objetivo del presente capítulo es determinar las óptimas condiciones para el cultivo celular dentro de los microdispositivos. Los ensayos de cultivo celular 3D se han realizado empleando células MT3C3, una línea de fibroblastos comercial. Se ha usado esta línea por su bajo coste y amplia distribución en la investigación biomédica. En la siguiente figura 24, se esquematiza el microchip de un cultivo celular 3D con las células confinadas distinguiendo las vivas de las muertas en la cámara central y la diferenciación de los canales laterales entre un medio de nutrientes fresco y un medio pobre de nutrientes. C Cultivo celular Proyecto - 48 - FIGURA 24: ESQUEMA DE LOS ENSAYOS QUE SE LLEVARÁN A CABO EN EL MICROCHIP DE CULTIVO CELULAR 3D. En este esquema un microcanal permanecerá sellado, mientras que a través del otro se perfundirá medio de cultivo nuevo continuamente. Las células irán consumiendo los nutrientes y el oxígeno de la microcámara central, generando así un gradiente de los mismos. En este esquema se hipotetiza que aquellas células más próximas a la fuente de oxígeno y nutrientes sobrevivirán (esferas verdes), mientras que las más alejadas morirán (esferas rojas). 8.1 RESULTADOS DE VIABILIDAD EN HIDROGELES DE COLÁGENO MACROSCÓPICOS En primer lugar, para poder evaluar la viabilidad dentro de los chips se requiere de un sistema control con el que comparar los resultados. En este contexto, se elaboró un protocolo para obtener cultivos celulares 3D macroscópicos sembrados sobre placas de cultivo convencionales. En el anexo B, se explica detalladamente este protocolo así cómo los componentes empleados. En estos ensayos se sembraron diferentes densidades celulares en distintos sistemas control para estudiar tanto la viabilidad celular en estos hidrogeles de colágeno como su estructura 3D. En estos ensayos es habitual que al ir Cultivo celular Proyecto - 49 - creciendo las células provoquen una contracción del hidrogel, reduciéndose su volumen. En ensayos macroscópicos esto no suele ser relevante, sin embargo en nuestro sistema esta contracción del hidrogel podría alterar el confinamiento y arruinar el ensayo. Se ha descrito esta contracción se reduce a medida que aumenta la concentración del hidrogel. Por lo tanto se testaron también diferentes concentraciones de hidrogel para evaluar su efecto en la viabilidad celular y en la contracción. En las figuras 25, 26, 27, 28, 29 y 30 se muestran cultivos celulares 3D macroscópicos a diferentes densidades celulares y variando también la concentración del hidrogel de colágeno. Tras 24 horas en cultivo la viabilidad en estos sistemas fue evaluada mediante el uso de una tinción de viabilidad para observar las células vivas, marcadas en verde, mientras que las muertas aparecen en rojo. FIGURA 25: CULTIVO CELULAR 3D MACRO A DENSIDAD DE 1 MILLÓN CÉLULAS/ml Y UNA CONCENTRACIÓN DE GEL DE 1,2 mg/ml. (A) Primer plano del chip, (B) Plano medio del chip y (C) Fondo del chip. La escala base de estas fotos es 100 ȝm. A B C Cultivo celular Proyecto - 50 - FIGURA 26: CULTIVO CELULAR 3D MACRO A DENSIDAD DE 3 MILLONES CÉLULAS/ml Y UNA CONCENTRACIÓN DE GEL DE 1,2 mg/ml. (A) Primer plano del chip, (B) Plano medio del chip y (C) Fondo del chip. La escala base de estas fotos es 100 ȝm. FIGURA 27: CULTIVO CELULAR 3D MACRO A DENSIDAD DE 10 MILLONES CÉLULAS/ml Y UNA CONCENTRACIÓN DE GEL DE 1,2 mg/ml. (A) Primer plano del chip, (B) Plano medio del chip y (C) Fondo del chip. La escala base de estas fotos es 100 ȝm. FIGURA 28: CULTIVO CELULAR 3D MACRO A DENSIDAD DE 1 MILLÓN CÉLULAS/ml Y UNA CONCENTRACIÓN DE GEL DE 2,4 mg/ml. (A) Primer plano del chip, (B) Plano medio del chip y (C) Fondo del chip. La escala base de estas fotos es 100 ȝm. A C A A C B B C B Cultivo celular Proyecto - 51 - FIGURA 29: CULTIVO CELULAR 3D MACRO A DENSIDAD DE 3 MILLONES CÉLULAS/ml Y UNA CONCENTRACIÓN DE GEL DE 2,4 mg/ml. (A) Primer plano del chip, (B) Plano medio del chip y (C) Fondo del chip. La escala base de estas fotos es 100 ȝm. FIGURA 30: CULTIVO CELULAR 3D MACRO A DENSIDAD DE 10 MILLONES CÉLULAS/ml Y UNA CONCENTRACIÓN DE GEL DE 2,4 mg/ml. (A) Primer plano del chip, (B) Plano medio del chip y (C) Fondo del chip. La escala base de estas fotos es 100 ȝm. Observando los resultados macroscópicos, tenemos una viabilidad muy buena para las diferentes densidades celulares y para las concentraciones del hidrogel de colágeno testadas. Tal y cómo se esperaba, los hidrogeles de menor concentración (1,2 mg/ml) mostraron una mayor contracción con respecto a los de mayor concentración (2,4 mg/ml). Esto es particularmente evidente en las imágenes a 10 millones células/ml, en las que la densidad parece ser mayor en los hidrogeles de 1,2 mg/ml. Estos hidrogeles experimentaron una mayor contracción y por tanto las células quedan más concentradas de lo esperado. A B C A C B Cultivo celular Proyecto - 52 - Ahora podemos realizar los experimentos dentro de los chips microfluídicos y compararlos con estos resultados obtenidos en controles macroscópicos. 8.2 MÉTODO Y RESULTADOS DE CULTIVO CELULAR 3D EN CHIPS MICROFLUÍDICOS EN ESTÁTICO Los controles macroscópicos mostraron que en todas las condiciones ensayadas la viabilidad era bastante elevada. Por otro lado, la contracción del hidrogel ocurrió tal y como se esperaba. A continuación se procedió a testar estas mismas condiciones dentro de los chips microfluídicos. El método a seguir para cultivo celular 3D en estático, es el siguiente: 1. Se coge un chip microfluídico y se introduce en una placa Petri de pequeño tamaño en la campana extractora de flujo laminar. 2. Dentro de campana, se lava el chip, tanto externamente como internamente con isopropanol para esterilizarlo. De este modo garantizamos que hemos eliminado la presencia de posibles bacterias u hongos que podrían contaminar el cultivo. Posteriormente se hacen dos lavados con agua destilada para quitar los restos de isopropanol, que serían perjudiciales para las células. Finalmente se seca el chip aplicando vacío hasta dejarlo completamente seco por el exterior y por el interior. 3. Se procede al levantamiento de las células de la placa Petri. Se trata de “tripsinizar” (despegar las células de la placa Petri), centrifugar y contar estas células según protocolo en el anexo C. Cultivo celular Proyecto - 53 - 4. Posteriormente, se pasa a la preparación del hidrogel de colágeno según protocolo expuesto en el anexo A, y se añade el volumen necesario de células para que queden a la concentración de interés. Se mezclan bien las células con el hidrogel con una micropipeta y se deja en hielo para evitar una polimerización prematura. 5. Se cogen 10 ȝl de hidrogel de colágeno con las células y se confina en la microcámara central mediante la técnica de confinado detallada en el capítulo 7. Finalmente, la placa Petri cerrada con el chip se mete al biorreactor durante 15 minutos para permitir la polimerización del hidrogel. 37 ºC de temperatura, 5% de CO2 y 100% de humedad. 6. Finalizada la polimerización se añade suficiente medio de cultivo a la placa Petri y con la pipeta se purga el aire de los microcanales laterales, quedando ahora con medio de cultivo. 7. Se deja la placa en el incubador hasta el día siguiente. 8. Para evaluar la viabilidad dentro del chip, se retira el medio de cultivo y se lava con PBS, finalmente se añade la tinción de viabilidad a la placa y se lleva al microscopio. En las figuras 31, 32, 33, 34, 35 y 36 se muestran ensayos de cultivo celular 3D dentro de los chips microfluídicos. En estas condiciones la renovación de nutrientes y oxígeno depende exclusivamente de la difusión. Cultivo celular Proyecto - 54 - FIGURA 31: CULTIVO CELULAR 3D EN ESTÁTICO A DENSIDAD DE 1 MILLÓN CÉLULAS/ml Y UNA CONCENTRACIÓN DE GEL DE 1,2mg/ml. (A) Primer plano del chip, (B) Plano medio del chip y (C) Fondo del chip. La escala base de estas fotos es 100 ȝm. FIGURA 32: CULTIVO CELULAR 3D EN ESTÁTICO A DENSIDAD DE 3 MILLONES CÉLULAS/ml Y UNA CONCENTRACIÓN DE GEL DE 1,2 mg/ml. (A) Primer plano del chip, (B) Plano medio del chip y (C) Fondo del chip. La escala base de estas fotos es 100 ȝm. FIGURA 33: CULTIVO CELULAR 3D EN ESTÁTICO A DENSIDAD DE 10 MILLONESCÉLULAS/ml Y UNA CONCENTRACIÓN DE GEL DE 1,2 mg/ml. (A) Primer plano del chip, (B) Plano medio del chip y (C) Fondo del chip. La escala base de estas fotos es 100 ȝm. A B B C A B C Cultivo celular Proyecto - 61 - El comportamiento celular dentro de la microcámara central se fue observando durante varios días. Tras 7 días en flujo se tomaba el sistema completo y se perfundía con la tinción de viabilidad descrita en el protocolo D. En la figura 38A, puede verse como antes de activarse el flujo las células se encuentran distribuidas homogéneamente en los diferentes planos de la microcámara central. Tras 7 días, se muestra en la figura 38B como esta distribución cambia abruptamente y la mayoría de las células aparecen concentradas en las proximidades del microcanal que está siendo prefundido, presumiblemente debido a la creación de un gradiente de hipoxia y nutrientes a lo ancho de la microcámara central. FIGURA 38: CULTIVO CELULAR 3D EN CHIP MICROFLUÍDICO CON FLUJO. (A) Distribución celular antes de activar el flujo y (B) Distribución celular tras 7 días aplicando un flujo de 2-2.5 µL/min por el microcanal derecho. Con este ensayo hemos demostrado la capacidad del sistema de desencadenar un intenso proceso migratorio, debido probablemente a un gradiente de hipoxia y nutrientes. Esto reproduce con gran acierto lo que puede ocurrir “in vivo”, ya que en los tejidos las células se encuentran embebidas en una matriz proteica y reciben los nutrientes desde los vasos sanguíneos cercanos. Cuando un vaso se obstruye por un coágulo se generan las mismas condiciones que dentro de nuestro sistema. Por otro lado, cuando un tumor comienza a crecer va agotando los nutrientes y estas células tumorales comienzan a migrar siguiendo un patrón similar al mostrado en nuestro sistema. A B Cultivo celular Proyecto - 62 - En conclusión, hemos demostrado no solo la biocompatibildiad de nuestro sistema sino que también lo hemos empleado para reproducir un proceso biológico de gran interés como es la respuesta desencadenada por hipoxia y falta de nutrientes. Cultivo celular Proyecto - 63 - APÍTULO 9 CONCLUSIONES Y TRABAJO FUTURO Durante este proyecto de investigación se planteó crear un sistema microfluídico para estudiar el comportamiento celular en ambientes tridimensionales sometidos a un gradiente de nutrientes y oxígeno. Para ello se requería alcanzar una serie de objetivos. En primer lugar, debía lograrse un fino control sobre la localización de un hidrogel dentro del chip microfluídico. Para tal fin, se ha desarrollado exitosamente un protocolo de confinamiento en el que el hidrogel, con las células embebidas, queda localizado exclusivamente en la microcámara central, mientras que los canales laterales permanecen libres para el flujo de medio. En segundo lugar, se ha demostrado la biocompatibilidad del dispositivo. Ensayos con diferentes condiciones de densidad celular y concentración del hidrogel mostraron una viabilidad celular muy alta y, aparentemente, similar a los controles macroscópicos. Finalmente, se ha logrado mantener un cultivo con flujo continuo durante una semana. Durante estos ensayos se ha establecido un gradiente de nutrientes y C Cultivo celular Proyecto - 64 - oxígeno y se ha demostrado cómo las células migran en respuesta a este gradiente. Por otro lado, se llevaron a cabo ensayos preliminares para la formación de gradientes químicos dentro del sistema microfluídico. Aunque se ha demostrado la capacidad del sistema para generar dichos gradientes a corto plazo, aún debe trabajarse para mantener su estabilidad de manera indefinida. TRABAJO FUTURO Este proyecto de investigación no acaba en estos ensayos sino que tiene un trabajo futuro muy amplio. Una vez que se ha demostrado la viabilidad del sistema, estudios posteriores muy interesantes serían ensayos con células tumorales sometidas a las mismas condiciones de gradiente de nutrientes. Parece que la deprivación de nutrientes aumenta la capacidad de metástasis e invasión de los tumores, y el sistema que hemos desarrollado serviría como modelo para estudiar dicho comportamiento y testar nuevos fármacos que detengan esta invasión acelerada por la hipoxia y la falta de nutrientes. También otra de las ideas más destacadas es seguir haciendo ensayos de gradientes bioquímicos. Estas biomoléculas podrían ser factores de crecimiento, fármacos, medios de nutrientes con diferentes composiciones a la utilizada en estos ensayos y otras muchas según el interés concreto del estudio. Para ensayos futuros en la formación de gradientes, se han propuesto el uso de bombas peristálticas trabajando de forma alterna. Al utilizar dos bombas peristálticas, una en cada canal, mientras se impulsa líquido por un canal, el otro queda pinzado tanto en la entrada como en la salida, aportando una presión suficientemente alta para que el flujo vaya por el canal adecuado. Cultivo celular Proyecto - 65 -