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TOXICOGENÓMICA DE LAS ENFERMEDADES MITOCONDRIALES Grado en Biotecnología Trabajo Fin de Grado Departamento de Bioquímica Facultad de Veterinaria Luis Díez Espallargas 1 La Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber (LHON) es una enfermedad que cursa con ceguera crónica y que está causada por mutaciones en el genoma mitocondrial. Se caracteriza por tener una baja penetrancia, de manera que ser portador de mutaciones patológicas como m.3460G>A, en estudio en este trabajo, no es determinante para padecer la enfermedad. Haciendo uso del modelo de cíbridos, y mediante el uso de técnicas de cultivo celular, bioquímicas, genético – moleculares y a nivel proteico se pretende demostrar que existen factores genético – nucleares y ambientales que podrían afectar al lugar de unión del coenzima Q10 en el Complejo Respiratorio I, alterando la capacidad OXPHOS y aumentando la penetrancia y el riesgo a manifestar el fenotipo patológico. La caracterización de dicho lugar de unión permite conocer hasta qué punto los genes nucleares y mitocondriales implicados en su conformación pueden afectar la función mitocondrial. En este sentido, se ha estudiado a fondo el gen nuclear NDUFS7 sin encontrar diferencias apreciables en los modelos utilizados, a falta de caracterizar por completo las proteínas que interaccionan con el coenzima Q10. Por otra parte, los xenobióticos podrían afectar directamente esta interacción interrumpiendo la función OXPHOS. Se demuestra que es así en la caso de la rolliniastatina1, pues la capacidad respiratoria se ve muy disminuida en los modelos mutantes; y la capacidad energética es afectada en valores muy significativos. Este trabajo confirma que la penetrancia de mutaciones patológicas en el genoma mitocondrial se ve afectada por la exposición a factores ambientales. 2 Leber Hereditary Optic Neuropathy (LHON) is a disease that causes chronic blindness and is caused by mutations in the mitochondrial genome. It is characterized by low penetrance, so to have pathological mutations as m.3460G> A, the one studied in this work, is not decisive for the disease. Using the model of cybrids, and through cell culture, biochemical, genetic and protein – based techniques we want to demonstrate that there are nuclear – genetic and environmental factors that could affect the binding site of coenzyme Q10 in Respiratory Complex I, altering the OXPHOS capacity and increasing the penetrance and risk to manifest the disease phenotype. Characterization of the binding site allows us to know how nuclear and mitochondrial genes involved in its conformation may affect mitochondrial function. In this sense, it has been thoroughly studied the nuclear gene NDUFS7, with no significant differences in the models used, in the absence of fully characterization proteins that interact with the coenzyme Q10. Furthermore, xenobiotics could directly affect this interaction interrupting the OXPHOS function. We prove that it is true in the case of rolliniastatina-1, which greatly reduces the respiratory capacity in the mutant models; and energetic capacity is affected in very significant values. This work confirms that the penetrance of disease mutations in the mitochondrial genome is affected by exposure to environmental factors. 3 5 7 7 1. Líneas celulares 8 2. Medios de cultivo 8 3. Reactivos generales 8 4. Instrumentación 8 5. Kits comerciales empleados 9 1. Condiciones de cultivo celular 9 2. Procedimientos de cultivo celular 9 3. Test de contaminación con micoplasmas 10 4. Extracción de DNA a partir de células 10 5. Extracción de RNA a partir de células 11 6. Cuantificación de ácidos nucleicos 11 7. Calidad del RNA extraído 11 8. Obtención de cDNA desde el RNA extraído 11 9. Purificación del cDNA amplificado 11 10. Reacción de PCR de genes nucleares que codifican proteínas del sitio de unión del coenzima Q10 en el Complejo Respiratorio I 12 11. Obtención de enriquecido de mitocondrias de línea celular 12 12. Electroforesis no desnaturalizante de proteínas mitocondriales 13 13. Electrotransferencia a membrana 13 14. Western Blot de Complejos Respiratorios I y II 13 15. Ensayo in gel de actividad de Complejos Respiratorios I y II 14 16. Consumo de oxígeno en células intactas 14 17. Ensayo de potencial de membrana por microscopía de fluorescencia 15 18. Ensayo de especies reactivas de oxígeno por microscopía de fluorescencia 15 19. Determinación de potencial de membrana y especies reactivas de oxígeno por citometría de flujo 15 20. Ensayo de ATP 16 21. Análisis estadísticos 17 4 1. Pruebas de cultivo celular 18 a. Contaminación con micoplasmas 2. Estudio de genes nucleares que conforman el lugar de unión del coenzima Q10 en el Complejo Respiratorio I 18 a. Análisis de las secuencias obtenidas 3. Estudio de ensamblaje del Complejo Respiratorio I 20 a. Western Blot b. Actividades de los Complejos Respiratorios I y II in gel 4. Determinación de concentraciones inhibitorias de xenobiótico para cada línea celular a partir del consumo de oxígeno en células intactas 22 5. Estudio de parámetros celulares por microscopía de fluorescencia 23 6. Estudio de parámetros celulares por citometría de flujo 26 a. Potencial de membrana b. ROS 7. Determinación de niveles de ATP 28 29 31 32 5 La Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber (LHON) es una enfermedad que se caracteriza por una pérdida de visión bilateral e indolora, generalmente en la edad adulta temprana (de 15 a 30 años de edad), debido a la degeneración de las células ganglionares retinales. Suele comenzar de forma aguda en uno de los dos ojos y alrededor de dos meses después el otro. Los discos ópticos se atrofian tras la fase aguda y mediante pruebas de agudeza visual se puede diagnosticar un escotoma central (zona de ceguera parcial). La visión puede recuperarse parcialmente en algunos casos (20-40% de los enfermos) pero la mayoría de personas que la padecen permanecen ciegas y sufren un serio impacto en su calidad de vida. La mayoría de pacientes son jóvenes que pueden llegar a desarrollar trastornos de ansiedad o depresivos por el shock que supone una pérdida de visión casi total, a lo que hay que sumar la dificultad y tardanza en el diagnóstico, la incertidumbre relacionada con los trastornos genéticos raros,… Como sintomatología asociada, se puede encontrar en algunos casos arritmia cardiaca, neuropatía periférica, temblor postural, miopatía inespecífica, desórdenes neurológicos,… Algunas mujeres pueden llegar a padecer un síndrome similar a la esclerosis múltiple. El LHON afecta a alrededor de 1:30.000-50.000 personas en la población europea, y es más frecuente en hombres que en mujeres (50% de hombres y 10% de mujeres que presentan una mutación con alto potencial patológico llegan a padecer la enfermedad). Cuando se manifiesta, los síntomas suelen aparecer entre los 15 y los 30 años de edad, dándose el 95% de los casos antes de los 50 años.1 Las tres mutaciones más frecuentes que producen LHON están presentes en torno al 90% de los enfermos y son m.3460G>A, m.11778G>A y m.14484T>C. Todas afectan a proteínas de la NADH:ubiquinona oxidorreductasa, o Complejo Respiratorio I (CI) de la cadena de transporte electrónico mitocondrial (EC 1.6.5.3). La transición m.3460G>A provoca alrededor de un 13% de todos los casos LHON. Afecta al gen MT-ND1 que codifica para la proteína p.MT-ND1, una subunidad de membrana del CI. Provoca un cambio de aminoácido en la posición 53, de alanina a treonina. Conforma el sitio de unión del coenzima Q10 junto con p.MT-ND3, p.MT-ND4L y p.MT-ND6 (codificadas en el mtDNA), y NDUFS2 y 7 (codificadas en el nDNA). Una razón que podría explicar la penetrancia incompleta son los haplogrupos mitocondriales (un haplogrupo se define como un conjunto de características genéticas que por su asociación permiten establecer subgrupos poblacionales) que pueden variar el entorno genético mitocondrial en el que se encuentra la mutación. Por ejemplo, miembros del haplogrupo UK presentan mayor riesgo a sufrir patología óptica. Sin embargo, esto no explicaría la diferencia de penetrancia entre personas dentro de un mismo pedigrí (por ejemplo, una madre sana y un hijo enfermo).2 6 La especificidad tisular y la mayor prevalencia masculina sugieren que factores específicos de tejido, incluyendo el juego de proteínas expresado y las condiciones fisiológicas, son requeridas para mostrar el fenotipo patológico. Algunos factores genético-nucleares en estudio en cuanto a las diferencias dentro de un pedigrí, podrían ser SNPs en el cromosoma X o la síntesis diferencial intersexual de estrógenos, pero no han podido ser demostrados hasta el momento.3 Otros factores que podrían explicar las diferencias en penetrancia dentro de un pedigrí son los factores ambientales, como tabaco, grandes cantidades de alcohol o xenobióticos4,7. El presente estudio se encargará de demostrar si alguno de estos xenobióticos influye en el desarrollo del fenotipo patogénico marcado por la mutación m.3460G>A. 7 Factores genético-nucleares y ambientales que afectan al lugar de unión del coenzima Q10 en el Complejo Respiratorio I modificarían la capacidad de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la penetrancia de los portadores de m.3460G>A. Este proyecto se enmarca dentro de las investigaciones realizadas por la Dra. Ester López en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Veterinaria. El objetivo principal de este trabajo es el estudio del efecto de factores genético-nucleares y ambientales (xenobióticos) que afectan a proteínas que conforman el lugar de unión del coenzima Q10 en el Complejo Respiratorio I de la cadena de transporte electrónico mitocondrial en dos líneas celulares transmitocondriales que poseen el cambio m.3460G>A. Este objetivo general se ha subdividido en los siguientes objetivos puntuales: 1. Caracterización de los genes, nucleares y mitocondriales, que codifican proteínas que conforman el lugar de unión del coenzima Q10 en el Complejo Respiratorio I. 2. Evaluación de los niveles y actividad del Complejo Respiratorio I de la cadena de transporte electrónico. 3. Estudio de la influencia de xenobióticos en la capacidad energética celular y parámetros asociados. 8 1. Líneas celulares Se utilizan dos líneas celulares transmitocondriales con los fondos genéticos nucleares de adenocarcinoma alveolar A549 y osteosarcoma 143B. De cada línea se usan una sublínea control y una sublínea mutante, con el cambio m.3460G>A. Una célula transmitocondrial o cíbrido es una célula a la que se le elimina su mtDNA (célula ρ0) y posteriormente se le introduce el nuevo mtDNA de interés: Se utilizará la nomenclatura A549-C, A549-M, 143B-C y 143B-M para hablar del control y mutante de cada línea. Cuando se añada xenobiótico, se indicará con D. 2. Medios de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose (SIGMA, ref. 41966029) 500 ml DMEM - glucose free (SIGMA, ref. 41966-052) 500 ml Suero fetal bovino (GIBCO) 500 ml 3. Reactivos generales Todos los reactivos utilizados fueron de grado analítico o aptos para biología molecular y cultivo celular en su caso. La mayoría de ellos proceden de las casas comerciales SigmaAldrich, BioRad, Invitrogen, Merck, Roche y Panreac®. 4. Instrumentación Cámaras de cultivo Microscopio invertido Contador de células automático Beckman Coulter Lector de microplacas NOVOstar, BMG Labtech Termociclador Veriti 96Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) Nanodrop ND-1000 spectrophotometer OROBOROS Oxygraph-2k Estación de imágenes celulares FLoid (Life Technologies) Sistema cuantitativo de imágenes fluorescentes Odyssey (Li-COR) eliminación de mtDNA Célula original Célula ρ0 Cíbrido fusión con plaqueta que tiene mitocondrias pero no núcleo 15 17.Ensayo de potencial de membrana por microscopía de fluorescencia Para su realización, se utiliza la estación de visualización Floid Cell Imaging Station (Life Technologies) y el kit Mito-ID® Membrane Potential / Cytotoxicity kit (Enzo Life Sciences). Se basa en una sonda catiónica que cambia de color según su estado de protonación: tras entrar libre en la célula se dirige al espacio intermembranoso mitocondrial y allí se protona, virando de color verde a rojo. El cultivo es idéntico al realizado para la localización de mitocondrias. Tras las 24 horas, se prepara la solución para realizar la incubación según las instrucciones del fabricante. Se retira el medio de los pocillos, se lavan con PBS y se disponen 2 ml de la solución por pocillo, a los que se añaden en el último momento 200 µl de la sonda MitoID M Detector Reagent. Se incuba 15 minutos a 37ºC. Para la visualización, se usa NucBlueTM Cell Stain (Life Technologies), que tiñe los núcleos de color azul. Todas las imágenes se toman con la misma intensidad de luz y contraste, para poder comparar los resultados. Se hace en paralelo el mismo ensayo, realizando la incubación con la concentración adecuada de xenobiótico para cada línea celular. 18.Ensayo de especies reactivas de oxígeno por microscopía de fluorescencia En este caso, se emplea el kit CellROX® Red (Life Technologies). Se basa en la detección del ión superóxido. El cultivo es idéntico al realizado para los dos ensayos anteriores. Tras las 24 horas, se prepara la solución para realizar la incubación según las instrucciones del fabricante. Se incuba 15 minutos a 37ºC. Para la visualización, se usa NucBlueTM Cell Stain (Life Technologies), que tiñe los núcleos de color azul. Todas las imágenes se toman con la misma intensidad de luz y contraste, para poder comparar los resultados. Se hace en paralelo el mismo ensayo, realizando la incubación con la concentración adecuada de xenobiótico para cada línea celular. 19.Determinación de potencial de membrana y especies reactivas de oxígeno por citometría de flujo Tomando placas de 6 pocillos, se establecen los cultivos el día anterior a los ensayos de citometría de la siguiente forma: una placa para cada línea, con tres pocillos (tres medidas) para medida de potencial de membrana y tres pocillos para medida de ROS, a 150.000 células / pocillo. Todo el establecimiento de cultivos se hace por duplicado, para que la incubación con los reactivos se lleve a cabo en las dos condiciones experimentales, sin y con xenobióticos. 16 La determinación del potencial de membrana se realiza con el kit Mito-ID® Membrane Potential / Cytotoxicity kit (Enzo Life Sciences), pues sirve tanto para microscopía de fluorescencia como para citometría de flujo. Para ROS, se emplea la sonda diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA). La conversión de la sonda no fluorescente (DCFH-DA) en un compuesto altamente fluorescente (DCF) ocurre en dos etapas. Primero, la DCFH-DA atraviesa la membrana celular y es deacetilada por esterasas para formar la DCFH, impidiendo su salida de las células. Después, la DCFH se convierte en la DCF por la acción del peróxido de hidrógeno, gracias a la acción de la peroxidasa. 20.Ensayo de ATP Se realiza mediante los kits Cell-titer blue y Cell-titer-Glo Luminescent (Promega). Mide el ATP total, es decir, determina el ATP sintetizado durante la incubación menos el que se consuma el que se haya creado en esas dos horas (menos el que se haya consumido). Balance en esas dos horas, de lo que se sintetiza, lo que se ha consumido, y la vida media del ya había que se supone que habrá desaparecido ya. Para este ensayo, se tienen en cuenta dos variables experimentales: La ausencia o presencia de xenobióticos La concentración de O2durante el cultivo: se realiza el ensayo a concentración atmosférica de O2y en hipoxia, condición también considerada como “normoxia tisular”, con O2al 3%. Se establece el crecimiento de las sublíneas celulares en placas de 96 pocillos de fondo blanco. Por pocillo ha de haber 10.000 células en un volumen de 200 µl, lo que equivale a resuspender las células a una concentración de 50.000 células / ml. Las cuatro filas superiores de la placa se usan para la cuantificación de ATP y las cuatro inferiores para la cuantificación de células. De esta manera se normalizan los resultados (concentración de ATP / célula). Se cultivan durante toda la noche. Al día siguiente se preparan los siguientes medios de cultivo: Medios ATP Células DMEM "free" 50 ml 50 ml Piruvato 50 mg/ml 110 µl 110 µl Deoxiglucosa 1 M 250 µl --- Si procede, se añaden las cantidades adecuadas de xenobiótico. El medio DMEM “free” no tiene ni glucosa ni piruvato. La deoxiglucosa es un análogo de la glucosa que bloquea la glucolisis; el piruvato permite sintetizar poder reductor para poder realizar el metabolismo aeróbeo (ciclo de Krebs y fosforilación oxidativa) en la mitocondria. Se retira el medio de cultivo del día anterior, se lava con PBS, se añaden los medios recién preparados. A las filas de pocillos utilizadas para el contaje celular se añade 20 μl / pocillo del colorante Cell-titer Blue. 17 Se incuba durante dos horas a 37ºC. Se mide la fluorescencia en las filas de cuantificación celular. Se añade el reactivo del kit, 100 μl / pocillo, en las filas de cuantificación de ATP, se incuba 10 minutos en agitación y se procede a medir la luminiscencia. 21.Análisis estadísticos Se realizan con el programa bioinformático StatView 6.0. En los gráficos se presentan las medias y la desviación estándar. Para comprobar que la distribución de las variables es normal se realiza el test de Kolmogorov-Smirnov. Si lo es, se realiza un test t desapareado para comparar los distintos parámetros. Si no lo es, se aplica el test no paramétrico de Mann Whitney. Los p-valores menores a 0,05 se consideran estadísticamente significativos. 18 1. Pruebas de cultivo celular a. Contaminación con micoplasmas Se realizó el estudio de contaminación con micoplasmas en todas las líneas utilizadas. Los resultados de las medidas de luminiscencia fueron: medida 1 medida 2 relación 2/1 C+ 1843 2237 1,214 C2131 253 0,119 A549-C 755 588 0,779 A549-M 532 423 0,795 143B-C 1242 277 0,223 143B-M 1033 292 0,283 La relación medida 2 / medida 1 permite evaluar la contaminación: valores por debajo de 0,9 indican ausencia de micoplasmas. Dado que las cuatro muestras se encontraron por debajo de dicho valor, se puede afirmar que todas están libres de contaminación por micoplasmas. 2. Estudio de genes nucleares que conforman el lugar de unión del coenzima Q10 en el Complejo Respiratorio I En primer lugar se aisló el RNA de cada una de las líneas celulares utilizadas. Tras ello se cuantificó y se analizó la calidad de dicho RNA. En la tabla 2 y en la figura 1 se puede ver la concentración y calidad del RNA obtenido. En las muestras de la línea A549 se obtuvo RNA con buena calidad, con las bandas de 28S y 18S rRNAs claramente diferenciables. No fue así para las muestras de 143B, pues en el control Sublínea [ng / µl] A549-C 1110,4 1207,3 ng / µl A549-C 1304,2 A549-M 971,8 1061,4 ng / µl A549-M 1151,0 143B-C 225,3 221,5 ng / µl 143B-C 217,6 143B-M 256,2 251,8 ng / µl 143B-M 247,4 PM 12 kb A549 C A549 M 143B C Figura 1: Geles de electroforesis con las muestras de RNA extraído. A) Muestras de la línea A549. B) Muestras de la línea 143B. 143B M Tabla 1: Resultados de medidas de luminiscencia. Tabla 2: Concentraciones de RNA. PM 12 kb A B 19 son visibles dos bandas, de las cuales una correspondería al 28S; y en el mutante no se observa nada. Pese a ello, todas las muestras funcionaron en la reacción de obtención de cDNA. A continuación se construyó el cDNA de dichas muestras, se cuantificó y se realizó la reacción de PCR de los genes de interés (NDUFS2 y NDUFS7). Tras ella, se comprueba la amplificación por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Deberá observarse una única banda de amplificado, de aproximadamente 1400 pb para el gen NDUFS2 y 700 pb para NDUFS7. En la tabla 3 se recogen los valores de cuantificación del cDNA obtenido y en la figura 2 la comprobación de la reacción de PCR para el gen NDUFS7. La reacción de PCR del gen NDUFS2 no funcionó. Se repitió cambiando las condiciones de reacción descritas en la referencia, pero el resultado nunca fue el esperado. Sería conveniente poner a punto la reacción de PCR de este gen para poder seguir adelante con el estudio del sitio de unión del coenzima Q10 en CI. En cuanto al gen NDUFS7 (Figuera 2), se obtuvo una sola banda. No pudo verse en este mismo gel si era la banda correcta ya que el marcador de pesos moleculares de 1 kb se encontraba en mal estado, pero se repitió la electroforesis con las mismas muestras de cDNA amplificado y se certificó que eran de la longitud requerida, aproximadamente 700 kb. Se seleccionaron estas muestras para continuar el estudio. a. Análisis de las secuencias obtenidas El Servicio de Secuenciación Automática de la Universidad Autónoma de Madrid (sede Moncloa) mandó los archivos con las secuencias de las cuatro sublíneas para el gen NDUFS7, y fueron tratados gracias al programa bioinformático Sequencher 4.1.4. Sublínea [ng / µl] A549-C 1636,4 1640,9 ng / µl A549-C 1645,4 A549-M 1587,7 1584,9 ng / µl A549-M 1582,0 143B-C 1651,9 1657,3 ng / µl 143B-C 1662,6 143B-M 1618,3 1623,8 ng / µl 143B-M 1629,2 PM 1 kb A549 C A549 M Blanco 143B C 143B M Tabla 3: Concentraciones de cDNA. Figura 2: Gel de electroforesis con las muestras de cDNA amplificadas para el gen NDUFS7. amplicón de 688 pb 20 Se alinearon las secuencias de las dos líneas celulares con la secuencia de referencia NM_024407.4 (base de datos Nucleotide, NCBI). La línea 143B presentó el cambio 111C>T (numeración en la secuencia de referencia). Puede observarse (figura 3) que la línea A549 presenta claramente un único pico en la posición 111, correspondiente a C. En la línea 143B se observan el pico más alto y que el programa detectó como correcto, correspondiente a T; y un pico más bajo que podría ser señal de fondo de las dos C anteriores o podría ser real y que la muestra analizada fuera heterocigota en esta posición. En estudios posteriores se debería comprobar la heterocigosidad diseñando un RFLP-PCR. 3. Estudio de ensamblaje del Complejo Respiratorio I Para poder estudiar los niveles y la actividad de CI se obtuvo el enriquecido de mitocondrias y se realizó una electroforesis en condiciones no desnaturalizantes. El gel resultante fue por una parte electrotransferido a membrana para cuantificar los niveles de CI y CII, y por otra se ensayaron los niveles de actividad de ambos complejos. Se estudian ambos ya que CII está compuesto íntegramente por proteínas codificadas en el DNA nuclear, de manera que se utiliza como control de cantidad de proteína cargada y así se normalizan los resultados. Los resultados que se muestran corresponden al ensayo de actividad in gel (figura 17) y la tabla de datos asociada (tabla 4) tras el tratamiento de la imagen con el programa bioinformático Quantity One 1-D Analysis Software, v. 4.6.5 (Biorad). a. Western Blot Los resultados obtenidos en el Western Blot no fueron buenos. Por una parte, la electrotransferencia a membrana arrastró mucho colorante azul de los tampones de la electroforesis no desnaturalizante, por lo que el color perturbó mucho la imagen obtenida a través del escáner Odyssey (Li-COR). A549 143B Figura 3: Fragmento de secuencia en el que se encuentra el cambio 111C>T. 21 Además, la técnica de Western Blot no funcionó, pues donde deberían haberse visto las bandas correspondientes a CI (éste da dos bandas) y CII el escáner no reveló nada, por lo que se concluye que o algún paso de la transferencia a membrana, fijación de proteínas o incubación con anticuerpos fue mal realizado, o bien éstos últimos se encontraban en mal estado y no permitieron la visualización de las proteínas. b. Actividades de los Complejos Respiratorios I y II in gel *SC se refiere a supercomplejos: estructuras de CI asociadas y detectadas así en el ensayo. A549-C A549-M 143B-C 143B-M CI 12,12 12,66 21,31 8,09 3,38 3,4 10,29 9,56 24,78 29,40 6,78 19,85 CII 0,79 12,17 8,17 19,77 CI/CII 31,37 2,42 0,83 1,00 Las relaciones CI/CII en la línea celular A549 reflejaron que la actividad de CI se ve muy comprometida en el mutante. En 143B los resultados no mostraron lo mismo, dado que la medición hecha por el software se vio afectada por los restos de tinción del carril de 143B-C en el gel. Sería conveniente repetir el experimento con las muestras de esta línea para poder obtener resultados más fiables. Figura 17: Gel de electroforesis no desnaturalizante de proteínas mitocondriales. CI PM A549 C c A549 M c 143B C c 143B M c SC CII Tabla 4: Valores de señal (actividad) en el gel calculados con el software QuantityOne. 22 4. Determinación de concentraciones inhibitorias de xenobiótico para cada línea celular a partir del consumo de oxígeno en células intactas El xenobiótico que se ha elegido para realizar los estudios que se tratan más adelante es la rolliniastatina-1. Es una acetogenina anonanácea. Se ha elegido por tener actividad inhibitoria en CI, más concretamente por ocupar el lugar de unión del coenzima Q10, región de CI de interés en el estudio. Como primera aproximación al estudio de la inhibición diferencial con rolliniastatina-1 en las diferentes líneas celulares se procedió a medir el consumo de oxígeno (respiración endógena) tras la adicción de cantidades crecientes del xenobiótico. Se toman los valores de consumo de oxígeno de las tres respiraciones de cada línea tras cada dosis de rolliniastatina-1 (una vez se ha estabilizado la gráfica) y se refieren a la respiración endógena, que se toma como el 100%. Con dichos valores en forma de porcentaje, se hace un tratamiento estadístico con el programa StatView 6.0. El procedimiento es el siguiente: con los datos de una pareja sublínea celular control – sublínea celular mutada, se realiza un test t-student. Se toman las parejas de datos de respiración de control y mutada con la misma dosis de droga y se comprueba el p-valor: 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % tasa de respiración Dosis A549 A549-M A549-C Figura 5: Porcentajes de capacidad respiratoria en la línea celular A549 tras las dosis de rolliniastatina-1. *: primera variación significativa entre control y mutante, p-valor = 0,0466. Figura 4: Fórmula química de la rolliniastatina-1. * 23 Para la línea celular A549 (figura 5) la diferencia ocurre tras la cuarta dosis y por tanto la concentración elegida es 0,002 nM. Para 143B (figura 6), la dosis es 0,025 nM. Éstas serán las concentraciones adicionadas a las líneas celulares para estudiar cómo afecta la presencia del xenobiótico al parámetro en estudio de aquí en adelante. 5. Estudio de parámetros celulares por microscopía de fluorescencia Se estudió el potencial de membrana mediante el uso de la sonda catiónica que vira de color verde a rojo cuanto mayor es el potencial. Los resultados obtenidos se muestran en las figuras 9 y 10. 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % tasa de respiración Dosis 143B 143B-M 143B-C Figura 6: Porcentajes de capacidad respiratoria en la línea celular 143B tras las dosis de rolliniastatina-1. *: primera variación significativa entre control y mutante, p-valor = 0,0204. * 24 Figura 7: Imágenes de microscopía de fluorescencia de la línea celular A549, potencial de membrana. A) Control. B) Mutante. C) Control con xenobiótico. D) Mutante con xenobiótico. A C D B Figura 8: Imágenes de microscopía de fluorescencia de la línea celular 143B, potencial de membrana. A) Control. B) Mutante. C) Control con xenobiótico. D) Mutante con xenobiótico. A B C D 31 contrario del control en el que la variación no es significativa. En 143B, la rolliniastatina-1 provocó que los niveles de ROS aumentaran. Tiene sentido esta correlación entre potencial y ROS, dado que una menor función OXPHOS supone menor diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana y también menor flujo de electrones que puedan desencadenar la síntesis de ROS. La modificación de la penetrancia de mutaciones patológicas en el mtDNA no es específica de la rolliniastatina-1 y LHON. Existen multitud de xenobióticos de todo tipo que podrían afectar a mutaciones desencadenantes de otras enfermedades mitocondriales, de otros fenotipos, incluso en el caso de enfermedades multifactoriales como el Párkinson. Las conclusiones que se han obtenido con la realización de este trabajo son las siguientes: Se confirma la patogenicidad de la mutación m.3460G>A. tanto en el modelo ampliamente estudiado (143B) como en otro con fondo genético nuclear distinto (A549) y en condiciones más cercanas a las fisiológicas (normoxia tisular). No hay diferencias determinantes en la secuencia del gen NDUFS7. Debería realizarse la secuenciación de todas las subunidades nucleares y mitocondriales implicadas en la unión del coenzima Q10 a CI. La exposición a rolliniastatina-1 aumenta el riesgo a desencadenar el desarrollo del fenotipo patológico. Los factores ambientales como xenobióticos pueden modificar la penetrancia de mutaciones patológicas, lo que puede ser utilizado por aquellos afectados por este tipo mutaciones a modo de prevención, para evitar la exposición y contacto con estas sustancias. The conclusions that we have obtained from this work are: Pathogenical mutation m.3460G> A is confirmed both in widely studied model (143B) and the one with different nuclear genetic background (A549), and in conditions closer to physiological (tissue normoxy). No determinant differences in gene NDUFS7 sequence. Sequencing of all nuclear and mitochondrial subunits involved in the binding of coenzyme Q10 to CI should be done. Exposure to rolliniastatin-1 increases the risk to trigger the development of the disease phenotype. Environmental factors such as xenobiotics may modify the penetrance of disease mutations, which can be used by those affected by these mutations as a prevention in order to avoid exposure and contact with these substances. 32 1.- Yu-Wai-Man, P. et al, Leber Hereditary Optic Neuropathy. GeneReviews (1993). 2.- Hudson, G. et al, Clinical expression of Leber hereditary optic neuropathy is affected by the mitocondrial DNA-haplofroup background. The american journal of human genetics (2007). 3.- Giordano, C. et al, Oestrogens ameliorate mitocondrial dysfunction in Leber hereditary optic neuropathy. Brain (2010). 4.- Kirkman, M. A. et al, Gene-environment interactions in Leber hereditary optic neuropathy. Brain (2009). 5.- Potluri, P. et al, A novel NDUFA1 mutation leads to a progressive mitochondrial complex I-specific neurodegenerative disease. Molecular Genetics and Metabolism (2009). 6.- Carelli, V et al, Leber hereditary optic neuropathy: Biochemical effect of 11778/ND4 and 3460/ND1 mutations and correlation with the mitochondrial genotype. American academy of neurology (1997). 7.- Degli Esposti, M, Inhibitors of NADH-ubiquinone reductase: an overview. Biochimica et Biophysica Acta (1998).