Repositorio Institucional de Documentos

Proyecto Fin de Carrera INGENIERO AGRÓNOMO “Validación de marcadores moleculares asociados a la androesterilidad en cebolla (Allium cepa L.). Aplicación a la selección en poblaciones mejoradas de Cebolla Fuentes de Ebro.” Autor: José Ignacio López Villalba Directores: Ana Gárces-Claver Cristina Mallor Giménez Escuela Politécnica Superior de Huesca 2014 AGRADECIMIENTOS Sin duda el presente trabajo fin de carrera lleva implícita la necesidad de manifestar mi más sincero y cordial agradecimiento a todas las personas que han hecho posible su desarrollo, en concreto: Al laboratorio de Biología Molecular del Plantas, de la Unidad de Hortofruticultura del Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria (CITA) por haberme brindado la oportunidad de realizar un trabajo de tales características prestándome sus instalaciones y equipos, así como el ambiente de trabajo realmente acogedor en el que me he desenvuelto durante la realización del mismo. Deseo agradecer por su dirección, instrucción y gran ayuda incondicional en todo momento a Ana Garcés, Cristina Mallor y Ester Sales. A Mary (Rita Navarro) por toda la ayuda ofrecida, la técnica que me ha conseguido transmitir, así como por toda la paciencia que le ha tocado tener conmigo. Al resto de personas: Teresa, Pilar, Ramón, Oreto, Arantxa, Bea, Pili… que han habitado el Laboratorio durante mi estancia, generando un clima de trabajo excepcional, ofreciéndome su grata ayuda en todo momento. Gracias a todos. Índice ÍNDICE Índice de tablas…………………………………………………………………………I Índice de figuras……………………………………………………………….………II Lista de Abreviaturas………………………………………………………….…...…III Resumen………………………………………………………………………..….…..V Abstract……………………………………………………….………………..……..VII 1. INTRODUCCIÓN......................................................................................... 1 1.1. El cultivo de la cebolla........................................................................... 1 1.1.1. Características botánicas de la cebolla .......................................... 1 1.1.2. Importancia económica................................................................... 2 1.1.3. La colección de cebolla del Banco de Germoplasma de Especies Hortícolas del CITA...................................................................................... 3 1.1.4. La cebolla de Fuentes de Ebro....................................................... 4 1.2. Mejora genética de la cebolla................................................................ 6 1.2.1. Genética y mejora de la cebolla...................................................... 6 1.2.2. Androesterilidad en cebolla ............................................................ 7 1.2.3. Métodos de selección..................................................................... 9 1.2.4. Marcadores moleculares asociados a la androesterilidad en cebolla.. ..................................................................................................... 12 2. OBJETIVOS............................................................................................... 15 3. MATERIAL Y MÉTODOS .......................................................................... 17 3.1. Material vegetal................................................................................... 17 3.2. Extracción y cuantificación de ADN a partir de hoja y bulbo de cebolla…....................................................................................................... 18 3.3. Marcadores moleculares, amplificaciones y electroforesis.................. 20 3.4. Análisis de los resultados.................................................................... 21 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................. 23 4.1. Optimización de la extracción de ADN de hoja y bulbo de cebolla. .... 23 Índice 4.3. Identificación de líneas androestériles y mantenedoras en las poblaciones Fuentes 1 y Fuentes 2 .............................................................. 27 4.4. Genotipado para androesterilidad de variedades de cebolla españolas conservadas en el BGHZ.............................................................................. 29 5. CONCLUSIONES...................................................................................... 33 6. REFERENCIAS ......................................................................................... 35 ANEXO I: Protocolo de extracción de ADN optimizado.................................... 41 ANEXO II: Condiciones y reacciones de PCR para los distintos marcadores utilizados .......................................................................................................... 42 1.1. Condiciones y reacción para conjunto de cebadores MK.................... 42 1.2. Condiciones y reacción para el par de cebadores OPT...................... 42 1.3. Condiciones y reacción para par de cebadores jnurf05 ...................... 43 1.4. Condiciones y reacción para el par de cebadores PSAO.................... 43 1.5. Condiciones y reacción para el par de cebadores DNF-566............... 44 1.6. Condiciones y reacción para el par de cebadores RNS-357............... 44 ANEXO III: Comparación de medias obtenidas de valores de concentración de ADN y de los ratios 260/280 y 260/230 en los 4 ensayos realizados............... 45 ANEXO IV: Resultados MK, OPT y Jnurf05 para Familia Fuentes 2................ 46 Índice de tablas I ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: Variedades locales de cebollas españolas (BGHZ) 18 Tabla 2: Modificaciones del tratamiento del material vegetal y de los volúmenes de CTAB y de 2-mercaptoetanol para los cuatro métodos de extracción de ADN total ensayados 19 Tabla 3: Marcadores moleculares asociados a la androesterilidad en cebolla analizados en este trabajo 21 Tabla 4: Concentraciones de ADN y ratios de absorbancia para los cuatro ensayos realizados. 23 Tabla 5: Concentración y ratios de absorbancia 260/280 y 260/230 (medias ± SE, con n=3) a obtenidos para los cuatro métodos ensayados. 24 Tabla 6: Análisis de 5 marcadores moleculares asociados a la androesterilidad en cebolla utilizando cinco líneas fenotipadas de A. cepa L 26 Tabla 7: Resultados de la amplificación con los marcadores MK, OPT y jnurf05 los individuos de las familias Fuentes 1 y Fuentes 2 (A. cepa L.). En las celdas se indica el nº de individuos que han presentado el mitotipo y el estado alélico genotipado por el marcador. 29 Tabla 8: Mitotipo de 20 variedades de cebolla, analizado con el marcador MK, y genotipado del locus MS con los marcadores jnurf05 y OPT. 31 Índice de figuras II ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Distribución por continentes de la producción mundial en el año 2011 de cebollas secas, cebollas verdes y chalotes (FAOSTAT, 2013) 3 Figura 2: Electroforesis de los fragmentos amplificados con los marcadores PsaO, OPT, DNF-566 y jnurf05 a partir de ADN de 6 plantas de la línea androestéril BGHZ-4552. También se observa la amplificación con jnurf05 de las entradas PM (fértil) y PF (androestéril), procedentes de una parcela de un agricultor. 27 Figura 3: Ejemplo de los productos de amplificación obtenidos para algunos individuos de las familias Fuentes 1 y Fuentes 2 utilizando el marcador MK. a) Individuos de la familia Fuentes 1, los fragmentos amplificados de 833 y 628 pb, correspondieron a un genotipo CMS-T. b) Individuos de la familia Fuentes 2, el fragmento amplificado fue de 628 pb, lo que indicó citoplasma N. 28 Figura 4: Electroforesis de los productos de amplificación obtenidos para las variedades españolas de cebolla utilizando el marcador citoplasmático MK. 30 Abreviaturas III LISTA DE ABREVIATURAS ADN: ácido desoxirribonucleico. ADNasa: Endonucleasa digestiva. ADNmt: ADN mitocondrial. AFLPs: (Amplified Fragment Length Polimotphism PCR) Polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados. ANOVA: (Analysis of variance) Análisis de varianza. BGHZ: Banco de Germoplasma de Hortícolas de Zaragoza. CAPS: (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) Secuencias digeridas amplificadas polimórficas. CITA: Centro de Investigación y Tecnológica Agroalimentaria de Aragón. cM: Centimorgan CMS: (Cytoplasmic Male sterility) Esterilidad citoplasmática masculina. CMS-S: (Fertility restoration system type S) Sistema restauración fertilidad tipo S. CMS-T: Fertility restoration system type S) Sistema restauración fertilidad tipo T. CTAB: (Cetyl Trimethylammonium Bromide) Bromuro de cetiltrimetilamonio. EDTA: (Ethylenediaminetetraacetic) etilendiaminotetraacético. N 2: nitrógeno líquido. OPT: (Putative oligopeptide transporter) Gen del transporte oligopeptido putativo. ORF: (Open Reading Frame) Marco de lectura abierto. Pb: pares de bases. PCR: (Polymerase Chain Reaction) Reacción en cadena de la polimerasa. RAPD: (Random Amplified Polymorphic DNA) Amplificación aleatoria de ADN polimórfico. RFLP: (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción. Introducción 2 efectuarse la polinización entre las diferentes flores de la misma umbela o las otras umbelas del mismo bulbo. Se pueden producir hasta seis semillas por flor. El sistema radicular está formado por numerosas raíces fasciculadas blancas. El tallo está representado por una masa caulinar aplastada con los entrenudos cortos y situada en la base del bulbo llamada disco, que emite un escapo floral hueco de sección cilíndrica de entre uno y dos metros de largo que da origen a la inflorescencia. Las hojas insertadas sobre el disco están constituidas de dos partes fundamentales, una inferior o vaina envolvente y una superior o filodio, hueca redondeada y con los bordes unidos. Las vainas pertenecientes a las hojas exteriores adquieren una consistencia membranosa y actúan como túnicas protectoras, mientras que las vainas de las hojas interiores engruesan al acumular sustancias de reserva formando la parte comestible del bulbo (Maroto, 1995). 1.1.2. Importancia económica En la actualidad la cebolla se cultiva en todo el mundo, ya que existe un gran número de cultivares con distinta adaptación a las diferencias de la climatología y del fotoperiodo que influyen en su desarrollo. Su cultivo es el más importante dentro de su género y en cuanto a cultivos de hortalizas mundiales, se encuentra en segundo lugar después del tomate (FAOSTAT, 2013). La producción mundial de cebollas en el año 2011 alcanzó un valor para cebollas secas de 86 millones de toneladas y de 4 millones de toneladas para cebollas verdes y chalotes (FAOSTAT, 2013). Los porcentajes de producción por continentes se pueden observar en la figura 1. Introducción 3 Figura 1: Distribución por continentes de la producción mundial en el año 2011 de cebollas secas, cebollas verdes y chalotes (FAOSTAT, 2013) En relación con el comercio exterior, España es un país exportador de cebolla generalmente a países europeos como Alemania, Inglaterra, Portugal, Francia, Holanda y Bélgica, con un 90% de la exportación total (MAGRAMA, 2014). La producción española para cebollas secas fue de 1,3 millones de toneladas y para cebollas verdes y chalotes de 43.000 toneladas, situándose así en el puesto décimo segundo de productores mundiales. Se cultiva en todas las comunidades de España teniendo gran importancia en comunidades mediterráneas como Valencia, Cataluña o Andalucía, así como zonas de interior como Aragón o Castilla-La Mancha, siendo el 85% de la superficie en regadío y al aire libre (Soria, 1997). Aragón ocupa el quinto puesto tanto en producción como en superficie cultivada, cultivando mayoritariamente cebolla grano y babosa (Carravedo y Mallor, 2007). 1.1.3. La colección de cebolla del Banco de Germoplasma de Especies Hortícolas del CITA El Banco de Germoplasma de Especies Hortícolas (BGHZ) se creó en el año 1981 con un objetivo prioritario: la conservación de los recursos genéticos hortícolas de España para evitar la pérdida de variabilidad intraespecífica que se estaba produciendo debido a la sustitución de muchas de las antiguas variedades locales por variedades mejoradas, más uniformes pero con una Introducción 4 base genética más restringida (Álvarez y Marín, 1983). Después de más de 30 años del inicio de sus actividades, el BGHZ se ha convertido en un importante banco de germoplasma de hortícolas tanto a nivel nacional como internacional. Actualmente, el banco conserva 17.780 entradas pertenecientes a 357 especies, que incluyen, además de cultivares locales de las hortícolas más importantes, especies de cultivo minoritario y otras silvestres relacionadas, todas ellas de gran utilidad para la mejora genética y la conservación de la biodiversidad. Las diferentes entradas se mantienen en el banco en forma de semillas en condiciones de larga duración, esto es a baja temperatura y humedad relativa, lo que les permite conservarse durante décadas sin perder el poder germinativo (Mallor et al., 2012). En el BGHZ, destacan importantes colecciones específicas, entre las que se incluye la de cebolla, que ha sido objeto de la publicación “Variedades autóctonas de cebollas españolas” (Carravedo y Mallor, 2007), en las que se describen las características de las entradas que conforman esta colección. Actualmente la colección de cebolla está formada por 686 entradas. Parte de este material vegetal ha sido caracterizado morfológica y molecularmente (Mallor et al., 2011; Mallor et al., 2013) y en la actualidad se está utilizando para el estudio de caracteres relacionados con la calidad (Garcés-Claver et al., 2013; Andrés-García et al., 2013). Adicionalmente, se están desarrollando metodologías para la identificación/desarrollo de genotipos de interés (líneas doblehaploides y líneas androestériles), necesarios para llevar a cabo programas de mejora en esta especie (Castillo et al., 2013). 1.1.4. La cebolla de Fuentes de Ebro La cebolla Fuentes de Ebro es una variedad autóctona aragonesa caracterizada principalmente por su escaso picor, lo que la hace un producto valorado muy positivamente por los consumidores, además de su terneza y jugosidad; popularmente se dice de ella que “no pica y tiene un sabor dulzón”. Introducción 5 Esto viene motivado por las características del suelo de la zona de producción, las prácticas del cultivo y el material vegetal utilizado (Mallor et al., 2007). También se caracteriza por su cuello grueso, su forma globosa redondeada por la raíz y ligeramente alargada hacia el tallo y su coloración externa blanco-paja. Sus túnicas interiores son blancas, carnosas y crocantes. En Aragón se cultivan en torno a unas 150 ha de esta variedad (Mallor et al., 2010). Desde 1997 cuenta con la marca C’alial que otorga el Gobierno de Aragón a los productos agroalimentarios con reconocida calidad y reputación. Desde el 26 de octubre de 2010 cuenta con la Denominación de Origen (DO) Protegida y el pasado 25 de noviembre de 2013 se publicó en el DOUE la inscripción de la Cebolla Fuentes de Ebro DOP en el Registro de Denominaciones de Origen de la Unión Europea. Su integración en este registro de denominaciones de origen limita la zona de cultivo en la confluencia del valle del Ginel con el valle del Ebro, englobando las localidades de Fuentes de Ebro, Mediana de Aragón, Osera de Ebro, Pina de Ebro, Quinto de Ebro y Villafranca de Ebro. Actualmente, cuenta con tres empresas inscritas, 19 agricultores y 55 hectáreas cultivadas. (http://www.aragon.es, Denominaciones de origen protegidas). En el presente proyecto se ha trabajado con material vegetal de esta variedad que proviene de un programa de selección que se está llevando a cabo con esta variedad (Mallor y Sales, 2012). Dicho programa nace del interés de homogeneizar los bulbos de esta variedad principalmente en cuanto a su nivel de pungencia, ya que se había puesto de manifiesto grandes diferencias entre los diversos individuos (Mallor et al., 2010). El programa de selección se inició con la obtención de semillas de esta variedad a través de agricultores de Fuentes de Ebro, las muestras recolectadas fueron 15 y se sembraron para su estudio en 2006. El estudio de este material vegetal puso de manifiesto la heterogeneidad de los bulbos, particularmente en cuanto a su nivel de pungencia, justificando así la necesidad de iniciar un programa de mejora con esta variedad (Mallor et al., 2010). Con este objetivo, en 2008 se realizó una selección masal de los bulbos cuya expresión genotípica resultó más interesante, considerando como criterio Introducción 6 principal la pungencia pero también otras características relevantes en la calidad de la cebolla como el tamaño, la firmeza y el contenido en sólidos solubles. Se cultivaron conjuntamente en una jaula de aislamiento y se obtuvo la semilla de cada planta individualmente. De esta manera, se formaron doce familias de medios hermanos (misma madre y diferentes padres). Estas doce familias seleccionadas se sembraron en dos parcelas, una situada en Montañana en el CITA (Zaragoza) y la otra en Fuentes de Ebro (Zaragoza). Se utilizó un ensayo estadístico de bloques al azar con cuatro repeticiones y parcelas elementales de 80 plantas. Se analizaron 20 bulbos por repetición, parcela y familia. De las 12 familias, las que mejor resultado proporcionaron en cuanto a los parámetros deseados, fueron la Familia 1 (F1) y la Familia 2 (F2). Con objeto de incrementar la cantidad de semilla, se cultivaron los bulbos en dos jaulas de aislamiento en el CITA, y se recogieron las semillas de cada familia por separado. Estas dos familias F1 y F2 han sido objeto de estudio en este proyecto, para identificar genotipos de interés en estas líneas que ya han sido sometidas a un proceso de selección. 1.2. Mejora genética de la cebolla 1.2.1. Genética y mejora de la cebolla La cebolla es una especie diploide cuyo genoma consta de 15.300 Mpb/1C, y se organiza en ocho pares de cromosomas (2n=16) (Fristch et al., 2002), siendo éstos de gran tamaño y con una morfología bien definida de sus cromátidas y de la posición de su centrómero. Las poblaciones son altamente heterocigotas y muestran una variación fenotípica importante (Mc Callum et al., 2007). Generalmente la mejora genética en cebolla persigue obtener individuos con: - Uniformidad del tamaño, forma, color y fecha de madurez del bulbo. - Altos rendimientos. Introducción 7 - Buena adaptación a las condiciones de cultivo de una determinada zona. - Resistencias a plagas y enfermedades. - Resistencia a la floración prematura. - Piel intacta y atractiva. - Cuello fino. - Bulbo único y centrado (sin bulbos dobles ni divididos). - Carne firme. Además según sea su categoría, se buscan diferentes mejoras: -Bulbos destinados a almacenamiento: se busca que posean una dormancia larga innata, carne dura y pieles resistentes. -Bulbos destinados al consumo en fresco: deben tener sabor suave, ser dulces y de un único anillo concéntrico grande. -Bulbos destinados a deshidratación: deben tener un elevado contenido en materia seca, piel y carne blancas y un contenido bajo en azúcares reductores. Para este tipo son así mismo deseables los bulbos esféricos y aplanados, porque facilitan el corte mecánico de cuello y raíces con una pérdida reducida de carne del bulbo. 1.2.2. Androesterilidad en cebolla La esterilidad citoplasmática masculina o CMS (Cytoplasmic Male Sterility) se puede encontrar en más de 140 especies de plantas, incluyendo la cebolla (Laser y Lersten, 1972). Los factores inductores se encuentran en el genoma mitocondrial (Hanson, 1991) por lo que se trata de un carácter que se transmite sólo de las madres a la descendencia. La CMS puede ser restaurada por acción de genes nucleares ‘restauradores de la fertilidad’ (Rf). Estos genes han sido aislados en petunia (Bentolila et al., 2002), rábano (Brown et al., 2003), arroz (Komori et al., 2004) y sorgo (Klein et al., 2005). Introducción 8 En las plantas superiores como la cebolla, la esterilidad masculina puede deberse bien a un fallo en la formación de polen, a la producción de polen no funcional, o a la incapacidad de producir la dehiscencia de las anteras en la floración. Es por ello que los individuos androestériles, al no desarrollar el polen, son incapaces de autopolinizarse, por lo que cualquier semilla que produzcan deberá ser el resultado de una polinización cruzada. Esta característica es utilizada por tanto en la obtención de híbridos. En ausencia de androesterilidad el cruzamiento controlado sólo se podría conseguir eliminando manualmente en las plantas de la línea femenina las anteras de todas las flores que forman la umbela y a continuación fecundar también manualmente los estigmas con el polen del progenitor deseado en el momento adecuado, lo cual resulta extremadamente trabajoso. En cebolla existen dos tipos androesterilidad: la CMS-S (Jones y Emsweller, 1936) y CMS-T (Berninger, 1965), en función del control genético de la restauración de la fertilidad. Mientras que para CMS-S la restauración de la fertilidad es controlada por un único locus, denominado Ms, para CMS-T pueden estar interviniendo tres loci independientes (Jones y Clarke,1943; Scheisguth, 1973). Como se ha mencionado, la CMS es inducida por factores que se encuentran en el genoma mitocondrial y que en consecuencia se heredan vía materna (Brewster, 1994). Por tanto la identificación del tipo de citoplasma (mitotipo) es esencial para conocer el carácter androestéril. Podemos encontrar tres tipos de individuos: i) el mitotipo normal (N), siempre dará lugar a individuos con polen fértil; ii) el mitotipo de citoplasma S (sistema CMS-S), producirá junto con genotipos recesivos homocigóticos msms individuos androestériles; iii) y el mitotipo de citoplasma T (sistema CMS-T), producirá individuos fértiles o androestériles según el estado alélico de los loci que controlen la androesterilidad de este sistema. Por tanto, en la cebolla, como resultado de la interacción entre el factor citoplasmático y el gen nuclear Ms podemos encontrar: a) líneas androestériles (CMS): en las que el mitotipo podrá ser CMS-T o CMS-S. En el caso del sistema CMS-S, la forma del gen nuclear Ms determinará la producción de polen fértil. Cuando el gen sea dominante Introducción 9 homocigoto (MsMs) o heterocigoto (Msms) se producirá polen fértil y cuando la forma alélica sea homocigota recesiva (msms) el polen no será fértil. b) líneas restauradoras de la fertilidad o mantenedoras (Nmsms): son fértiles con mitotipo N y gen nuclear recesivo homocigótico (msms). Estas líneas son las encargadas de perpetuar las líneas androestériles porque su hibridación con ésta producirán descendencias cuyo genotipo será Smsms. Las plantas con esta constitución, se dan con una frecuencia del 5% en la mayoría de las poblaciones (Pike, 1986). El sistema genético CMS-S fue descubierto en el cultivar “Italian Red” y fue utilizado por primera vez por Jones y Clarke (1943) el cual describió la genética de la androesterilidad así como la forma de utilizarlo para producir cultivares híbridos. El sistema CMS-T, fue identificado por Berninger (1965) en el cultivar francés “Jaunepaille des Vertus”. Está controlado por tres loci independientes (Schweisguth, 1973) motivo por el cual el sistema CMS-S es el preferido por los mejoradores y empresas de semillas ya que la herencia de un único locus es más sencilla y estable en diferentes condiciones climáticas (Havey, 2000). En el sistema CMS-T, las plantas son fértiles si tienen el alelo dominante restaurador de la fertilidad A o dos de los alelos dominantes C y D para dos genes complementarios (Havey, 2002). Así, la identificación de los tipos de citoplasma (N, S o T) resulta esencial como primer paso para la obtención de híbridos F1, ya que este tipo de programas de mejora puede llevar de 4 a 8 años con análisis genéticos convencionales, periodo que se incrementa en cebolla dada la característica bienal de este cultivo. Por ello la identificación de marcadores moleculares asociados a estos mitotipos y genes nucleares resulta crucial para una eficiente selección de genotipos útiles en la obtención de híbridos (Havey, 1995). 1.2.3. Métodos de selección En cuanto a los métodos de selección utilizados en cebolla, se incluyen la selección masal, la selección genealógica y el desarrollo de híbridos F1. Introducción 10 En la selección masal se eligen las mejores plantas de una población según los objetivos buscados. Es más efectiva cuando los caracteres esperados son fácilmente evaluables y de alta heredabilidad, siendo además deseable que estos caracteres estén determinados por pocos genes. Si trabajamos con caracteres cuantitativos o de baja heredabilidad que están más condicionados por la interacción ambiente-genotipo resulta menos recomendable utilizar este método. Resulta muy práctico por ejemplo cuando se requiere un cambio importante para adaptar una población mejorada a una nueva localidad, debido a que los bulbos no deseados son cuantiosos y fácilmente notorios. Otro método de selección es el genealógico, procedimiento que es factible utilizar tanto para analizar caracteres cuantitativos como cualitativos, dado que se puede distinguir la interacción ambiente-genotipo. Recolectando la semilla individualmente de cada planta se obtienen familias de medios hermanos (misma madre y diferentes padres). Se seleccionan entonces bulbos en base a la media de la familia de medios hermanos y de sus desviaciones respecto a la media de la población. En cuanto a la producción de híbridos, al tratarse de una especie alógama este sistema permite la explotación de la heterosis, evitando así la depresión por consanguinidad. Debido a este vigor híbrido, el cruzamiento de variedades de cebolla muy distintas da lugar a híbridos que exceden en vigor a los parentales. En los híbridos la influencia de alelos recesivos desfavorables presentes en homocigosis en una de las líneas parentales, se oculta por la presencia de alelos deseables dominantes del otro progenitor. Por ejemplo, se cruzó una cebolla finesa con una variedad noruega de bulbo grande y se obtuvieron híbridos con un vigor superior a cualquiera de los parentales (Synnevag, 1988). La semilla que procede de los cultivares híbridos tiene más supervivencia y rendimiento que la semilla de un cultivar con polinización abierta, que siempre tendrá semillas procedentes de autofecundación. Otro punto positivo sobre la utilización de híbridos lo tienen las empresas de semillas ya que los híbridos no se pueden reproducir de la semilla guardada, Introducción 11 sino que deben ser producidos de nuevo a partir de las líneas parentales apropiadas (Brewster, 1994). Para la producción de híbridos se tienen que desarrollar, por un lado, líneas androestériles y mantenedoras que estén bien adaptadas a la localidad donde se cultivará el híbrido, y por el otro una línea polinizadora con una buena aptitud combinatoria específica. Para que el híbrido se desarrolle adecuadamente, utilizando el sistema CMS-S, la línea madre deberá tener la constitución genética ‘Smsms’, con esto, se asegura que no se produzca la autofecundación. Estas líneas madres se mantienen al cruzarlas con líneas mantenedoras como se refleja en el apartado 1.2.2. En cuanto a la línea paterna puede tener una constitución de citoplasma normal (N) con cualquier combinación (MsMs, Msms o msms) o con un citoplasma S una combinación Msms o MsMs. Las líneas maternas y paternas se siembran juntas para que se crucen y con ello se obtiene la semilla hibrida en la F1, la cual se recoge en las líneas maternas. Hay que tener en cuenta en la producción de híbridos que los individuos pueden sufrir polinización cruzada de manera entomófila es por ello que estas líneas androestériles deberían estar separadas 1.5 km de otros cultivos de cebolla para evitar contaminaciones polínicas. Otro factor importante a tener en cuenta a la hora de producir semilla híbrida es conseguir que las líneas maternas y paternas florezcan a la vez, lo cual se puede optimizar escalonando las fechas de plantación de las dos líneas. Cabe destacar que la utilización de híbridos F1 de cebolla está implantada actualmente en España. El desarrollo de nuevos híbridos es de interés creciente para las casas comerciales de semillas, que buscan nuevos híbridos con aspectos destacables como: la homogeneidad de cultivo, tanto en su forma como desarrollo de cultivo; la precocidad; el mayor periodo de conservación y, por lo tanto, de comercialización; y la presencia de un único anillo de formación interior, idóneo para el “slicing” o cortado para aros de cebolla y aprovechamiento en la industria de la IV gama. Para el desarrollo de estos híbridos en cebolla a escala comercial es indispensable el uso de la androesterilidad citoplasmática. Esta herramienta trae aparejado la necesidad de obtener una variedad que actúe como madre y que sea androestéril, otra Material y métodos 18 Tabla 1: Variedades locales de cebollas españolas (BGHZ) a Pungencia de los bulbos evaluada mediante cuantificación del ácido pirúvico (µmol g -1 FW) producido tras la lisis celular usando el método propuesto por Schwimmer y Weston (1961) y modificado por Boyhan et al. (1999): Baja= entre 0 y 3 µmol g -1 FW, media= entre 3 y 7 µmol g -1 FW, alta= más de 7 µmol g -1 FW b Descrito en concordancia con la latitud en la que se recolectaron: día corto (0-32º latitud N), día medio (33-39º latitud N) y día largo (>40º latitud N) 3.2. Extracción y cuantificación de ADN a partir de hoja y bulbo de cebolla. El ADN total fue aislado a partir de 50 mg de hoja joven de plantas de las familias Fuentes 1 y Fuentes 2 y de 75 mg de bulbo liofilizado y molido en el caso de las variedades españolas. El método seguido inicialmente fue el descrito por Doyle y Doyle (1987) con modificaciones menores (Garcés-Claver et al., 2007). En los primeros pasos de este protocolo se utiliza el CTAB como detergente catiónico que solubiliza las membranas y desplaza cationes unidos al ADN, evitando que actúen las ADNasas. También se Nº Código Procedencia Nombre local Pungencia a Color piel Fotoperiodo b 1 BGHZ-3745 Zaragoza Zaragozana Baja Marrón Día largo 2 BGHZ-4222 Zaragoza Cebolla de Fuentes Baja Marrón Día largo 3 BGHZ-0227 Barcelona Cebolla Vigatana Baja Morada Día largo 4 BGHZ-0534 Córdoba Cebolla del Pilon Media Marrón Día medio 5 BGHZ-0323 Valencia Cebolla de Liria Media Marrón Día medio 6 BGHZ-0903 Palencia Cebolla de Horcal de matanza Media Blanca Día largo 7 BGHZ-1129 Cantabria Bedoya morada sangre de buey Media Morada Día largo 8 BGHZ-2707 Huesca Cebolla de Torres morada Media Morada Día largo 9 BGHZ-3331 Baleares Ceba mallorquina Media Blanca Día medio 10 BGHZ-0347 Cádiz Cebolla colora Alta Morada Día medio 11 BGHZ-0182 Granada Cebolla Recas Alta Marrón Día medio 12 BGHZ-0805 Jaén Cebolla temprana Alta Morada Día medio 13 BGHZ-2399 La Coruña Cebolla de Betanzos Alta Amarilla Día largo 14 BGHZ-0359 Asturias Cebolla morada de Amposta Alta Morada Día largo 15 BGHZ-1355 Cuenca Cebolleta blanca Alta Blanca Día medio 16 BGHZ-0600 Ávila Cebolla mondonguera Alta Marrón Día largo 17 BGHZ-3096 Teruel Cebolla pequeña Alta Marrón Día largo 18 BGHZ-4177 Huelva Cebolla temprana Alta Violeta Día medio 19 BGHZ-1728 La Rioja Cebolla Recas Alta Marrón Día largo 20 BGHZ-0535 Albacete Cebolla colorada Alta Morada Día medio Material y métodos 19 añade 2-mercaptoetanol, para inhibir la oxidación de polifenoles que se liberan en el proceso de homogenización del material. Dado que los resultados iniciales obtenidos en cuanto a la calidad y cantidad de ADN no fueron los esperados, fue necesario optimizar la extracción para los parámetros que intervenían en estos procesos (el CTAB y el 2-mercaptoetanol), partiendo siempre de los mismos mg de material vegetal. En el proceso de extracción se ensayaron diferentes volúmenes de detergente y antioxidante: i) dos volúmenes de buffer CTAB (400-800 µl); ii) dos volúmenes de 2-mercaptoetanol (0.4-08 µl); y iii) dos procesos de tratamiento de la muestra vegetal de partida (fresco o congelado con N 2 ) (Tabla 2). Para todos los métodos ensayados, el triturado del tejido se hizo en un molino (TissueLyser II, Qiagen, Valencia, CA, EEUU). Tabla 2. Modificaciones del tratamiento del material vegetal y de los volúmenes de CTAB y de 2-mercaptoetanol para los cuatro métodos de extracción de ADN total ensayados muestra vegetal de partida Volumen buffer CTAB (µl) Volumen 2-mercaptoetanol (µl) Método 1 Congelada con N 2 400 0.4 Método 2 Congelada con N 2 800 0.8 Método 3 Fresco 400 0.4 Método 4 Fresco 800 0.8 En el método 1, se trituró el material de partida congelado previamente en nitrógeno líquido y posteriormente, se adicionaron 400 µl de CTAB y 0.4 µl de 2mercaptoetanol. En el método 2 se siguió el mismo procedimiento que en el método 1 pero duplicando los volúmenes de CTAB y de 2-mercaptoetanol. Respecto al método 3, el material de partida no se congeló previamente con nitrógeno líquido, sino que se le añadió al material fresco 200 µl de CTAB y se trituró para después añadirle otros 200 µl más de CTAB y 0.4 µl de 2-mercaptoetanol. Por último, en el método 4 se realizó el mismo procedimiento que en el método 3 pero duplicando los volúmenes de CTAB y de 2-mercaptoetanol. En cuanto a la cuantificación de ADN se realizó mediante el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 UV-vis (NanoDrop technologies, Wilmington, DE, EEUU), utilizando el software ND-1000 3.3.0. La calidad del ADN viene determinada por la relación entre las medidas de la absorbancia a diferentes longitudes de onda (260, 280 y 230 nm), siendo los valores de ratio adecuados los Material y métodos 20 comprendidos entre 1,7 y 1,9 para el ratio 260/280 y entre 2,0 y 2,2 para el ratio 260/230. Obtenida la concentración de cada muestra en ng/µl, se diluyeron en agua MilliQ estéril para trabajar con una concentración de 10 ng/µl. Todo el proceso se realizó en la cabina de flujo laminar y utilizando en todo momento material esterilizado. Las diluciones se almacenaron a -20 ºC para su conservación. 3.3. Marcadores moleculares, amplificaciones y electroforesis. Para la identificación del tipo de citoplasma se utilizó el marcador MK descrito por Kim et al. (2009), que distingue los tres mitotipos en una única PCR. Por otro lado, se utilizaron un total de 5 marcadores asociados al locus Ms: dos marcadores co-dominantes alelo-específicos, el OPT y el PsaO (Bang et al., 2011); dos marcadores SCAR, el dominante DNF-566 y el recesivo RNS-357 (Yang et al., 2013); y el marcador jnurf05, de tipo CAPS (Park et al., 2013) (Tabla 3). Las condiciones de PCR que se utilizaron para cada marcador fueron las descritas por los diferentes autores y se describen en el Anexo II. Las amplificaciones fueron realizadas en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (P.E. Applied Biosystems, Foster City, CA, EEUU). Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en geles de agarosa Ultrapure™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU) al 1.8% en tampón 1x TAE (0.04 M Tris-Acetato, 1 mM EDTA. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio a 50 ng/µl y se visualizaron mediante luz ultravioleta en un equipo GelDoc2000 (Bio-Rad, Hercules, CA, EEUU). Material y métodos 21 Tabla 3: Marcadores moleculares asociados a la androesterilidad en cebolla analizados en este trabajo Nombre marcador Cebadores Secuencia (5'→3') Fragmentos esperados en función del genotipo (pb) MK F CATAGGCGGGCTCACAGGAATA 833, 628 R1 AATCCTAGTGTCCGGGGTTTCT R2 CAGCGAACTTTCATTCTTTCGC OPT F CCTTGGAAAGGCGCAACTAAAGATTTGA 659, 526 R TGTGGCCCAATAATACAAACAAGCAGGA DNF-566 FN1 TACAGATTTGTTTATCTTCTTCTTCTTCT 566 RN1 TTCATTTGTTAGGATGTACTCTTACC RNS-357 F3S2 TCAGTATCAATAGAAGGAATCAC 357 R3S2 GTATACCATTGGTACTTGATGCA PSAO F CCTCATGCTTGCTTGGTCTT 490, 437 R AAGCGTGATCGATTGTAGGTCCTTT jnurf05 F AACAAATCAATCGCCTGAAAA 888, 519, 378 R ATTATGGCCGATTTCTCAGC 3.4. Análisis de los resultados Para distinguir entre los cuatro métodos ensayados de extracción de ADN, se realizó un análisis de normalidad de los datos y de la varianza (ANOVA) para los datos de concentración de ADN y de ratios de absorbancia 260/280 y 260/230. La normalidad de los datos fue estudiada aplicando el Test de Shapiro-Wilk. Los análisis estadísticos fueron realizados utilizando el programa informático SPSS ver.15.0 (2006). Para el análisis de validación de los marcadores moleculares, se realizó un estudio de comparación entre los fragmentos obtenidos en cada gel y los correspondientes a los esperados para cada conjunto de marcadores de acuerdo a los fenotipos de las plantas estudiadas en cada caso. El genotipado de los individuos se realizó por el criterio de tamaño de fragmentos obtenidos y esperados. Material y métodos 22 Resultados y discusión 23 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Optimización de la extracción de ADN de hoja y bulbo de cebolla. A continuación se muestran los resultados de concentración y calidad de ADN para cada uno de los ensayos que se realizaron (Tabla 4). Tabla 4: Concentraciones de ADN y ratios de absorbancia para los cuatro ensayos realizados. Ratios absorbancia Método Repetición Concentración (ng/µl) 260/280 260/230 1 1 245.52 2.36 1.79 2 324.36 1.88 1.24 3 458.27 2.47 1.94 2 1 183.29 2.52 1.41 2 141.51 2.36 1.6 3 136.09 2.18 1.47 3 1 124.31 2.14 1.84 2 178.73 2.26 1.87 3 150.57 1.52 1.78 4 1 256.12 1.97 2.15 2 240.97 2.05 2.04 3 351.69 1.95 2.24 Se realizó la prueba estadística de normalidad, aplicando el Test de Shapiro-Wilk ya que la muestra era pequeña, al conjunto de datos para cada uno de los tres factores (concentración, ratio 260/280 y ratio 260/230), verificándose la hipótesis de normalidad de la muestra. Posteriormente se realizó el ANOVA y se observaron diferencias significativas para la concentración y para los ratios 260/280 y 260/230 (Tabla 5; ver también Anexo III). Resultados y discusión 24 Tabla 5. Concentración y ratios de absorbancia 260/280 y 260/230 (medias ± SE, con n=3) a obtenidos para los cuatro métodos ensayados. Concentración (ng/µl) Ratio 260/280 Ratio 260/230 Método 1 342.72 ± 107.56 a 2.24 ± 0.31 ab 1.65 ± 0.36 bc Método 2 153.63 ± 25.83 b 2.35 ± 0.17a 1.49 ± 0.09 c Método 3 151.20 ± 27.21 b 1.97 ± 0.39ab 1.83 ± 0.05 b Método 4 282.93 ± 60.03 a 1.99 ± 0.05 b 2.14 ± 0.10 a a Valores seguidos por la misma letra en la misma columna no fueron significativamente diferentes (P<0.05). En relación a la concentración del ADN, los valores de mayor concentración fueron los obtenidos para los métodos 1 y 4, significativamente distintos de los métodos 2 y 3. En base a estos resultados, para un aislamiento de ADN eficiente a partir de material fresco de cebolla se procedería a realizar la extracción en un volumen de 400 µl de tampón CTAB, mientras que para tejido congelado sería preciso duplicar el volumen de tampón en el que se homogeniza el material vegetal. Respecto a la calidad del ADN, mientras que los resultados del análisis muestran que para el ratio 260/280 sólo hay diferencias significativas entre el método 2 y el 4, para el ratio 260/230, el mejor valor fue el obtenido para el método 4, siendo, además, significativamente diferente del resto. Por tanto se seleccionó, por concentración y calidad del ADN obtenido el método 4 para la extracción de las muestras a analizar en el presente trabajo. El método optimizado y que finalmente se utilizó se encuentra descrito en el Anexo I. Resultados y discusión 25 4.2. Validación de marcadores moleculares asociados a la androesterilidad en cebolla. La validación de los marcadores moleculares asociados a la androesterilidad en cebolla se realizó para seis marcadores, uno asociado al tipo de citoplasma (MK) y cinco (PsaO, DNF-566, RNS-357, OPT y jnurf05) al gen nuclear Ms responsable de la androesterilidad para el sistema CMS-S. En la Tabla 6 se pueden ver los resultados para todos los marcadores en el material vegetal utilizado como testigo. Para el marcador MK asociado al mitotipo, los resultados obtenidos fueron los esperados según el fenotipo de la línea en todas las muestras analizadas. Las entradas fenotipadas como androestériles (CMS), las líneas BGHZ-4552 y PF presentaron el fragmento asociado al sistema CMS-S, mientras que la línea FEE fue genotipada como correspondiente al sistema CMS-T. En esta última no se continuó el estudio de los marcadores asociados al locus Ms ya que éste no participa en la androesterilidad de este sistema. Las entradas BGHZ-4553 y PM, fenotipadas como mantenedora y fértil, respectivamente, presentaron ambas el mitotipo N, según lo esperado. Respecto a los marcadores asociados al locus Ms, el único que identificó correctamente el genotipo de todas las líneas de acuerdo al fenotipo esperado fue el marcador CAPS jnurf05, identificando como homocigotas recesivas (msms) las líneas BGHZ-4452, BGHZ-4553 y PF y como homocigota dominante (MsMs) la línea PM (Figura 2). Este marcador se haya a un distancia aproximada de 0.05 cM del locus Ms (Park et al., 2013) y ha sido posicionado en el cromosoma 2 del mapa consenso de cebolla (McCallum et al., 2012). El marcador jnurf05 ha sido localizado en un mapa genético junto con los marcadores OPT y PsaO, y mientras que jnurf05 co-localiza con Ms, OPT y PsaO aparecen como marcadores flanqueantes y en sentidos opuestos, posicionándose más cerca OPT que PsaO (Park et al., 2013). Resultados y discusión 26 Tabla 6. Análisis de 5 marcadores moleculares asociados a la androesterilidad en cebolla utilizando cinco líneas fenotipadas de A. cepa L. Fenotipo Nombre entrada Procedencia Marcador MK PsaO DNF-566 / RNS-357 OPT Jnurf05 androestéril 4552 BGHZ CMS-S Msms (fértil) No amplifica MsMs (fértil) msms (estéril) androestéril FEE CITA CMS-T - - - - androestéril PF agricultor CMS-S msms (estéril) MsMs(fértil) msms (estéril) msms (estéril) mantenedora 4553 BGHZ N Msms (fértil) No amplifica MsMs (fértil) msms (manten) fértil PM agricultor N Msms (fértil) MsMs(fértil) msms (fértil) MsMs (fértil) Respecto al resto de marcadores utilizados, OPT identificó incorrectamente la línea BGHZ-4452, el estado alélico obtenido fue MsMs siendo el esperado msms, mientras que el marcador PsaO identificó incorrectamente dos (las líneas BGHZ-4452 y BGHZ-4453) de las tres líneas (Figura 2). La distancia mapeada para estos dos marcadores, 1.5 cM para OPT y 6.4 cM para PsaO, respecto al locus Ms implica la posibilidad de sobrecruzamiento (intercambio de segmentos entre los cromosomas homólogos durante la meiosis) o recombinación y como consecuencia de los mismos una incorrecta identificación del genotipo. Trabajos previos ya han indicado la dificultad de predecir el genotipo correcto para Ms utilizando marcadores estrechamente ligados al locus Ms, tanto en germoplasma de cebolla como en líneas de mejora en EEUU (Gökçe y Havey, 2002). También Bang et al. (2011) señalaron que OPT y PsaO fallan a la hora de predecir el genotipo de Ms en plantas procedentes de poblaciones de polinización libre. Los marcadores DNF-566 y RNS-357, por su parte, no sólo identificaron incorrectamente la línea PF, sino que no amplificaron ningún fragmento para las líneas BGHZ-4452 y BGHZ-4453. La ausencia de amplificación puede ser debida a diferencias en la secuencia genómica de anillamiento de los cebadores. Estos marcadores fueron presentados como universales y adecuados para su uso tanto en híbridos F1 como en poblaciones de polinización libre, de diferentes orígenes y con diferentes fotoperiodos (día largo / día corto) (Yang et al., 2013). Sin embargo, los resultados que se han obtenido en este trabajo no coinciden con estos resultados. Resultados y discusión 27 Figura 2. Electroforesis de los fragmentos amplificados con los marcadores PsaO, OPT, DNF-566 y jnurf05 a partir de ADN de 6 plantas de la línea androestéril BGHZ-4552. También se observa la amplificación con jnurf05 de las entradas PM (fértil) y PF (androestéril). A la vista de estos resultados, se escogieron, para el genotipado de las poblaciones y variedades de cebolla en estudio, los marcadores jnurf05 y OPT. El marcador jnurf05 se eligió por su correcta predicción de los genotipos utilizados como control en este trabajo y porque hasta el momento es el marcador que más cerca ha sido localizado del locus Ms en el mapa genético. El marcador OPT, se ha seguido utilizando en los análisis posteriores porque resultó uno de los más adecuados junto a jnurf05, presentando la ventaja de que no requiere una digestión posterior a la PCR, resultando más rápido y económico. Por ello, se quiso estudiar la viabilidad y comportamiento de ambos marcadores en las dos familias y en las variedades locales utilizadas en este trabajo. 4.3. Identificación de líneas androestériles y mantenedoras en las poblaciones Fuentes 1 y Fuentes 2 Para la identificación de líneas androestériles y mantenedoras en estas dos poblaciones se utilizaron el marcador MK, para identificar el mitotipo y los marcadores, OPT y jnurf05, para determinar los alelos del gen nuclear Ms. Los resultados obtenidos con el marcador MK, mostraron que todos los individuos de la familia Fuentes 1 poseen un mitotipo CMS-T, lo que indica que estos individuos pueden ser fértiles o androestériles en función de su dotación nuclear, pero el sistema de androesterilidad que presentarían no resulta de interés a la hora de producir híbridos F1, dada su complejidad Por tanto, en Conclusiones 34 Referencias 35 6. REFERENCIAS A.P.G. 2003. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG II. Bot. J. Linn. Soc. 141: 399-436. ÁLVAREZ, JM, MARÍN, ML. 1983. Un banco de germoplasma para especies hortícolas. En: Los recursos fitogenéticos y las nuevas variedades vegetales: su impacto en el sector agrario. ITEA, volumen Extra, número 2: 25-37. ANDRÉS-GARCÍA B, GARCÉS-CLAVER A, COLLADO-FERNÁNDEZ M, MALLOR C. 2013. ‘Variabilidad de compuestos relacionados con el sabor y aroma en cebollas autóctonas españolas’ VII Congreso Ciencia y Tecnología de los Alimentos “CYTA 2013”. Córdoba. BANG H., CHO D.Y., YOO K., YOON M., PATIL B.S., KIM S. 2011. Development of simple PCR-based markers linked to the Ms locus, a restorer-of-fertility gene in onion (Allium cepa L.). Euphytica 179: 439-449. BENTOLILA S., ALFONSO A.A., HANSON M.R. 2002. A pentatricopeptide repeat containing gene restores fertility to cytoplasmic male-sterile plants. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 10887-10892. BERNINGER E. 1965. Contribution à l´étude de la sterilité mâle de l´oignon (Allium cepa L.). Ann. Amélior. Plant. 15: 183-199. BREWSTER J.L. 1994. Onions and other vegetable Alliums. CAB International, Wallingford, UK. 236 pp. BROWN G.G., FORMANOVA N., JIN H., WARGACHUK R., DENDY C., PATIL P., LAFOREST M., ZHANG J., CHEUNG W.Y., LANDRY B.S. 2003. The radish Rfo restorer gene of Ogura cytoplasmic male sterility encodes a protein with multiple pentatricopeptide repeats. Plant J. 35: 262-272. CARRAVEDO M., MALLOR C. 2007. Variedades autóctonas de cebollas españolas conservadas en el Banco de Germoplasma de Especies Hortícolas de Zaragoza. Gobierno de Aragón, Zaragoza, España, 382 pp. CASTILLO AM, FAYOS O, VALLÉS MP, GARCÉS A, MALLOR C. 2013. ‘Obtención de doblehaploides de variedades de cebolla españolas mediante cultivo de ovarios’ X Reunión de la Sociedad Española de Cultivo In Vitro de Tejidos Vegetales (SECIVTV). Zaragoza. Referencias 36 DOYLE J.J., DOYLE J.L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19: 11-15. ENGELKE T., AGBICODO E., TATLIOGLU T. 2004. Mitochondrial genome variation in Allium ampeloprasum and its wild relatives. Euphytica .137: 181-191. ENGELKE T., TEREFE D., TATLIOGLU T. 2003. A PCR-based marker system monitoring CMS-(S), CMS-(T) and (N)-cytoplasm in the onion (Allium cepa L.). Theor. Appl. Genet. 107: 162–167. FAOSTAT. 2013. Anuario estadístico de la FAO 2013 [En línea] <http://faostat3.fao.org/faostat-gateway/go/to/home/E> [Consulta: 15 de Noviembre de 2013]. FRIESEN N., FRITSCH R., BLATTNER F.R., 2006. Phylogeny and new intrageneric classification of Allium L. (Alliaceae) based on nuclear ribosomal DNA ITS sequences. Aliso 22: 372-395. FRITSCH R.M., FRIESEN N. 2002. Evolution, Domestication and Taxonomy. Allium Crop Science: Resent Advances. CABI Publishing, Wallingford, UK, 5-30. GARCÉS-CLAVER A, FAYOS O, MALLOR C, SAVIRÓN M, ORDUNA J. 2013. ‘Capsinoides y Sulfóxidos de cisteína: compuestos nutracéuticos’ I Feria de la Seguridad Alimentaria. Zaragoza. GARCÉS-CLAVER A., MOORE FELLMAN S., GIL ORTEGA R., JAHN M., ARNEDOANDRES M.S. 2007. Identification, validation and survey of a single nucleotide polymorphism (SNP) associated with pungency in Capsicum spp. Theor. Appl. Genet. 115: 907–916. GOBIERNO DE ARAGÓN. 2013. [En línea] <http://www.aragon.es/DepartamentosOrganismosPublicos/Departamentos/Agr iculturaGanaderiaMedioAmbiente/AreasTematicas/CalidadAgroalimentaria/ci.01 _Denominaciones_origen.detalleDepartamento?channelSelected=03bbc8548b 73a210VgnVCM100000450a15acRCRD> [Consulta: 20 de Diciembre de 2013]. GÖKÇE A.F., HAVEY M.J. 2002. Linkage equilibrium among tightly linked RFLPs and the Ms locus in open-pollinated onion populations. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 127: 944–946. HANSON M.R. 1991. Plant mitochondrial mutations and male sterility. Ann. Rev. of Genet. 25: 461-486. Referencias 37 HAVEY M.J. 1993. A putative donor of S-cytoplasm and its distribution among openpollinated populations of onion. Theor. Appl. Genet. 86: 128-134. HAVEY M.J. 1995. Identification of cytoplasms using the polymerase chain reaction to aid in the extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion. Theor. Appl. Genet. 90: 263-268. HAVEY M.J. 2000. Diversity among male-sterility-inducing and male-fertile cytoplasms of onion. Theor. Appl. Genet. 101: 778-782. HAVEY M.J. 2013. Single nucleotide polymorphisms in linkage disequilibrium with the male-fertility restoration (Ms) locus of onion. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 138: 306– 309. JONES H.A., CLARKE A. 1943. Inheritance of male sterility in the onion and the production of hybrid seed. Proc. Am. Soc. Hortic. Sci. 43: 189-194. JONES H.A., EMSWELLER S.L. 1936. A male-sterile onion. Proc. Am. Soc. Hortic. Sci. 34: 582-585. JOSHI S.P., RANJEKAR P.K., VIDYA S.G. 1999. Molecular markers in plant genome analysis. Current Science 77: 230–240. KIK C. 2002. Exploitation of wild relatives for the breeding of cultivated Allium species. Allium crop science: Recent advances 81-100. KIM S., LEE E., CHO D.Y., HAN T., BANG H., PATIL B.S., AHN Y.K., YOON M. 2009. Identification of a novel chimeric gene, orf725, and its use in development of a molecular marker for distinguishing three cytoplasm types in onion (Allium cepa L.). Theor Appl Genet 118: 433-441. KLEIN R.R., KLEIN P.E., MULLET J.E., MINX P., ROONEY W.L., SCHERTZ K.F. 2005. Fertility restorer locus Rf1 of sorghum (Shorgum bicolor L.) encodes a pentatricopeptide repeat protein not present in the collinear region of rice chromosome 12. Theor Appl Genet 111: 994-1012. KOMORI T., OHTA S., MURAI N., TAKAKURA Y., KURAYA Y., SUZUKI S., HIEI Y., IMASEKI H., NITTA N. 2004. Map-based cloning of a fertility restorer gene, Rf1, in rice (Oryza sativa L.). Plant J. 37: 315-325. LASER K.D., LERSTEN N.R. 1972. Anatomy and cytology of microsporogenesis in cytoplasmic male sterile angiosperms. Bot. Rev. 38: 425-454. MAGRAMA. 2013. Madrid. Observatorio de tecnologías probadas. Material vegetal. Referencias 38 MALLOR C, ARNEDO-ANDRÉS MS, GARCÉS-CLAVER A. 2014. Assessing the genetic diversity of Spanish Allium cepa landraces for onion breeding using microsatellite markers. Scientia Horticulturae, 170: 24–31. MALLOR C, CARRAVEDO M, ESTOPAÑÁN G, MALLOR F. 2011. Characterization of genetic resources of onion (Allium cepa L.) from the Spanish secondary centre of diversity. Spanish Journal of Agricultural Research, 9 (1): 144-155. MALLOR C., BALCELLS M., MALLOR F., SALES E. 2010. Genetic variation for bulb size, soluble solids content and pungency in the Spanish sweet onion variety Fuentes de Ebro. Response to selection for low pungency. Plant Breed. 130: 55-59. MALLOR C., LLAMAZARES A., GUTIERREZ M., BRUNA P., MALLOR F., ARNEDOANDRES M.S., ALVAREZ J.M. 2007. Evaluación morfológica, de pungencia y contenido en sólidos solubles de la cebolla ‘Fuentes de Ebro’. ITEA 103: 212223. MALLOR C., SALES E. 2012. Yield and traits of bulb quality in the Spanish sweet onion cultivar 'Fuentes de Ebro' after selection for low pungency. Sci. Hort. 140: 60-65 MAROTO J.V. 1995. Horticultura herbácea especial. Ed. Mundi-Prensa. Madrid, 702pp. McCALLUM J., BALDWIN S., SHIGYO M., DENG Y., VAN HEUSDEN S., PITHERJOYCE M., KENEL F. 2012. Allium Map—a compara-tive genomics resource for cultivated Allium vegetables. BMC Genomics 13: 168. McCALLUM J., PITHER-JOYCE M., SHAW M., KENEL F., DAVIS S., BUTLER R., SCHEFFER J., JAKSE J., HAVEY M.J. 2007. Genetic mapping of sulfur assimilation genes reveals a QTL for onion bulb pungency. Theor. Appl. Genet. 114: 815-822. PARK J., BANG H., CHO D.Y., YOON M.K., PATIL B.S., KIM S. 2013. Construction of high-resolution linkage map of the Ms locus, a restorer-of-fertility gene in onion (Allium cepa L.). Euphytica 192: 267-278. PIKE L.M. 1986. Onion breeding. In: Breeding Vegetable Crops. (Bassett, M.J., Ed.). AVI Publishing Co., Westport, CT, USA: 161-176. SATO Y. 1998. PCR amplification of CMS-specific mitochondrial nucleotide sequences to identify cytoplasmic genotypes of onion (Allium cepa L.). Theor. Appl. Genet. 96: 367–370. Referencias 39 SCHWEISGUTH B. 1973. Étude d’un nouveau type de stérilité male chez l’oignon, Allium cepa L. Ann. Amélior. Plant 23: 221–233. SORIA H. 1997. Cebollas: bajo el signo de la estabilidad. Vida rural nº 49: 60-61. SYNNEVAG G. 1988. Genetic contributions from the multiplier onion to the breeding of the common onion. Proceedings of the 4th Eucarpia Allium Symposium. Institute of Horticultural Research, Wellesbourne, UK.133-138. VAVILOV N.I. 1926. Center of origins of cultivated plants. Trudy Prikl. Bot Gen 16: 139248. VON KOHN C., KIELKOWSKA A., HAVEY M.J. 2013. Sequencing and annotation of the chloroplast DNAs and identification of polymorphisms distinguishing normal male-fertile and male-sterile cytoplasms of onion. Genome 56: 737-742. Referencias 40 Anexo I 41 ANEXO I: Protocolo de extracción de ADN optimizado. -Pesar aproximadamente 50 mg de hojas e introducirlo un tubo eppendorf de 2 ml junto con dos bolitas de tungsteno. -Añadir 400 µl de CTAB y triturar mediante un molino (Tissuelyser). -Una vez triturado el material vegetal, añadir 400 µl de CTAB y 0.8 µl de 2mercaptoetanol. Mezclar suavemente por inversión. -Incubar en baño a 65ºC durante 25 min, mezclando habitualmente por inversión. -Añadir 450 µl de Sevag (cloroformo: alcohol isoamílico 24:1), mezclando por inversión hasta conseguir una mezcla homogénea. -Centrifugar a 10000 g durante 15 min. -Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf de 1.5 ml y añadir lentamente 300 µl de isopropanol mezclando suavemente hasta la precipitación del ADN. Mantener, al menos, 30 min en el congelador. -Centrifugar a 13000 g durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y añadir 800 µl de tampón de lavado. Lavar durante 20 min a temperatura ambiente. -Centrifugar a 13000 g durante 5 min. -Eliminar el sobrenadante y dejar el precipitado secar durante varias horas a temperatura ambiente. -Resuspender el precipitado en 200 µl de MTE durante varias horas en el frigorífico. Soluciones empleadas: Tampón de extracción (CTAB): 100 mM Tris HCl a pH 8.0, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% CTAB, 1% PVP, 0.1% bisulfito sódico. Tampón de lavado: 10 mM acetato de amonio en etanol al 76%. Tampón de disolución (MTE): 10 mM Tris HCl a pH 8.0, 0.1 mM EDTA. Anexo II 42 ANEXO II: Condiciones y reacciones de PCR para los distintos marcadores utilizados 1.1. Condiciones y reacción para conjunto de cebadores MK ºC Tiempo Ciclos Reactivos Volumen (µl) 94 5 min 1 H 2 O MilliQ 5.4 94 30 s 40 Buffer 10x 1 60 30 s MgCl 2 (50 mM) 0.3 72 90 s dNTPs (2.5 mM) 0.8 72 10 min 1 Cebador MK-F (10 µM) 0.2 10 ∞ Cebador MK-R1 (10 µM) 0.2 Cebador MK-R2 (10 µM) 0.2 Taq. Polimerasa (5 u) 0.1 ADN (10 µM) 2.5 Volumen final = 10 µl 1.2. Condiciones y reacción para el par de cebadores OPT ºC Tiempo Ciclos Reactivos Volumen (µl) 95 5 min 1 H 2 O MilliQ 5.5 94 30 s 40 Buffer 10x 1 68 60 s MgCl 2 (50 mM) 0.3 72 60 s dNTPs (2.5 mM) 0.8 72 10 min 1 Cebador OPT-F (10 µM) 0.2 10 ∞ Cebador OPT-R (10 µM) 0.2 Taq. Polimerasa (5 u) 0.1 ADN (10 µM) 2.5 Volumen final = 10 µl Anexo II 43 1.3. Condiciones y reacción para par de cebadores jnurf05 ºC Tiempo Ciclos Reactivos Volumen (µl) 95 5 min 1 H 2 O MilliQ 5.5 95 30 s 10 Buffer 10x 1 65* 30 s MgCl 2 (50 mM) 0.3 72 2 min dNTPs (2.5 mM) 0.8 95 30 s 30 Cebador Jnurf05-F (10 µM) 0.2 57 30 s Cebador Jnurf05-R (10 µM) 0.2 72 2 min Taq. Polimerasa (5 u) 0.1 72 7 min 1 ADN (10 µM) 2.5 10 ∞ Volumen final = 10 µl *Cada ciclo -0.8ºC 1.4. Condiciones y reacción para el par de cebadores PSAO ºC Tiempo Ciclos Reactivos Volumen (µl) 95 5 min 1 H 2 O MilliQ 5.5 95 30 s 10 Buffer 10x 1 65* 30 s MgCl 2 (50 mM) 0.3 72 2 min dNTPs (2,5 mM) 0.8 95 30 s 30 Cebador PSAO-F (10 µM) 0.2 57 30 s Cebador PSAO-R (10 µM) 0.2 72 2 min Taq. Polimerasa (5 u) 0.1 72 10 min ADN (10 µM) 2.5 10 ∞ Volumen final = 10 µl *Cada ciclo -0.8ºC