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Nuevas arquitecturas poliméricas basadas en la química click TRABAJO FIN DE MÁSTER Hugo García Juan Directores: Dr. Luis T. Oriol Langa Dra. Milagros Piñol Lacambra Dpto. de Química Orgánica Universidad de Zaragoza Dña. MILAGROS PIÑOL LACAMBRA y D. LUIS T. ORIOL LANGA; ambos profesores titulares del Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza y miembros del Instituto de Ciencia de Materiales de Aragón de la Universidad de Zaragoza-CSIC, HACEN CONSTAR: Que el trabajo recogido en la memoria titulada “Nuevas arquitecturas poliméricas basadas en la química click”, ha sido realizado bajo nuestra supervisión por D. HUGO GARCÍA JUAN en laboratorios del Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias y del Instituto de Ciencia de Materiales de Aragón (Universidad de Zaragoza-CSIC) y reúne las condiciones para su presentación como “Trabajo Fin de Máster”. Zaragoza, a 23 de Junio de 2014 Fdo.: Dr. Luis T. Oriol Langa Fdo.: Dra. Milagros Piñol Lacambra RESUMEN La combinación de las técnicas de polimerización radicalaria controlada (como la ATRP), que permite controlar tanto la masa como los grupos terminales del polímero, con la química click 1 constituye una herramienta excepcional para la síntesis de nuevas arquitecturas poliméricas con una estructura perfectamente definida. 2 En este trabajo se han preparado por ATRP polimetacrilatos de oligoetilenglicol y dietilenglicol termosensibles con un grupo alquino en un extremo. Estos polímeros son solubles en agua a temperatura ambiente, pero sobrepasada una temperatura crítica (LCST) se vuelven insolubles. El acoplamiento por reacción click de estos polímeros con un dendrón con azida en el punto focal dio lugar a un copolímero bloque dendríticolineal (LDBC) de estructura compleja y con respuesta dual: a la temperatura y a la luz, gracias a las unidades de azobenceno en la periferia del dendrón (Figura 1). Figura 1: LDBC sintetizado Se ha estudiado la formación de vesículas en disolución acuosa y se ha comprobado cómo estas vesículas responden a la luz y a la temperatura. Asimismo se ha estudiado el encapsulado y liberación bajo estímulos de sondas fluorescentes, para verificar la aplicación de estas vesículas como nanotransportadores. 1 H. C. Kolb, M. G. Finn, K.B. Sharpless, Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40, 2004-2021 2 G.K. Such, A. Johnston, K. Liang, F. Caruso, Progress in Polymer Science, 2011, 37, 985-1003 Otra arquitectura polimérica interesante explorada son los polímeros tipo ramificado. Figura 2: Síntesis de polímeros ramificados Estos polímeros están formados por una cadena principal de la que cuelgan, a su vez, cadenas poliméricas laterales (Figura 2). Se ha explorado la aplicación de la reacción click de tiolinos fotoiniciada 3 como estrategia para conseguir fotopolímeros con esta estructura compleja, utilizando los polimetracrilatos termosensibles con alquino terminal, como macrómero, y ditioles comerciales. 3 C. N. Bowman, C. E. Hoyle, Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 1540 – 1573 Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado por el proyecto MAT2011-27978-C02-01 y el Gobierno de Aragón (Grupo Cristales Líquidos y PolímerosE04). Se agradece especialmente la colaboración del Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza, los diferentes servicios utilizados del CEQMA (Universidad de Zaragoza-CSIC), así como del Laboratorio de Microscopías Avanzadas (LMA, Universidad de Zaragoza). Índice 1. Introducción 1 1.1. Polimerización radicalaria controlada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2. Química click ...................................... 1 1.2.1. Cicloadición de azidas y alquinos catalizada por Cu(I) . . . . . . . . . . . . 2 1.2.2. Reacción de tiolenos/inos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.3. Polímeros con termorrespuesta en agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.4. Copolímeros bloque dendrítico-lineales con respuesta a estímulos . . . . . . . . . . 5 2. Antecedentes 8 3. Objetivos 12 4. Resultados y discusión 13 4.1. Síntesis y caracterización de polímeros lineales con termorrespuesta . . . . . . . . . 13 4.2. Síntesis y caracterización de un LDBC sensible a la luz y a la temperatura . . . . . . 15 4.3. Preparación de agregados en agua y estudio de su morfología . . . . . . . . . . . . . 16 4.4. Estudio de la morfología de los agregados tras ser irradiados y calentados . . . . . . 19 4.5. Estudio del encapsulado de moléculas y liberación mediante estímulos . . . . . . . . 20 4.6. Síntesis de polímeros ramificados con termorrespuesta mediante reacciones de tiolinos 23 5. Conclusiones 27 6. Anexos I 6.1. Parteexperimental ................................... I 6.1.1. Síntesis del 2-bromo-2-metilpropanoato de 3-trimetilsililprop-2-in-1-ilo . . . I 6.1.2. Procedimiento general para las polimerizaciones ATRP . . . . . . . . . . . . I 6.1.3. Procedimiento general para desprotección de triples enlaces terminales . . . II 6.1.4. Síntesis del [(OEG-co-DEG)_3200]-b-d(isoAZO/C18) . . . . . . . . . . . . III 6.1.5. Tinción de muestras para TEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III 6.1.6. Determinación de la CMC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IV 6.1.7. Estudios de irradiación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IV 6.1.8. Encapsulado de rodamina B en vesículas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IV 6.1.9. Estudios de microscopía confocal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IV 6.1.10. Procedimiento general para fotopolimerizar . . . . . . . . . . . . . . . . . . IV 6.2. Ejemplo de espectro de 1H-RMN de polímero con termorrespuesta . . . . . . . . . . V 6.3. Ejemplo de DSC para el cálculo de la LCST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V 6.4. Espectro de 1H-NMR del d(isoAZO/C18) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VI 6.5. Espectro de 1H-NMR del [(OEG-co-DEG)_3200]-C≡C................ VI 6.6. Espectro de 1H-NMR de [(OEG-co-DEG)_3200]-b-d(isoAZO/C18) . . . . . . . . . VII 6.7. TGA del [(OEG-co-DEG)_3200]-b-d(isoAZO/C18) . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII purificación mediante métodos no cromatográficos, altos rendimientos y buena regio y estéreoselectividad (aunque no necesariamente enantioselectividad). Se caracterizan también por ser procesos cinética y termodinámicamente favorables (∼20 kcal/mol).3 Entre las reacciones que se incluyen en esta denominada química click se encuentra por ejemplo la reacción de Diels-Alder. Sin embargo podemos destacar dos reacciones que han adquirido una gran importancia en ciencia de materiales: la cicloadición de azidas y alquinos catalizada por Cu(I) (CuAAC) y las reacciones de tiolenos y tiolinos. La combinación de estas reacciones con las técnicas de polimerización radicalaria controlada viva constituyen una herramienta fundamental para el diseño de nuevas arquitecturas poliméricas bien definidas, ya que nos permiten unir de una manera sencilla bloques poliméricos, sintetizados con un excelente control de la masa molecular y unos grupos funcionales bien definidos. Es posible diseñar así polímeros tipo estrella, polímeros ramificados regulares o copolímeros bloque lineal-lineal o dendrítico-lineales, entre otros.4 5 1.2.1. Cicloadición de azidas y alquinos catalizada por Cu(I) La CuAAC entre una azida orgánica y un alquino terminal en presencia de Cu(I) da lugar a un 1,2,3-triazol sustituído en posiciones 1,4. Esto contrasta con la reacción no-catalizada, en la cual obtenemos mezclas 1,4 y 1,5. La razón de esta mejora es que la reacción catalizada por Cu(I) es del orden de 107veces más rápida y, al transcurrir por un mecanismo perfectamente definido, se obtiene sólo uno de los regioisómeros. El mecanismo propuesto para la reacción se representa en la Figura 2. Figura 2: Mecanismo propuesto para la CuAAC Esta reacción se puede llevar a cabo en cualquier disolvente, prótico o aprótico, y es tolerante a prácticamente cualquier grupo funcional presente en el medio de reacción, incluso a azidas inorgánicas. El Cu(I) puede introducirse directamente en este estado de oxidación, lo que obliga a trabajar 3H. C. Kolb, M. G. Finn, K.B. Sharpless, Angew. Chem. Int. Ed.,2001, 40, 2004-2021 4N. Akeroyd, B. Klumperman, Eur. Polym. J.,2011, 47, 1207–1231 5O. Türünç, M. A. R. Meier, J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem.,2012, 50, 1689-1695 2 en ausencia de oxígeno; o bien puede introducirse como Cu(II) junto con un reductor suave como ascorbato de sodio, que lo reducirá a Cu(I) in situ, evitando así tener que trabajar en atmósfera inerte. Esta reacción ha sido ampliamente utilizada en Química Macromolecular (y Ciencia de Materiales en general) tanto para la preparación de polímeros como para procesos de fotopolimerización o funcionalización de macromoléculas.6 1.2.2. Reacción de tiolenos/inos Las reacciones entre tioles y alquenos (Figura 3) no son un descubrimiento reciente. Ya a mitad del Siglo XIV, Goodyear descubrió el vulcanizado de los neumáticos que consiste en la reacción de azufre con poli(cis-isopreno). Sin embargo, en los últimos años, la investigación sobre esta reacción ha repuntado debido a su utilidad para conseguir nuevas arquitecturas poliméricas o para entrecruzar cadenas, dando lugar a redes con una estructura muy homogénea y unas propiedades excelentes.7 Figura 3: Reacción de tioles y alquenos Por contra, la reacción de tiolenos tiene una limitación ya que cada alqueno reacciona únicamente con un tiol. Esto significa que la máxima densidad de entrecruzamiento posible viene limitada por la monofuncionalidad del alqueno. Una alternativa es la reacción de tioles y alquinos (también llamada de tiolinos), en la cual cada alquino puede reaccionar con dos tioles, según el mecanismo en dos etapas descrito en la Figura 4. Figura 4: Mecanismo de la reacción de tiolinos Esta reacción introduce una mayor concentración de azufre en la red formada. Entre otras ventajas nos permite controlar el índice de refracción de nuestro material dentro de un rango, ya que el aumento 6G.K. Such, A. Johnston, K. Liang, F. Caruso, Prog. Polym. Sci.,2011, 37, 985-1003 7A .B. Lowe, C. E. Hoyle, C. N. Bowman, J. Mater. Chem.,2010, 20, 4745-4750 3 del contenido en azufre revierte en un mayor índice de refracción lo que tiene especial utilidad en aplicaciones ópticas.8 Esta reacción es especialmente útil para funcionalizar polímeros en posiciones concretas de la cadena. Como se ha comentado, la técnica de polimerización ATRP permite obtener polímeros con grupos terminales perfectamente definidos. Así pues, si uno de estos grupos terminales es un alquino, se pueden hacer reacciones sobre él aprovechando la reacción con tioles. Como alternativa a la CuAAC, también es aplicable a las polimerizaciones tipo RAFT, que mediante una reacción de aminolisis dan lugar a un tiol en un extremo de la cadena, sobre el que, de nuevo, se pueden hacer reacciones con alquinos.9 Una particularidad interesante de estas reacciones es la posibilidad de ser llevada a cabo con luz usando un fotoiniciador adecuado, lo que las diferencia de la CuAAC. Las fotopolimerizaciones se han usado desde hace tiempo en numerosas aplicaciones cotidianas como la litografía o los implantes dentales. Sin embargo, las fotopolimerizaciones clásicas tienen dos problemas fundamentales: son inhibidas por oxígeno y dan lugar a redes muy heterogéneas. La síntesis de redes poliméricas mediante fotopolimerización de tioles y alquenos, o alquinos, combina las virtudes de las fotopolimerizaciones (control espacial y temporal) con las propiedades de la química click, lo que se traduce en una menor sensibilidad al oxígeno y en la formación de redes mucho más homogéneas.10 Esta estrategia ha resultado ser especialmente interesante en la preparación de hidrogeles físicos para ingeniería de tejidos. En estos casos el fotoiniciador Irgacure 2959® es uno de los más utilizados debido a su moderada solubilidad en agua (∼1 % en peso), a su sensibilidad a la luz de 365 nm (compatible con células) y a que no es citotóxico.11 1.3. Polímeros con termorrespuesta en agua La solubilidad de ciertos polímeros puede verse afectada por la temperatura del medio. En general, los compuestos de bajo peso molecular van aumentando su solubilidad de forma gradual conforme aumenta la temperatura; sin embargo, los polímeros con termorrespuesta presentan una rápida transición de soluble a insoluble, o viceversa. Cuando el paso que se produce es de soluble a insoluble, la temperatura a la que se produce se denomina LCST, del inglés lower critical solution temperature, (Figura 5). Inversamente, si el paso es de insoluble a soluble, la temperatura se denomina UCST, del inglés upper critical solution temperature. El comportamiento LCST es el más estudiado. Este comportamiento depende tanto del polímero como del disolvente, siendo especialmente interesante en agua. El fenómeno se debe a que por debajo de la LCST el polímero es soluble por los enlaces de hidrógeno que forma con el agua. Una vez sobrepasada dicha temperatura se rompen estos enlaces, el polímero se vuelve insoluble y pasa a un estado globular debido a la hidrofobicidad de la cadena principal. El proceso es completamente reversible, redisolviéndose al enfriar por debajo de la temperatura crítica. Cualitativamente, la LCST se controla 8J-G. Liu, M. Ueda, J. Mater. Chem.,2009, 19, 8907-8919 9B. Yu, J. W. Chan, C. E. Hoyle, A. B. Lowe, J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem.,2009, 47, 3554–3557 10C. N. Bowman, C. E. Hoyle, Angew. Chem. Int. Ed.,2010, 49, 1540 – 1573 11C. G. Williams, A. N. Malik, T. K. Kim, P. N. Manson, J. H. Elisseeff, Biomaterials,2005, 26, 1211-1218 4 por la proporción hidrófila/hidrófoba del polímero. Así pues cuanto más porcentaje hidrófobo tenga el polímero más baja será la temperatura a la que se vuelva insoluble. Existen un buen número de homopolímeros y copolímeros que presentan este comportamiento.12 (a) Por debajo de la LCST (b) Por encima de la LCST Figura 5: Disolución de polímero con termorrespuesta en agua por debajo y por encima de la LCST En particular los polimetacrilatos de oligoetilenglicol y dietilenglicol (OEG-co-DEG) han mostrado tener la biocompatibilidad del PEG y, a su vez, comportamiento LCST en agua debido a la solubilidad de las cadenas de OEG y a la insolubilidad de la cadena principal. Estos polímeros pueden sintetizarse de forma relativamente sencilla controlando tanto la masa molar como los grupos terminales, usando polimerizaciones radicalarias controladas como la ATRP.13 Si un polímero con termorrespuesta se une a un bloque hidrófobo se pueden obtener copolímeros bloque anfífilos que pueden formar agregados en agua, como vesículas o micelas. Estos agregados mantienen la termorrespuesta inicial de manera que la temperatura es un estímulo para inducir cambios morfológicos en los mismos. Estos cambios se pueden utilizar en aplicaciones como la liberación controlada de un determinado compuesto que hubiera sido encapsulado en su interior.14 1.4. Copolímeros bloque dendrítico-lineales con respuesta a estímulos Los copolímeros bloque son macromoléculas formadas por al menos dos cadenas poliméricas de distinta composición. Si los bloques que conforman el copolímero bloque son de distinta polaridad puede producirse una separación de fases en fundido a escala nanoscópica. Si el copolímero bloque es de naturaleza anfífila puede producirse la formación de agregados supramoleculares como vesículas o micelas en disolución. La combinación de bloques poliméricos y dendríticos abre nuevas posibilidades en el diseño de materiales poliméricos funcionales (Figura 6). En estos materiales la periferia del dendrón puede ser funcionalizada para conseguir unas determinadas propiedades como son la hidrofilia y la hidrofobia (claves para poder controlar el autoensamblaje en disolución) o bien la capacidad de responder a ciertos estímulos. 12R. Liu, M. Fraylich, B. R. Saunders, Colloid polym. Sci.,2009, 287, 627-643 13G. Vancoillie, D. Frank, R. Hoogenboom, Prog. Polym. Sci.,2014, 39, 1074-1095 14S. J. T. Rezaei, M. R. Nabid, H. Niknejad, A. A. Entezami, Polymer,2012, 53, 3485-3497 5 (a) Copolímero bloque lineal-lineal (b) Copolímero bloque dendríticolineal (LDBC) Figura 6: Estructuras de copolímeros bloque Existen varias estrategias para la preparación de estos copolímeros bloque dendrítico-lineales (Figura 7). Puede sintetizarse un dendrímero que sirva como macroiniciador para hacer crecer desde él el polímero, o bien al revés, crecer un polímero que sirva como punto focal para el crecimiento del dendrímero. Sin embargo, la estrategia más sencilla es construir ambos por separado y unirlos después mediante una reacción de acoplamiento. Una vez más, la química click es una herramienta sintética excepcional para la unión de los bloques dendríticos y lineales. Para ello, ambos bloques han de ser sintetizados de tal manera que contengan grupos funcionales complementarios que reaccionen entre sí. En el caso del bloque lineal esto puede conseguirse mediante técnicas de polimerización radicalaria viva, como la ATRP. En cuanto al bloque dendrítico se puede usar cualquiera de los métodos habituales utilizados para su preparación.15 La ventaja de este método es que se puede ejercer mejor control sobre la síntesis ya que ambos bloques pueden ser purificados y caracterizados con total precisión antes de acoplarse. Figura 7: Estrategias para la síntesis de LDBC Una alternativa que hace todavía más interesante a estos materiales es la posibilidad de hacerlos 15F. Wurm, H. Frey, Prog. Polym. Sci.,2011, 36, 1-52 6 capaces de responder a estímulos provocando, por ejemplo, cambios estructurales en las moléculas. Esta propiedad puede introducirse en cualquiera de los dos bloques, o en ambos. Incluso puede hacerse cada bloque sensible a un estímulo diferente, como podrían ser la luz y la temperatura. Esto, unido a su capacidad para formar agregados en agua, los hace ideales para actuar como nanotransportadores para transporte de fármacos y liberación controlada de los mismos mediante estímulos. El fármaco puede encapsularse físicamente en el interior del agregado o en la membrana, dependiendo de la naturaleza del fármaco y del tipo de agregado que se tenga. Las ventajas de usar agregados poliméricos como nanotransportadores van desde la solubilización de fármacos poco solubles en agua a la reducción de la toxicidad.16 Un estímulo particularmente interesante es la luz. Este estímulo puede ser inducido de forma muy precisa y controlada en tiempo y espacio. La fotorrespuesta generalmente está asociada a la presencia de grupos funcionales que son capaces de isomerizar al ser irradiados con luz de una determinada longitud de onda. El cromóforo más usado y más estudiado en este tipo de materiales es el azobenceno. Figura 8: Isomerización del azobenceno El azobenceno es una molécula orgánica sencilla formada por dos anillos aromáticos unidos por enlace diazoico. Su espectro UV-vis se caracteriza por dos bandas: una de mayor intensidad correspondiente a una transición π−π*, en torno a 365 nm, y otra correspondiente a una transición n−π* sobre 430 nm. Sin embargo estas longitudes de onda varían según la naturaleza de los sustituyentes.17 La irradiación en la región UV produce una isomerización reversible del isómero trans al isómero cis, el cual pierde la planaridad del trans y es más polar y, por tanto, más hidrófilo. Este proceso puede revertirse irradiando con luz en la región del visible, calentando, o bien dejándolo en oscuridad (Figura 8). El confinamiento de este compuesto en copolímeros bloque lo hace interesante debido a sus aplicaciones en almacenamiento holográfico o en la preparación de nanobjetos con fotorrespuesta. 16E. Blasco, M. Piñol, L. Oriol, Macromol. Rapid Commun.,2014, 35, 1090-1115 17R. Klajn, Pure Appl. Chem.,2010, 82, 12, 2247-2279 7 2. Antecedentes El origen de este trabajo está en la investigación llevada a cabo en el grupo de Cristales Líquidos y Polímeros (CLIP) con materiales con fotorrespuesta basados en copolímeros bloque dendríticolineales (LDBC), en los cuales las moléculas de azobenceno se encuentran en la periferia de un dendrímero tipo poliéster del ácido 2,2-bis(hidroximetil)propionico o bis-MPA. Esta arquitectura molecular combina perfectamente la alta funcionalidad de los dendrímeros con la segregación de los copolímeros bloque. Concretamente, los LDBC cristal líquido basados en azobenceno se han evaluado como materiales para el almacenamiento holográfico de datos. La razón es que la irradiación con luz linealmente polarizada produce la fotoisomerización de las moléculas de azobenceno acompañada de la orientación de las mismas con su eje molecular largo perpendicular a la dirección de polarización de la luz. El acoplamiento del azodendrón a un bloque polimérico transparente a la luz UV permite el uso de films de mayor grosor, en los cuales la nanosegregación de fases conserva el efecto cooperativo en la orientación de las moléculas de azobenceno en los distintos dominios. El primer trabajo realizado en el grupo en este campo consistió en la síntesis de LDBC formados por una cadena lineal de PEG (Mn=2000 Da) acoplada a dendrones de bis-MPA, desde la 1ª generación a la 4ª, funcionalizados con 4-cianoazobenceno (Figura 9). Estos compuestos mostraron mesofases esméctica tipo A (excepto para la primera generación) y morfologías lamelares en fundido. Irradiando con luz linealmente polarizada de 488 nm se consiguió inducir anisotropía óptica aunque el material presente el inconveniente de su cristalinidad.18 Figura 9: LDBC formado de PEG y distintas generaciones de azodendrón Con el fin de mejorar las propiedades de los films obtenidos se prepararon LDBC sustituyendo el PEG por PS, PMMA y PEMA, y estudiando tanto la influencia de la longitud del espaciador que une las moléculas de azobenceno al dendrón como la longitud del bloque lineal. Se observó comportamiento cristal líquido así como morfología lamelar sólo para la 3ª y 4ª generación en los LDBC con un contenido en dendrón del 25% en peso aproximadamente (Figura 10). Se estudió también 18J. del Barrio, L. Oriol, R. Alcalá, C. Sánchez, Macromolecules,2009, 42, 5752-5760 8 su capacidad para generar anisotropía fotoinducida, obteniéndose mejores valores con un espaciador decametilénico que con el pentametilénico.19 Figura 10: LDBC formado de PMMA y un dendrón funcionalizado con 4-cianoazobenceno Especialmente interesante resultó el estudio del comportamiento en agua de los LDBC derivados de PEG, así como su capacidad para formar distintos tipos de agregados dependiendo de la relación hidrófobo/hidrófilo. Así, variando la generación del dendrímero y la longitud del bloque lineal se ha podido controlar la morfología de los agregados formados en agua, obteniéndose desde nanofibras (proporción 33/67) a vesículas (proporción 80/20) (Figura 11).20 Figura 11: Distintos agregados formados variando el ratio hidrófobo/hidrófilo 19E. Blasco, J. del Barrio, M. Piñol, L. Oriol, C. Berges, C. Sánchez, R. Alcalá, Polymer,2012, 53, 4604-4613 20J. del Barrio, L. Oriol, C. Sánchez, J. L. Serrano, A. Di Cicco, P. Keller, M.-H. Li, J. Am. Chem. Soc.,2010, 132, 11, 3762-3769 9 Particular atención se ha puesto en el estudio de los derivados de 4ª generación unidos a PEG de Mn=2000 Da, capaces de formar vesículas en agua y actuar como nanotransportadores con respuesta a la luz. Estas vesículas están formadas por una bicapa del azodendrón aislada del medio acuoso interno y externo por las cadenas de PEG (Figura 12). Figura 12: Estructura de las vesículas formadas Los estudios demostraron la existencia de un espacio interior que les permite encapsular compuestos hidrófilos además de poder incorporar compuestos hidrófobos en el interior de la membrana. La liberación de los compuestos encapsulados se activa mediante irradiación con luz en la región UV. La isomerización trans →cis del azobenceno produce un cambio en la forma y polaridad de las moléculas, lo que provoca cambios estructurales en las vesículas deformándolas. Esta deformación aumenta la permeabilidad de la membrana y produce la liberación de los compuestos encapsulados. Posteriormente se realizó una modificación consistente en remplazar el 4-cianoazobenceno por 4-isobutiloxiazobenceno. Este cambio no alteró las propiedades de autoensamblaje en disolución; sin embargo redujo considerablemente la intensidad de luz y el tiempo de exposición necesario para producir la liberación fotoinducida. Esta mejora se atribuye a la menor tendencia a la agregación del 4-isobutiloxiazobenceno y a que la isomerización trans →cis provoca un cambio de polaridad mayor que en el cianoazobenceno.21 En un trabajo posterior se redujo el número de unidades de azobenceno en la periferia del dendrón combinando la unidad 4-isobutiloxiazobenceno con cadenas alifáticas. Una vez más se mantuvieron las propiedades de autoensamblaje a la vez que se redujeron los tiempos de respuesta debido a la menor agregación de las unidades de azobenceno dada la menor concentración de las mismas. Las vesículas con un 75 % de contenido de azobenceno en la periferia del dendrón mostraron un comportamiento similar a las que contienen un 100%. Las que tenían un 25 % no sufrieron alteraciones al ser irradiadas. Sin embargo cuando el contenido de azobenceno es del 50 % las vesículas se destruyen completamente al ser irradiadas tal y como se observó en Cryo-TEM (Figura 13).22 21E. Blasco, J. del Barrio, C. Sánchez-Somolinos, M. Piñol, L. Oriol, Polym. Chem.,2013, 4, 2246-2254 22E. Blasco, J.L. Serrano, M. Piñol, L. Oriol, Macromolecules,2013, 46, 5951-5960 10 Figura 13: Fotografias de cryo-TEM a distintos% de azobenceno antes y después de irradiar 11 Figura 20: Curva de DLS (escala logarítmica) La concentración micelar crítica en agua (CMC) se determinó midiendo la fluorescencia de rojo nilo en un entorno hidrófobo (ver Anexo 6.1.6). Se excita a 560 nm y el rojo nilo cuando se encuentra en un entorno hidrófobo, como es el interior de la membrana al formarse los agreagados, emite a 606 nm. Estas longitudes de onda están alejadas de las longitudes de onda que provocan la isomerización del azobenceno. La fluorescencia del rojo nilo en agua depende entonces de la existencia de agregados en disolución, y su intensidad de la concentración de los mismos. En caso de estar por debajo de la CMC no se formarán agregados y el rojo nilo no será fluorescente puesto que no se puede situar en un entorno hidrófobo. Así pues, se representa en una gráfica la intensidad de luz emitida a 606 nm, frente al logaritmo de la concentración. El valor de la CMC se obtiene calculando el valor del onset en la Figura 21. Figura 21: Intensidad de fluorescencia frente a concentración de agreagados Para el compuesto [(OEG-co-DEG)_3200]-b-d(isoAZO/C18), el valor de la CMC obtenido es 35 µg/mL. Este valor es comparable a los obtenidos en otros agregados de naturaleza similar.27,28 27J. L. Mynar, A. P. Goodwin, J. A. Cohen, Y. Ma, G. R. Fleming, J. M. J. Fréchet, Chem. Commun., 2007, 2081–2082 28Y. Chang, Y. C. Kwon, S. C. Lee, C. Kim, Macromolecules,2000, 33, 4496-4500 18 4.4. Estudio de la morfología de los agregados tras ser irradiados y calentados Como se ha comentado, el LDBC sintetizado es capaz de responder a la temperatura calentando una disolución acuosa del polímero por encima de la LCST, y a la luz (mediante la fotoisomerización de las moléculas de azobenceno de la periferia del dendrón). Es de esperar que los agregados formados en agua a partir de este LDBC también sean capaces de responder a estos estímulos provocando cambios en su morfología. En primer lugar se registraron espectros de UV-vis de una disolución de vesículas de concentración 0,5 mg/mL irradiando con luz de 365 nm (ver Anexo 6.1.7) a distintos tiempos para ver la evolución de las curvas (Figura 22). A tiempo cero se aprecia la banda a 360 nm, correspondiente con la banda π−π* a la misma longitud de onda en el espectro en disolución de CHCl3, y dos hombros en 344 y 380 nm, asociados a la presencia de agregados tipo H y tipo J, respectivamente. Figura 22: Espectros de UV-vis de una disolución de agregados irradiando con luz de 365 nm a distintos tiempos Como consecuencia de la isomerización trans →cis del azobenceno, el máximo de la banda π−π* se desplaza a longitudes de onda más cortas a la vez que disminuye su intensidad mientras que la banda n−π* aumenta en intensidad. A los 5 minutos se alcanza el estado estacionario. Tras mantener la disolución irradiada en oscuridad 24 horas se aprecia como se va recuperando el espectro inicial registrado para el isómero trans. Los cambios en la morfología tras irradiar y calentar fueron estudiados por TEM. Se investigaron tres muestras con estas características: Muestra irradiada durante 10 minutos. Muestra calentada por encima de la LCST29, a 60ºC, durante 1 hora y preparada en caliente. Muestra calentada por encima de la LCST, a 60ºC, durante 1 hora y enfriada lentamente hasta temperatura ambiente. 29Tomamos como valor de la LCST para el LDBC el valor que se obtuvo para el bloque lineal aislado, que fue de 42ºC 19 (a) Muestra irradiada (b) Muestra preparada en caliente (c) Muestra preparada en frío tras haber calentado Figura 23: Fotos de TEM tras estimular los agregados En las imágenes obtenidas (Figura 23) se puede apreciar como, efectivamente, hay cambios apreciables en la morfología en ambos casos. También se han realizado estudios de DLS para estudiar estos cambios morfológicos (Figura 24). En primer lugar se hizo un estudio comparando una disolución de agregados antes y después de haber irradiado durante 10 minutos, observándose cambios apreciables en la distribución de tamaños. En segundo lugar se estudió el comportamiento de los agregados en disolución con la temperatura. Para ello se realizaron medidas a 60ºC. En este caso, la medida obtenida en el equipo no era estable. Esto puede deberse a que al elevar la temperatura por encima de la LCST los dos bloques del LDBC son hidrófobos, lo que se traduce en que las vesículas dejan de ser estables en disolución y empiezan a formar agregados, dando lugar a una medida inestable. Se realizó un último estudio tras haber dejado enfriar y estabilizar la disolución de agregados, observándose un cambio en la distribución de tamaños respecto a la distribución inicial. (a) DLS tras irradiar (b) DLS tras calentar y enfriar Figura 24: Estudios de DLS tras irradiar 4.5. Estudio del encapsulado de moléculas y liberación mediante estímulos Las vesículas formadas, tal y como se ha comentado, tienen la capacidad de albergar moléculas tanto hidrófilas como hidrófobas, en la cavidad generada en el interior o en la membrana, respectiva20 mente. Así pues se ha llevado a cabo un estudio de encapsulado y liberación mediante estímulos de un compuesto hidrófobo, como es el rojo nilo, y otro hidrófilo, como es la rodamina B. Ya se comprobó que los agregados formados eran capaces de encapsular rojo nilo en el interior de su membrana (debido a la hidrofobicidad del entorno), y que esta propiedad nos permite determinar la CMC del compuesto (Sección 4.3). Así pues se trató de averiguar si eran capaces de liberar este compuesto mediante estímulos lumínicos y/o térmicos. Para ello, en primer lugar, se midió el espectro de fluorescencia antes y después de calentar una disolución de agregados con rojo nilo encapsulado por encima de la LCST durante 30 minutos (Figura 25). Se puede apreciar que el espectro no cambia lo que indica que el rojo nilo se mantiene en el entorno del polímero. Sin embargo el estudio de TEM indica que las vesículas se destruyen. Lo que previsiblemente sucede es que al calentar la disolución de agregados por encima de la LCST el LDBC se vuelve más hidrofóbo, con lo que las vesículas colapsan formado agregados macroscópicos y el rojo nilo se mantiene en este entorno, con lo que el espectro no cambia. Figura 25: Espectro de fluorescencia del rojo nilo encapsulado antes y después de calentar La liberación del rojo nilo mediante luz se determinó midiendo el espectro de fluorescencia del rojo nilo encapsulado tras irradiar con luz de 365 nm a distintos tiempos (Figura 26). Se observa que al irradiar se produce una disminución en la intensidad de fluorescencia del rojo nilo, lo que a priori indica que el compuesto es liberado como consecuencia de la fotoisomerización del azobenceno. Sin embargo también es posible que la disminución en la intensidad de fluorescencia se deba a que la isomerización trans →cis provoca un aumento de polaridad en la membrana haciéndola menos hidrófoba. Cuando se repitió la medida 24 h después de dejar de irradiar, se comprobó que la fluorescencia se recuperaba parcialmente. Esto probablemente indica que la liberación del rojo nilo sea parcial y ésta sea la razón de que pasadas 24 h se recupere parcialmente la intensidad de fluorescencia. Como compuesto hidrófilo se eligió la rodamina B. Para realizar este estudio se formaron las vesículas en presencia de rodamina B (ver Anexo 6.1.8). Se dializó en agua la disolución de agregados formada con el fin de eliminar tanto el THF como la rodamina B no encapsulada. 21 Figura 26: Espectro de fluorescencia del rojo nilo encapsulado, irradiando a distintos tiempos (a) Sin irradiar (b) Irradiada 1 minuto (c) Irradiada 2 minutos (d) Irradiada 5 minutos (e) 18h después de irradiar (f) 18h después de calentar Figura 27: Imágenes de microscopio confocal irradiando a distintos tipos La evolución en la liberación de la rodamina B fue seguida mediante microscopía confocal (Figura 27). En primer lugar se estudió una muestra sin estimular, comprobándose la existencia de rodamina encapsulada ya que se aprecian puntos iluminados. A continuación se irradió esa misma muestra a distintos tiempos, observándose como la intensidad de los puntos (señalados con círculos amarillos) disminuye, hasta casi desaparecer a los 5 minutos de irradiación, como consecuencia de la liberación de la rodamina. En último lugar se estudiaron dos muestras 18 horas después de haber sido irradiadas durante 15 minutos y calentadas a 60ºC durante 1 hora, respectivamente. Se comprobó como la intesidad de los agregados era mucho menor que en la muestra sin estimular, lo que siginifica que ambos estímulos son capaces de provocar cambios en los agregados que permiten la liberación de la rodamina B al medio. Se realizaron también imágenes en unas condiciones que nos permitieran ver si la rodamina era liberada al medio (Figura 28). Efectivamente se vio como aparece una intensidad de 22 fondo correspondiente a la rodamina B liberada, tanto al irradiar como al calentar. (a) Sin irradiar (b) 18 h después de haber irradiado (c) 18 h después de haber calentado Figura 28: Variación de la intensidad de fluorescencia del fondo al irradiar y al calentar 4.6. Síntesis de polímeros ramificados con termorrespuesta mediante reacciones de tiolinos La presencia de un grupo etinilo o alquino terminal en los polimetacrilatos sintetizados permite realizar otro tipo de química diferente a la CuAAC utilizada para la síntesis del LDBC. Así, se ha realizado un estudio preliminar sobre la síntesis de polímeros ramificados a partir de los polímeros con termorrespuesta sintetizados, mediante reacciones de tiolinos usando distintos ditioles e iniciadores, con el fin de estudiar la reacción y la posibilidad de obtener nuevas arquitecturas poliméricas. En este tipo de reacciones alquino-ditiol, dada la estequiometría se obtienen, a priori, cadenas poliméricas lineales. Puesto que el alquino está en el extremo de un polímero, en nuestro caso se obtendrá un polímero ramificado con una unidad repetitiva de la que cuelga el polimetacrilato. Este tipo de estructuras obtenidas por fotopolimerización de tiolinos no han sido prácticamente exploradas hasta la fecha. Dada la ya citada solubilidad de los polimetacrilatos de oligotilenglicol y dietilenglicol en agua se intentó la fotopolimerización en este medio usando Irgacure 2959® como fotoiniciador, debido a su ligera solubilidad en agua (ver Anexo 6.1.10). El polímero utilizado en esta prueba fue el (OEG-co-DEG)_3200 y el ditiol elegido el HS-DEG-SH (Figura 29). Figura 29: Síntesis de polímeros ramificados mediante reacción de tiolinos 23 El estudio de RMN reveló que la reacción no se produjo ya que la señal a 4.58 ppm correspondiente al metileno unido al alquino no desapareció (ver Anexo 6.9). Una posible explicación es la poca solubilidad del fotoiniciador Irgacure 2959® en agua, que si bien es moderada (1 mg/mL), no parece suficiente como para que la reacción avance. Con el objetivo de solventar este problema se llevó a cabo la misma fotopolimerización en THF aumentando el porcentaje en peso del fotoiniciador al 4%, frente al 0,1 % que se puede alcanzar en agua. Se realizó por duplicado, usando los polímeros (OEG-co-DEG)_3200 y(OEG-co-DEG)_12000. En esta ocasión sí que desapareció la señal de 4.58 ppm en ambos espectros, a la vez que apareció una nueva señal en la zona de 2.7 ppm, correspondiente al -CH2-Sformado (Figura 30). Se estudiaron los polímeros obtenidos por GPC (Figura 31). Pese a que por RMN se vio que la fotopolimerización tenía lugar, por GPC se ve que si bien la distribución de masas se ensancha en la zona de tiempos de elución más bajos (es decir, masas más altas) se conservan los picos de los polímeros iniciales. La conclusión es que la reacción se produce, puesto que por RMN hay cambios en las señales, pero probablemente el grado de polímerización alcanzado es muy bajo. Una explicación es que una vez ha reaccionado un grupo tiol con el alquino sea el otro tiol de la misma molécula puente el que ataque la otra posición del alquino, en lugar de que ataque otro tiol de otra molécula. Esto explicaría que la reacción se produzca según el espectro de RMN pero no haya un desplazamiento de masas en el GPC. Figura 30: Espectros de 1H-RMN superpuestos antes y después de fotopolimerizar el (OEG-co-DEG)_3200 en THF con Irgacure 2959® 24 (a) (OEG-co-DEG)_3200 (b) (OEG-co-DEG)_12000 Figura 31: GPC de las fotopolimerizaciones realizadas en THF con Irgacure2959® Se trató de mejorar la fotopolimerización usando como fotoiniciador el Irgacure 651®. Éste presenta una mayor absorción a la longitud de onda que emite la lámpara UV, 365 nm. Con este fotoiniciador se realizaron dos pruebas usando un polímero de masa 17000 (OEG-co-DEG)_17000) y dos ditioles distintos, representados en la Figura 32, para estudiar su posible influencia. (a) HS-PEG1500-SH (b) HS-Ar-SH Figura 32: Ditioles empleados en las fotopolimerizaciones con Irgacure 651® De nuevo, los espctros de RMN indican que la reacción ha tenido lugar. Los estudios de GPC indican que con el ditiol HS-PEG1500-SH el pico de distribución de pesos moleculares no se desplaza en el cromatograma pero en la fotopolimerización con el ditiol aromático (HS-Ar-SH) sí que hubo un cambio claro en la distribución de masas (Figura 33). Figura 33: GPC de las fotopolimerizaciones realizadas con Irgacure 651® Es posible que en efecto cuando se trabaja con tioles flexibles haya tendencia a ciclar y por tanto no se extiende la cadena. Al llevar a cabo la reacción con un ditiol más rígido como el HS-Ar-SH se 25 evita esta reacción intramolecular, lo que hace que la distribución de tamaños, ahora sí, se desplace a tiempos de elución más bajos (masas mayores). No obstante, otra posible explicación es que se formen oligómeros y que en el caso de estos ditioles flexibles su volumen hidrodinámico no varíe respecto al polímero de partida lo que justificaría que no haya un cambio en las curvas de GPC a pesar de observar polimerización. Como se ha comentado estos resultados son preliminares pero muestra la potencialidad de usar la fotopolimerización de tiolinos para obtener nuevos polímeros con una estructura ramificada compleja. 26 5. Conclusiones La combinación de la técnica de polimerización radicalaria controlada ATRP y de la química click ha demostrado ser de especial utilidad para la síntesis de nuevas arquitecturas poliméricas de estructura perfectamente controlada. Se ha preparado un LDBC cuyo bloques son capaces de responder a dos estímulos, la luz y la temperatura. El LDBC sintetizado es capaz de formar vesículas en agua tal y como se observó en TEM y DLS. Estos agregados presentan respuesta a la luz y la temperatura. Estos estímulos desencadenan cambios estructurales en los agregados, tal y como se observó en TEM y DLS. Los agregados preparados son capaces de encapsular compuestos hidrófobicos e hidrófilos, como son el rojo nilo y la rodamina B, respectivamente. Son, a su vez, capaces de liberarlos aprovechando los cambios morfológicos producidos por la luz y la temperatura, excepto en el caso del rojo nilo, que no pudo ser liberado mediante temperatura. La reacción de tiolinos muestra ser una reacción prometedora para la síntesis de polímeros ramificados con termorrespuesta. 27 6.6. Espectro de 1H-NMR de [(OEG-co-DEG)_3200]-b-d(isoAZO/C18) 6.7. TGA del [(OEG-co-DEG)_3200]-b-d(isoAZO/C18) VII 6.8. DSC del [(OEG-co-DEG)_3200]-b-d(isoAZO/C18) 6.9. Espectro de 1H-NMR del (OEG-co-DEG)_12000 fotopolimerizado en agua VIII