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Facultad de Ciencias Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Trabajo de Fin de Grado Liposomas decorados con Apo2L/TRAIL como tratamiento antitumoral de tumores sólidos Autor: Lola Pejenaute Ochoa Director: Luis Martínez Lostao 1 ÍNDICE: Resumen………………………………………………………………………………………………………………..…………….2 Abstarct…………………………………………………………………………………………………………..………….……….3 Antecedentes y Objetivos…………………………………………………………………………………….……..…….…4 Introducción………………………………………………………………………….………………………………………..……6 Apoptosis………………………………………………..…………………………………………………………………………6 Vías de la apoptosis………………………………………..…………………………………….………………..…………7 Vía intrínseca………………………..………………………………………………....…………7 Vía extrínseca…………………………………………………………………………..…………8 Apo2L/TRAIL………………………………………………..……………………………………………………..…..…………8 Características y receptores…………………………………………………..……………8 Apo2L/TRAIL como tratamiento anti-tumoral…………………………….……….9 Materiales y Métodos........................................................................................................11 Expresión y purificación Apo2L/TRAIL-His6……………………………………….………………………….11 Expresión de Apo2L/TRAIL TRAIL-His………………………..………………………11 Purificación de Apo2L/TRAIL-His6…………………………………………..…………12 Preparación de las nanopartículas lipídicas LUV-TRAIL………………………………..………………12 Preparación de las nanopartículas tipo LUV……………………….…………….12 Preparación de los LUV-TRAIL……………………………………………………..…..12 Cultivos celulares…………………………………………………………………………………………….………….13 Ensayos de citotoxicidad.........................................................................................13 Ensayo de reducción del MTT..........................................................13 Cuantificación de la muerte celular mediante tinción con IP.............14 Expresión de los receptores de Apo2L/TRAIL...........................................................15 Microscopía de fluorescencia..................................................................................15 Análisis de proteínas mediante Western blot...........................................................15 Análisis estadístico..................................................................................................17 Resultados.........................................................................................................................18 Estudio de citotoxicidad de TRAIL soluble y LUV-TRAIL en las células HCT-116...........18 Expresión de receptores de Apo2L/TRAIL en células HCT-116...........................18 Citotoxicidad inducida por los LUV-TRAIL en células HCT-116............................19 Análisis de la morfología nuclear tras el tratamiento con LUV-TRAIL en células HCT-116.....19 Activación de las caspasas tras el tratamiento con LUV-TRAIL en células HCT-116.......19 Estudio de citotoxicidad de TRAIL soluble y LUV-TRAIL en las células Caki-1................20 Expresión de receptores de Apo2L/TRAIL en células Caki-1.................................20 Citotoxicidad inducida por los LUV-TRAIL en células Caki-1..................................20 Análisis de la morfología nuclear tras el tratamiento con LUV-TRAIL en células Caki-1....20 Activación de las caspasas tras el tratamiento con LUV-TRAIL en células Caki-1……....21 Discusión...........................................................................................................................22 Conclusiones.....................................................................................................................24 Conclusions………………………………………………………………………………………………………………………25 Bibliografía........................................................................................................................26 2 RESUMEN: El propósito principal de este trabajo de fin grado ha consistido en llevar a cabo la purificación de la proteína Apo2L/TRAIL (TRAIL) y unirla a la superficie de nanopartículas lipídicas (LUV-TRAIL) con el objetivo de usarla como tratamiento antitumoral en tumores sólidos, en concreto de colon, para lo cual se utilizó la línea celular HCT-116 y de riñón empleando la línea celular Caki-1. Para ello, se ha llevado a cabo la purificación de dicha proteína, y la generación de las nanopartículas lipídicas y posteriormente se unió la proteína a su superficie para analizar su bioactividad y capacidad como tratamiento antitumoral comparándola con la proteína soluble. TRAIL es un ligando mortal que interaccionan con sus receptores proapoptóticos en células tumorales activando la vía extrínseca de la apoptosis e induciendo la muerte de células cancerosas. Por ello, antes de llevar a cabo los ensayos de citotoxicidad se estudió en ambas líneas la expresión de los receptores de TRAIL. Posteriormente se llevaron a cabo estudios de la citotoxicidad de los LUV-TRAIL comparándolos con TRAIL soluble realizando ensayos dosis-respuesta y se analizó la muerte de las células tumorales mediante citometría de flujo y MTT. También se emplearon durante estos experimentos un anticuerpo bloqueante específico de TRAIL; RIK, con el objetivo de demostrar que la muerte inducida por los LUV-TRAIL en dichas líneas se debe específicamente a TRAIL. Para estudiar los cambios morfológicos nucleares que sufren las células tras el tratamiento con los LUV-TRAIL se realizó una tinción nuclear empleando la sonda fluorescente Hoechst y se analizó mediante microscopía de fluorescencia. Se observó en ambas líneas celulares que tras el tratamiento con los LUV-TRAIL se producían los eventos característicos de la apoptosis como la condensación de la cromatina, la fragmentación del núcleo y la formación de burbujas nucleares llamadas “blebs”. Finalmente, para analizar la capacidad de los LUV-TRAIL de inducir apoptosis se analizó su capacidad de activarlas principales caspasas implicadas en la vía extrínseca de la apoptosis. Para ello, se realizó un Western Blot para ambas líneas celulares tratadas con los LUV-TRAIL para analizar la activación de la caspasa 8 y la caspasa 3, y se realizaron experimentos de citotoxicidad empleando los inhibidores de caspasas ZVAD (inhibidor general de caspasas) e IETD (inhibidor específico de caspasa 8), con el objetivo de demostrar que la muerte inducida por los LUV-TRAIL en dichas líneas se produce como consecuencia de la activación de caspasas. 3 ABSTRACT: The main purpose of this final project work has been to carry out the purification of Apo2L/TRAIL (TRAIL) and to anchor it to the surface of the lipid nanoparticles (LUV-TRAIL), in order to use it as an antitumor treatment in solid tumors, particularly in colon cancer, using HCT-116 cellline, and in renal cancer, using Caki-1 cell line. It has been performed the purification of TRAIL, the generation of the lipid nanoparticles, and after that, TRAIL was tethered to liposome surface. Finally the bioactivity and antitumor ability of LUV-TRAIL was analyzed compared the soluble version of TRAIL. TRAIL is a death ligand which interacts with its pro-apoptotic receptors in tumor cells, activating the extrinsic apoptotic pathway and inducing cell death. Therefore, the expression of TRAIL receptors was studied in both tumor cell lines before carrying out the cytotoxic assays. Then, citotoxicity assays using LUV-TRAIL and soluble TRAIL were performed analyzing cell death by the MTT method and by flow cytometry. In some cases the blocking anti-human TRAIL, RIK was used in order to corroborate that cell death induced by LUV-TRAIL on these lines was specifically due to TRAIL. In order to study the nuclear morphological changes after LUV-TRAIL treatment, it was carried out nuclear staining with the fluorescent probe Hoechst and was analyzed by fluorescence microscopy. In both cells lines, it was observed that LUVTRAIL treatment induced the typical apoptotic morphological changes in nuclei such as chromatin condensation, nuclear fragmentation and blebbing formation. Finally, to study the ability of LUV-TRAIL to induce apoptosis, it was analyzed their capability to induce the activation of the main caspases (caspase 8 and caspase 3) implicated in the extrinsic apoptotic pathway by Western Blot in both cells lines. It also carried out cytotoxicity assays using the pancaspase inhibitor ZVAD and the caspase 8 inhibitor IETD in order to asses that LUV-TRAIL-induced cell death was due to a caspase activation in both cell lines. 4 ANTECEDENTES Y OBJETIVOS: La molécula de Apo2L/TRAIL endógena fue descubierta de forma independiente a mediados de la década de 1990, por dos grupos diferentes (Pitti, et al 1996, Wiley, et al 1995). Se trata de una proteína de membrana tipo II que pertenece a la familia del TNF capaz de inducir apoptosis en gran variedad de células cancerosas, al unirse a sus receptores pro-apoptóticos DR4 y DR5, pero no en células normales lo que hizo de esta molécula un prometedor agente para la terapia contra el cáncer (Almasan and Ashkenazi 2003). De hecho en la actualidad se encuentran varios ensayos clínicos en fase II/III basados en el efecto pro-apoptótico de Apo2L/TRAIL sobre varios tipos de cánceres. Los estudios donde se está empleando dicha proteína utilizan principalmente dos estrategias terapéuticas: el uso de Apo2L/TRAIL humano recombinante soluble, o bien el uso anticuerpos monoclonales agonistas dirigidos contra DR4 o DR5 solos o en combinación con otras drogas (Ashkenazi 2008, Martinez-Lostao, et al 2012). En éstos últimos, los resultados obtenidos son más o menos prometedores debido a que el estrés de la combinatoria desencadena la apoptosis con mayor eficacia que de forma individual Sin embargo, a pesar de la seguridad que Apo2L/TRAIL ha demostrado como monoterapia en los estudios clínicos, su efectividad no ha sido la esperada ya que hasta un 50% de los canceres presentan resistencia a la forma soluble de Apo2L/TRAIL debido a distintos mecanismos moleculares. Por ello, durante los últimos cuatro años, se emprendió un proyecto en el Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza para acoplar Apo2L/TRAIL a la superficie de nanopartículas lipídicas (LUVTRAIL) con una composición lipídica similar a la de los exosomas naturales con fin de emplearlos como tratamiento anti-tumoral ya que se había demostrado, en estudios anteriores del mismo grupo, que en los linfocitos T activados la forma fisiologica de secreción de Apo2L/TRAIL es anclado a la superficie de unas vesículas lipídicas llamadas exosomas. Dada la implicación de Apo2L/TRAIL en la regulación del sistema inmune, se emplearon los LUV-TRAIL in vivo en un modelo experimental de artritis reumatoide observándose una mayor efectividad de los mismos comparados con la forma soluble de Apo2L/TRAIL a la hora de reducir la inflamación articular (Martinez-Lostao, et al 2010). Posteriormente se estudió la capacidad anti-tumoral de los LUV-TRAIL analizando su efecto citotóxico en distintas líneas celulares tumorales humanas de estirpe hematológica, que o bien sobre-expresaban proteínas anti-apoptóticas o bien 5 se habían silenciado proteínas pro-apoptóticas lo que les confería resistencia no solo a la muerte inducida por Apo2L/TRAIL soluble sino también a la muerte celular inducida por los fármacos quimioterápicos convencionales (De Miguel, et al 2013). El análisis comparativo de la capacidad citotóxica de Apo2L/TRAIL soluble y los LUV-TRAIL demostró que éstos inducían la apoptosis en todas las células tumorales analizadas de una forma mucho más eficaz que Apo2L/TRAIL soluble disminuyendo significativamente la concentración inhibitoria media (IC50) sin mostrar citotoxicidad frente a su contrapartida normal, los linfocitos T mostrando por tanto una alta especificidad contra las células tumorales. Los liposomas han sido utilizados como un vehículo de transporte de diferentes compuestos dirigidos contra células diana. Sin embargo, la unión de proteínas capaces de inducir la apoptosis supone una nueva vía de actuación sobre las células tumorales, con prometedores resultados, que hasta entonces no había sido puesta en marcha, y suponía una nueva posibilidad para hacer frente a distintos de tipos de cáncer resistentes a la forma soluble de Apo2L/TRAIL, actualmente en distintos ensayos clínicos, al incrementar significativamente su bioactividad. A la vista de estos antecedentes, el objetivo principal de este trabajo de fin de grado ha sido continuar con el estudio de los LUV-TRAIL como tratamiento antitumoral estudiando su capacidad citotóxica en este caso, sobre diferentes líneas celulares tumorales humanas provenientes de tumores sólidos. Los objetivos concretos de este trabajo de fin de grado han sido: 1) Obtener y purificar Apo2L/TRAIL-His6 recombinante soluble empleando E. Coli BL21-CodonPlus(DE3)-RP transformadas con el plásmido pET28c-His6sApo2L/TRAIL. 2) Generar nanopartículas lipídicas artificiales de características similares en cuanto a tamaño y composición lipídica a la de los exosomas naturales con Apo2L/TRAIL-His6 anclado a su superficie (LUV-TRAIL). 3) Analizar la capacidad de inducir muerte celular in vitro tanto de la forma soluble como de los LUV-TRAIL comparando su actividad sobre líneas celulares de tumores sólidos provenientes de un cáncer de colon (HCT-116) y de un cáncer de riñón (Caki-1). 4) Estudiarlos mecanismos moleculares implicados en la muerte celular inducida por los LUV-TRAIL. 6 INTRODUCCIÓN: Apoptosis La Apoptosis es un tipo de muerte celular programada, es decir, en la que su activación y ejecución se dan de forma controlada y ordenada, siguiendo una secuencia determinada por elementos codificados genéticamente. Produce una muerte limpia de la célula en la cual los restos celulares son retirados por macrófagos sin que haya salida del material citoplasmático al exterior de la célula y sin que tenga lugar un proceso inflamatorio. Las células apoptóticas presenta una serie de características fenotípicas que permiten diferenciarlas en cultivo como la exposición de fosfatidilserina en la cara externa de la membrana celular, condensación anormal de la cromatina y fragmentación nuclear, aparición de burbujas en la membrana plasmática (blebs) y caída del potencial de membrana mitocondrial. Se trata de un proceso fundamental e indispensable para el desarrollo y mantenimiento adecuado de cualquier ser pluricelular, de modo que la falta de regulación de la apoptosis por exceso o por defecto puede contribuir a la producción de trastornos en el organismo tales como cáncer, malformaciones, trastornos metabólicos, neuropatías, lesiones miocárdicas y enfermedades autoinmunes. Las principales moléculas encargadas de transducir, amplificar y ejecutar la apoptosis son las caspasas. Éstas son una clase de cisteín-proteasas con especificidad de corte en ácido aspártico que se sintetizan en forma de zimógeno, como procaspasas inactivas, y se localizan por norma general en el citoplasma. Las caspasas se activan por proteólisis, llevada a cabo por otras caspasas o por ellas mismas, separándose las subunidades p20 y p10. Una vez activadas, las caspasas actúan como proteasas sobre sus sustratos. Las caspasas que intervienen en la apoptosis pueden clasificarse en:  Caspasas iniciadoras: caspasas 2, 8, 9 y 10  Dentro de las caspasas iniciadoras, las caspasas 8 y 10 presentan dominios DED (Dominios efectores de muerte), mientras que las caspasas 2 y 9 presentan dominios CARD (Dominio de reclutamiento de caspasas).  Caspasas ejecutoras: caspasas 3, 6 y 7  son activadas por las caspasas iniciadoras por proteólisis actuando ellas mismas como proteasas proteolizando multitud de proteínas vitales para mantener la integridad celular conduciendo a la célula a la apoptosis. 7 Vías de la apoptosis La apoptosis se puede llevar a cabo a través de dos vías principales: Vía intrínseca Esta ruta es la más conservada evolutivamente. También se le llama ruta mitocondrial, porque la mitocondria juega un papel muy importante. Cuando la célula se ve sometida a determinados agentes o estímulos estresantes tales como radiación UV, quimioterapia o daño en el DNA se ponen en marcha diferentes mecanismos de señalización celular activando dicha ruta apoptótica. En esta vía juegan un papel fundamental las proteínas de la familia Bcl-2. Dentro de las proteínas de la familia Bcl-2, que regulan procesos de permeabilización mitocondrial podemos encontrar tres subfamilias:  Proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1): permiten su asociación a las proteínas pro-apoptoticas, inhibiendo su acción.  Proteínas pro-apoptóticas multidominio (Bax, Bak): Bax se encuentra en el citosol como monómero, y Bak se encuentra asociado a la membrana interna mitocondrial. Al recibir un estímulo apoptótico, Bax y Bak se unen y forman canales en la membrana mitocondrial por los que sale al citosol el citocromo c del espacio intermembrana.  Proteínas pro-apoptóticas sólo BH3 (Bid, Bim, Noxa, Puma): No pueden iniciar apoptosis por si solas sino actúan asociándose a las proteínas de la subfamilia antiapoptótica, inhibiendo su acción anti-apoptótica o uniéndose directamente a Bax y Bak activando su actividad pro-apoptótica. La activación de la vía intrínseca provoca la caída de potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) y la salida de diversos elementos pro-apoptóticos desde la matriz mitocondrial al citosol, como son el citocromo c o Smac/DIABLO (inhibidor de IAPs). Una vez en el citosol, el citocromo c liberado se une a la molécula adaptadora Apaf-1 y a la procaspasa 9 promoviendo la formación de un complejo multimolecular denominado apoptosoma, en el que se activa la caspasa 9. Esta caspasa 9 activa procesa y activa a su vez a las caspasas ejecutoras (fundamentalmente caspasa 3 y 7) que finalmente llevan a la célula a la muerte por apoptosis. Vía extrínseca Esta vía de inducción de apoptosis se activa por medio de la unión de un ligando mortal a su receptor especifico en la superficie de la membrana celular. Los ligandos mortales son proteínas que pertenecen a la familia del Factor de Necrosis Tumoral (TNF). Algunos de ellos activan vías de señalización implicadas en respuestas 8 pro-inflamatorias y de diferenciación celular, como TNF-α y en ocasiones la apoptosis , y otros como , FasL y Apo2L/TRAIL que son fundamentalmente pro-apoptóticos. Estos ligandos poseen receptores mortales específicos que son proteínas de membrana de tipo I que poseen entre una y cinco repeticiones de secuencias ricas en cisteína (CRD) en su parte extracelular y un dominio mortal (DD) en su región intracelular. Los receptores para los distintos ligandos mortales sonCD95/Apo1/Fas en el caso de FasL, TNFR para TNFα. Y en el caso de Apo2L/TRAIL, sin embargo se caracteriza porque tener más de un receptor: DR4 y DR5 que son los receptores proapoptóticos, DcR1 y DcR2 que actúan como receptores señuelo incapaces de transducir la señal pro-apoptótica y un receptor soluble llamado osteoprotegerina. La transducción de la señal apoptótica comienza cuando un homotrímero de ligando mortal se une a su correspondiente receptor mortal a través de las CRD provocando que los receptores mortales también trimericen a nivel extracelular, lo que a su vez provoca que las regiones intracelulares adopten una conformación determinada que hace que se recluten unas proteínas adaptadoras a los dominios mortales, TRADD (para TNF-α) y FADD para FasL y Apo2L/TRAIL que poseen tanto dominios mortales (DD) que les permiten por una parte unirse a los DD de los receptores, como dominios efectores de muerte (DED) que les permiten unirse a los DED de las procaspasas iniciadoras 8 y 10. Se forma de este modo un complejo multimolecular intracelular que se denomina DISC (Death Inducing Signalling Complex) donde las procaspasas iniciadoras (fundamentalmente la procaspasa 8) se activan. La caspasa 8 activa procesa y activa directamente a las procaspasas ejecutoras (3, -6 y -7) llevando a la célula a la muerte por apoptosis. En algunos tipos celulares existe un nexo de unión entra la vía extrínseca e intrínseca de la apoptosis. En estos casos, la caspasa 8 activa puede procesar a la proteína pro-apoptótica sólo BH3 de la familia de las Bcl-2, Bid dando lugar a un fragmento corto activo llamado tBid que capaz de inducir la oligomerización de Bax/Bak activando así la vía intrínseca de la apoptosis y amplificando la señal apoptótica. Apo2L/TRAIL Características y receptores Apo2 Ligando, Apo2L, también denominado TRAIL, TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand, es un ligando mortal, miembro de la superfamília del TNF, capaz de iniciar el proceso apoptótico por la vía extrínseca de manera independiente de Fas . El gen de 20 kb que codifica a Apo2L/TRAIL está localizado en el cromosoma 3, y está compuesto de cinco exones y cuatro intrones. Como miembro de la superfamilia del TNF, se expresa como proteína transmembrana de tipo II, de 281 aminoácidos de 15 ello, TRAIL soluble o los LUV-TRAIL se preicubaron con 500 ng/ml de RIK durante 1 hora a 37 ºC. En el caso de las inhibidores de caspasas, las células se preicubaron con 30 µM de ZVAD o IETD durante 1 hora a 37 ºC. En ambos casos, el resto del ensayo de citotoxicidad se realizó como se ha descrito. Expresión de los receptores de Apo2L/TRAIL La expresión de los receptores de Apo2L/TRAIL, DR4, DR5, DcR1 y DcR2 se analizó mediante citometría de flujo empleando anticuerpos específicos para cada uno de los receptores conjugados con ficoeritrina (BD Bioscience). Para ello se recolectaron 5x104 células por punto experimental a las que se les añadió 1 ml de PBS con 5% de SFB. Tras centrifugar las células, se resuspendieron en 100 µL del anticuerpo correspondiente diluido en PBS con 5% de SFB. Las células se incubaron durante 30 minutos en oscuridad a Tª ambiente. Posteriormente, se centrifugaron las células, se lavaron con 500 µL de PBS en 5% de SFB dos veces y finalmente las muestras se analizaron mediante citometría de flujo. Como control negativo las células se marcaron con un control de isotipo conjugado con ficoeritrina (BD Bioscience). Microscopia de fluorescencia Para analizar las características morfológicas nucleares típicas de la apoptosis (formación de blebs, condensación cromatínica, desintegración nuclear) se realizó tinción de las células con el colorante nuclear Hoechst 33342 (colorante fluorescente permeable que se excita con una longitud de onda de 350 nm y emite a 460 nm y que es capaz de unirse al surco menor de la doble hebra de DNA, con preferencia por las secuencias ricas en adenina y timina). Para ello, se sembraron 4x104 células/pocillo en una placa de 24 pocillos sobre las cuales se había depositado un cubreobjetos esterilizado con etanol, durante 24 horas y posteriormente se añadió TRAIL soluble o LUV-TRAIL durante 6 horas. Posteriormente, se tomó una muestra de cada pocillo para analizarla muerte celular mediante citometría de flujo y con el resto se llevó a cabo la tinción. Se fijaron las células con formaldehído al 4% durante 15minutos a 4ªC. Tras lavar las células con PBS, se retiró en sobrenadante y se tiñeron las células añadiendo el colorante Hoechst 33342 Las muestras se guardaron en la nevera a 4ºC durante toda la noche y se observaron al microscopio de fluorescencia al día siguiente. Análisis de proteínas mediante Western-blot Para analizar la activación de la caspasa 8 y la caspasa 3 mediante Western blot, se sembraron 1x106células en una placa de 6 pocillos y se les añadió 300 ng/ml de TRAIL soluble o LUV-TRAIL. Tras 12 horas, se recolectaron las células, se lavaron con 16 PBS y se les añadió 30 μl de tampón de lisis (Tritón X-100 al 1% (v/v), Tris-HCl 50mM pH 7,6, EDTA 1mM, ortovanadato sodico 1mM, pirofosfato sódico 10mM, fluoruro de fenilmetilsulfonio 1mM, fluoruro de sodio 10mM, leupeptina 1mM, cloruro de sodio 150mM y glicerol al 10% (v/v)). Las células se incubaron durante 30 minutos a 4 ºC, se centrifugaron 5 minutos a 14000 rpm a 4ºC y se recolectó el sobrenadante al que se le añadió 30 μl de un tampón de carga 3x (Tris-HCl 150mM pH 7,4, SDS al 3%, molibdato de sodio 0,3mM, pirofosfato sódico 30 mM, fluoruro de sodio 30mM, glicerol al 30% (v/v), β-mercaptoetanol al 30% (v/v) y azul de bromofenol al 0,06% (p/v)). Por último, los lisados celulares se calentaron a 100 ºC en un bloque seco durante 5 minutos , se centrifugaron 15 segundos a 1500 rpm . Las proteínas del lisado celular obtenido se separaron en función de su peso molecular en gel de poliacrilamida al 12% con SDS desnaturalizante. La composición del gel de concentración fue: acrilamida/bis al 5%, Tris-HCl 125mM pH 6,8, SDS al 0,1%, persulfato amónico al 0,1%, TEMED al 0,01%. La composición del gel de resolución fue: acrilamida/bis 10% o 15% Tris-HCl 370mM pH 8,8, SDS al 0,1%, persulfato amónico 0,1%, TEMED al 0,01%. La composición del tampón de carrera fue: Tris base 25mM, glicina 192 mM y SDS al 0,1%. Las condiciones de la carrera electroforética fueron: 180 V y 20 mA durante 90 minutos. Las proteínas separadas en el gel se transfirieron a una membrana de polivinilo difluorido (PVDF, Hybond C-extra, Amersham) utilizando un tampón de transferencia compuesto por: Tris-HCl 48mM pH 8,3, glicina 3mM, SDS al 0,037% y metanol al 20%. La transferencia se llevó a cabo en un equipo de transferencia semi-seca (Hoefer) a 20 V y 400 mA, durante 55 minutos. Las proteínas fijadas en las membranas de PVDF se analizaron mediante el uso de anticuerpos específicos (primario y secundario) y el sustrato correspondiente. En primer lugar, la membrana de PVDF se bloqueó con leche desnatada en polvo al 5% (p/v), disuelta en PBS y se lavo 3 veces durante 5 minutos con Tampón B (NaCl 0,12M, tris/HCl 10mM pH 8,0, Tween 20 al 0,1% (p/v) en PBS pH 7,4). Posteriormente, la membrana se incubo con el anticuerpo primario específico (diluido en tampón B con leche desnatada en polvo al 2%) para detectar la proteína deseada durante 12 horas, los anticuerpos utilizados fueron:  Caspasa 8 (0,1 µg/ml)  Ratón (BD Pharmingen)  Pro-caspasa 3 (0,1 µg/ml) Conejo (Cell Signaling)  Caspasa 3 (0,1 µg/ml)  Conejo (Cell Signaling)  Actina (0,1 µg/ml)  Ratón (BD Pharmingen) Tras la incubación, la membrana se lavó con tampón B 3 veces durante 5 minutos en agitación y luego se incubo con el anticuerpo secundario marcado con peroxidasa o fosfatasa alcalina correspondiente (Sigma) diluido en tampón B con leche desnatada en polvo al 2% durante 1 hora. Una vez, finalizada la incubación, se retiró el 17 anticuerpo secundario, se lavó la membrana con tampón B 3 veces durante 10 minutos en agitación y finalmente se añadió el sustrato correspondiente. La detección de los inmunocomplejos se realizó mediante una solución de revelado, preparada en el momento de su utilización, que contenía: 22,5 ml de tampón Tris-HCl 0,2M, MgCl2 1mM, pH 9,6, 2,5 ml de una disolución 1 mg/ml de NBT (cloruro de tetrazolio nitro-azul) en dimetilformamida y 375 μl de una disolución 4 mg/ml de BCIP (sal p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-3’-indolilfosfato) en dimetilformamida (todos ellos de Sigma). La reacción de revelado se detuvo lavando la membrana con abundante agua destilada. Finalmente se llevó a cabo un control de carga mediante el revelado de actina del mismo modo que se ha indicado antes. Análisis estadístico Para todos los estudios de comparación entre variables cuantitativas ha sido aplicado el test de la t de Student. Los datos que se muestran corresponden a la media ± desviación estándar típico (SD). En todos los casos, se ha considerado como significativamente estadístico un valor de p <0,05. Los datos estadísticos han sido analizados usando el software Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft). 18 RESULTADOS: Estudio de citotoxicidad de TRAIL soluble y LUV-TRAIL en las células HCT116 Expresión de receptores de Apo2L/TRAIL en células HCT-116 En primer lugar se analizó mediante citometría de flujo la expresión de los receptores pro-apoptóticos DR4, DR5 así como los receptores señuelo DcR1 y DcR2 (ANEXO FIGURAS: Figura 1). Se puede observar que las células HCT-116 provenientes de un carcinoma de colon expresan DR4 y DR5 siendo la expresión de este último superior. Las células HCT-116 no expresaron ninguno de los dos receptores señuelo, DcR1 y DcR2. Citotoxicidad inducida por los LUV-TRAIL en células HCT-116 Tras determinar la expresión de los receptores de Apo2L/TRAIL se llevaron a cabo el estudio de citotoxicidad sobre las células HCT-116 realizando ensayos dosisrespuesta en paralelo con TRAIL soluble y LUV-TRAIL (ANEXO FIGURAS: Figura 2). En el análisis de la viabilidad celular mediante el ensayo de reducción del MTT (Figura 2A), se observó que ya desde la dosis más baja se produce un descenso mayor de la misma cuando las células fueron tratadas con los LUV-TRAIL siendo estadisticamente significativa a las dosis de 37,04 a 1000 ng/ml cuando se compara con el descenso de la viabilidad inducido por TRAIL soluble. Los resultados obtenidos mediante el marcaje con yoduro de propidio (Figura 2B), indican que este mayor descenso de la viabilidad observado con el tratamiento con los LUV-TRAIL es debido a una inducción de la muerte celular siendo estadisticamente significativa a todas las dosis empleadas comparándola con la muerte celular inducida por TRAIL soluble La IC50 con los datos del marcaje con yoduro de propidio fue de 666 ng/mL para TRAIL soluble y de 8 ng/mL para LUV-TRAIL, esto es, Apo2L/TRAIL unido a nanopartículas lipídicas presenta una bioactividad 83,25 veces mayor. Es importante destacar que los LUV solos (sin Apo2L/TRAIL aclopado en su superficie) no inducen muerte celular. Además, se realizaron ensayos de citotoxicidad pre-incubando tanto TRAIL soluble como los LUV-TRAIL con el anticuerpo bloqueante de TRAIL, RIK (ANEXO FIGURAS: Figura 3). Como se puede observar la muerte celular tras el tratamiento con 500 ng/ml tanto de TRAIL soluble como de los LUV-TRAIL cuando se ha pre-incubado con RIK disminuyen hasta los niveles basales. 19 Análisis de la morfología nuclear tras el tratamiento con LUV-TRAIL en células HCT-116 Para analizar la morfología nuclear tras el tratamiento con los LUV-TRAIL en las células HCT-116 se realizó la tinción con Hoechst 33342 y su análisis mediante microscopía de fluorescencia (ANEXO FIGURAS: Figura 4). Se puede observar que las células vivas presentes en el control mantienen la forma redondeada del núcleo, en cambio a medida que se aumenta la concentración de la Apo2L/TRAIL (tanto soluble como asociado a liposomas), aumenta el porcentaje de células con las características típicas de un muerte por apoptosis como la formación de blebs, condensación de la cromatina y fragmentación del núcleo. Los porcentajes de muerte analizados mediante marcaje con yoduro de propidio mostraron unos niveles superiores tanto a 100 ng/ml como a 1000 ng/ml con LUV-TRAIL siendo del 41 % y 84,3 % respectivamente frente a TRAIL soluble en donde el porcentaje de muerte alcanzó un 14,2 % y 41,3% respectivamente. Cuando se realiza la pre-incubación con RIK tanto los cambios morfológicos como la muerte celular disminuyó a niveles basales. Activación de las caspasas tras el tratamiento con LUV-TRAIL en células HCT-116 Tras comprobar la mayor capacidad citotóxica de los LUV-TRAIL en las células HCT-116, se analizó el mecanismo de acción de los mismos. Para ello se analizó en primer lugar la activación de las principales caspasas implicadas en la muerte celular inducida por Apo2L/TRAIL, la caspasa iniciadora 8 y la caspasa ejecutora 3 tras el tratamiento con los LUV-TRAIL (ANEXO FIGURAS: Figura 5A). Se puede observar que en ninguno de los dos controles se produce activación de la caspasa 8 aunque sí que aparece una cierta activación de la caspasa 3 posiblemente debida a la muerte basal del cultivo celular. Cuando las células fueron tratadas con Apo2L/TRAIL (tanto soluble como asociado a liposomas) se observa una clara activación tanto de la caspasa 8 como de la caspasa 3 siendo claramente superior en el caso de los LUV-TRAIL. Esta mayor activación de las caspasas por parte de los LUV-TRAIL se correlaciona con el mayor porcentaje de células positivas para el marcaje de yoduro de propidio (Figura 5B). Para corroborar que la muerte celular observada tras el tratamiento con los LUV-TRAIL en las células HCT-116 era debida a la activación de las caspasas, se llevaron a cabo ensayos de inhibición de la citotoxicidad pre-incubando las células con los inhibidores IETD (inhibidor específico de la caspas 8) y ZVAD (inhibidor general de caspasas) (ANEXO FIGURAS: Figura 6). Se puede observar que el pre-tratamiento con ambos inhibidores de caspasas revierte la muerte celular inducida por ambas formas de Apo2L/TRAIL (soluble y asociado a liposomas). 20 Estudio de citotoxicidad de TRAIL soluble y LUV-TRAIL en las células Caki1 Expresión de receptores de Apo2L/TRAIL en células Caki-1 De igual manera, se analizó mediante citometría de flujo la expresión de los receptores pro-apoptóticos DR4, DR5 así como los receptores señuelo DcR1 y DcR2 en la línea celular Caki-1 proveniente de un carcinoma de riñón (ANEXO FIGURAS: Figura 7). Como se puede observar, las células Caki-1 expresan bajos niveles de DR4 y altos niveles de DR5 y no expresaron ninguno de los dos receptores señuelo, DcR1 y DcR2 indicando que esta línea celular también puede ser sensible a la acción de Apo2L/TRAIL. Citotoxicidad inducida por los LUV-TRAIL en células Caki-1 Una vez analizada la expresión de los receptores de Apo2L/TRAIL se llevaron a cabo el estudio de citotoxicidad sobre las células Caki-1 llevando a cabo ensayos dosisrespuesta en paralelo con TRAIL soluble y LUV-TRAIL (ANEXO FIGURAS: Figura 8). Cuando se analizó la viabilidad celular mediante el ensayo de reducción del MTT (Figura 8A), se observó que ambas formas de Apo2L/TRAIL producen un descenso similar de la misma alcanzando unos valores de disminución de la viabilidad celular del 71% con TRAIL soluble y del 78% con los LUV-TRAIL con la dosis de 1000 ng/ml. Cuando se analiza la muerte celular mediante el marcaje con yoduro de propidio (Figura 8B), se observa que a la mayor concentración empleada (1000 ng/ml), TRAIL soluble indujo muerte en un 57% de las células mientras que al tratar las células con LUV-TRAIL la muerte aumenta a un 68%. Cuando se calcula la IC50, se observa que es de 330 ng/ml para TRAIL soluble, mientras que se reduce hasta 220 ng/mL en el caso LUV-TRAIL siendo la bioactividad de éstos 1,5 veces mayor. De nuevo los LUV solos no indujeron muerte celular. Nuevamente se realizaron ensayos de citotoxicidad inhibiendo la acción de Apo2L/TRAIL pre-incubando con el anticuerpo bloqueante de TRAIL, RIK (ANEXO FIGURAS: Figura 9). De nuevo en las células Caki-1 se observa que la muerte celular tras el tratamiento con 500 ng/ml deApo2L/TRAIL (soluble o asociado a liposomas) disminuye hasta niveles basales. Análisis de la morfología nuclear tras el tratamiento con LUV-TRAIL en células Caki-1 También se analizó os cambios de la morfología nuclear tras el tratamiento con los LUV-TRAIL en las células Caki-1 (ANEXO FIGURAS: Figura 10), observando de nuevo que a mayor concentración de Apo2L/TRAIL (tanto soluble como asociado a liposomas), aumenta el porcentaje de células con las características típicas de un 21 muerte por apoptosis (formación de blebs, condensación cromatínica y fragmentación nuclear). Los porcentajes de muerte analizados mediante marcaje con yoduro de propidio mostraron unos niveles similares para ambas formas de Apo2L/TRAIL tanto a 100 ng/ml como a 1000 ng/ml: 44,4 % y 63,4 % respectivamente con TRAIL soluble y de 48,9 % y 61,7 % con los LUV-TRAIL. De nuevo tanto los cambios morfológicos como la muerte celular disminuyó a niveles basales cuando se realiza la pre-incubación con RIK. Activación de las caspasas tras el tratamiento con LUV-TRAIL en células Caki-1 También se analizó la activación de las principales caspasas implicadas en la muerte celular inducida por Apo2L/TRAIL (caspasa 8 y caspasa 3) tras el tratamiento con los LUV-TRAIL en las células Caki-1 (ANEXO FIGURAS: Figura 11A). Nuevamente no se observó activación de la caspasa 8 en ambos controles y una cierta activación de la caspasa 3 debida probablemente a la muerte basal del cultivo celular. En el caso de las células Caki-1 cuando fueron tratadas tanto con TRAIL soluble como con los LUV-TRAIL se observa una clara activación de la caspasa 8 siendo ligeramente superior en el caso de los LUV-.TRAIL y una activación similar de la caspasa 3 tras el tratamiento con ambos. Esta activación similar de las caspasas con ambas formas de Apo2L/TRAIL se correlaciona con el porcentaje similar de células positivas para el marcaje de yoduro de propidio (Figura 11B). Finalmente, también se realizaron ensayos de inhibición de la citotoxicidad preincubando las células con los inhibidores de caspasas IETD y ZVAD en las células Caki-1 (ANEXO FIGURAS: Figura 12) observándose de nuevo que el pre-tratamiento con ambos inhibidores de caspasas revierte la muerte celular inducida por ambas formas de Apo2L/TRAIL (soluble y asociado a liposomas) en esta línea celular. 22 DISCUSIÓN: En el presente trabajo se ha analizado la capacidad citotóxica de una nuevo formulación de Apo2L/TRAIL basada en su anclaje a la superficie de nanopartículas lipídicas de tipo LUV sobre líneas celulares tumorales humanas provenientes de tumores sólidos (carcinoma de colon y carcinoma de riñón). Ambas líneas celulares expresaron los receptores pro-apoptóticos de Apo2L/TRAIL, DR4 y sobre todo DR5 por lo que fueron susceptibles de ser sensibles a la acción citotóxica de Apo2L/TRAIL. Efectivamente tanto la línea celular HCT-116 como la línea celular Caki-1 fueron sensibles tanto a la forma soluble de Apo2L/TRAIL como la asociada a liposomas observándose una mayor sensibilidad en el caso de las células HCT-116. Cuando se compara la capacidad citotóxica de TRAIL soluble y los LUV-TRAIL, se observa que mientras que las células HCT-116 los LUV-TRAIL fueron claramente más eficaces a la hora de inducir la muerte celular reduciendo la IC50 en unas 83 veces, en las células Caki-1 este aumento de bioactividad de los LUV-TRAIL fue menor reduciendo la IC50 sólo en 1,5 veces. La menor sensibilidad de las células Caki-1 tanto a TRAIL soluble como a los LUV-TRAIL a pesar de expresar ambos receptores proapoptóticos de Apo2L/TRAIL hace pensar que mecanismos moleculares intracelulares propios de esta línea celular les confieren cierta resistencia a Apo2L/TRAIL comparado con la línea celular HCT-116. En ambas líneas celulares la muerte celular observada tras el tratamiento con los LUV-TRAIL fue debida específicamente a la presencia de Apo2L/TRAIL ya que cuando los experimentos de citotoxicidad fueron realizados en presencia del anticuerpo bloqueante de Apo2/TRAIL RIK la capacidad citotóxica de los LUV-TRAIL fue completamente inhibida en ambas líneas celulares. En este sentido, los LUV solos (sin Apo2L/TRAIL acoplado a su superficie), no fueron capaces de inducir la muerte celular. Para estudiar el mecanismo por el que los LUV-TRAIL inducen la muerte celular, se analizó en primer lugar las características morfológicas de núcleo tras el tratamiento con los liposomas con Apo2L/TRAIL anclado a su superficie. Tanto en las células HCT116 como en las células Caki-1 se observó que tras el tratamiento con los LUV-TRAIL aparecían las características típicas de una muerte por apoptosis como son la formación de blebs, condensación de la cromatina y fragmentación nuclear. Además, los cambios morfológicos observados tras el tratamiento con los LUV-TRAIL fueron específicamente debidos a la presencia de Apo2L/TRAIL ya que los liposomas solos no produjeron ningún de ellos y de nuevo la pre-incubación con RIK inhibió la presencia de dichos cambios. Los datos obtenidos en el estudio de la morfología nuclear mediante microscopía de fluorescencia claramente sugerían que los LUV-TRAIL inducen la muerte celular por apoptosis en ambas líneas celulares. Para comprobar que la muerte 23 celular observada tras el tratamiento con los LUV-TRAIL era un proceso apoptótico, seguidamente se analizó la activación de las principales caspasas implicadas en la apoptosis inducida por Apo2L/TRAIL, la caspasa iniciadora 8 y la caspasa ejecutora 3. Efectivamente en ambas líneas celulares se observo mediante Western blot que al igual que lo descrito para TRAIL soluble, los LUV-TRAIL son capaces de inducir el procesamiento y la consiguiente activación tanto de la caspas 8 como de la caspasa 3 en ambas líneas celulares siendo esta activación mucho mayor en las células HCT-116 cuando se compara con la activación inducida por TRAIL soluble, lo que se correlaciona con el mayor efecto citotóxico observado en los ensayos dosis-respuesta realizados en esta línea celular. Finalmente, para corroborar que la muerte celular observada tras el tratamiento con los LUV-TRAIL en ambas líneas celulares se debe efectivamente a la activación de las caspasas, en algunos de los experimentos de citotoxicidad realizados se emplearon los inhibidores de caspasas IETD, un inhibidor específico de caspasa 8, y ZVAD, inhibidor general de caspasas. Tanto en las células HCT-116 como en las células Caki-1 la pre-incubación de las células con estos inhibidores redujo los niveles de muerte celular a valores basales. Estos datos indican que la muerte celular inducida por los LUV-TRAIL en las líneas celulares HCT-116 y Caki-1 al igual que la inducida por TRAIL soluble, es una muerte celular por apoptosis dependiente de la activación de caspasas a través de la vía extrínseca de la apoptosis. En trabajos anteriores del Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza, se había demostrado la mayor capacidad citotóxica de esta nueva formulación de Apo2L/TRAIL basas en el anclaje de este ligando mortal a la superficie de nanopartículas lipídicas en líneas celulares tumorales humanas de estirpe hematológica (De Miguel, et al 2013). En el presente trabajo de grado se ha observado que los LUV-TRAIL también presentan una mayor bioactividad que la forma soluble de la proteína en líneas celulares tumorales humanas provenientes de tumores sólidos como el carcinoma de colon y el carcinoma de riñón. 24 CONCLUSIONES: Las conclusiones obtenidas el presente trabajo fin de grado son las siguientes: 1. Se han generado liposomas tipo LUV con el ligando mortal Apo2L/TRAIL anclado a su superficie (LUV-TRAIL) manteniendo su bioactividad. 2. Los LUV-TRAIL generados presentan una mayor capacidad citotóxica en las dos líneas celulares tumorales humanas empleadas, HCT-116 (proveniente de carcinoma de colon) y Caki-1 (proveniente de un carcinoma de riñón). 3. La línea celular HCT-116 es más sensible tanto a TRAIL soluble como a los LUVTRAIL que la línea celular Caki-1. 4. La muerte celular inducida por los LUV-TRAIL en ambas líneas celulares se debe específicamente a la presencia de Apo2L/TRAIL. 5. La muerte celular inducida por los LUV-TRAIL en ambas líneas celulares es una muerte por apoptosis dependiente de la activación de caspasas a través de la vía extrínseca.