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Proyecto Fin de Carrera INGENIERO AGRÓNOMO Identificación de metabolitos relacionados con el carácter picante en variedades españolas de pimiento (Capsicum annuum L.) de “Reconocida Calidad Diferenciada” (Denominaciones de Origen Protegidas e Indicaciones Geográficas Protegidas). Autor: Alberto Galán Enciso Directores: Ana Garcés-Claver Oreto Fayos Avellán Escuela Politécnica Superior de Huesca Abril 2014 Agradecimientos En primer lugar, me gustaría agradecer a Ana Garcés y Oreto Fayos su dedicación en las diferentes etapas dentro de la elaboración de este proyecto. Igualmente al resto de miembros del CITA, que en algún momento u otro me han servido de gran ayuda. También quiero reseñar en estas líneas el apoyo constante e incondicional recibido por mi familia en todo momento. Por último, no querría olvidarme de los diferentes compañeros y amigos que me han acompañado durante este trayecto. A todos ellos, MUCHAS GRACIAS. Índice Índice de tablas ............................................................................................................ i Índice de figuras ......................................................................................................... iii Lista de abreviaturas ................................................................................................... v Resumen ................................................................................................................... vii Abstract .................................................................................................................... viii 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1 1.1 Situación taxonómica ........................................................................................................................ 1 1.2 Origen y domesticación ..................................................................................................................... 2 1.3 Producción de pimiento ..................................................................................................................... 3 1.4 Usos del pimiento .............................................................................................................................. 6 1.5 Denominaciones de origen e importancia ......................................................................................... 7 1.6 El carácter picante en pimiento: los capsicinoides .......................................................................... 12 1.7 Métodos de determinación y cuantificación de los capsicinoides ................................................... 14 2 OBJETIVO ......................................................................................................... 17 3 MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................... 19 3.1 Material vegetal .............................................................................................................................. 19 3.2 Reactivos y soluciones ..................................................................................................................... 21 3.3 Extracción de capsicinoides ............................................................................................................. 22 3.4 Método analítico HPLC-ESI-MS........................................................................................................ 22 3.5 Análisis estadístico .......................................................................................................................... 23 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 25 4.1 Identificación de capsicinoides mayoritarios y minoritarios mediante HPLC-ESI-MS/MS(QTOF). ...... 25 4.2 Análisis cualitativo de la composición de capsicinoides ...................................................................... 30 4.3 Análisis cuantitativo del contenido de capsicinoides ......................................................................... 36 5 CONCLUSIONES .............................................................................................. 41 6 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 43 Anexo 1 Tiempo de Retención (RT), relación masa-carga exacta de [M+H+] (m/z), fórmula elemental y error de los capsicinoides biosintetizados en un fruto de distintas variedades de pimiento comercial con reconocida calidad diferenciada…………………………………………………………………………………47 Índice Índice de tablas i Índice de tablas Tabla 1: Producción mundial de hortalizas en el año 2013 ........................................ 3 Tabla 2: Superficie y producción de los principales países productores de pimiento (2013). ........................................................................................................................ 4 Tabla 3: Superficie y producción europea de pimiento (2013).................................... 4 Tabla 4: Producción y superficie de pimiento en España para el año 2013 ............... 5 Tabla 5: Producción, comercialización y valor económico de las diferentes DOP e IGP de hortícolas destinadas a la industria conservera .............................................. 8 Tabla 6: Estructuras químicas, fórmula empírica, peso molecular y relación masacarga (m/z) de los capsicinoides clasificados en función de la posición del metil en la cadena acil (anteiso, iso o lineal). (1) 4-ene-6-metil nornorcapsicina; (2) N-vainillin 5octenamida; (3) 6-metil nornordihidrocapsicina; (4) N-vainillin octanamida; (5) 4-ene7-metil norcapsicina; (6) N-vainillin 6-nonenamida; (7) 6-metil nordihidrocapsicina; (8) 7-metil nordihidrocapsicina; (9) N-vainillin nonanamida; (10) 6-ene-8-metil capsicina [capsicina]; (11) 8-metil dihidrocapsicina [dihidrocapsicina]; (12) N-vainillin decanamida; (13) 6-ene-8-metil homocapsicina; (14) 6-ene-9-metil homocapsicina; (15) N-vainillin 8-undecenamida; (16) 8-metil homodihidrocapsicina; (17) 9-metil homodihidrocapsicina; (18) N-vainillin undecanamida. ............................................. 14 Tabla 7: Tipo de Reconocida Calidad Diferenciada, variedad de pimiento e información disponible del picor de los frutos analizados. ........................................ 19 Tabla 8. Tiempo de Retención (RT), relación masa-carga exacta de [M+H+] (m/z), fórmula elemental y error de los capsicinoides biosintetizados en un fruto de la variedad Berezi en estado maduro. Los números entre paréntesis hacen referencia a los compuestos de la Tabla 6 y la Figura 8 .............................................................. 28 Tabla 9: Perfil de capsicinoides de los distintos frutos de pimiento analizados. (1) 4ene-6-metil nornorcapsicina, (3) 6-metil nornordihidrocapsicina; (4) N-vainillin octanamida; (5) 4-ene-7-metil norcapsicina; (6) N-vainillin 6-nonenamida; (7) 6-metil nordihidrocapsicina; (8) 7-metil nordihidrocapsicina; (9) N-vainillin nonanamida; (10) 6-ene-8-metil capsicina (capsicina); (11) 8-metil dihidrocapsicina (dihidrocapsicina); (12) N-vainillin decanamida; (13) 6-ene-8-metil homocapsicina; (14) 6-ene-9-metil homocapsicina; (15) N-vainillin 8-undecenamida; (16) 8-metil homodihidrocapsicina; (17) 9-metil homodihidrocapsicina y (18) N-vainillin undecanamida. 1 = Presencia, 0 = Ausencia ................................................................................................................ 34 Tabla 10: Cuadrados medios para los valores transformados de CAP y DHC de los distintos extractos de frutos analizados. ................................................................... 38 Tabla 11: Agrupación de medias para los datos transformados [log (x+1)] de concentración de CAP y de DHC ............................................................................. 39 Índice de tablas ii Índice de figuras iii Índice de figuras Figura 1: Distribución de especies de Capsicum domesticadas en la época del descubrimiento de América. ....................................................................................... 2 Figura 2: Crema de uso tópico cuyo principio activo es la capsicina. ......................... 6 Figura 3: Corte longitudinal de un fruto de pimiento. ................................................ 12 Figura 4: Ruta de biosíntesis propuesta para los capsicinoides ............................... 13 Figura 5: Distribución geográfica de las variedades de pimiento utilizadas .............. 20 Figura 6: Variedades suministradas por las diferentes asociaciones o empresas adscritas con una figura de calidad diferenciada ...................................................... 21 Figura 7. Patrón de fragmentación MS/MS característico de la capsicina (m/z 306) 26 Figura 8: Cromatograma de la variedad Berezi (estado maduro).. ........................... 29 Figura 9: Dendrograma de la similitud de todas las entradas de pimiento analizadas en función de la presencia o ausencia de los distintos capsicinoides detectados .... 33 Figura 10: Gráfica de concentraciones de capsicina y dihidrocapsicina ................... 37 Introducción 2 1.2 Origen y domesticación Las distintas especies del género Capsicum son originarias de Sudamérica (Pickersgill, 1969; McLeod et al., 1982; Eshbaugh et al., 1983; Walsh y Hoot, 2001; Pickersgill, 1984; Eshbaugh, 1993). En tres zonas americanas se han identificado secuencias arqueológicas: El Valle de Tehuacán, el Valle de Oaxaca y la Sierra de Tamaulipas. Son zonas semiáridas situadas en México con fluctuaciones estacionales que afectan la variedad de recursos de subsistencia durante el año. Las zonas áridas favorecen tanto la conservación de materiales arqueológicos como los restos botánicos. La domesticación de las diferentes especies de pimiento ocurrió entre los años 5200 y 3400 a. C. (Andrews, 1984), realizándose independientemente en varias áreas y empleando diferentes especies silvestres. La combinación de evidencias arqueológicas, análisis genéticos y la distribución actual de las plantas, ha permitido a los investigadores sugerir que C. annuum fue inicialmente domesticado en México o en el norte de América Central, C. frutescens en el Caribe, C. baccatum en Bolivia, C. chinense en el norte de la Amazonía, y C. pubescens en el sur de los Andes (Pickersgill, 1984; Eshbaugh, 1993) (Figura 1). Figura 1: Distribución de especies de Capsicum domesticadas en la época del descubrimiento de América. El pimiento fue traído a Europa en el primero de los viajes de Colón desde América, llegando a la Península Ibérica, desde donde rápidamente se difundió al resto de Europa y del Mundo. En el siglo XVI el pimiento aparece ampliamente difundido por Europa, también Introducción 3 durante este mismo siglo se inició su expansión tanto en el Extremo Oriente como en África (Pénzes, 1967). 1.3 Producción de pimiento El pimiento es la novena hortaliza más producida en el mundo con alrededor de 30 millones de toneladas (t) (Tabla 1) (FAOSTAT, 2013). China es el principal país productor (15 millones de t) y España ocupa la sexta posición con aproximadamente 1x106 t (Tabla 2). Tabla 1: Producción mundial de hortalizas en el año 2013 Hortaliza Producción *106(t) Tomate 159,5 Sandía 102,8 Cebolla 86,3 Col y otras crucíferas 68,6 Pepino, pepinillo 64,7 Berenjena 46,8 Zanahoria y nabo 35,8 Melón 31,2 Chiles, Pimiento picantes, pimientos (verdes) 29,6 En relación a la superficie de cultivo/rendimiento (Tabla 2), se muestra diferencia entre países con una alta tasa de rendimiento (Países Bajos) con respecto a otros (Indonesia), debido a las diferencias en las innovaciones de cultivo entre ambos países. Pese a que en Países Bajos se consiguen rendimientos cinco veces superiores a los obtenidos en España, debido al elevado grado de mecanización de los cultivos, España ocupa la segunda posición en cuanto a rendimiento (superior a 50 t/ha) muy influenciada por la gran cantidad de producción obtenida bajo plástico, con una producción de 920.000 t, se consolida como el sexto productor mundial. Introducción 4 Tabla 2: Superficie y producción de los principales países productores de pimiento (2013). País Superficie (ha) Producción 106 (t) Rendimiento (t/ha) China 707.086 15.5 21,9 México 144.391 2.1 14,8 Turquía 93.826 1.9 21,0 Indonesia 239.770 1.5 6,2 EE.UU. 30.110 0,99 32,9 España 17.739 0,92 51,9 Egipto 39.666 0,67 16,9 Nigeria 57.382 0,45 7,8 Argelia 21.272 0,38 18,0 Países Bajos 1.357 0,37 269 Total Mundial 1.837.703 29,60 16,1 A nivel europeo, España es el mayor productor (Tabla 3), abarcando casi un tercio de toda la producción europea. Los siguientes países en producción son Países Bajos y Rumania. España es el primer exportador europeo, seguido de Países Bajos y Turquía. Con una exportación total de 564.254 t (FEPEX, 2013), Alemania es el principal destinatario de los productos (186.168 t), seguido de Francia (97.222 t), Países Bajos (57.013 t) e Italia (54.597 t). Tabla 3: Superficie y producción europea de pimiento (2013) País Superficie (ha) Producción (t) Rendimiento (t/ha) España 17.739 921.089 51,9 Países Bajos 1.357 365.000 269,0 Rumania 20.001 253.505 12,7 Italia 10.327 229.093 22,2 Ucrania 17.100 185.200 10,8 Macedonia 8.465 153.842 18,2 Serbia 17.888 145.206 8,1 Grecia 3.600 130.800 36,3 Hungría 2.668 128.003 48,0 Introducción 5 Bulgaria 4.620 66.298 14,4 Total Europa 118.584 2.857.593 24,1 A nivel nacional, la superficie y producción de pimiento, se ha reducido desde el año 2007 en un 20% y un 15% respectivamente (MAGRAMA, 2013). La producción asciende a 918.549 t, para una superficie total de 17.595 ha, siendo 6.984 ha al aire libre (40%) y 10.367 ha como cultivo protegido (60%). La exportación asciende a 511.340 t, lo que supone un 56% de la producción total. Andalucía es la principal Comunidad Autónoma productora de este cultivo y Almería la provincia en la que se focaliza la mayor parte de la producción (Tabla 4). Tabla 4: Producción y superficie de pimiento en España para el año 2013 Superficie (ha) Rendimiento (kg/ha) Secano Regadío Total Secano Regadío Producción (t) Aire libre Protegido Aire libre Protegido GALICIA 36 601 700 1.337 9.056 57.198 50.796 70.259 ASTURIAS 13 2 3 18 10.000 20.000 30.000 260 PAÍS VASCO 115 134 50 229 9.924 17.343 29.004 49.015 NAVARRA - 770 6 776 - 25.647 21.350 19.876 LA RIOJA - 169 3 172 - 25.000 42.000 4.351 ARAGÓN - 177 1 178 - 13.685 27.000 2.449 CATALUÑA 1 383 12 396 804 22.718 42.582 9.213 BALEARES - 59 28 87 - 24.100 40.200 2.548 CASTILLA Y LEÓN 2 271 9 282 5.000 20.224 74.622 6.162 MADRID - 30 - 30 - 25.000 - 750 C. LA-MANCHA - 1.203 35 1.238 - 37.676 35.400 46.563 C. VALENCIANA 3 153 498 654 10.000 18.411 71.691 38.549 MURCIA - 146 1.188 1.334 - 44.000 88.000 110.968 EXTREMADURA - 458 13 471 - 34.891 250.000 19.230 ANDALUCÍA 57 2.361 7.730 10.148 8.395 31.752 64.266 572.218 ALMERÍA - 60 7.240 7.300 - 23.350 64.760 470.263 CANARIAS 7 67 91 165 10.000 44.546 77.185 10.078 ESPAÑA 244 6.984 10.367 17.595 9.617 32.644 66.386 918.549 Introducción 6 1.4 Usos del pimiento El principal uso al que se destina el pimiento está relacionado con el arte culinario, ya sea para consumo en fresco, especia o colorante. A continuación se citan algunos de los ejemplos más empleados en la cocina mundial actual: i) la salsa tabasco tiene su origen en el chile tabasco (C. frutescens) el cual fue introducido en Louisiana (EE.UU.) procedente del estado de Tabasco (México) para ser el comienzo de la conocida salsa (Pozo et al., 1991); y ii) la Paprika se define como el polvo obtenido al secar y moler frutos rojos de variedades semidulces. Es muy empleado en gran cantidad de platos, por ejemplo en el gulash, plato tradicional húngaro. En países de habla hispana, se denomina pimentón al polvo molido de pimiento rojo, sea cual sea su variedad. Se emplea tanto para la realización de alimentos como en la industria chacinera. Otro uso del que existe conocimiento, es su utilidad como analgésico. Ya desde las antiguas civilizaciones, los mayas empleaban el pimiento para calmar la tos y el dolor de garganta y los aztecas, para combatir el dolor de muelas (Pozo et al., 1991). En la actualidad, los compuestos responsables del carácter picante, denominados capsicinoides, y concretamente la capsicina, se emplean como analgésico en tratamientos de enfermedades dolorosas como artritis (Figura 2). El modo de acción de la capsicina es el siguiente: cuando se aplica a los tejidos, la capsicina provoca la liberación de la llamada sustancia P (un decapéptido involucrado en la sensibilidad del dolor). Dicha sustancia se libera de manera ordinaria cuando los tejidos son dañados, siendo el resorte empleado por el organismo para detectar la lesión. Al aplicar capsicina, se provoca la liberación de la sustancia P, para posteriormente inhibirla, de manera que la sensación de dolor sea más tenue. Figura 2: Crema de uso tópico cuyo principio activo es la capsicina También se tienen documentadas otras aplicaciones dentro del ámbito de la medicina con distintos propósitos, como es la pérdida de peso (Lejeune et al., 2003) o la defensa antimicrobiana (Kurita et al., 2002), entre otras. Otros usos conocidos y derivados de los capsicinoides se encuentran los espray de autodefensa, constituidos a base de capsicina (0,5%), y los ahuyentadores de animales, empleados tanto en jardines como en márgenes de carreteras. Introducción 7 1.5 Denominaciones de origen e importancia Las Denominaciones de Origen nacen con objeto de preservar la garantía de calidad de los productos por parte de productores y consumidores. Estas se originan a partir del estatuto del vino del año 1932 y posteriormente la Ley 25/1970 los llamados alimentos de “Calidad Diferenciada”. Tienen como particularidad estar protegidos por una normativa de la comunidad europea, la cual garantiza el cumplimiento de unos requisitos superiores a los exigidos en el resto de productos. Engloba productos de origen animal, vegetal, bebidas espirituosas y vinos. Entre las figuras de calidad diferencia podemos encontrar las Denominación de Origen Protegidas (DOP), Indicación Geográfica Protegida (IGP), Especialidades Tradicionales Garantizadas (ETG). Existe también, en algunas comunidades autónomas, una determinación que se proporciona a ciertos productos que, sin llegar a las condiciones exigidas por el reglamento regulador de las Denominaciones de Origen, contienen unas características determinadas por las cuales han obtenido un reconocimiento, como por ejemplo es el distintivo Eusko Label empleado en la comunidad autónoma vasca. Los productos de calidad diferenciada comercializados bajo estas figuras están protegidos por el Reglamento 1151/2012 de la Unión Europea, que garantiza el cumplimiento de unos requisitos superiores a los exigidos para el resto de productos. Actualmente en España existen 170 productos, no vínicos, que poseen rasgo diferenciador respecto a la calidad (ya sean DOP o IGP). De todos ellos, 30 pertenecen al grupo de las hortalizas, siendo once de ellos pimientos: Pemento da Arnoia, Pemento de Herbón, Pemento de Oímbra, Pemento do Couto, Pemento do Mougán, Pimiento de Gernika, Pimentón de Murcia, Pimentón de la Vera, Pimiento asado del Bierzo, Pimiento del Piquillo de Lodosa y Pimiento Riojano. Estas tres últimas, destacan por su alto grado de comercialización a nivel nacional e incluso dos de ellas a nivel europeo (Tabla 5). Introducción 8 Tabla 5: Producción, comercialización y valor económico de las diferentes DOP e IGP de hortícolas destinadas a la industria conservera PRODUCCIÓN (t) COMERCIALIZACIÓN (t) DOP/IPG En superficie inscrita Destinada a conserveras inscritas Nacional U.E. Países Terceros TOTAL Alcachofa de Tudela 1.215 524 153,9 0 0 153,9 Berenjena de Almagro 1.359 1.359 1.359 0 0 1.359 Espárrago de Huétor-Tájar 82,3 27,5 56 0 0 56 Espárrago de Navarra 2.989 2.617 1.101 90 2 1.192,8 Grelos de Galicia 0 89.330 55,4 0 0 55,4 Pimiento Asado del Bierzo 72,1 70,1 27,2 0,8 0 28 Pimiento del Piquillo de Lodosa 1.547 1.547 536 20 5 561 Pimiento Riojano 526,5 71 71 0 0 71 TOTAL 7.791,10 95.545,50 3.359,30 110,8 7 3.477,10 Fuente de los datos: Consejos Reguladores de las distintas DOPs e IGPs y entidades asimiladas. Datos publicados por la Secretaría General de Agricultura y Alimentación en “Datos de las DOP e IGP de Productos Agroalimentarios año 2012”. Es destacable la importancia del pimiento Piquillo de Lodosa que junto al pimiento Asado del Bierzo y al espárrago de Navarra han conseguido gran reconocimiento, por sus características organolépticas, no solo a nivel nacional. La totalidad de la producción del Piquillo de Lodosa, y la mayor parte del pimiento Bierzo, se destinan para conserva. En el caso del pimiento asado del Bierzo, prácticamente la totalidad de la producción se comercializa a nivel nacional pero en el caso del piquillo de Lodosa una quinta parte de la producción total se exporta a países europeos. También es destacable la parte destinada a países no europeos por parte del Piquillo de Lodosa, la cual supera al espárrago de Navarra, de mayor importancia a nivel nacional. A continuación se presenta una breve descripción, extraída a partir del pliego de condiciones de las DOP o IGP, de diferentes variedades de pimiento que han sido utilizados en este trabajo: “Pimiento de Arnoia”: poseen la condición de IGP y se caracterizan por ser pimientos de forma cónica, acampanada, de sección longitudinal trapezoidal, con 3 o 4 cascos y 4 costillas y un número variable de septos longitudinales bastante patentes. El ápice puede ser hendido o redondeado, y la zona de inserción del pedúnculo es lobulada. Peso aproximado entre 50 y 90 g por unidad, con una longitud entre 7,5 y 15 cm. La piel es lisa y brillante, de color verde claro (estado inmaduro), oscilando el espesor de la carne entre los 2,6 y los 7,7 mm. El ámbito geográfico de producción comprende un área de 23 km² de Introducción 9 extensión constituida por el término municipal de A Arnoia y por la parroquia de Meréns, perteneciente al municipio de Cortegada. La totalidad del área se encuentra incluida en la Comarca de "O Ribeiro", situada al oeste de la provincia de Orense (MAGRAMA, 2014). “Pimiento De Couto”: el pimiento “Do Couto” se encuentra amparado por la IGP y se caracteriza por tener la sección longitudinal troncocónica-trapezoidal y sección transversal redondeada. En ocasiones la sección transversal aparece ligeramente surcada y con el extremo apical marcado con tres o cuatro cantos. El peso por fruto oscila entre 4 y 6 g por unidad, siendo su longitud entre 4 y 8 cm y su anchura de 2 cm. El pedúnculo oscila entre 2 y 3 cm, siempre de menor longitud que el fruto. El espesor del pericarpo oscila entre 1 y 1,5 mm. El color de la piel es de color verde oscuro, con poco brillo (estado inmaduro). El área de producción de pimientos amparados por la indicación geográfica protegida está constituida por la totalidad de la comarca del Ferrol, integrada por los siguientes municipios: Ferrol, Narón, Valdoviño, Cedeira, Moeche, As Somozas, San Sadurniño, Neda, Fene, Mugados y Ares. La superficie total asciende a 613,5 km² (MAGRAMA, 2014). “Pimiento de Herbón”: es el conocido ‘pimiento de Padrón’ que obtuvo el reconocimiento como DOP en el año 2009. Su nombre es el topónimo de la parroquia del ayuntamiento de Padrón en la que se ubica el monasterio al que se vincula la introducción de este pimiento procedente de América. Las características que posee el fruto son: sección longitudinal cónica o troncocónica, siendo ligeramente rugoso y marcando en el ápice 3 o 4 lóculos. El diámetro de la base oscila entre 1,5 y 2 cm, siendo la longitud del fruto entre 3,4 y 5,5 cm. El espesor del pericarpo es aproximadamente 1,5 mm. El peso del fruto oscila entre 3,5 y 4,5 g por unidad. La zona de producción está constituida por los municipios de: Padrón, Dodro, Rois pertenecientes a A Coruña y Pontecesures y Valga de la provincia de Pontevedra (MAGRAMA, 2014). “Pimiento de Oímbra”: los frutos amparados por esta IGP presentan forma alargada, con 3 o 4 lóbulos en su sección transversal, siendo el ápice picudo o redondeado. La piel es lisa y brillante, de color verde. La longitud es de 10 a 20 cm y el peso por fruto oscila entre 100 y 200 g. El espesor del pericarpo oscila entre 6 y 8 mm. El área de producción está constituida por la totalidad de la comarca orensana de Verín, compuesta por: Oímbra, Verín, Castrelo do Val, Monterrei, Cualedro, Laza, Riós y Vilardevós. La superficie total de esta comarca asciende a 1.000 km² (MAGRAMA, 2014). “Entenza”: esta variedad se ha obtenido por medio de un programa de selección de pimientos de la variedad Herbón (pimiento de Padrón comercial), siendo sus características morfológicas parecidas, pero eliminando el carácter picante del pimiento de Padrón. En Introducción 10 estos momentos la variedad no posee una figura comercial especifica, pero es muy apreciada por los consumidores (Rodríguez Bao et al., 2006). “Pimiento Asado del Bierzo”: estos pimientos amparados por la IPG se caracterizan por poseer 3-4 lóbulos, conformación alargada, siendo la longitud y anchura superiores a 10 y 6 cm respectivamente. Con respecto a la superficie, las paredes son lisas, con pocas hendiduras y poco marcadas. La piel es tersa y brillante, sin rugosidades ni zonas blandas, de color rojo pálido a rojo oscuro. No se admite que tenga zonas verdes. El ápice está hundido, siendo el espesor del pericarpio inferior a 8 mm. El peso por unidad debe ser superior a 160 g. La zona de producción y de elaboración se encuentra en el centro de la comarca del Bierzo, en la provincia de León, en la Comunidad Autónoma de Castilla y León. Comprende los siguientes términos municipales: Arganza, Bembibre, Borrenes, Cabañas Raras, Cacabelos, Camponaraya, Carracedelo, Carucedo, Castropodame, Congosto, Cubillos del Sil, Molinaseca, Ponferrada, Priaranza, Sobrado, Villadecanes-Toral de los Vados y Villafranca del Bierzo. La superficie de la zona delimitada supone aproximadamente 1.600 km². No se aplica restricción geográfica a la zona de asado del pimiento (MAGRAMA, 2014). “Ibarrako Piperrak – Guindillas de Ibarra”: esta variedad, que tradicionalmente se conoce como Berezi, se etiqueta bajo el distintivo Eusko Label. Las características distintivas de esta variedad son su fruto estrecho y alargado, entero, consistente, de sección redonda, con color verde amarillento, ligero brillo y uniforme en su coloración. El ápice es agudo y ligeramente curvado, siendo el pedúnculo entero, fino y largo. Longitud de la parte comestible oscilante entre 5 y 12 cm. Con respecto a la delimitación geográfica, los frutos deberán haber sido producidos en la zona atlántica de la Comunidad Autónoma Vasca, con evapotranspiración real (Thornthwaite) igual o superior a 585 mm y con temperatura mínimas en invierno (no excesivamente bajas) y máximas en verano (no excesivamente altas) correspondientes a un clima suave que permita el desarrollo del fruto en las condiciones de calidad previamente señaladas. Para esta variedad se ha trabajado con frutos inmaduros y maduros. “Pimiento de Gernika” o “Gernikako Piperra”: la variedad Derio junto con la variedad Iker están amparadas bajo esta DOP. Sus características morfológicas son las siguientes: posee 2 o 3 lóbulos, poco marcados, siendo la forma del fruto triangular, estrecha y alargada, con sección elíptica a triangular. El ápice es agudo y el pedúnculo entero, fino y largo. La longitud es de 6 a 12 cm. El peso por fruto se mantiene en la franja de 10 y 12 g. El color oscila entre verde medio y oscuro, con ligero brillo y uniforme en su coloración. La zona geográfica comprende las provincias de Gipuzkoa y Bizkaia y las siguientes zonas de Álava: zona cantábrica alavesa que comprende los municipios de Ayala, Okondo, Llodio, Amurrio y Introducción 11 Artzi-niega y la zona de estribaciones del Gorbea, municipios de Urkabustaiz, Zuya, Zigoitia, Legutiano y Aramaio (MAGRAMA, 2014). “Luzea”: es una variedad registrada en el año 2002 por Neiker, que posee características que le confieren una especial facilidad para ser asado. Dicha aptitud comenzó a ser demandada por los horticultores vascos dando lugar a un proceso de investigación comenzado en 1998 que tuvo como conclusión la obtención de esta variedad. Se intentó conseguir la denominación Eusko Label, pero debido al problema de suministro continuo de producto, no se consigue dicha denominación (Larregla del Palacio et al., 2008). “Pimiento del Piquillo de Lodosa”: los pimientos de la variedad Piquillo son los únicos que están protegidos por esta DOP. Se caracterizan por ser de color rojo, forma triangular, ápice agudo, corta longitud, diámetro medio y poco peso por fruto. La zona de producción y elaboración está formada por ocho municipios situados en la “Ribera Baja” de Navarra: Andosilla, Azagra, Carear, Lerín, Lodosa, Mendavia, San Adrián y Sartaguda (MAGRAMA, 2014). “Pimiento Riojano”: es la variedad Najerano la que se comercializa con esta IGP. Los frutos de esta variedad se caracterizan por tener los pedúnculos de forma cónica y acabado ligeramente en pico, superficie algo rugosa, con 2-3 caras de 16-18 cm de longitud y 6-8 mm de grosor. El color es rojo intenso y el peso por fruto oscila entre 225 y 300 g. El pimiento Najerano es cultivado en los valles de Rioja Baja, Media y Alta, y comercializado tanto en fresco como en conserva (MAGRAMA, 2014). “Pimentón de la Vera”: para la obtención del producto amparado por la DOP de mismo nombre, se emplean frutos de pimiento de las siguientes variedades: Jaranda, Jariza, Jeromín y Bola. La zona de producción de pimientos para la elaboración de “Pimentón de la Vera” está constituida por los municipios comprendidos en las comarcas naturales de La Vera, Campo Arañuelo, Valle del Ambroz y Valle del Alagón, en el Norte de la provincia de Cáceres (MAGRAMA, 2014). “Pimentón de Murcia”: esta DOP utiliza la variedad Bola. Se caracteriza por tener una forma subesférica, pericarpio semicarnoso, estando la cavidad del fruto dividida en tres partes iguales, separado por tabiques algo carnosos. La relación de peso seco frente a peso seco será como máximo de 5/1. El fruto es de poco peso. La zona de producción está constituida por los terrenos ubicados en los siguientes términos municipales: Alhama de Murcia, Beniel, Cartagena, Fortuna, Fuente Álamo, Librilla, Lorca, Molina de Segura, Murcia, Puerto Lumbreras, San Javier, Torre Pacheco y Totana. La zona de elaboración y envasado del “Pimentón de Murcia” comprende todos los términos municipales de la provincia de Murcia. La superficie total asciende a 4.844 km² (MAGRAMA, 2014). Objetivo 18 Material y métodos 19 3 MATERIAL Y MÉTODOS 3.1 Material vegetal Se han utilizado un total de 14 entradas de pimiento (C. annuum L.), que destacan por ser variedades que se comercializan bajo una calidad diferenciada, ya sea regional o nacional (Tabla 7) y por tanto con una reconocida calidad superior. Cuatro frutos de cada una de estas variedades fueron suministradas por las diferentes asociaciones o empresas adscritas con la figura de calidad diferenciada de cada variedad de pimiento (Figura 5 y Figura 6). Tabla 7: Tipo de Reconocida Calidad Diferenciada, variedad de pimiento e información disponible del picor de los frutos analizados. Nombre IGP/DOP Figura de calidad diferenciada Variedad carácter picante Pimiento de Arnoia IGP Arnoia No picante Pimiento de Oímbra IGP Oímbra No picante Entenza Variedad mejorada Entenza No picante Pimiento del Couto IGP Couto No picante Pimiento de Herbón DOP Padrón Picante Pimiento Asado del Bierzo IGP Bierzo Picante Guindilla de Ibarra Eusko Label Berezi Picante Pimiento de Gernika DOP Derio No picante Luzea Variedad mejorada Luzea No picante Pimiento Piquillo de Lodosa DOP Piquillo Picante Pimiento Riojano IGP Najerano-Leiva No picante /picante Pimiento Riojano IGP Najerano-Tricio No picante /picante Pimentón de la Vera DOP Vera No picante /picante Pimentón de Murcia DOP Bola No picante Material y métodos 20 Para la variedad Najerano, IGP Pimiento Riojano, dos empresas adscritas a esta IPG enviaron frutos, desde la localidad de Leiva se enviaron dos y otro dos desde Tricio. Puesto que se recibieron de localidades diferentes se trataron en los posteriores análisis como entradas diferentes. La distribución geográfica de las distintas variedades se puede observar en la Figura 5. Figura 5: Distribución geográfica de las variedades de pimiento utilizadas en este trabajo Para todas las variedades, los frutos se recibieron en estado maduro (color rojo), excepto para las variedades Berezi, Derio y Luzea que se enviaron frutos en los dos estados, maduro (color rojo) e inmaduro (color verde). Los frutos fueron procesados para obtener el extracto de capsicinoides como en el apartado siguiente se describe. Material y métodos 21 Figura 6: Variedades suministradas por las diferentes asociaciones o empresas adscritas con una figura de calidad diferenciada. a) Arnoia, b) Couto, c) Herbón, d) Oímbra, e) Entenza, f) Bierzo, g) Berezi Inmaduro, h) Berezi Maduro, i) Derio Inmaduro, j) Derio Maduro, k) Luzea, l) Piquillo, m) Vera, n) Najerano (Tricio), y o) Bola 3.2 Reactivos y soluciones Todos las soluciones, estándares, tampones y eluyentes fueron preparados con agua de grado analítico tipo I (Milli-Q Synthesis, Millipore, Bedford, MA). Capsicina (CAP) (8-metil-Nvanillil-trans-6-nonenamida) (≥97%), dihidrocapsicina (DHC) (8-metil-N-vanillilnonamida) (≥90%), metanol (≥99.9%, grado LC-MS), ácido acético, Na-acetatos [10 mM NaOH, 2.5% (v/v) de ácido acético y 50% (v/v) 2-propanol], acetonitrilo (grado LC-MS) fueron comprados Material y métodos 22 en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El análogo de la capsicina (4,5-dimetooxibenzil)-4metiloctamida (DMBMO) fue sintetizado según el método Cooper et al. (1991) y utilizado como estándar interno (SI). 3.3 Extracción de capsicinoides Para la extracción de los capsicinoides se siguió el método descrito por Garcés-Claver et al. (2006). Los frutos fueron secados a 55ºC durante 4-5 días y, posteriormente, molidos en un molinillo Polytron. A cien miligramos de muestra de tejido seco se añadió 1 ml de acetonitrilo puro, con una pequeña cantidad del estándar interno (SI) (4,5-dimetoxibenzil)-4metiloctamide (DMBMO) para obtener una concentración final de 5 μM de DMBMO. La suspensión de polvo seco en acetonitrilo fue agitada a temperatura ambiente durante una hora (empleando un agitador orbital de New Brunswick Scientific, Edison, NJ, trabajando a 250 rpm), para posteriormente ser llevada a un baño de agua caliente, sin agitar, a 65ºC durante una hora. La mezcla se agitó otra vez a temperatura ambiente durante una hora en las condiciones anteriormente citadas. Luego, la suspensión se centrifugó durante 15 min a 16.000 g, y el sobrenadante se recogió y llevó a 1 ml de acetonitrilo. Para finalizar, el sobrenadante se filtró antes de realizar el análisis, empleando filtros de membrana 0,45 y 0,22 μm PVDF (Millipore, Bedford, MA). Se realizaron 3 réplicas de cada extracto. 3.4 Método analítico HPLC-ESI-MS La separación cromatográfica se realizó en un sistema HPLC serie1100 (Agilent Technologies, Waldbron, Alemania). Se utilizó la columna analítica HPLC C18 column (Symmetry C18, 150 x 2,1 mm; 3,5 μm de tamaño esférico de partículas, Waters, Milford, MA, EEUU) acoplada en serie a una precolumna (Symmetry C18 10 mm x 2,1 mm; 3,5 μm de tamaño esférico de partículas, Waters). Las condiciones de HPLC fueron: como solventes se utilizaron el metanol (solvente A) y el agua Milli-Q acidificada con 2,5% (v/v) de ácido acético (solvente B); el flujo fue de 250 µLmin-1; la temperatura de la columna 25ºC; y el volumen de inyección 5 µl. El programa de elución comenzó con un gradiente lineal de 50 a 60% A en 30 min, se mantuvo 30 min a esta composición, y posteriormente se incrementó la concentración de A de 60 a 70% en dos min, y se mantuvo en esta composición durante 8 min. Finalmente, la concentración de A disminuyó hasta 50% en 5 min y se mantuvo 10 min más. La detección de los capsicinoides se realizó por acoplamiento del sistema de HPLC a un espectrómetro de masas cuadrupolo de tiempo de vuelo [quadrupole time-of-flight (QTOF)] Material y métodos 23 equipado con una fuente de ionización por electroespray (ESI) y una válvula divergente de seis puertos (microTOF-Q™ Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). Los análisis de ESIMS2(QTOF) se realizaron en modo positivo, utilizando Argón como gas de colisión. Los espectros de masas fueron adquiridos en un rango de m/z 50–800 y los análisis de MS/MS fueron realizados de forma automatizada seleccionando como iones precursores los cinco más intensos y con una m/z en el rango de 270-350, que incluye las m/z los iones [M+H+] correspondientes a los capsicinoides conocidos. El eje de masas fue calibrado utilizando un conjunto de Na-acetatos [10 mM NaOH, 2.5% (v/v) de ácido acético y 50% (v/v) 2-propanol]. El programa informático utilizado fue el Bruker Daltonik software, que incluye el micrOTOF Control v.2.3, el HyStar v.3.2 y el Data Analysis v.4.0 para controlar el equipo MS(QTOF), la conexión del sistema HPLC con el MS y el procesador de datos respectivamente. Para las asignaciones de las fórmulas moleculares de los iones producto se utilizaron las herramientas Smart Formula y Smart Formula 3DTM que viene en el mismo programa. 3.5 Análisis estadístico Para evaluar las diferencias existentes entre los contenidos de CAP y DHC de las distintas muestras de pimientos analizadas, se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) para los datos transformados de las concentraciones de CAP y DHC. También se estudió la correlación entre las variables. Dado que la prueba de normalidad, determinó que los datos obtenidos no presentaban una distribución normal, estos fueron transformados, log (x+1), con el fin de realizar un correcto análisis estadístico. Las diferencias entre las variedades se compararon con la prueba de rango múltiple de Student-Newman-Keuls (p≤0,05). Todos los análisis se realizaron mediante el programa estadístico Statgraphics Centurion XVI v16.2.04 (StatPoint Technologies, Inc.,). Para estudiar la relación entre las entradas, la presencia de los capsicinoides se clasificó por el criterio de presencia (1) / ausencia (0) y se creó un archivo en forma de matriz binomial. A partir de esos datos, se estimó la similitud entre entradas utilizando el coeficiente Dice. Con los valores obtenidos se construyó una matriz de similitud. Estos cálculos se realizan mediante el programa NTSYSpc versión 2.11 (Rohlf, 2000). Material y métodos 24 Resultados y Discusión 25 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Identificación de capsicinoides mayoritarios y minoritarios mediante HPLCESI-MS/MS(QTOF). Los analitos fueron separados con un gradiente de solventes en una columna C18 y el espectro de masas fue adquirido por ESI-MS(QTOF) en el rango de masas de m/z 50–800 durante toda la carrera cromatográfica, obteniéndose cromatogramas 3-D (tiempo, m/z e intensidad). Para una solución combinada de los estándares de CAP, DMBMO y DHC se extrajeron los cromatogramas de los iones para los valores de m/z correspondientes al [M+H+] de cada analito. Los resultados mostraron que el método HPLC-ESI-MS/MS(QTOF) fue capaz de resolver correctamente los estándares de CAP, DMBMO y DHC cuando están juntos en una misma solución con tiempos de resolución de 32,3 min, 37,1 min y 44,6 min, respectivamente. A partir de los extractos de fruto de las distintas variedades se extrajeron los cromatogramas de los iones para los valores de m/z correspondientes a los [M+H+] de cada analito descrito en la Tabla 6 y del SI (m/z 308,22). Un ejemplo de cromatograma a partir de un extracto de “Berezi” se presenta en la Figura 8. Dos de los dieciocho compuestos, picos 10 y 11, y el SI, en Figura 8, coincidieron en RT y m/z con los valores de los estándares de CAP, DHC y SI. Además, la identidad de estos tres compuestos fue confirmada por comparación de los espectros de fragmentación obtenidos en el MS/MS de los compuestos con los obtenidos para los estándares (Figura 7), tanto para los valores de m/z, como para las intensidades relativas de los iones fragmentados (Tabla 8). Resultados y Discusión 26 Figura 7. Patrón de fragmentación MS/MS característico de la capsicina (m/z 306) (fuente: Rodríguez et al., 2010) El compuesto 12 tiene el mismo valor de m/z y la misma fórmula empírica que el compuesto 11 (DHC) (Tabla 6), pero eluye 4,1 min después, lo cual sugiere que este compuesto es un isómero de la DHC. Este compuesto se identificó como N-vainillin decanamida (12) (Tabla 6). Al igual que ocurre con los compuestos 11 (DHC) y 12, también se observó que para las parejas de los compuestos 5 y 6, 7 y 8, 13 y 14, y 16 y 17 (Figura 8), coincidían para el valor de m/z y fórmula empírica, y que en todos los casos uno de ellos eluía más tarde que el otro por lo que se tratan de isómeros. Estos compuestos fueron asignados en función del valor de m/z exacta, de la fórmula empírica, del patrón de fragmentación y de la m/z exacta de los iones producto (Tabla 8) con el 4-ene-7-metil norcapsicina (5) y N-vainillin 6-nonenamida (6); 6-metil nordihidrocapsicina (7) y 7-metil nordihidrocapsicina (8); 6-ene-8-metil homocapsicina (13) y 6-ene-9-metil homocapsicina (14); 8-metil homodihidrocapsicina (16) y 9-metil homodihidrocapsicina (17), respectivamente. Al extraer la m/z 278,17 que corresponde a los isómeros 4-ene-6-metil nornorcapsicina (1) y N-vainillin 5-octenamida (2), se obtuvo únicamente un pico (1 ó 2) (Figura 8). La asignación de este compuesto a uno de los dos isómeros de la pareja fue confirmada por el 153.0 306.2 137.0 170.0 182.0 +MS2(306.1), 7.1min #236 0.0 0.5 1.0 1.5 7 x10 Intens. 100 125 150 175 200 225 250 275 300 m/z N H2 O OH OCH3 OH OCH3 H3N O N H O m/z 137 m/z 182 m/z 170 m/z 306 153.0 306.2 137.0 170.0 182.0 +MS2(306.1), 7.1min #236 0.0 0.5 1.0 1.5 7 x10 Intens. 100 125 150 175 200 225 250 275 300 m/z N H2 O OH OCH3 OH OCH3 OH OCH3 H3N O N H O N H O m/z 137 m/z 182 m/z 170 m/z 306 Resultados y Discusión 27 valor de m/z exacta y por la determinación de su fórmula empírica (Tabla 8). Además, el espectro de MS/MS reconfirmó que el patrón de fragmentación del compuesto era el típico de los capsicinoides y que la m/z exacta correspondía a la de los iones productos. Sin embargo, no se pudo determinar cual de los dos isómeros era de la pareja. Lo mismo sucedió con el pico (3 ó 4), obtenido al extraer la m/z 280,19, correspondiente a la pareja de isómeros 6-metil nornordihidrocapsicina (3) y N-vainillin octanamida (4). Resultados y Discusión 34 Tabla 9: Perfil de capsicinoides de los distintos frutos de pimiento analizados. (1) 4-ene-6-metil nornorcapsicina, (3) 6-metil nornordihidrocapsicina; (4) N-vainillin octanamida; (5) 4-ene-7-metil norcapsicina; (6) N-vainillin 6-nonenamida; (7) 6-metil nordihidrocapsicina; (8) 7-metil nordihidrocapsicina; (9) N-vainillin nonanamida; (10) 6-ene-8-metil capsicina (capsicina); (11) 8-metil dihidrocapsicina (dihidrocapsicina); (12) N-vainillin decanamida; (13) 6-ene-8-metil homocapsicina; (14) 6-ene-9-metil homocapsicina; (15) N-vainillin 8undecenamida; (16) 8-metil homodihidrocapsicina; (17) 9-metil homodihidrocapsicina y (18) N-vainillin undecanamida. 1 = Presencia, 0 = Ausencia (1) ó (2) (3) ó (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) ARNOIA 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 ARNOIA 4 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 ARNOIA 7 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 ARNOIA 8 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 BEREZI IN 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 BEREZI IN 2 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 BEREZI IN 4 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 BEREZI IN 8 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 BEREZI M 2 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 BEREZI M 3 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 BEREZI M 7 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 BEREZI M 10 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 BIERZO 2 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 BIERZO 3 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 BIERZO 4 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 BIERZO 6 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 BOLA 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 BOLA 4 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 BOLA 9 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 BOLA 2 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Resultados y Discusión 35 (1) o (2) (3) o (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) DERIO M 5 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 DERIO M 6 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 DERIO M 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 DERIO M 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 LEIVA 10 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 LEIVA 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 PADRÓN 2 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 PADRÓN 7 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 PADRÓN 9 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 PADRÓN C8 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 PIQUILLO 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 PIQUILLO 3 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 PIQUILLO 5 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 PIQUILLO 7 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 TRICIO 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 TRICIO 2 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 VERA 3 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 VERA 6 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 VERA 8 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 VERA 9 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Resultados y Discusión 36 4.3 Análisis cuantitativo del contenido de capsicinoides Dado que sólo se disponen de estándares comerciales de CAP y DHC, únicamente se puede realizar la cuantificación de estos dos compuestos. No obstante, el sumatorio de la concentración de ambos compuestos supone aproximadamente el 90% del contenido total, por lo que este dato es un buen indicador del valor real del picor del fruto. A partir de las distintas concentraciones de los estándares de CAP y DHC, y de una concentración conocida y siempre constante de SI, se obtuvieron las rectas de regresión que permitieron establecer las ecuaciones necesarias para la cuantificación: -Para CAP: Y = 0,5915 X + 0,0122 (R2 = 0,99) -Para DHC: Y = 0,5852 X + 0,3238 (R2 = 0,99) Siendo: Y el valor del [área del capsicinoide x concentración del SI] / área de SI, y X la concentración (µM). Los datos del contenido medio de CAP y DHC (µg*g-1 ms) para las distintas variedades se muestran en la Figura 10. Resultados y Discusión 37 Figura 10: Concentraciones medias de CAP y DHC de las distintas variedades de pimiento analizadas en este trabajo. a) datos de concentración media de CAP y DHC para las variedades más picantes; b) datos de concentración media de CAP y DHC para las variedades menos picantes Las variedades con mayor concentración media de CAP fueron Padrón y Berezi en estado maduro, presentando valores 228,25 y 273,61 µg*g-1 ms, respectivamente, las cuales también presentaron contenidos medios mayores de DHC, con valores de 146,21 y 207,11 µg*g-1 ms, respectivamente (Figura 10a). Estos valores están por encima de los valores publicados para la variedad Agridulce (CAP 8,7 ± 0,1 µg*g-1 ms y DHC 8,3 ± 0,2 µg*g-1 ms) y por debajo de los de la variedad Tabasco (CAP 3785 ± 235 µg* g-1 ms y DHC 2461 ± 80 µg*g-1 ms) (Garcés-Claver et al., 2006). El nivel de picante de Padrón resultó 14 veces inferior al del Tabasco. ARNOIA BEREZI IN BEREZI M LEIVA PADRON CAP 25,66 38,03 273,61 111,90 288,25 DHC 18,56 44,94 207,11 76,08 146,21 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 Concentración µg / g m.s. Concentración de CAP y DHC a) BIERZO BOLA DERIO PIQUILLO TRICIO VERA CAP 0,67 0,13 0,03 0,52 0,32 4,66 DHC 0,19 0,00 0,00 0,22 0,00 1,86 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 Concentración µg / g m.s. b) Resultados y Discusión 38 Las variedades que tuvieron concentraciones medias más bajas de CAP fueron Derio, Bola y Tricio con 0,03, 0,13 y 0,32 µg*g-1 ms, respectivamente, presentando a la vez valores nulos de contenido medio de DHC (Figura 9b). La prueba estadística de normalidad de los datos para cada uno de los dos factores, concentración de CAP y DHC, determinó que los datos no presentaban una distribución normal, por lo que fueron transformados [log (x+1)]. Los resultados obtenidos del ANOVA señalaron diferencias significativas para contenido en CAP y DHC, entre y dentro de las distintas variedades (Tabla 10). Tabla 10: Cuadrados medios para los valores transformados de CAP y DHC de los distintos extractos de frutos analizados. CAP DHC g.l Cuadrados medios g.l Cuadrados medios Entre variedades 10 25,1953* 7 24,8018* Dentro de variedades 29 3,08055* 22 4,38625* *Existen diferencias significativas con un nivel de significación del 95% Grados de libertad (g.l) En el ANOVA para concentración de CAP se incluyeron 40 muestras divididas en 11 variedades mientras que para la DHC se incluyeron 30 muestras repartidas en 8 variedades, ya que no en todos los frutos en los que está presente la CAP necesariamente lo está la DHC, como es el caso de las variedades Bola, Tricio y Derio en estado maduro. En relación a la agrupación de medias, mientras que para el contenido de CAP se establecieron tres grupos, para el contenido de DHC sólo dos (Tabla 11). Si bien la variedad Berezi se dividió en dos submuestras, en función de su estado de maduración, con el fin de determinar diferencias significativas, ambas fueron incluidas en un mismo grupo (bc para CAP y b en el caso de la DHC). A pesar de que en su estado más avanzado de maduración, se detectaron mayores concentraciones de dichos compuestos y mayor número de compuesto, estas diferencias no llegaron a ser significativas. La variabilidad de estos compuestos en función del estado de desarrollo de fruto ya ha sido previamente descrita en pimientos (Sukrasno et al., 1993). Resultados y Discusión 39 Las que presentaron una menor concentración media tanto en CAP como DHC fueron las variedades del grupo a. En el análisis para CAP se incluyeron ocho variedades dentro de este grupo, obteniéndose valores medios de concentración entre 0,03 y 111,90 µg*g-1 ms, mientras que para DHC se incluyeron cinco, obteniéndose valores medios comprendidos desde lo no detectados hasta 76,08 µg*g-1 ms. El rango tan amplio obtenido en estos grupos se debe a la gran variabilidad entre frutos de la misma variedad (Lindsey y Bosland, 1995; Estrada et al., 1998; Zewdie y Bosland, 2000). Tabla 11: Agrupación de medias para los datos transformados [log (x+1)] de concentración de CAP y de DHC Genotipo CAP DHC Bierzo 1,43 ± 0,881 a 0,61 ± 1,05 a Bola 0,68 ± 0,88 a nd2 Derio Maduro 0,24 ± 0,88 a nd Piquillo 1,48 ± 0,88 a 0,68 ± 1,05 a Tricio 1,26 ± 1,24 a nd Vera 3,25 ± 0,88 ab 2,11 ± 1,05 ab Arnoia 3,53 ± 0,88 ab 2,87 ± 1,05 ab Leiva 3,86 ± 1,24 abc 3,66 ± 1,48 ab Berezi Inmaduro 5,56 ± 0,88 bc 5,72 ± 1,05 b Berezi Maduro 7,16 ± 0,88 bc 6,73 ± 1,05 b Padrón 7,51 ± 0,88 c 6,59 ± 1,05 b 1 Media ± ES con. 2nd.: no detectado; Valores seguidos por la misma letra en la misma columna no muestran diferencias significativas entre ellos (P<0.05) según la prueba de rangos múltiples de Student-NewmanKeuls. Para la variedad Leiva no se detectaron diferencias significativas con el resto de grupos. Esto podría deberse a que sólo se incluyeron dos frutos en el análisis (en lugar de cuatro como en la mayoría), siendo además, uno de ello no picante (valores nulos de CAP y DHC). Se observó correlación positiva (R2 = 96.59%) entre el contenido de CAP y el de DHC, es decir, a medida que aumenta la concentración de uno de estos compuestos también aumenta la concentración del otro, esto es debido a que comparten la misma ruta de biosíntesis. Resultados similares fueron encontrados por Blum et al. (2003). Esto implicaría que en un programa de mejora si se seleccionaran entradas con altos contenidos en CAP se seleccionarían también altos contenidos de DHC. Resultados y Discusión 40 Conclusiones 41 5 CONCLUSIONES Las conclusiones obtenidas en este trabajo han sido: 1. La aplicación de un método de HPLC-ESI-MS/MS(QTOF) ha permitido la detección, con alta selectividad y sensibilidad, de 16 capsicinoides a partir de extractos de frutos de pimiento de variedades comerciales de reconocida calidad diferenciada. 2. Este método analítico ha permitido la identificación de 14 capsicinoides mediante la determinación de la relación de la masa-carga exacta de los iones padres [M+H+], necesarios para la asignación de la fórmula empírica. Además, los capsicinoides fueron reconfirmados mediante el análisis del patrón de fragmentación de los iones padres. 3. Se han presentado los perfiles de contenido de capsicinoides para los distintos frutos y variedades de pimiento comerciales de reconocida calidad diferenciada, encontrándose variabilidad entre frutos y variedades. 4. Es la primera vez que se presenta información tan precisa sobre la presencia de los distintos metabolitos relacionados con el carácter picante en variedades comerciales de pimiento. 5. La disponibilidad de estándares comerciales de capsicina y dihidrocapsicina ha permitido, mediante la aplicación del método HPLC-ESI-MS/MS(QTOF), la cuantificación de estos dos compuestos con gran fiabilidad y exactitud a partir de extractos de pimiento. 6. La cuantificación de los frutos de las distintas variedades de pimiento utilizadas en este trabajo ha puesto de manifiesto la existencia de variabilidad para el contenido de capsicina y dihidrocapsicina dentro y entre las variedades comerciales analizadas en este trabajo. 7. Las variedades más picantes, Berezi (con distintivo Eusko Label “Guindilla de Ibarra”) y Padrón (reconocida como DOP “Pimiento de Herbón”), contuvieron los perfiles de capsicinoides más amplios. Conclusiones 42 8. No en todos los casos coincidieron los resultados del carácter picante obtenidos para las distintas variedades con la información disponible que hay de ellas. Bibliografía 43 6 BIBLIOGRAFÍA Andrews J. 1984. En: Peppers, the domesticated Capsicums. University Texas Press, pp 170. Blum E, Mazourek M, O’Connell MA, Curry J, Thorup T, Liu K, Jahn MM, Paran I. 2003. Molecular mapping of capsaicinoid biosynthesis genes and quantitative trait loci analysis for capsaicinoid content in Capsicum. Theoretical and Applied Genetics, 108: 79–86. Bristow AWT. 2006. Accurate mass measurement for the determination of elemental formula-a tutorial. Mass Spectrometry Reviews, 25: 99–111. Collins MD, Wasmund LM, Bosland PW. 1995. Improved method for quantifying capsaicinoids in Capsicum using high-performance liquid chromatography. HortScience, 30: 137–139. Contreras-Padilla M, Yahia EM. 1998. Changes in capsaicinoids during development , maturation , and senescence of chile peppers and relation with peroxidase activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46: 2075–2079. Cooper TH, Guzinski JA, Fisher C. 1991. Improved high-performance liquid chromatography method for the determination of major capsaicinoids in Capsicum oleoresins. 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Federación Española de Asociaciones de Productores Exportadores de Frutas, Hortalizas, Flores y Plantas Vivas. www.fepex.es Anexo I 50 Leiva 1 Measured Elemental Calculated Error mSigma m/z formula m/z (mDa) Fit value (10) RT = 33.6 306,2115 C18H28NO3306,2064 -5,2 122,0376 C7H6O2122,0362 -1,4 12,5 137,0596 C8H9O2137,0597 0,1 19 153,1271 C10H17O 153,1274 0,3 62,5 182,1549 C11H20NO 182,1539 -1 70,9 (11) RT = 46.7 308,2250 C18H30NO3308,2220 -1,1 122,0361 C7H6O2122,0362 0,2 43,8 137,0582 C8H9O2137,0597 1,5 17,4 155,1383 C10H19O 155,1430 4,7 n.d. 172,168 C10H22NO 172,1696 1,6 64,7 184,1629 C11H22NO 184,1696 6,7 n.d. Piquillo 1 Measured Elemental Calculated Error mSigma m/z formula m/z (mDa) Fit value (10) RT = 35 306,2075 C18H28NO3306,2064 -1,1 122,0351 C7H6O2122,0362 1,2 784,5 137,0560 C8H9O2137,0597 3,7 24,9 153,1272 C10H17O153,1274 0,2 n.d. 182,1256 C11H20NO 182,1539 1,3 n.d. (11) RT = 49 308,2250 C18H30NO3308,2220 4,8 Anexo I 51 Padrón 9 Measured Elemental Calculated Error mSigma m/z formula m/z (mDa) Fit value (6) RT = 26.1 292,192 C16H26NO3292,1907 -1,3 (8) RT = 32.7 294,2091 C16H28NO3294,2064 -2,8 122,0368 C7H6O2122,0362 -0,5 784,5 137,0594 C8H9O2137,0597 0,3 19,8 158,1537 C9H20NO 158,1539 0,2 58,4 170,1474 C10H20NO 170,1539 6,5 n.d. (9) RT = 35.3 294,2081 C16H28NO3294,2064 -1,8 (10) RT = 35.2 306,2099 C18H28NO3306,2064 -3,5 122,0377 C7H6O2122,0362 -1,4 11,4 137,0603 C8H9O2137,0597 -0,6 18,2 153,1289 C10H17O153,1274 -1,6 62,5 170,1558 C10H20NO 170,1539 -1,9 n.d. 182,1535 C11H20NO 182,1539 0,5 70,9 (11) RT = 49.1 308,2248 C18H30NO3308,2220 -2,8 17,8 122,0374 C7H6O2122,0362 -1,1 784,5 137,0601 C8H9O2137,0597 -0,4 15,9 155,1402 C10H19O 155,1430 2,8 n.d. 172,1712 C10H22NO 172,1696 -1,6 64,7 184,165 C11H22NO 184,1696 4,6 n.d. (12) RT = 54 308,2225 C18H30NO3308,2220 -0,5 122,0388 C7H6O2122,0362 -2,6 784,5 137,061 C8H9O2137,0597 -1,3 24,9 155,1401 C10H22NO 172,1696 2,9 n.d. 172,1673 C11H22NO 184,1696 2,3 n.d. (14) RT = 51.7 320,2217 C19H30NO3320,2220 0,4 Measured Elemental Calculated Error mSigma m/z formula m/z (mDa) Fit value (15) RT = 53.2 320,2223 C19H30NO3320,2220 -0,3 122,0361 C7H6O2122,0362 0,1 784,5 137,0591 C8H9O2137,0597 0,6 19,1 184,1737 C10H22NO 184,1696 -4,1 n.d. 196,1716 C12H22NO 196,1696 -2 n.d. (17) RT = 69.6 322,2359 C18H32NO3322,2220 1,7 (18) RT = 70.7 322,2375 C18H32NO3322,2220 0,1 122,0359 C7H6O2122,0362 0,3 784,5 137,0591 C8H9O2137,0597 0,6 12,5 186,186 C11H24NO2186,1852 -0,7 70,9 Anexo I 52 Vera 3 Measured Elemental Calculated Error mSigma m/z formula m/z (mDa) Fit value (10) RT = 35.5 306,2092 C18H28NO3306,2064 -2,8 122,0421 C7H6O2122,0362 -5,8 784,5 137,0664 C8H9O2137,0597 -6,7 11,3 153,1299 C10H17O 153,1274 -2,5 n.d. 170,1552 C10H18O2170,1301 -1,3 n.d. 182,151 C11H20NO 182,1539 2,9 n.d. (11) RT = 49.6 308,2241 C18H30NO3308,2220 -2,1 122,0400 C7H6O2122,0362 -3,8 784,5 137,0657 C8H9O2137,0597 -6 31,3 172,1739 C10H22NO 172,1696 -4,3 64,7 184,1712 C11H22NO 184,1696 -1,6 n.d.