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Trabajo Fin de Grado MUTACIONES EN EL GEN DE APOA5 EN SUJETOS CON HIPERTRIGLICERIDEMIA GRAVE ESTUDIO DE LA PREVALENCIA EN UNA ZONA SANITARIA DE ARAGÓN Autor Mª Victoria Méndiz Manero Directores Dra. Isabel de Castro-Orós Dr. Fernando Civeira Murillo Grado en Biotecnología Universidad de Zaragoza 2014 2 Departamento de Bioquímica. Universidad de Zaragoza Laboratorio de Biología Molecular. Hospital Universitario Miguel Servet 3 ÍNDICE Resumen. Abstract 4 Abreviaturas 5 Introducción 6 1. Metabolismo de lípidos 6 1.1. Metabolismo de lipoproteínas 6 1.1.1. Metabolismo de los quilomicrones 7 1.1.2. Metabolismo de las VLDL 8 1.1.3. Metabolismo de las LDL 9 1.1.4. Metabolismo de las HDL 9 1.2.Metabolismo de los triglicéridos 10 2. Dislipemias 11 2.1 Hipertrigliceridemia 11 2.2. Fenotipos de las hipertrigliceridemias 11 3. Variantes genéticas asociadas a la HTG 13 3.1 Apolipoproteína AV e hipertrigliceridemia 13 Hipótesis y objetivos 14 Materiales y métodos 15 1. Descripción de la muestra 15 2.Obtención de la muestra 15 3.Obtención del DNA genómico 15 4.Análisis y concentración de la muestra 15 5.Amplificación por PCR de los genes de estudio 16 6.Purificación del producto de PCR 17 7.Reacción de secuenciación 18 8.Precipitación alcohólica 18 9.Análisis estadístico 19 10.Análisis bioinformático 19 Resultados 20 1.Características de la población de estudio 20 2.Identificación de las variantes del gen de APOA5 21 Discusión 25 Conclusiones. Conclusions 26 Bibliografía 27 4 RESUMEN Las hipertrigliceridemias (HTG) son una dislipemia común que se ha asociado con el desarrollo de enfermedad cardiovascular. La HTG grave, definida con triglicéridos > 500 mg/dl, suele estar causada por mutaciones en genes del catabolismo de los triglicéridos y se asocia con predisposición a pancreatitis aguda. Mutaciones en APOA5 que causan baja concentración de Apo AV se asocian con la HTG grave. El objetivo de este estudio fue identificar las variantes génicas, comunes y no comunes en el gen candidato APOA5 en sujetos con HTG grave de causa primaria y analizar su asociación con la enfermedad. Para llevar a cabo este trabajo, se seleccionaron 66 pacientes procedentes de Centro de Salud de la Almozara de Zaragoza en los que se extrajo el DNA y se amplificaron mediante PCR y se secuenciaron el promotor, exones y nexos de unión exón-intrón del gen APOA5. Las frecuencias de las variantes encontradas se compararon con la población europea analizada en el proyecto 1000 Genomas y se analizaron con herramientas bioinformáticas para predecir su efecto. El 4,55% de los pacientes resultaron portadores de 2 variantes raras: p.Gln97*, previamente descrita como causal de HTG y p.Leu173Pro, identificada por primera vez en este trabajo. El análisis bioinformático de la mutación p.Leu173Pro mostró controversia. Además, las variantes comunes c.-3A>G, p.Ser19Trp, p.Iso44Iso y c.162-43A>G presentaron una frecuencia significativamente superior en los sujetos con HTG frente a la población de los 1000 Genomas. A partir de este trabajo podemos concluir que variantes comunes y no comunes en el gen APOA5 pueden estar implicadas en la patogenicidad de la HTG grave. ABSTRACT Hypertriglyceridemia (HTG) syndromes are common dyslipidaemias associated with the development of cardiovascular disease. Severe HTG, has been defined as triglyceride levels > 500 mg/dl, and is usually caused by mutations in genes involved in triglyceride catabolism; and associated with acute pancreatitis. The objective of this study was to identify common and uncommon genetic variants in APOA5 in subjects affected of severe HTG with a primary cause, and also to analyse its association with this disease. To perform this study, 66 patients from the Centro de Salud de la Almozara in Zaragoza were selected. DNA was extracted and APOA5 promoter, exons, and exonintron boundaries were amplified by PCR and sequenced. Frequencies of the identified variants were compared with European population from the 1000 Genomes Study, and were analysed with bioinformatical tools in order to predict its effect. The 4,5% of the patients were carriers of 2 rare variants: p.Gln97*, previously described as HTG cause, and p.Leu173Pro, identified by the first time in this work.The p.Leu173Pro bioinformatical analysis showed controversial data. Besides, common variants: c.- 3A>G, p.Ser19Trp, p.Iso44Iso and c.162-43A>G showed a significant higher frequency in HTG subjects compared to 1000 Genomes. As a consequence of this work, we can conclude that common and uncommon variants in APOA5 gene may be involved in the pathogenicity of severe HTG. 5 ABREVIATURAS 2MG: 2 monoacilglicerol AG: Ácidos Grasos Apo: Apoliproteína APOA5: Gen de la apolipoproteína A-V CL: Colesterol libre dNTP´s: Desoxirribonucleótidos trifosfato DGAT: Enzima acil-CoA diacilglicerol aciltransferasa ECP: Enfermedad Coronaria Prematura ECV: Enfermedad cardiovascular FL: Fosfolípidos GPIHBP1: glucosil-fosfatidil-inositol anclado a la lipoproteína de alta densidad unida a una proteína 1 HDL: Lipoproteína de elevada densidad HFC: hiperlipemia familiar combinada HMG-CoA: hidroxi-metil-glutaril Coenzima A IDL: Lipoproteína de densidad intermedia IMC: Índice de Masa Corporal Kb: Kilobases LH: Lipasa hepática LDL: Lipoproteína de baja densidad LMF1: Factor de maduración de la lipasa 1 LPL: Lipoproteína lipasa MTP: proteína microsomal Triglyceride Transfer Protein NA: No analizado PCR: reacción en cadena de la polimerasa PDI: proteína disulfito isomerasa QM: Quilomicrón QMr: Quilomicrón remanente RE: Retículo Endoplasmático SNP: polimorfismo de un solo nucleótido TE: tampón TRIS-EDTA TG: triglicéridos VLDL: lipoproteína de muy baja densidad 6 INTRODUCCIÓN En la actualidad, las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en los países desarrollados y se considera que seguirá siendo en el futuro. La Organización Mundial de la Salud (OMS) registró que en el año 2008 murieron por esta causa 17,3 millones de personas, representando un 30% de todas las muertes registradas en el mundo. Una de las principales causas de las enfermedades cardiovasculares es la alteración del metabolismo lipídico, produciendo acumulación de lípidos a nivel arterial y la formación de placa de ateroma, causantes de cardiopatía isquémica y otros accidentes cardiovasculares El metabolismo lipídico está finamente regulado entre las fuentes de aporte y las vías de eliminación. La alteración de cualquiera de los mecanismos que mantienen la homeostasis produce una alteración en las concentraciones de los lípidos provocando una dislipemia1. 1. METABOLISMO DE LÍPIDOS Los lípidos son un amplio y heterogéneo grupo de moléculas biológicas que se caracterizan por su apolaridad. Las largas cadenas de hidrocarburos que los componen les confieren esta propiedad, que les hace insolubles en agua. Clínicamente los lípidos más importantes en plasma son los triglicéridos (TG) y el colesterol2. Los TG son una llave energética formada por tres ácidos grasos unidos a un glicerol. Son sintetizados en el intestino y en células hepáticas y transportados hacia el plasma, Posteriormente, se produce la lipolisis en la superficie endotelial liberando los ácidos grasos en las células periféricas para su β-oxidación o su almacenaje2. El colesterol es una molécula grande, que presenta cuatro ciclos condensados y radicales, y tiene numerosas funciones. Es componente de las membranas celulares, precursor de hormonas esteroideas y de la vitamina D, y es necesario para la activación neuronal, como señal molécula3. El 80% del colesterol es derivado de la síntesis endógena por la enzima HMG-CoA Reductasa y, sólo un pequeño porcentaje proviene de la dieta4. 1.1 Metabolismo de las lipoproteínas La insolubilidad del colesterol y los TG requiere que sean transportados por lipoproteínas, complejos proteicos formadas por un núcleo de lípidos apolares (colesterol esterificado y TG) cubiertos por una capa polar de apolipoproteínas (Apo), fosfolípidos y colesterol libre (CL)4. 7 Las lipoproteínas se dividen en 5 grandes clases en función de sus propiedades fisicoquímicas: quilomicrones (QM), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL)5. Los TG son transportados principalmente por los QM y las VLDL, mientras que las LDL y HDL hacen lo propio con el colesterol. 1.1.1. Metabolismo de los quilomicrones Los QM son las lipoproteínas más ricas en TG, con un contenido superior al 85%, y tan solo un 2% de proteína. Además, contienen las apolipoproteínas: Apo B-48, Apo C-III, Apo C-II y Apo A-V.4 Los TG derivados de la dieta son hidrolizados en el intestino por medio de la lipasa pancreática en 2-monoacilglicerol (2-MG) y ácidos grasos (AG)6, que pueden ser absorbidos por los enterocitos (Fig. 1) donde son resistentizados en TG por la acil-CoA diacilglicerolaciltransferasa (DGAT)7. La proteína Microsomal Triglyceride Transfer Protein (MTP), junto con la proteína disulfito isomerasa (PDI), facilita la lipidación de la Apo B-48, en el primer paso para la formación del QM6. A continuación, se transportan al aparato de Golgi para ser exocitados al sistema linfático, y entran al torrente circulatorio por la vena cava, donde, los QM se enriquecen en Apo E, Apo C-II y Apo C-I mediante el intercambio con las HDL formándose el QM maduro. Fig. 1: Síntesis de quilomicrones Los TG de la dieta son hidrolizados en el intestino en 2-monoacilglicerol (2-MG) y ácidos grasos (AG). En el interior del enterocito, el 2-MG y AG son resistentizados en TG. Posteriormente la proteína MTP, facilita la lipidación de la Apo B-48, Los QM nacientes son exocitados hacia el torrente circulatorio. Tomada de Hassing HC, Surendran RP. “Pathophysiology of hypertriglyceridemia”.BiochimicaetByophysica Acta.2011 Cuando el QM maduro llega a los tejidos, es sustrato de la lipoprotein lipasa (LpL), enzima glicoproteica anclada por medio de los glicosaminoclicanos a la superficie endotelial8. La LpL hidroliza los triglicéridos a 2-MG y AGL que son capturados por los tejidos adiposo y muscular. 8 El QM, tras perder los TG, mediante intercambio con las HDL, disminuye su contenido en Apo C-II y se enriquece en Apo C-III, dando lugar a los QM remanentes (QMr) que viajarán al hígado, donde serán metabolizados por la lipasa hepática (LH)9. Finalmente los QMr ricos en Apo E, son reconocidos por el receptor de las LDL (rLDL) y por el LRP1 (proteína relacionada con el receptor LDL 1) e internalizados en las células hepáticas mediante endocitosis10. 1.1.2 Metabolismo de las VLDL Las VLDL son lipoproteínas de origen hepático que participan en el transporte de las grasas endógenas. Son ricas en TG suponiendo el 55% de la masa total frente al 10-15% de colesterol. Los TG son sintetizados en el hígado y empaquetados en partículas de VLDL con Apo B-100 como proteína principal y pequeñas cantidades de Apo E y Apo C (Fig. 2). Cuando las VLDL llegan al plasma, son retenidas por los proteoglicanos heparin sulfato y sus TG son hidrolizados por la acción de LpL liberando AGL y glicerol. Las VLDL intercambian Apos con las HDL de manera similar a lo que sucede en los QM. Finalmente, la partícula queda libre y convertida en VLDL remanente (VLDLr), conocida como IDL. Esta partícula puede ser captada de nuevo por el hepatocito mediante LDLr o ser metabolizada a LDL por la LH11. El papel de Apo A-V en la facilitación de la producción de VLDLr no está determinado. Recientemente se ha demostrado que niveles altos de Apo A-V, localizado en gotas lipídicas en el hígado, coinciden con altos niveles de TG almacenados, sugiriendo un papel de Apo A-V en la movilización de TG en la producción de VLDL11. Fig. 2: Síntesis de VLDL Los TG resintetizados en el hígado se movilizan gracias al complejo que componen las VLDL. Tomada de Hassing HC, Surendran RP. “Pathophysiology of hypertriglyceridemia”.BiochimicaetByophysica Acta.2011 9 1.1.3 Metabolismo de las LDL Las, lipoproteínas de baja densidad (LDL) contienen el 60-70% del colesterol total plasmático, por tanto, son las principales transportadoras de colesterol. Su eliminación del plasma es dependiente del receptor de LDL que reconoce Apo B-1004. 1.1.4 Metabolismo de las HDL Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) están compuestas, aproximadamente, por un 50% de lípidos y un 50% de proteínas .Contienen el 20-30% del colesterol y su función principal es el transporte del colesterol desde los tejidos periféricos hasta el hígado para su catabolismo. Sus principales proteínas son Apo A-I, Apo AII, Apo A-IV, Apo C y Apo E, siendo el componente esencial la Apo A-I, que se coloca a modo de cinturón junto con fosfolípidos, rodeando el colesterol4. Las HDL nacientes van adquiriendo lípidos a través del flujo del colesterol y de la lipolisis de las lipoproteínas ricas en TG. Estas HDL nacientes se encuentran en muy baja concentración en el plasma, tan solo un 5%, ya que rápidamente se transforman a maduras12. El riñón, el hígado y los tejidos esteroidogénicos son los principales sitios implicados en el catabolismo de las HDL. La eliminación de las HDL puede llevarse a cabo bien por captación selectiva de colesterol u otros lípidos de la partícula, o bien por endocitosis y degradación de toda la partícula. Fig. 3 Recreación de HDL (derecha) y LDL (izquierda). Recreación virtual de las moléculas que transportan colesterol, siendo HDL (derecha) y LDL (izquierda). Tomada de SPL (age fotostock) 16 La preparación de TE 0.1X se realizó a partir de 1,211 gramos de Trizma® Base (Casa Comercial) y 0,336 gramos de EDTA-Na2, en 900 ml de agua, ajustándose el pH a 8 por la adicción de ácido clorhídrico. Se conservó a 4ºC y tras una dilución 1:10 a -20ºC. 5. Amplificación por PCR de los genes de estudio La secuencia de Apo A5 se encuentra en la base de datos Ensembl. Utilizando como referencia la secuencia ENSG00000110243 (www.ensembl.org) del gen APOA5 se amplificaron el promotor, los 4 exones y las uniones exón-intrón mediante PCR. Debido a su gran tamaño, el exón 4 se dividió en dos fragmentos de amplificación: 4.1 y 4.2. Los exones 2 y 3 se amplificaron en único fragmento. En cada reacción de amplificación se mezcló la enzima Biotaq DNA polimerasa (Bioline), el tampón 10x (20mM Tris-HCl, pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1mM EDTA, 2mM DTT, 50% glicerol), el MgCl2, los dNTPs (Life Technologies), los cebadores correspondientes, el DNA de interés y el agua destilada estéril hasta alcanzar un volumen final de 20 µl. Las cantidades y concentraciones se muestran en la tabla 2. Tabla 2: Cantidades de los reactivos utilizados para la amplificación de APOAV Las amplificaciones se realizaron en un termociclador GeneAmp® 9700 (AppliedBiosystem). Los programas térmicos utilizados fueron diferentes para cada uno de los exones de acuerdo a las características de los cebadores y el producto de la PCR (Tabla 3). También los diferentes primers diseñados para la amplificación (Tabla 4). 17 Tabla 3: Programas para el termociclador de los exones de APOAV Tabla 4: Cebadores para la amplificación del gen APOA5. El resultado de las diferentes amplificaciones se comprobó mediante electroforesis de 96V durante 15 minutos en un gel de agarosa al 2% en TAE 1x teñido con SYBR® Safe (Lifetechnologies). 6. Purificación del producto de PCR mediante ExoSAP-IT® (USB) Para purificar el producto de amplificación se utilizó el producto comercial ExoSAP-IT ® (USB) que contiene las enzimas exonucleasa I y fosfatasa alcalina de camarón (SAP), que elimina los cebadores y nucleótidos residuales. La enzima exonucleasa I degrada los cebadores residuales y cualquier DNA de cadena única, mientras que la SAP hidroliza los dNTPs remanentes de la mezcla de la PCR. 18 Se preparó una dilución 1:10 de ExoSAP-IT® (USB) en agua destilada estéril de la que se añadieron 2 μl a 5 μl del producto de PCR. En un termociclador GeneAmp® 9700 (Applied Biosystem) se realizó una incubación a 37 °C durante 45 min seguida de 15 min a 80 °C con el objeto de inactivar al enzima. Las muestras purificadas se conservaron a -20 °C para su posterior utilización. 7. Reacción de secuenciación Los fragmentos amplificados y purificados se secuenciaron meiante electroforesis capilar. Para su preparación utilizamos el producto comercial BigDye® Terminator v3.1 CycleSequencing Kit (AppliedBiosystems), que contiene un vial de BigDye v3.1 ReactionMix que contiene una DNA polimerasa termoestable y dNTPs marcados con fluorocromos y un vial con el tampón de secuenciación BigDye v3.1 5X que aporta las condiciones idóneas para la reacción enzimática. Todo el proceso se llevó a cabo en frío y protegiendo el reactivo BigDye de la luz. Las reacciones se prepararon en un volumen final de 10 µl, y con el siguiente programa para el termociclador, según indica la tabla 5. Tabla 5. Reactivos y concentraciones de la reacción de secuenciación. 8. Precipitación alcohólica El resultado de las reacciones de secuenciación se purificó por precipitación alcohólica con el fin de eliminar los terminadores sobrantes. En primer lugar añadimos 4 μl de EDTA 62,5 mM a los 10μl de la reacción de secuenciación. Preparamos una mezcla con: 2,6 μl de NaAc 3 M pH 5,2 con, 7,8 μl de agua destilada y 67,71 μl de etanol al 96% (v/v) de la que se añadieron 60 μl a la muestra. Seguidamente se centrifugó a 2.090 xg, 1 minuto a 4ºC en una centrífuga 3-16K (Sigma). Seguidamente, la muestra se incubó a temperatura ambiente y protegida de la luz, durante 15 minutos. A continuación, se centrifugó durante 30 minutos a 2.090 xg a 4 °C. Para eliminar el sobrenadante se realizó una centrifugación con las muestras invertidas durante 1 min a 180 xg, también a 4ºC. 19 A continuación, se añadieron 70 μl de etanol al 70% y se centrifugaron las muestras durante 15 min a 4 °C a 2.090 xg. De nuevo se eliminó el sobrenadante centrifugando de forma invertida las muestras durante 1 min a 180 xg a 4ºC. Finalmente, el pellet obtenido se guardó congelado a -20 °C para su posterior utilización. Previamente a realizar la electroforesis capilar, se resuspendió el pellet en 20 µl de formamida (LifeTechonologies) y para la desnaturalización de las muestras se realizó una incubación en un termociclador GenAmp® 9700 (AppliedBiosystems) de 2 min a 94 °C. La electroforesis capilar se llevó a cabo en el secuenciador automático ABI 3500XL (AppliedBiosystems) en el Servicio de Secuenciación y Genómica Funcional del IIS Aragón. El alineamiento y la lectura de las secuencias resultantes se llevó a cabo mediante el programa informático Variant Reporter™ (AppliedBiosystems). 9. Análisis estadístico El análisis estadístico se llevó a cabo con el programa informático SPSS 15.0 (SPSS Inc.) tomando como nivel significativo estadístico valores de p menor a 0,05 (p<0,05). Para comprobar si una variable seguía la distribución normal se realizó un análisis de Kolmogorov-Smirnov. Los rasgos cuantitativos que siguieron una distribución normal se expresaron como media ± desviación estándar y se analizaron con la prueba T-Student, mientras que aquellas variables que no siguieron una distribución normal se expresaron como mediana y rango intercuartílico y se analizaron con el test U de Mann-Whitney. Las variables cualitativas, incluyendo la comparación de frecuencias alélicas y genotípicas, se expresaron en porcentaje y se analizaron mediante Chi-cuadrado. También se estudió si la población estaba en equilibrio Hardy Weinberg. Se realizó la comparación de las frecuencias alélicas de estas variantes comunes o polimorfismos en nuestra población de estudio frente a la población Europea del estudio de los 1000 Genomas (www.1000Genomes.org). 10. Análisis bioinformático Para evaluar la patogenicidad de las variantes génicas identificadas, se usaron los siguientes programas informáticos y bases de datos, cuando el cambio era no sinónimo: PolyPhen-229, SIFT30 y MutationTaster31. Polyphen-2 clasifica las variantes en benignas, posiblemente dañinas y probablemente dañinas, según si la secuencia estaba conservada y según la estructura de la proteína. SIFT cataloga las variantes en función de la homología de secuencia, como tolerante o intolerante. MutationTaster, se utilizó también para variantes que incluían codones de parada y alteraciones intrónicas o complejas, clasificándolas como posiblemente causales de la enfermedad o posiblemente polimorfismos. 20 RESULTADOS 1. Características de la población de estudio El grupo de individuos seleccionados estuvo finalmente compuesto por 66 sujetos: 51 varones y 15 mujeres. En la tabla 6 se muestran las características clínicas y bioquímicas de los sujetos. Como consecuencia de los criterios de inclusión, todos los sujetos presentaron una hipertrigliceridemia grave con una mediana de 655,5 mg/dl, en el estudio. Para conocer si las variables se ajustaban a una distribución normal o binomial, aplicamos el test de Kolmogorov-Smirnov a las variables. Tabla 6: Características de la población de estudio. Las variables cuantitativas se expresan como Media ± Desviación estándar, excepto para las variables que no siguen la distribución normal (mediana, rango intercuartiles). Las variables cualitativas se expresan como %. IMC: Índice de masa corporal; CT: colesterol total, TG: triglicéridos, cHDL: colesterol HDL, cLDL: colesterol LDL,TSH: hormona tiroidea, HbA1c: hemoglobina glicosilada, CVD: enfermedad cardiovascular, HTA: hipertensión arterial. 21 2. Identificación de las variantes del gen APOA5 Para la identificación de las variantes comunes y la detección de mutaciones nuevas y previamente descritas en el gen APOA5 asociadas con HTG, se realizó la secuenciación automática del promotor, los exones y los nexos de unión-intrón del gen APOA5, tal y como se describe en el apartado 7 del capítulo Materiales y Métodos. El análisis de las frecuencias genotípicas (tabla 7) mostró que todos los polimorfismos a excepción de las variantes c.-3A>G; c.162-43 A>G; c.*158 C>T se encontraban en equilibrio de Hardy-Weinberg (tabla 7), siendo su frecuencia la esperada en la población general. La comparación de las frecuencias genotípicas entre la población hipertrigliceridémica estudiada y los 1000 Genomas se llevó a cabo mediante la prueba Chi-cuadrado. Observamos que todas las variantes en las que se pudo calcular el p-valor excepto c.*31C>T mostraron una distribución de genotipos diferente a la esperada. Se observó un incremento de los genotipos portadores del alelo menor en detrimento de los homocigotos para el alelo mayor. Se realizó la comparación (tabla 8) de las frecuencias alélicas de estas variantes comunes o polimorfismos en nuestra población de estudio frente a la población Europea del estudio de los 1000 Genomas (www.1000Genomes.org). Los SNPs c.-3A>G, p.Ser19Trp, p.Iso44Iso y c.162-43A>G mostraron una frecuencia significativamente mayor en los sujetos con HTG (p <0.05). Finalmente realizamos el análisis informático de las variantes encontradas. Todas las variantes que supusieron un cambio no sinónimo fueron analizadas con los programas informáticos PolyPhen-229, SIFT30 y MutationTaster31, las variantes que se encontraban en promotores o dieron lugar a un codón de parada sólo pudieron ser analizadas por MutationTaster. El resultado de este análisis bioinformático se muestra en la tabla 9. 22 Tabla 7: Frecuencias genotípicas de los SNPs identificados en el gen APOA5 en la población con HTG y los 1000 Genomas de la población europea. N: número individuos; p: grado de significación estadística según la prueba Chicuadrado 23 Tabla 8: Frecuencias alélicas de los SNPs identificados en el gen APOA5 en la población con HTG y los 1000 Genomas de la población europea. p: grado de significación estadística según la prueba Chicuadrado Tabla 9: Análisis bioinformático de las variantes encontradas en el gen APOA5 PolyPhen-2 establece un rango de 0 a 1. Las variantes se consideran PrD (Probablemente dañinas), PoD (Posiblemente dañinas) o B (Benignas). La puntuación que establece SIFT va de 0 a 1. Una sustitución de aminoácido se predice como dañino cuando la puntación es ≤ 0.05 y tolerante si la puntación es > 0.05. Mutation Taster analiza la probabilidad de que una variante sea causante de enfermedad o polimorfismo. NA: no analizado. 24 El análisis mediante PolyPhen-2 y SIFT mostró que el SNP p.Ser19Trp, clásicamente asociado con HTG, es potencialmente dañino y por tanto probablemente causal para la enfermedad, tal y como también resultó del análisis con Mutation Taster. También cabe destacar la variante p.Gln97*, que genera un codón de parada, dando lugar a una proteína truncada y una variante no descubierta previamente p.Leu173Pro, cuyo análisis bioinformático predijo su patogenicidad según PolyPhen-2 pero no según Mutation Taster, dando lugar a una controversia. El resto de variantes no pudieron ser analizadas por PolyPhen-2 y SIFT o resultaron benignas en el análisis de Mutation Taster. 25 DISCUSIÓN En este trabajo hemos analizado mediante secuenciación el promotor, exones y nexos de unión exón-intrón del gen APOA5 en 66 sujetos con HTG primaria. El 4,55% de los pacientes resultaron portadores de 2 variantes raras (p.Gln97* y p.Leu173Pro). Dos de los pacientes del estudio resultaron heterocigotos para la mutación p.Gln97*, que produce una proteína aberrante, y había sido descrita con anterioridad como causal de HTG por Priore et al32. La variante p.Leu173Pro, descrita por primera vez este trabajo, se encontró en un paciente en heterocigosis. Su análisis bioinformático la predijo como una variante patogénica según PolyPhen-2 y como un polimorfismo por Mutation Taster, por tanto, la podemos considerar como una variante controvertida que requiere un análisis más profundo. Mutaciones que provocan un codón de parada en los aminoácidos 131 y 148 se ha observado que no se unen a las lipoproteínas circulantes33, 34, por tanto puede ser que un cambio de aminoácido en esta posición (p.Val153Met) produzca un cambio de conformación en la proteína suficientemente grave como para dar lugar a hipertrigliceridemia. Además, hemos identificado variantes comunes o polimorfismos que se asocian con la HTG ya que se encuentran en una frecuencia alélica diferente de la que se observa en población general, según la base de datos europea de los 1000 Genomas: c.-3A>G, p.Ser19Trp, p.Iso44Iso y c.162-43 A>G. El SNP p.Ser19Trp se ha asociado en trabajos previos con la HTG grave35.Los pacientes de este estudio presentaron una concentración mediana de TG de 665,5 mg/dl, lo que explica la menor frecuencia de defectos raros en nuestro estudio comparadas con el trabajo publicado por Surendran et al36, que encontró 46 mutaciones en 86 pacientes seleccionados por sufrir hiperquilomicronemia y por tanto, con niveles más altos de TG. Nuestros resultados confirman que la HTG primaria es altamente heterogénea en su etiología y se asocia con la acumulación de variantes comunes y raras en APOA5. En conclusión, nuestros resultados sugieren que la HTG primaria del adulto con TG alrededor de 500-1000 mg/dl presenta mayor cantidad de variantes genéticas respecto a la población general, con una combinación de mutaciones de efecto entre moderado y agresivo, y polimorfismos clásicamente asociados con la enfermedad.