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Trabajo Fin de Máster EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS TECNOLÓGICOS EN LA DESNATURALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA ALERGÉNICA Ara h1 DE CACAHUETE Autor: SARA PUY TORRES Directora: Mª DOLORES PÉREZ CABREJAS Facultad de Veterinaria CURSO 2013-2014 Agradecimientos Primero de todo, quiero agradecer a mi directora Dolores Pérez Cabrejas, por permitirme participar en este proyecto. Por transmitirme sus conocimientos e inquietudes en la investigación, por su apoyo, tiempo y dedicación durante todos estos meses, que han hecho posible la realización de este trabajo fin de máster. Agradezco también a los profesores Miguel Calvo y sobre todo a Lourdes Sánchez por su colaboración y su ayuda durante la elaboración de este trabajo. Por otro lado, darle las gracias a Mercedes Montserrat por su paciencia, colaboración sin límites y tiempo dedicado a este trabajo así como por sus consejos y su amistad. También a todos los compañeros del departamento, que de una forma u otra me han ayudado y me han hecho más agradable el trabajo de laboratorio, especialmente a Veguita, José Antonio, Dani y Saydou. A Sergio Ramos y Blanca Jauregui del Centro Nacional de Tecnología y Seguridad Alimentaría por su colaboración en los tratamientos de las muestras por altas presiones. Índice 1. Resumen/Abstract ........................................................................................................... 1 2. Introducción .................................................................................................................... 5 2.1. Alergia alimentaria .................................................................................................. 5 2.2. Alérgenos alimentarios: legislación y etiquetado .................................................... 7 2.3. Alergias al cacahuete ............................................................................................. 10 2.4. Efectos de los tratamientos tecnológicos en las proteínas alergénicas del cacahuete ........................................................................................................................... 13 3. Objetivos ........................................................................................................................ 17 4. Materiales y Métodos .................................................................................................... 18 4.1. Materiales .............................................................................................................. 18 4.2. Métodos .................................................................................................................. 18 4.2.1. Aislamiento de la proteína Ara h1 ................................................................. 18 4.2.2. Determinación de la concentración de proteína ............................................ 20 4.2.3. Electroforesis en gel de poliacrilamida .......................................................... 21 4.2.4. Técnicas inmunoquímicas .............................................................................. 22 4.2.5. Tratamiento de altas presiones ...................................................................... 26 5. Resultados y discusión ................................................................................................... 27 5.1. Aislamiento de la proteína Ara h1......................................................................... 27 5.2. Obtención y caracterización de antisueros anti-Ara h1........................................ 30 5.3. Aislamiento y conjugación de anticuerpos con peroxidasa .................................. 32 5.4. Desarrollo de técnicas de ELISA para la determinación de la proteína Ara h1 .. 33 5.5. Efecto del tratamiento con altas presiones en la proteína Ara h1 ........................ 34 5.5.1. Determinación de la proteína inmunorreactiva ............................................ 34 5.5.2. Determinación del perfil electroforético ........................................................ 36 5.5.3. Efecto de los reactivos NEM y KIO3 en la desnaturalización de la proteína Ara h1 ....................................................................................................................... 38 6. Conclusiones .................................................................................................................. 41 7. Bibliografía .................................................................................................................... 43 Resumen/Abstract 1 1. Resumen/Abstract Resumen El cacahuete (Arachis hipogaea) es uno de los principales alimentos que causa alergia alimentaria, ya que representa un 13,1% y un 16,2% del total de alergias alimentarias en niños y en adultos respectivamente. La alergia al cacahuete se caracteriza porque persiste de por vida, a pequeñas dosis desencadena manifestaciones clínicas y con relativa frecuencia da lugar a un shock anafiláctico. Se han descrito hasta 13 proteínas con capacidad alergénica en el cacahuete, siendo las proteínas Ara h1 y Ara h2 las que presentan una mayor tasa de sensibilización entre la población alérgica a ese alimento. Los alimentos son sometidos a tratamientos tecnológicos para su higienización, así como para alargar su conservación y mejorar sus propiedades sensoriales. Por ello, el efecto que dichos tratamientos tienen en la estructura de las proteínas alergénicas de cacahuete es de gran relevancia ya que pueden inducir su desnaturalización, y afectar en consecuencia su capacidad alergénica y su detección. Se han llevado a cabo numerosos estudios para conocer el efecto de los tratamientos térmicos en las proteínas alergénicas del cacahuete. Sin embargo, existe muy poca información del efecto que tienen en ellas las nuevas tecnologías de conservación. El objetivo principal de este trabajo ha sido estudiar el efecto que tienen los tratamientos con altas presiones en la proteína Ara h1 de cacahuete. Para ello, la proteína se ha asilado a partir de cacahuete crudo mediante técnicas de precipitación salina y técnicas cromatográficas, se han obtenido antisueros frente a ella mediante inoculación en conejos y los anticuerpos específicos se han purificado por inmunoadsorción y se han conjugado con el enzima peroxidasa. Utilizando estos reactivos, se han desarrollado diferentes formatos de la técnica de ELISA para la determinación de la proteína Ara h1 resultando el formato de tipo competitivo directo el más adecuado para su cuantificación. El efecto de las altas presiones en la proteína Ara h1 se ha determinado midiendo la pérdida de inmunorreactividad tras someterla a diferentes presiones y tiempos. Las muestras tratadas con altas presiones se han analizado también utilizando técnicas electroforéticas en condiciones nativas y desnaturalizantes. Además, se ha determinado el efecto que tiene la adición de reactivos que modifican los grupos sulfidrilo en la desnaturalización de la proteína Ara h1. Resumen/Abstract 2 La desnaturalización de la proteína Ara h1 por efecto de las altas presiones ha sido muy baja a 200 y 300 MPa. A presiones superiores a 400 MPa, se produce una marcada desnaturalización que tiene lugar en los primeros minutos del tratamiento, obteniéndose una disminución del 47%, 53% y del 70% a los 20 minutos de tratamiento a 400, 500 y 600 MPa, respectivamente. El grado de desnaturalización ha sido similar al tratar la proteína purificada en tampón y en un extracto de cacahuete. Mediante técnicas eletroforéticas, se ha observado que la desnaturalización de la proteína Ara h1 por efecto de la presión da lugar a la formación de agregados mediante enlaces covalentes y no covalentes. La adición del reactivo N-etilmaleimida antes del tratamiento con altas presiones muestra un efecto protector en la desnaturalización de la proteína Ara h1, que parece deberse al bloqueo del grupo sulfidrilo libre de la proteína. Por el contrario, la adición de iodato potásico aumenta su desnaturalización debido probablemente a la oxidación de ese grupo sulfidrilo. La presencia de ambos reactivos previene la agregación de la proteína Ara h1 mediante enlaces covalentes, pero no la que se establece mediante interacciones no covalentes. Resumen/Abstract 3 Abstract Peanut (Arachis hypogaea) is one of the main foods that causes food allergies, as it represents 13,1 % and 16,2 % of total of total food allergies in children and adults respectively. Peanut allergy is characterized by persisting throughout life, in small doses it triggers clinical manifestations and quite often causes an anaphylactic shock. Thirteen allergenic proteins have been identified in peanuts; being Ara h1 and Ara h2 recognized by more than 90% of peanut allergic individuals. Foods are subjected to technological treatments to make them safe, to extend shelflife and to improve organoleptic properties. Therefore, the effect that such treatments have on the structure of peanut allergenic proteins is of great importance since it can induce denaturation and consequently affect allergenic capacity and detection. Many studies have been carried out in order to know the effect of the thermal treatments in peanut allergenic proteins. However, there is very little information about the effect of new processing technologies on them. The main objective of this study was to study the effect of high pressures treatments on denaturation of protein Ara h1. To perform this work, Ara h1 was isolated from raw peanut by salting-out and chromatographic techniques, antisera were obtained in rabbits, and specific antibodies purified by immunoadsorption and conjugated with peroxidase. Different formats of ELISA technique were developed using these reagents in order to determine Ara h1 protein, being the direct competitive the most suitable format. The effect of high pressure on Ara h1 protein was determined by measuring the loss of immunoreactivity at different pressures and times. Samples treated by high pressures were analyzed using electrophoresis under native and denaturing conditions. Moreover, the effect of the addition of reagents which modify sulfhydryl groups in the Ara h1 denaturation was also determined. Resumen/Abstract 4 Denaturation of Ara h1 protein was very low at 200 and 300 MPa. At pressures above 400 MPa, a severe denaturation took place within the first few minutes of treatment, obtaining a decrease of 47 %, 53 % and 70 % after 20 minutes at 400, 500 and 600 MPa, respectively. The denaturation degree was similar for the purified protein in buffer and in peanut extract. Using electrophoretic techniques, it was observed that pressure-induced denaturation of Ara h1, leads to aggregation by covalent and non-covalent bonds. The addition of N-ethylmaleimide before treatment with high pressures showed a protective effect in Ara h1 denaturation, which seems to be due to the blocking of the free sulfhydryl group of the protein. By contrast, the addition of potassium iodate increased its denaturation probably due to the oxidation of that sulfhydryl group. The presence of both reagents prevented aggregation of Ara h1 protein by covalent bonds, but not by noncovalent interactions. Introducción 5 2. Introducción 2.1.Alergia alimentaria La alergia alimentaria es un término genérico que incluye aquellas reacciones adversas a alimentos debidas a su ingestión, contacto o inhalación, que tienen una patogenia inmunológica comprobada. Estas reacciones dependen de la susceptibilidad de cada individuo y no dependen de la dosis ingerida. Las reacciones alérgicas a alimentos han de distinguirse de las reacciones tóxicas por alimentos y de las intolerancias alimentarias. Las reacciones de intolerancia están relacionadas con defectos de enzimas implicadas en el metabolismo del alimento y las reacciones tóxicas con la presencia de agentes químicos o biológicos presentes en el alimento. Ambas son dependientes de la dosis ingerida y no implican una respuesta inmune del individuo (AESAN, 2007; Sampson, 2004). El desarrollo de una alergia alimentaria depende fundamentalmente de la susceptibilidad del individuo; sin embargo, existen diversos factores que pueden predisponer la aparición de una alergia a los alimentos, como por ejemplo los hábitos alimentarios, la edad de introducción de alimentos en la dieta infantil, la capacidad alergénica propia del alimento, etc (Cianferoni y Spergel, 2009). La alergia alimentaria incluye tanto las reacciones de patogenia inmunológica que están mediadas por IgE (hipersensibilidad o alergia de tipo inmediato) como las que están producidas por otro mecanismo inmunitario conocido (no mediadas por IgE). La presencia de niveles altos de anticuerpos específicos de la clase IgE es característica de las primeras, mientras que en las segundas, tiene lugar un aumento de otras clases de inmunoglobulinas, complejos inmunes o una respuesta inmune mediada por células (AESAN, 2007). En los últimos años se ha observado un aumento de la prevalencia de las alergias alimentarias (Schierer et al., 2003) estimándose que entre un 4 y un 6% de los adultos y entre un 5 y 8% de los niños presentan estas reacciones adversas a alimentos (Zugasti, 2009). Introducción 12 Tabla 1. Alérgenos del cacahuete (Sáiz et al., 2013; IUIS). N.D: no disponible. La proteína Ara h2 es una glicoproteína que tiene un peso molecular de 17 kDa y pI de 5,2 (Burks et al., 1992). Pertenece a la familia de las conglutinas que también son proteínas de almacenamiento de la semilla, cuya estructura está relacionada con la superfamilia de las albúminas 2S. Contiene 8 cisteinas, las cuales están unidas por puentes disulfuro confiriéndole una elevada estabilidad frente a la actividad de enzimas (Flinterman et al., 2007; Maleki et al., 2003). La frecuencia de sensibilización de la proteína Ara h2 es del 91% (Sáiz et al., 2013) y se han caracterizado hasta 10 epítopos lineales, siendo 3 de ellos los inmunodominantes (Wen et al., 2005). Alérgeno Peso molecular (kDa) pI Función Familia Sensibilización (%) Ara h1 63.5 4,55 Proteína de almacenamiento de semilla Vicilinas >90 Ara h2 17 5,2 Proteína de almacenamiento de semilla Conglutinas >90 Ara h3 57 5,5 Proteína de almacenamiento de semilla Glicininas 44-53 Ara h4 35,9 5,5 Proteína de almacenamiento de semilla Glicininas 44-53 Ara h5 14 4,6 Proteína de unión de actina Profilinas 13 Ara h6 14,5 5,2 Proteína de almacenamiento de semilla Conglutinas 38 Ara h7 15,8 5,6 Proteína de almacenamiento de semilla Conglutinas 43 Ara h8 16,9 5,03 N.D Proteínas relacionadas con patogénesis N.D Ara h9 9,8 5,0 N.D Proteínas de lípidos N.D Ara h10 16 9,6-9,8 N.D Oleosinas N.D Ara h11 14 9,6-9,8 N.D Oleosinas N.D Ara h12 8-12 N.D N.D Defensinas N.D Ara h13 8-11 N.D N.D Defensinas N.D Introducción 13 2.4.Efectos de los tratamientos tecnológicos en las proteínas alergénicas del cacahuete Los alimentos son sometidos a tratamientos tecnológicos para su higienización, así como para alargar su conservación y mejorar sus propiedades sensoriales. El efecto que dichos tratamientos tienen en la estructura de las proteínas alergénicas de cacahuete es de gran relevancia, puesto que pueden inducir su desnaturalización, agregación y/o interacción con otros componentes, etc., y dichos cambios pueden afectar su capacidad alergénica. La mayoría de los trabajos publicados han estado dirigidos al estudio del efecto que tienen los tratamientos térmicos en su alergenicidad (Beyer et al., 2001; Maleki et al., 2000). Sin embargo, existe muy poca información del efecto que tienen sobre la proteína Ara h1 las nuevas tecnologías de conservación, como por ejemplo, las altas presiones, los pulsos eléctricos de alto voltaje, la irradiación, etc. Aunque no se espera que estas técnicas reemplacen a los métodos térmicos tradicionales, resultan interesantes para la industria alimentaria, por lo que actualmente ya existen en el mercado productos elaborados con estas tecnologías, y se espera que lo hagan en mayor grado en un futuro próximo y a un coste competitivo. Los estudios sobre el tratamiento térmico se han llevado a cabo principalmente tratando el cacahuete entero o sus extractos y determinando su inmunorreactividad mediante técnicas de Western-blotting, en las que se utilizan sueros de individuos alérgicos al cacahuete (Beyer et al., 2001; Maleki et al., 2000). Se ha observado que los procesos de fritura (120°C, 10 minutos) o hervido (100°C, 20 minutos) dan lugar a una disminución de la reactividad de las IgE con la proteína Ara h1, mientras que el proceso de tostado (170°C, 20 min) aumenta su inmunorreactividad (Beyer et al., 2001; Maleki et al., 2000a y b; Pomés et al., 2006). Este aumento de la inmunorreactividad se ha relacionado con la formación de nuevos epítopos generados por la reacción de Maillard, o con la exposición de epítopos localizados en el interior de la proteína en su estado nativo. Este hecho podría explicar la diversa prevalencia de las alergias al cacahuete observada en países con un alto consumo, como China o USA. Así, en China donde el cacahuete se consume fundamentalmente frito o hervido, la prevalencia de las alergias al cacahuete es mucho menor que en USA, donde se consume fundamentalmente tostado (Maleki et al., 2000). Introducción 14 Por otra parte, algunos de los estudios del efecto del tratamiento térmico en la alergenicidad de la proteína Ara h1 se han llevado a cabo calentando la proteína purificada y determinado su reactividad con el suero de pacientes alégicos a cacahuete, utilizando una técnica de ELISA de tipo competitivo indirecto. En estos estudios, se ha indicado que la proteína Ara h1 no disminuye su inmunorreactividad, incluso tras tratamientos a 140°C durante 15 minutos o a 100°C durante una hora (Burks et al., 1992; Beyer et al,. 2001; Koppelman et al., 1999). Estos hechos indican que los epítopos reconocidos por las IgE no se ven alterados por la aplicación de dichos tratamientos. Sin embargo, a pesar de que la alergenicidad de la proteína Ara h1 parece no verse afectada por los tratamientos térmicos, los estudios realizados a nivel molecular indican que dichos tratamientos inducen cambios en su estructura. Utilizando la técnica de calorimetría diferencial de barrido se ha indicado que la Ara h1 tiene una temperatura máxima y una entalpía de desnaturalización de 90,2ºC y 1574 kJ/mol, respectivamente. Además, el tratamiento térmico de la proteína Ara h1 produce un aumento en la estructura de hoja plegada beta y de la hidrofobicidad de la proteína, y da lugar a la formación de agregados mediante interacciones covalentes (Koppelman et al., 1999, Montserrat et al., 2013). Recientemente, utilizando una técnica de ELISA de tipo sandwich, se han determinado los parámetros cinéticos y termodinámicos de la desnaturalización por el calor de la proteína Ara h1 en un rango de temperaturas de 82 a 90ºC, los cuales indican que la desnaturalización de dicha proteína sigue un orden de reacción de n = 1,5 (Montserrat et al., 2013). La irradiación es un tratamiento que consiste en exponer los alimentos a radiaciones ionizantes de naturaleza corpuscular o magnética. Esta tecnología puede producir la desnaturalización de las proteínas debido a la acción de los radicales libres generados por efecto de la radiolisis, y su posterior fragmentación o agregación a través de interacciones electrostáticas y/o covalentes por puentes disulfuro. Se ha observado que la irradiación de extractos de cacahuete puede llegar a reducir unas 7 veces la reactividad de las muestras con IgE del suero de individuos alérgicos (Chung et al., 2008). El tratamiento por altas presiones consiste en someter los alimentos a presiones en el rango de 100 a 900 MPa durante periodos de tiempo que generalmente oscilan entre 1 y 30 minutos (Mañas y Pagán, 2005; Raso y Barbosa-Cánovas, 2003; Smelt, 1998). En general, las células vegetativas de las bacterias, los mohos y las levaduras resultan eficazmente Introducción 15 inactivadas por esta tecnología, mientras que los esporos bacterianos son muy resistentes a la presión (Smelt, 1998). Las altas presiones son capaces de modificar la estructura de las proteínas, al inducir cambios en las interacciones intra e intermoleculares de los grupos funcionales de los aminoácidos. En general, la aplicación de presiones superiores a 200300 MPa a temperatura ambiente provoca la disociación de las macroestructuras en subunidades, así como la desnaturalización de las estructuras monoméricas, probablemente debido al debilitamiento de las interacciones hidrofóbicas y a la separación de los puentes salinos inter o intramoleculares. Sin embargo, salvo que las presiones sean muy elevadas, los enlaces por puentes de hidrógeno y los enlaces covalentes no parecen verse afectados por estos tratamientos (Hendrickx et al., 1998). Existen muy pocos estudios sobre el efecto que tiene el tratamiento con altas presiones en las proteínas alergénicas del cacahuete. Johnson et al (2010), He et al., (2014) y Huang et al., (2014) aplicaron tratamientos entre 150 y 800 MPa y no observaron cambios en la estructura secundaria de las proteínas Ara h2 y Ara h6. En el estudio realizado por Hu et al (2011) se ha indicado que tratamientos de microfluidización entre 60 y 180 MPa dan lugar a cambios en la estructura secundaria de la proteína Ara h2 e incrementan su intensidad de absorción en el ultravioleta y su hidrofobicidad. Además, estos cambios estructurales disminuyen la inmunorreactividad de la proteína, determinada mediante una técnica de ELISA en placa, al destruir o enmascarar epítopos que reaccionan con las IgG. Si las modificaciones que sufre la proteína Ara h2 afectan también a su capacidad alergénica es un hecho que está todavía por estudiar. Por otra parte, el efecto del procesado constituye probablemente el principal problema al utilizar técnicas inmunoquímicas para determinar proteínas alergénicas alimentarias. En estudios realizados para detectar la presencia de cacahuete en alimentos tratados térmicamente, en los que se utilizan técnicas de inmunoensayo basadas en la determinación de la proteína Ara h1, se ha observado que el procesado disminuye la solubilidad de dicha proteína dificultando su extracción (Chassaigne et al., 2007). Además, dichos tratamientos desnaturalizan la proteína, destruyendo epítopos que son reconocidos por los anticuerpos, y/o inducen la agregación con otros componentes, enmascarando así sus determinantes antigénicos (Poms et al., 2004; Hu et al., 2010). Estos resultados ponen de manifiesto la necesidad de realizar estudios que permitan conocer el efecto que los tratamientos tecnológicos tienen en las proteínas diana utilizadas para la detección de Introducción 16 cacahuete en alimentos procesados, cuando esos ensayos se van a usar en los programas de control de alérgenos de alimentos o en la evaluación de riesgos de alérgenos. Objetivos 17 3. Objetivos El objetivo general del Trabajo Fin de Master que se presenta ha sido estudiar el efecto que tienen los tratamientos con altas presiones en la proteína Ara h1 de cacahuete. Para realizar este trabajo se ha contado con la participación del Centro Nacional de Tecnología y Seguridad Alimentaría situado en San Adrián (Navarra) que dispone de un equipo de altas presiones para la realización de los tratamientos. Para llevar a cabo este objetivo principal, se han planteado los siguientes objetivos parciales:  Desarrollar una técnica de ELISA para determinar la proteína Ara h1.  Determinar el efecto que tienen los tratamientos con altas presiones en la estructura de la proteína Ara h1, tratando la proteína en tampón y en extracto de cacahuete a diferentes presiones y tiempos.  Estudiar el efecto de la adición de diferentes reactivos al medio de tratamiento en la desnaturalización por altas presiones de la proteína Ara h1 con el objeto de obtener información del mecanismo de acción de acción de dicha desnaturalización. Materiales y Métodos 18 4. Materiales y Métodos 4.1.Materiales Los cacahuetes crudos, con cáscara y envasados en atmósfera modificada fueron adquiridos en una tienda local. El conjugado comercial de IgG de cabra anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa, la agarosa, los adyuvantes de Freund completo e incompleto, la N-etilmaleimida (NEM), los geles Sephacryl S-200, la Concanavalina A Sheparose y el Azul de Cibacrón Sepharose fueron suministrados por Sigma (Poole, Reino Unido). El gel de Sepharose 4B BrCN-activada, los geles de poliacrilamida, los tampones para las electroforesis y los marcadores de peso molecular, procedieron de Pharmacia Biotech (Upsala, Suecia). El test del ácido bicinconínico (BCA) y el estabilizador del conjugado de la peroxidasa, eran de Pierce (Rockford, IL, EEUU). El 4cloro-1-naftol fue suministrado por Merck (Darmstand, Alemania) y la N-Ndimetilformamida (DMF) procedía de Carlo Erba (Milán, Italia). El sustrato de la peroxidasa que contenía tetrametilbencidina (TMB) procedía de ZEULAB (Zaragoza, España). Las placas de ELISA F96 Maxisorp se obtuvieron de Nunc (Roskilde, Dinamarca) y las hojas de nitrocelulosa Trans Blot Transfer Medium de Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU). Las membranas de diálisis se obtuvieron de Medicell (Londres, Reino Unido) y los discos de ultrafiltración de Amicon (Beverly, MA, EEUU). El kit para la conjugación de los anticuerpos se obtuvo de Innova Biociences (Cambridge, UK). El resto de productos utilizados no señalados específicamente fueron reactivos de tipo analítico obtenidos de diversas fuentes. 4.2.Métodos 4.2.1. Aislamiento de la proteína Ara h1 La proteína Ara h1 fue aislada a partir de cacahuetes crudos mediante técnicas de precipitación salina y cromatográficas. Las fracciones proteicas obtenidas se analizaron mediante SDS-electroforesis. Materiales y Métodos 19 4.2.1.1. Preparación del extracto de cacahuete Tras haber estado inmersos en agua destilada durante una hora, los cacahuetes crudos se pelaron, se dejaron secar y se trituraron con una picadora hasta obtener una pasta fina y homogénea. Después, el cacahuete se procesó inmediatamente para prevenir la degradación causada por proteasas y lipasas endógenas. La extracción de las proteínas del cacahuete se realizó con tampón Tris 50 mM, pH 8,2 o con tampón borato sódico 10 mM pH 9 usando una relación 20 g de cacahuete por cada 100 mL tampón. La mezcla se mantuvo en agitación durante dos horas y las muestras se filtraron por lana de vidrio. 4.2.1.2. Precipitación con sulfato amónico La precipitación salina se realizó añadiendo sulfato amónico al extracto obtenido hasta alcanzar una saturación del 40%. La mezcla se mantuvo agitando durante una hora a temperatura ambiente y posteriormente se centrifugó a 23.000 g durante 45 minutos a 4ºC. Al sobrenadante obtenido tras la centrifugación se le añadió sulfato amónico hasta alcanzar una saturación del 80%, se mantuvo en agitación durante una hora a temperatura ambiente y se volvió a centrifugar. Se desechó el sobrenadante obtenido en esta fase y el precipitado se disolvió en 5 mL del tampón de extracción en un baño de ultrasonidos con hielo. Posteriormente, el extracto se pasó por un filtro de 0,45 µc. El mismo procedimiento de precipitación salina se realizó para saturaciones de 40-60% y 60-80% de sulfato amónico. 4.2.1.3. Filtración en gel Sephacryl S-200 Un volumen de 2 mL del extracto de cacahuete procedente de la etapa anterior se aplicó en una columna Sephacryl S-200 (90 x 2 cm) que previamente se equilibró con el tampón de extracción correspondiente. Se mantuvo un flujo de 30 mL/hora mediante una bomba peristáltica y se recogió el eluido en fracciones de 2 mL. 4.2.1.4. Cromatografía de intercambio iónico en Sepharose Q Las fracciones enriquecidas en proteína Ara h1 procedentes de la filtración en gel fueron dializadas frente a tampón Tris 50 mM, pH 8,2 y se aplicaron en una columna de Materiales y Métodos 20 Sepharose Q (25 x 3 cm) equilibrada con el mismo tampón. Seguidamente la columna se lavó con el mismo tampón hasta que la absorbancia del eluido a 280 nm fue inferior a 0,02. Para eluir las proteínas retenidas se aplicó un gradiente lineal de NaCl entre 0 y 0,5 M. El flujo se mantuvo a 18 mL/h y las fracciones recogidas fueron de 2 mL. 4.2.1.5. Cromatografía en Concanavalina A Las fracciones enriquecidas en proteína Ara h1 procedentes de la cromatografía en Sephacryl S-200 se aplicaron en una columna de Concanavalina A (10 x 2 cm), equilibrada con tampón Tris 50 mM pH, 8,2. A continuación se lavó la columna con el mismo tampón para eliminar las proteínas no retenidas hasta que la absorbancia a 280 nm fue menor de 0,02. La elución de las proteínas retenidas se llevó a cabo mediante un gradiente lineal entre 0 y 1 M de α-manopiranosa. El flujo se mantuvo a 24 mL/h y las fracciones recogidas fueron de 2 mL. 4.2.1.6. Cromatografía en Azul de Cibacrón Las fracciones enriquecidas en proteína Ara h1 procedentes de la cromatografía en Sephacryl S-200 se aplicaron en una columna Azul de Cibacrón (10 x 2cm), equilibrada con tampón Tris 50 mM pH 8,2. A continuación se lavó la columna con el mismo tampón para eliminar las proteínas no retenidas hasta que la absorbancia a 280 nm fue menor de 0,02. La elución de las proteínas se llevó a cabo aplicando un gradiente lineal de NaCl entre 0 y 0,5 M. El flujo se mantuvo a 24 mL/hora y las fracciones recogidas fueron de 2 mL. 4.2.2. Determinación de la concentración de proteína La concentración de proteína en las muestras de cacahuete se determinó usando el test del ácido bicinconínico. Para ello, se prepararon previamente estándares de albúmina sérica bovina (BSA) en tampón fosfato potásico 1,5 mM, fosfato sódico 8 mM, cloruro potásico 3 mM, cloruro de sodio 0,14 M, pH 7,4 (PBS) en un rango de concentraciones entre 125 μg/mL a 2 mg/mL y varias diluciones de las muestras a analizar. Después, se añadieron en los pocillos de una microplaca, 25 µL de los estándares o las muestras por triplicado, y 200 μL del reactivo BCA diluido 1/50. La mezcla se incubó a 37ºC durante Materiales y Métodos 21 30 minutos y se leyó la absorbancia de los pocillos a 570 nm en un lector de placas ELISA Multiskan MS (Labsystem, Helsinki, Finlandia). Se preparó una curva patrón representando la absorbancia de los estándares frente a su concentración, y la concentración de proteína en las muestras problema se calculó mediante interpolación de los valores de absorbancia en dicha curva. 4.2.3. Electroforesis en gel de poliacrilamida La preparación de las muestras se realizó en diferentes condiciones según el tipo de electroforesis. Para la electroforesis en condiciones nativas, las muestras se diluyeron en tampón Tris 50 mM pH 8,2 que contenía 1 mM EDTA y azul de bromoferol hasta una concentración de 1-2 mg/mL. Para las electroforesis en condiciones desnaturalizantes, a 90 µL de la mezcla anterior se le añadieron 10 µL de SDS al 25% (p/v, en agua destilada) y para las electroforesis en condiciones reductoras se añadieron además 10 µL de βmercaptoetanol. En estos dos últimos casos, las muestras se incubaron en un baño a 100ºC durante 5 minutos. A continuación, las muestras se aplicaron en geles comerciales que contenían una concentración de acrilamida de 8-25% o del 4-20%. Mediante un equipo Phast System (Pharmacia, Upsala, Suecia) o Miniprotean Biorad (bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) se llevaron a cabo las electroforesis siguiendo las recomendaciones establecidas por el fabricante para cada tipo de gel y condiciones del análisis. Cuando la electroforesis finalizó, las proteínas se tiñeron con el colorante Phast Gel blue R. Esta solución colorante contenía 0.65 g de Azul de Coomassie R, 300 mL de metanol, 100 mL de ácido acético y 500 mL de agua destilada. Los geles se mantuvieron inmersos en colorante y tras una hora en agitación, se retiró el colorante y se añadió una mezcla de decolorante compuesta por 250 mL de metanol, 80 mL de ácido acético, 20 mL de glicerina y 650 mL de agua destilada. Los geles permanecieron en esta mezcla hasta que quedaron incoloras las zonas del gel donde no había bandas de proteína. Resultados y Discusión 28 El extracto obtenido tras la precipitación salina se aplicó a una columna de Sephacryl S-200. El cromatograma muestra la presencia de tres picos (Figura 2) cuyas fracciones se analizaron por SDS-electroforesis (Figura 3). En el primer pico eluye mayoritariamente la proteína Ara h1 al encontrarse en el cacahuete en forma trímera, en el segundo pico, eluyen las proteínas Ara h2 y Ara h6 entre otras, y en el tercer pico eluyen los componentes de bajo peso molecular, principalmente pigmentos que absorben fuertemente a 280 nm. Figura 2. Perfil de la cromatografía en Sephacryl S-200 del extracto de cacahuete obtenido tras precipitación con sulfato amónico (60-80%). Las fracciones recogidas fueron de 2 mL. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 010 20 30 40 50 60 Absorbancia (280 nm) Nº de fracción Ara h1 22 25 29 32 34 37 Figura 3. SDS-Electroforesis en gel de poliacrilamida 8-25% de las fracciones de la cromatografía en Sephacryl S-200. Los números corresponden a las fracciones de la cromatografía. E: extracto de cacahuete obtenido tras la precipitación con sulfato amónico (60-80%). Ara h1 22 25 29 32 34 37 E + - Ara h2 Ara h6 Resultados y Discusión 29 Las fracciones enriquecidas en la proteína Ara h1 (21 a 26) se recogieron conjuntamente y se aplicaron en una columna de intercambio aniónico de Sepharose Q, cuyo perfil cromatográfico y electroforesis de algunas de las fracciones obtenidas se muestran en las Figuras 4 y 5 respectivamente. Todas las proteínas quedaron retenidas en el gel y eluyeron con un gradiente lineal de NaCl. La proteína Ara h1 eluyó a una concentración salina de aproximadamente 0,35 M. Otras proteínas contaminantes eluyeron a una concentración salina menor o mayor a la indicada para la proteína Ara h1 como se observa en la electroforesis de las fracciones 35 a 38 y 62 a 67 (previamente concentradas por ultrafiltración). Las fracciones 45 a 58, que contenían Ara h1 mayoritariamente, se recogieron conjuntamente. Figura 5. SDSelectroforesis en gel de poliacrilamida 4-20% de las fracciones de la cromatografía en Sepharose Q . 1: Fracciones 35 a 38 4: Fracción 50 2: Muestra enriquecida en proteína Ara h1 del Sephacryl S200) 5 : Fracciones 62 a 67 3: Fracción 48 + - 1 2 3 4 5 Ara h1 Figura 4. Perfil de la cromatografía en Sepharose Q de la fracción enriquecida en Ara h1 obtenida en la filtración en Sephacryl S-200. Las fracciones recogidas fueron de 2mL. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 10 20 30 40 50 60 70 NaCl (M) Absorbancia (280 nm) Nº de fracción Ara h1 Resultados y Discusión 30 El aislamiento de la proteína Ara h1 se ha llevado a cabo utilizando diferentes tipos de cromatografía, entre las que destacan, la cromatografía de exclusión molecular (Boldt et al., 2005; Van Boxtel et al., 2006), de intercambio aniónico (Van Boxtel et al., 2006; Burks et al., 1991; Palmer et al., 2005), hidrofóbica (Van Boxtel et al., 2006) y de afinidad en Concanavalina A (Marsh et al., 2008; Mondoulet et al., 2005; Wichers et al., 2004). En este trabajo, a pesar de que la fracción enriquecida en proteína Ara h1, procedente de la cromatografía en Sepharose Q, se ha sometido a cromatografías en concanavalina A y en Azul de Cibacrón, no se ha obtenido en ningún caso un mayor grado de pureza, por lo que estas etapas no se han incluido en el protocolo de aislamiento de dicha proteína (resultados no mostrados). Cuando la proteína Ara h1 se aisló para inmunizar conejos y obtener antisueros frente a ella, se seleccionó un menor número de fracciones de las cromatografías con el objeto de obtener una mayor pureza. En estos casos, el grado de pureza, determinado mediante densitometría, fue superior al 98%. Cuando la proteína Ara h1 se aisló para llevar a cabo los tratamientos con altas presiones, dado que se necesitaba disponer de una cantidad elevada de proteína, el número de fracciones tomadas de las cromatografías fue mayor, obteniéndose en estos aislamientos un grado de pureza de aproximadamente el 85%. 5.2.Obtención y caracterización de antisueros anti-Ara h1 Los antisueros frente a la proteína Ara h1 se obtuvieron mediante inoculación en conejos (grado de pureza del 98%, Figura 6a). La inmunorreactividad y la especificidad de los antisueros se comprobaron mediante las técnicas Western-blotting e inmunodotting (Figuras 6c y d). En la figura 6c, se muestran los resultados de la caracterización de los antisueros obtenidos mediante la técnica del Western-blotting en los que aparece una única banda coloreada en la muestra del extracto, que tiene la misma movilidad que la banda correspondiente a la Ara h1 (Figura 6b). Del mismo modo, en el inmunodotting (Figura 6d) aparecieron dos manchas coloreadas donde se aplicaron el extracto de cacahuete y la proteína Ara h1 y no hubo reacción en las otras proteínas aplicadas. Todo ello indica que el antisuero reconoce específicamente a la proteína Ara h1. Resultados y Discusión 31 Para determinar el título de los anticuerpos se realizó una técnica de ELISA de tipo no competitivo indirecto. El título de un antisuero se define como el inverso de la dilución correspondiente al 50% de la máxima absorbancia obtenida. Un ejemplo de una curva de titulación se muestra en la Figura 7, cuyo título fue de 1/7.000 aproximadamente. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 Absorbancia (280nm) -log10 (dilución) Figura 7. Curva de titulación de un antisuero frente a la proteína Ara h1 de cacahuete. Figura 6. (a) y (b) SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida 8-25%, (c) Inmunodotting y (d) Westernblotting obtenidos utilizando un antisuero anti-Ara h1. PM : patrón de pesos moleculares 4: Lactoferrina (2mg/mL) 1: Proteína Ara h1 grado de pureza del 98% (2mg/mL) 5: αlactalbúmina (2mg/mL) 2: Proteína Ara h1 grado de pureza del 85% (2mg/mL) 6: Proteína Ara h2 (2mg/mL) 3: Extracto de cacahuete (8mg/mL) El patrón está constituido por las siguientes proteínas: fosforilasa B (97 kDa), albúmina sérica bovina (67 kDa), ovoalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica (30 kDa), inhibidor de tripsina (20,1 kDa) y α-lactalbúmina bovina (14,4 kDa). PM 2 3 2 3 1 b a c 2 4 3 5 6 d Resultados y Discusión 32 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Absorbancia (280 nm) Nº de fracción pH 2,8 5.3.Aislamiento y conjugación de anticuerpos con peroxidasa Los anticuerpos anti-Ara h1 presentes en los antisueros se aislaron mediante una cromatografía de afinidad, utilizando una columna que contenía Ara h1 insolubilizada en Sepharose 4B. En la Figura 8 se muestra el perfil de esta cromatografía. Figura 8. Cromatografía de un antisuero anti-Ara h1 utilizando una columna que contenía la proteína Ara h1 insolubilizada en Sepharose 4B. Las fracciones recogidas fueron de 2 mL. La flecha indica el momento de aplicación del tampón de elución. En el perfil de la cromatografía se observan dos picos, en el primero, eluído con PBS que contenía 0,5 M NaCl, eluyen los componentes del antisuero que no interaccionan con el inmunoadsorbente. El segundo pico, eluído a pH 2,8, contiene los anticuerpos que han interaccionado con la proteína Ara h1. El análisis de las fracciones mediante una técnica de ELISA de tipo no competitivo indirecto, mostró la ausencia de anticuerpos específicos en el primer pico. Las fracciones 26 a 29 se recogieron, se concentraron por utltrafiltración y se congelaron a -20ºC hasta uso. El rendimiento del proceso de aislamiento de los anticuerpos anti-Ara h1 a partir de los antisueros de conejo fue muy bajo por lo que se realizaron varios aislamientos. Posteriormente se llevó a cabo la conjugación de los anticuerpos con peroxidasa mediante el procedimiento descrito en el apartado de métodos. Resultados y Discusión 33 5.4.Desarrollo de técnicas de ELISA para la determinación de la proteína Ara h1 En este trabajo se han desarrollado tres formatos de ELISA para la determinación de la proteína Ara h1 (sándwich y competitivo directo e indirecto, Figura 9a y b respectivamente). Para optimizar los ensayos, se realizaron diversas pruebas utilizando varias concentraciones y tampones de dilución para la fijación de la proteína y de los anticuerpos en la placa, distintos bloqueantes y tampones de lavado, así como varias diluciones y condiciones de dilución del antisuero y del conjugado. Con el formato de tipo sándwich el ruido de fondo obtenido con el estándar cero (sin proteína) en PBS fue muy alto y se redujo al aumentar el pH. A pH 9,2 el ruido de fondo se consideró aceptable pero también se veía reducida considerablemente la absorbancia de los estándares de proteína (Figura 9a). En el caso de los formatos directo e indirecto, se obtuvo una recta estándar con mayor pendiente para el formato directo, hecho que se debe probablemente a que durante el aislamiento de los anticuerpos se han seleccionado los que tienen una mayor afinidad por la proteína Ara h1. Además, en este formato se evita una etapa de incubación, acortándose así la duración total del ensayo. Por todo ello, para los posteriores análisis se utilizó el formato directo para determinar la proteína Ara h1. a b Figura 9. Curvas de calibración obtenidas mediante las técnicas de ELISA de tipo (a) sándwich y (b) directo e indirecto para la determinación de la proteína Ara h1. Resultados y Discusión 34 En la Figura 10, se muestra la curva de calibración obtenida para determinar la proteína Ara h1 utilizando la técnica ELISA competitivo directo que fue lineal en un rango de concentraciones entre 50 ng/ mL y 5 µg/mL (R2 > 0,98), con un límite de detección de 10,2 ng/mL y un límite de cuantificación de 20,6 ng/mL. 5.5.Efecto del tratamiento con altas presiones en la proteína Ara h1 En este trabajo, se ha estudiado el efecto que tiene el tratamiento con altas presiones en la desnaturalización de la proteína Ara h1. Para ello, un extracto de cacahuete y la proteína purificada se sometieron a diferentes presiones y tiempos de tratamiento. El grado de desnaturalización se determinó midiendo la pérdida de la inmunorreactividad de la proteína Ara h1 mediante una técnica de ELISA de tipo competitivo directo. Además, algunas de las muestras tratadas de la proteína purificada se analizaron mediante electroforesis en condiciones nativas y en condiciones desnaturalizantes, en presencia de SDS con y sin β-mercaptoetanol. 5.5.1. Determinación de la proteína inmunorreactiva En la Figura 11 se muestra la relación entre la concentración de proteína inmunorreactiva a cada presión y tiempo de tratamiento, y la concentración inicial de la proteína Ara h1 obtenida tras el tratamiendo de la proteína purificada (a) y del extracto de cacahuete (b). Figura 10. Curva de calibración de la técnica ELISA de tipo competitivo directo para la determinación de la proteína Ara h1. Resultados y Discusión 35 Como puede observarse en la Figura 11a, la proteína Ara h1 mantiene su inmunorreactividad tras el tratamiento a 200 MPa a todos los tiempos estudiados y a 300 MPa, la disminución de la concentración de la proteína inmunorreactiva es muy baja, menor a un 15% tras 30 minutos. A 400 MPa, se observa una disminución gradual hasta un 50% del valor inicial en los primeros 10 minutos, y después la concentración se mantiene prácticamente constante a tiempos mayores. A 500 y 600 MPa, la concentración de proteína inmunorreactiva disminuye de forma muy marcada en el primer minuto, y después lentamente, obteniéndose una disminución del 53% y el 70% a los 20 minutos de tratamiento. En el tratamiento del extracto de cacahuete (Figura 11b), el comportamiento de la proteína Ara h1 a 200 y 300 MPa fue similar al observado con la proteína purificada. A presiones mayores, la disminución de la proteína Ara h1 inmunorreactiva fue muy marcada en el primer minuto de tratamiento, obteniéndose una disminución del 53%, 57% y 78 % tras 20 minutos a 400, 500 y 600 MPa, respectivamente. Figura 11. Efecto de las altas presiones sobre la desnaturalización de la proteína Ara h1 del cacahuete (a) purificada y (b) en extracto, a diferentes presiones y tiempos de tratamiento. 0 20 40 60 80 100 120 140 0 5 10 15 20 25 30 Ara h1 (%) Tiempo (min) 0 20 40 60 80 100 120 140 0 5 10 15 20 25 30 Ara h1 (%) Tiempo (min) Resultados y Discusión 36 Existen muy pocos estudios sobre el efecto de las altas presiones en las proteínas alergénicas del cacahuete. Huang et al. (2014) determinaron el efecto del tratamiento entre 200 y 800 MPa en las proteínas del cacahuete utilizando un test comercial de ELISA de tipo sándwich con anticuerpos frente a un extracto de proteína de cacahuete. Estos autores observaron que el tratamiento de un extracto de cacahuete a 200 MPa no disminuía la concentración de proteínas inmunorreactivas y obtuvieron una disminución del 50% a 400 MPa y del 70% a 600 y 800 MPa tras tratarlo 10 minutos a esas presiones, valores que son similares a los obtenidos en este trabajo. Hu et al. (2011) trataron un extracto de cacahuete con presiones entre 50 y 200 MPa durante 5 minutos y observaron mediante SDS-electroforesis una disminución en la intensidad de la fracción de conaraquina II, en la que se encuentra mayoritariamente la proteína Ara h1, mientras que la presión no tenía efecto en el perfil de bandas de las fracciones de araquina y conaraquina de tipo I. Johnson et al. (2010) también indicaron que el tratamiento con altas presiones a 600 y 700 MPa a 20ºC y a 80ºC no tenía efecto en la estructura de la proteína Ara h2, determinada por la técnica de dicroísmo circular. 5.5.2. Determinación del perfil electroforético Las muestras de proteína Ara h1 sometidas a altas presiones se analizaron utilizando distintos tipos de electroforesis. En la electroforesis en condiciones nativas (Figura 12a), la proteína Ara h1 se muestra como una banda difusa cuya intensidad y extensión es mayor en la muestra sin tratar que en la tratada a 600 MPa durante 20 minutos. Además, en la muestra tratada se observa un incremento en la intensidad del color en el punto de aplicación de la muestra, lo que indica la presencia de agregados de alto peso molecular, que no pueden penetrar en el gel. Al analizar el sobrenadante y el precipitado obtenidos tras centrifugar la muestra tratada a 16.060 g durante 15 minutos, se observa que en la carrera del sobrenadante la banda difusa de la proteína es muy tenue, pero no aparecen agregados en el punto de aplicación de la muestra, que sí se visualizan en el precipitado. En la figura 12b se muestra la SDS-electroforesis de la proteína Ara h1 tratada a diferentes presiones. La muestra sin tratar presenta una banda de aproximadamente 63 Resultados y Discusión 37 kDa que corresponde a la forma monómera de la proteína. En las muestras tratadas, la intensidad de la banda de 63 kDa es menor para todas las presiones aplicadas. Además, aparecen otras bandas bastante difusas de mayor peso molecular a 400 MPa y a presiones superiores, indicando la presencia de agregados. En estas muestras no se observa color en el punto de aplicación de las muestras, lo que indica que los agregados observados en condiciones nativas se han disgregado en parte, debido al efecto del detergente. Estos resultados indican que algunos de los agregados formados por efecto de la presión, son debidos a interacciones de tipo no covalente. Al analizar las mismas muestras en condiciones reductoras no se observaron diferencias entre la muestra sin tratar y las tratadas, lo cual indica que los agregados observados en la SDS-electroforesis de las muestras tratadas son debidos a interacciones covalentes mediante puentes disulfuro. Figura 12. (a) Electroforesis nativa, (b) SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida 8-25% sin βmercaptoetanol y (c) con β-mercaptoetanol. PM : patrón de pesos moleculares 1: Ara h1 sin tratar 5: Ara h1 600 MPa 5 min 2: Ara h1 300 MPa 30 min 6: Ara h1 600 MPa 20 min 3: Ara h1 400 MPa 20 min 7: Ara h1 600 MPa 20 min (sobrenadante) 4: Ara h1 500 MPa 20 min 8: Ara h1 600 MPa 20 min (precipitado) El patrón está constituido por las siguientes proteínas: fosforilasa B (97 kDa), albúmina sérica bovina (67 kDa), ovoalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica (30 kDa), inhibidor de tripsina (20,1 kDa) y αlactalbúmina bovina (14,4 kDa). 1 6 PM 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 7 8 a b b c c Bibliografía 44 productos alimenticios. Diario Oficial de la Unión Europea, L 308, 25 de noviembre de 2003, 15-18. Real Decreto 2220/2004. Directiva 2005/26/CE, de 21 de marzo de 2005, por la que se establece una lista de sustancias o ingredientes alimentarios excluidos provisionalmente del anexo III bis de la Directiva 2000/13/CE. Diario Oficial de la Unión Europea, L 75, 22 de marzo de 2005, 33-34. Real Decreto 1164/2005. 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