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UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular “Estudio de las interacciones de FurA y otros reguladores transcripcionales implicados en el metabolismo del hierro y del nitrógeno” Proyecto de Fin de Grado en Biotecnología dirigido por María Luisa Peleato y Laura Botello-Morte Nuria Blasco Lavilla Curso 2013/2014 Mª LUISA PELEATO, Catedrática del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza, y LAURA BOTELLO-MORTE, Personal Docente en el mismo departamento, como directoras del trabajo AUTORIZAN a Doña Nuria Blasco a presentar el Trabajo de fin de grado en el contexto de formación del grado “Biotecnología” impartido en la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza. Dicho trabajo lleva por título: Estudio de las interacciones de FurA y otros reguladores transcripcionales implicados en el metabolismo del hierro y del nitrógeno, y ha sido realizado en los laboratorios del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Facultad de Ciencias. Para que así conste, firmamos la presente en Zaragoza a 24 de Junio de 2014. Mª Luisa Peleato y Laura Botello-Morte Índice 1. Resumen…………………………………………………………….……...…1 2. Antecedentes……………………………………………..……….…………..2 2.1. Introducción a las proteínas Fur………………………..………….2 2.2. Características generales………………………..…………………2 2.3. Las proteínas Fur en Anabaena sp………………………...………..4 2.4. La proteína Fur en E. amylovora………………………..………….5 3. Objetivos……………………………………………………….……………...6 4. Materiales y métodos……………………………………………….……...…7 4.1. Cepas y medios de cultivo utilizados………………………………..7 4.2. Clonaje de furB y furC de Anabaena………………………………..7 4.2.1 Preparación de células quimiocompetentes……………………7 4.2.2 Transformación de células quimiocompetentes………………...7 4.2.3 Electroforesis de DNA………………………………………8 4.2.4 Purificación de DNA………………………………………..8 4.2.5 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) …………………..8 4.2.6 Doble digestión y ligación…………………………………...9 4.2.7 Experimento doble híbrido…………………………………..9 4.3. Purificación y caracterización parcial de Fur de E. amylovora……….9 4.3.1 Electroforesis de proteínas………………………………….9 4.3.2 Sobreexpresión y obtención de biomasa de E. coli……………10 4.3.3 Empaquetamiento de la columna de afinidad a metales………..10 4.3.4 Obtención del extracto crudo y purificación por IMAC………..10 4.3.5 Diálisis de la proteína y cuantificación………………………11 4.3.6 Análisis oligomerización…………………………………...11 4.3.7 Detección de zinc estructural en la proteína…..………………11 4.3.8 Ensayo de actividad de unión al DNA……………………….11 5. Resultados…………………………………………………..……….………12 5.1. Clonaje de furB y furC de Anabaena………………………………12 5.1.1 Amplificación de plásmidos e insertos………………………12 5.1.2 Doble digestión y ligación………………………………….12 5.2. Cotransformación y experimento doble híbrido……………………13 5.3. Sobreexpresión y purificación de Fur de E. amylovora……………14 5.3.1. Sobreexpresión y obtención de biomasa……………………15 5.3.2. Purificación de la proteína…………………………………15 5.3.3. Cuantificación de la proteína………………………………17 5.4. Caracterización parcial de Fur de E. amylovora……………………17 5.4.1 Estudio de oligomerización y entrecruzamiento………………17 5.4.2 Detección de zinc estructural…………………………….…18 5.4.3 Análisis de la interacción con el DNA…………………….…19 6. Discusión……………………………………………………….………….…20 6.1. Interacciones de FurA, FurB y FurC en Anabaena…………………20 6.2. Purificación de Fur de E. amylovora………………………………21 7. Conclusiones…………………………………………….………….………..23 8. Bibliografía……………………………………………….……………….…24 9. Anexo I………………………………………………….……………………26 9.1 Cepas y plásmidos utilizados………………………………………26 9.2 Cebadores utilizados para el clonaje de furB y furC………………...27 9.3 Cebadores utilizados en secuenciación y detección de inserto………..27 9.4 Cebadores utilizados en la amplificación de promotores para EMSA...27 9.5 Composición para dos geles SDS-PAGE al 15%…………………...…28 9.6 Composición para dos geles EMSA al 6%……………………………28 ABREVIATURAS Abs Absorbancia APS Ammonium persulfate (persulfato amónico) bp base pairs (pares de nucleótidos) BSA Bovine serum albumin (albúmina sérica bovina) DNA Ácido desoxirribonucleico dNTPs Mezcla de los cuatro desoxinucleótidos rifosfato D.O. 600 Densidad óptica a 600 nm DTT 1,4‐ditiotreitol EDTA Ácido etilen‐diamino‐tetraacético EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay (ensayo de retardo en gel) g gramos h horas HAc/Ac‐ Tampón ácido acético/acetato IMAC Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (cromatografía de afinidad metal) IPTG Isopropil‐β‐D‐tiogalactopiranósido kDa kiloDalton Km Kanamicina l litro LB medio de cultivo Luria ‐ Bertani M Concentración molar Mb Megabases mg miligramos min minutos ml mililitros mM Concentración milimolar ng nanogramos nM Concentración nanomolar O/N Overnight (toda la noche) PCC Colección de cultivos del Institut Pasteur PCR Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa) PMSF fluoruro de fenilmetilsulfonilo p/p relación peso / peso p/v Relación peso / volumen Palr0523, Promotor del gen alr0523 Pfur, Promotor del gen fur PhrpL, Promotor del gen hrpL PhrpS, Promotor del gen hrpS RNA Ácido ribonucleico ROS Reactive Oxygen Species (especies reactivas de oxígeno) rpm revoluciones por minuto SDS Sodium Dodecyl Sulfate (dodecil sulfato sódico) SDS‐PAGE SDS ‐ PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS) s segundos TBE Tris‐ácido Bórico‐EDTA TEMED N, N, N´, N´‐tetra‐metiletilendiamina Tris Tris‐hidroximetil‐aminometano V Voltios v/v relación volumen / volumen X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido ε coeficiente de extinción molar °C grados centígrados μg microgramos μl microlitros μm micrómetros μM Concentración micromolar 1 1. Resumen Las proteínas Fur (ferric uptake regulator) son una superfamilia de reguladores de la transcripción presentes en la mayoría de los organismos procariotas. Tienen un papel clave en la regulación del metabolismo del hierro y en otros procesos celulares clave, como la defensa frente al estrés oxidativo, la regulación del metabolismo del nitrógeno, la diferenciación de heterocistos en cianobacterias o la virulencia en los patógenos [1]. Se han abordado dos objetivos principales referidos a las proteínas Fur. Por un lado se han estudiado las interacciones entre las proteínas de la familia Fur presentes en Anabaena sp. PCC 7120: FurA, FurB y FurC in vivo. Los resultados obtenidos indican que las proteínas FurA, FurC y en menor medida, FurB, forman homodímeros, y que es muy posible que las tres proteínas interaccionen entre sí. Por otro lado se ha purificado la proteína Fur de Erwinia amylovora y se ha realizado una caracterización parcial. E. amylovora es la bacteria que causa el fuego bacteriano, una enfermedad de las plantas muy extendida y que ha causado graves problemas fitosanitarios y económicos [2]. La captación de hierro en el hospedador es uno de los principales mecanismos de patogenicidad de esta enfermedad por lo que el estudio de Fur permitirá conocer mejor el mecanismo de infección de E. amylovora y aplicar posibles soluciones para remediar el fuego bacteriano. Se ha purificado Fur de E. amylovora por columna de afinidad a Cu2+, se ha hecho un estudio de oligomerización y se ha detectado zinc estructural en su forma reducida. Abstract The members of the Fur (ferric uptake regulator) superfamily are transcriptional regulators present in the majority of prokaryotic organisms. They have a key role in the regulation of iron metabolism, but are also implicated in other key cellular processes, such as defense against oxidative stress, regulation of nitrogen metabolism, the differentiation of heterocysts in cyanobacteria or virulence in the case of pathogenic bacteria [1]. The goal of this work is twofold: Firstly the interactions amongst the Fur protein family members present in Anabaena sp. PCC 7120: FurA, FurB and FurC were studied in vivo. The results obtained indicate that FurA, FurC and to a lesser extent FurB tend to form homodimers, and the results suggets that heterodimers can be also possible. Secondly the Fur protein of Erwinia amylovora was purified and a partial characterization was undertaken. E. amylovora is the causative agent of fire blight, a widespread plant disease that has already caused significant sanitary and economic problems [2]. Since iron uptake in the plant host is one of the main mechanisms of pathogenicity in this disease, it is expected that Fur studies can lead to a better understanding of the process of infection used by E. amylovora, and may ultimately offer possible remedies for fire blight. The protein was successfully purified with a Cu2+ affinity column, its capability to oligomerize was noted and structural zinc was detected in its reduced form. 2 2. Antecedentes 2.1 Introducción a las proteínas Fur Con una sola excepción descrita (Borrelia) [3], los organismos procariotas necesitan el hierro como micronutriente esencial. El hierro se encuentra poco disponible en muchos ecosistemas y ha llevado a los microorganismos a desarrollar una serie de estrategias para disminuir sus requerimientos y aumentar su captación del medio. Por otro lado, el exceso de este metal en el organismo puede ser altamente tóxico para las células al desencadenar un aumento en la cantidad de especies reactivas de oxígeno. La homeostasis del hierro es por tanto muy importante y las proteínas Fur (ferric uptake regulator) son las responsables de este proceso. Además, las proteínas Fur engloban una superfamilia de metalorreguladores implicados en el estrés oxidativo y el metabolismo de otros metales: Zur (zinc uptake regulator), Mur (manganese uptake regulator), Nur (nickel uptake regulator), PerR (peroxide stress response regulator) y el regulador de la respuesta a hierro hemo-dependiente, Irr [1]. 2.2 Características generales El mecanismo clásico aceptado para el modelo de la función de las proteínas Fur consiste en la formación de dímeros para unirse a los promotores de sus genes diana y reprimir su transcripción utilizando un metal como represor. La coordinación con el metal causa en ellas un cambio conformacional que promueve su unión al DNA en secuencias ricas en A/T [4]. Estructuralmente, las proteínas de la superfamilia Fur comparten un pliegue de unos 120 aminoácidos y se componen de un dominio de unión a DNA del tipo WH (winged helix), situado en el extremo N-terminal, y de una secuencia de unión a metales situada en el extremo C-terminal. Este último dominio también es responsable de la dimerización. Además, contienen el motivo HHHXHX2CX2C al comienzo del dominio C-terminal [1]. Se ha visto que pueden tener hasta dos sitios de unión a metal adicionales al correpresor. Su función no está clara todavía. En muchos casos el metal correpresor se une con gran afinidad a la zona bisagra que separa los dos dominios de la proteína. Concretamente, en las proteínas Fur, el metal correpresor, hierro, está penta-coordinado por tres residuos de histidina y dos acídicos. También en algunos miembros esta familia se ha encontrado zinc, que en algunos casos funciona como metal estructural que estabiliza la forma dimérica [5]. Su sitio de unión puede encontrarse tanto en el núcleo del dominio C-terminal, como cerca del mismo. En el segundo caso suele encontrarse coordinado por cuatro cisteínas en dos motivos CXXC. Finalmente, hay que decir que la estructura descrita es muy general y existe una gran variedad entre las proteínas Fur. Un ejemplo de ello es Fur de Helicobacter pylori, cuyos dominios N y Cterminal no responden a los descritos [6]. La secuencia de unión de Fur al DNA o caja Fur se ha definido de distintas formas, sin embargo la más aceptada parece consistir en dos hexámeros GATAAT en dirección 5’->3’, separados por un par de bases de un tercer hexámero en la orientación inversa [7]. En algunos 3 casos se encuentran también otros motivos estructurales adicionales en la zona de unión al DNA que optimizan la interacción [8]. Las proteínas Fur parecen ser las más extendidas dentro de la superfamilia Fur aunque sus funciones todavía no se conocen completamente. La gran cantidad de genes que son regulados por Fur indican que su función reguladora debe ser muy importante, sin embargo la función de muchos de sus genes diana se desconoce. Además de su función como regulador génico, se cree podría tener otras funciones, ya que es capaz de interaccionar con moléculas señalizadoras como el grupo hemo, el NO y el CO [9, 10], con otras proteínas que responden al estrés oxidativo y ha mostrado actividad disulfuro reductasa en cianobacterias, por lo que podría participar en respuestas detoxificantes e incluso tener un papel intrínseco en ellas [11]. Fur controla la homeostasis del hierro en la mayoría de los procariotas, con la excepción de las bacterias Gram-positivas con alto contenido en GC y las arqueobacterias [1]. Participa como regulador en la transcripción de genes necesarios para la captación del hierro como los que intervienen en la síntesis de sideróforos y sus receptores, transportadores ABC y proteínas para su almacenamiento [12]. Tiene un papel destacado en algunos mecanismos de patogénesis al controlar la expresión de factores de virulencia y la producción de algunas toxinas en bacterias de vida libre. Pero no solo regula la defensa a la limitación de hierro que sufrirían los patógenos en diversos hábitats, también juega un papel importante en la defensa contra el estrés oxidativo y nitrosativo que pueda causarle el hospedador. Por otro lado se ha visto que participa en procesos no relacionados con el hierro como la tolerancia a ácido, la captación de riboflavina, la formación de biofilms, la respuesta a estrés osmótico, la regulación del quorum sensing, la resistencia a cianuro, el control de la respiración y la diferenciación de los heterocistos en las cianobacterias [1]. En cuanto a su mecanismo de acción, hasta ahora se creía que Fur funcionaba como un represor transcripcional mediante la unión del dímero Fur-Fe2+ a elementos upstream de sus genes diana [4]. Sin embargo, cada vez se están encontrando más casos en los que Fur reprime a sus genes diana en la forma de apoproteína o los activa en la forma Fur-Fe2+ [13]. La activación de genes se ha visto que puede llevarla a cabo de forma directa, posicionando a la RNA polimerasa, y en un menor número de casos de forma indirecta mediante el desplazamiento de una proteína H-NS que permite la unión de la RNA polimerasa o a través de la represión de genes que codifican sRNAs [14]. Las proteínas Fur suelen están auto-reguladas mediante la unión de las mismas a sus propios promotores. También intervienen otros efectores que varían en función del metabolismo de la bacteria, como otros reguladores transcripcionales que incluyen otras proteínas Fur especializadas [1, 15]. Su regulación es muy compleja, y en ella no solo intervienen reguladores transcripcionales que responden al nivel de hierro, sino que también participan otros que responden a ROS, a Mn2+ y a las reservas intracelulares de carbono y nitrógeno [1, 16]. Cuentan con regulación postranscripcional que viene dada por RNAs antisentido [17] y también están reguladas por modificaciones postraduccionales que impiden su unión al DNA, como su interacción con hemo y con NO, o el cambio en el estado redox de sus cisteínas [1]. 10 4.3.2 Sobreexpresión y obtención de biomasa de E. coli Se partió de células de E. coli con el plásmido pET28a que tenía clonado el gen fur de E. amylovora. Se testaron 4 colonias para comprobar su sobreexpresión. Para ello se pusieron cultivos O/N, se refrescaron a una concentración 1:100 y se incubaron a 37ºC hasta alcanzar la fase de crecimiento exponencial. A continuación se dividió el cultivo en dos alícuotas de las cuales una se dejó como control, sin inducir, y en la otra se indujo la sobreexpresión añadiendo IPTG a una concentración de 1 mM para inducir la expresión de Fur. Se incubaron todos los cultivos durante 3h y después se extrajo una alícuota de cada uno para hacer un screening de expresión mediante una electroforesis SDS-PAGE. Aquella colonia que mayor sobreexpresión mostró se cultivó a gran escala en las mismas condiciones para la obtención de 5 l de cultivo de E. coli sobreexpresando Fur. El cultivo se centrifugó a 10000 rpm durante 10 min. Los pellets se lavaron con 0,15 M NaCl y la biomasa obtenida y se conservó a -20ºC. 4.3.3 Empaquetamiento de la columna de afinidad a metales Para la purificación de la proteína se utilizó una cromatografía de afinidad a metales con Cu2+ como metal inmovilizado en la matriz. Todos los tampones se desgasificaron y filtraron antes de ser utilizados. La columna se empaquetó con 7 ml de “Chelating Sepharose Fast Flow” (GE Healthcare). A continuación se lavó la matriz con 10 volúmenes de agua miliQ, se pasaron 3 volúmenes de una disolución de CuSO4 0,25 M y se eliminaron los restos de metal con 5 volúmenes de agua miliQ. El equilibrado se realizó con 5 volúmenes del tampón de unión (50 mM Tris/HCl, pH 8, 300 mM NaCl). 4.3.4 Obtención del extracto crudo y purificación por IMAC Se descongelaron 5 g de biomasa en 25 ml de tampón de unión con 2 mM PMSF como inhibidor de proteasas. Se sonicaron las células en baño de hielo con 10 ciclos de 45 s separados por 30 s de pausa, con una amplitud del 80% y un ciclo de 0,5. Se clarificó el extracto crudo mediante tres centrifugaciones de 20000 rpm y 4ºC durante 20 min cada una. El extracto resultante se filtró mediante dos filtros de 0,8 y 0,22 µm. Se pasó el extracto crudo por la columna de IMAC. Se lavó con 10 volúmenes de tampón de unión con 0,5 M (NH4)2SO4 para romper las interacciones inespecíficas y seguidamente con tampón de unión con 35 mM de glicina hasta que la observancia fue de Abs280nm = 0,15. Finalmente se eluyeron las proteína con un gradiente de 0-1M de imidazol en tampón de unión. Se recogió el eluido en alícuotas de 1 ml y se guardaron las alícuotas a 4ºC. Finalmente se analizó la presencia de la proteína Fur mediante electroforesis SDS-PAGE y se regeneró la matriz pasando 10 volúmenes de agua miliQ para eliminar el imidazol, 0,5 volúmenes de Strip Buffer (0,2 M EDTA, 0,5 M NaCl) para quitar el metal, 5 volúmenes de NaCl 0,5 M para eliminar las proteínas inespecíficamente unidas a la matriz, 5 volúmenes de agua miliQ para lavar la matriz, y 5 volúmenes de EtOH al 20% como medio para preservarla. La matriz se conservó en EtOH al 20% y a 4ºC. 11 4.3.5 Diálisis de la proteína y cuantificación Se dializó la proteína en tampón de diálisis (50 mM Tris/HCl pH 8, 100 mM de NaCl y 10% de glicerol) a 4ºC. Se realizaron tres cambios de tampón cada 3h. Terminada la diálisis, se centrifugaron las muestras a 4000 rpm, 4ºC y 15 minutos para eliminar posibles precipitados. La proteína se cuantificó por espectrofotometría de absorbancia molecular mediante la ley de Beer-Lambert (Abs = ‐ log (I/I0) = ε ∙ c ∙ l), usando como blanco el tampón usado en la última diálisis, y tomando el coeficiente de extinción teórico del servidor ProtParam de ExPASy para la proteína oxidada (ε280 = 6210 mM-1cm-1). Finalmente se alicuotó y se guardó a -20ºC. 4.3.6 Análisis de oligomerización Para comprobar la oligomerización de la proteína se hizo un ensayo de reducción y otro de entrecruzamiento cuyos resultados se analizaron con una electroforesis SDS-PAGE al 15%. En el ensayo de reducción se incubaron las muestras de proteína a 10 mM de DTT durante 10 min, dejando muestras como control negativo y utilizando tampón de carga sin βmercaptoetanol. En el ensayo de entrecruzamiento se incubó una muestra a 0,5% de glutaraldehído durante 15 min y en oscuridad y se dejó otra muestra como control negativo. 4.3.7 Detección de zinc estructural en la proteína Sobre gel SDS-PAGE al 15% corrido con muestras de la proteína, se aplicó una solución de 50 ml de 20 mM Tris/HCl pH 8, 100 mM NaCl, 500 µM PAR y 5% glicerol, y añadiendo H2O2 50 mM hasta que se observó la aparición de alguna banda naranja que indicaba la presencia de zinc. Una vez fotografiado el resultado se retiró la solución de PAR y se procedió a la tinción usual con azul de Coomassie. 4.3.8 Ensayo de actividad de unión al DNA Los ensayos de actividad de unión al DNA (EMSA) se realizaron en condiciones nativas con geles PAGE al 6% cuya composición se detalla en el anexo I, tabla 9.6. El tampón de electroforesis usado tenía una composición de 6,06 g/l Tris, 28,4 g/l glicina pH 8, y el tampón de carga utilizado fue 50 mM Tris/HCl pH 8, 30% de glicerol, 0.25% (p/v) de azul bromofenol y 0.25% (p/v) de xilenocianol FF. Los geles se precorrieron a 60 V y 4ºC durante 45-60 min para equilibrar el sistema. Cada muestra se preparó en un volumen final de 20 µl, con 40 ng de DNA inespecífico Palr0523, 40 ng del DNA específico y 0,01 mg/ml de BSA en tampón de unión (10 mM Bis Tris pH 7,5, 40 mM KCl, 1 mM MgCl y 5% glicerol). Se utilizaron concentraciones de proteína entre 300 y 1000 nM en presencia o ausencia de DTT, EDTA, Mn2+ y Zn2+ 1 mM según la muestra. Las mezclas de reacción se incubaron durante unos 15 min a temperatura ambiente antes de añadirles 3 µl del tampón de carga y cargarlas en el gel. Los geles se corrieron a 90-100 V y 4ºC hasta que el frente alcanzó el final del gel. Para visualizar los resultados, se incubaron los geles con 50 ml de tampón de electroforesis a los que se les añadió 5 µl de Vistra Green™ 10000X (Amersham Biosciences), durante 20 minutos, en agitación suave y oscuridad. Los resultados se visualizaron con un Gel Doc 2000 (Bio-Rad). 12 5. Resultados 5.1 Clonaje de FurB y FurC de Anabaena Se clonaron los genes furB y furC como proteínas de fusión a los fragmentos T25 y T18 de la proteína adenilato ciclasa. Los vectores recombinantes se cotransformaron en células de E. coli BTH101 y se cultivaron las células en presencia de X-Gal e IPTG. El IPTG produjo la sobreexpresión de las proteínas que, al interaccionar, reestablecieron la proteína adenilato ciclasa dando lugar a la activación del operón lac y a la degradación de X-Gal para dar un compuesto azul. Esto permitió ver las interacciones entre FurA, FurB, y Furc. 5.1.1 Amplificación de plásmidos e insertos Se clonaron los genes de furB y furC en los plásmidos del kit doble híbrido (anexo I, tabla 9.2) utilizando los sitios de restricción de las enzimas KpnI y BamHI (Fermentas). Una vez recibidos los cebadores, se amplificaron los insertos a partir de DNA genómico de Anabaena sp. PCC 7120 por PCR y se purificaron los productos. Paralelamente los plásmidos del kit se replicaron creciendo cultivos con las cepas que los contenían y se purificaron (figura 5.1). Figura 5.1. Amplificación y purificación de los insertos y los plásmidos del kit de doble híbrido. Amplificación y purificación de los genes furC (A) y furB (B): carril M: marcador de peso molecular, carril -: control negativo de la PCR, carril +: control positivo (PCR sobre DNA genómico). Purificación de los plásmidos (C): carril 1: marcador de peso molecular, carril 2: pKT25-zip, carril 3: pKNT25, carril 4: PKT25, carril 5: pUT18C-zip, carril 6: pUT18C y carril 7: pUT18. 5.1.2 Doble digestión y ligación Obtenidos los plásmidos y los insertos amplificados, se realizó una doble digestión con las enzimas de restricción BamHI y KpnI para conseguir un clonaje direccional (figura 5.2). Figura 5.2. Digestión de los insertos y los plásmidos del doble híbrido. Plásmidos (A): carril 1: marcador de peso molecular, carril 2: pUT18C digerido, carril 3: pUT18C sin digerir, carril 4: pUT18 digerido, carril 5: pUT18 sin digerir, carril 6: pKNT25 digerido, carril 7: pKNT25 sin digerir, carril 8: pKT25 digerido, carril 9: pKT25 sin digerir. Insertos (B): carril 1: marcador, carril 2: furB digerido, carril 3: furC digerido. 13 Los plásmidos e insertos digeridos se purificaron y se ligaron para obtener los plásmidos recombinantes. Posteriormente se transformaron células quimiocompetentes E. coli XL1-Blue con las mezclas de ligación mediante choque térmico. Se utilizó un control negativo de ligación en el que no había inserto que mostró que pocos plásmidos habían sido capaces de recircularizar como consecuencia de haber sido digeridos con una sola enzima. Posteriormente se analizó mediante PCR de colonias la presencia de los insertos. Los cebadores utilizados hibridaban en los plásmidos (anexo I, tabla 9.4), permitiendo diferenciar la presencia o no del inserto según el peso molecular del amplificado (figura 5.3). La mayoría de las colonias analizadas poseían el plásmido recombinante. Figura 5.3. Comprobación del clonaje de furB y furC en los plásmidos del kit de doble híbrido. Amplificación de los genes furB y furC en los plásmidos pUT18C (A), pUT18 (B), pKNT25 (C) y pKT25 (D): carriles 1: marcador de peso molecular, carriles 2-5: furB, carriles 6-9: furC, carriles 10: controles de los plásmidos vacíos, carriles 11: controles negativos de PCR. Se purificaron dos plásmidos de cada clonaje y se mandaron al servicio de secuenciación de la Universidad de Zaragoza para comprobar que el vector contenía el inserto de cada gen sin mutaciones. 5.2 Cotransformación y experimento de doble híbrido Finalmente, se purificaron los purificaron los plásmidos del kit de doble híbrido conteniendo el gen furA a partir de células E. coli XL1-Blue. Se cotransformaron células quimiocompetentes E. coli BTH101 con 50 ng de dos plásmidos compatibles, uno de los cuales poseía el fragmento T25 y el otro, el fragmento T18 de adenilato ciclasa. Se utilizaron los plásmidos pUT18C y pKT25 como control negativo, y los plásmidos pUT18C-zip y pKT25-zip como control positivo. Se analizaron las interacciones tanto de las proteínas entre ellas como de las proteínas consigo mismas para formar homodímeros. Para cada pareja se analizaron todas las posibles combinaciones (8 por cada pareja de proteínas a estudiar), anexo I, tabla 9.1. De esta forma se asegura que ninguna de la interacciones entre los dos fragmentos de adenilato ciclasa, o entre las proteínas de fusión Fur, se vean afectadas por los impedimentos estéricos que supone la fusión de las proteínas [29]. furB/furC furB/furC 14 Las células cotransformadas se sembraron en placas con los antibióticos de selección de ambos plásmidos, IPTG para inducir la expresión de las proteínas Fur y X-Gal como sustrato revelador de la interacción. Las placas se dejaron a 30ºC, después se replicaron a una nueva placa para visualizar mejor las posibles interacciones. Se realizaron de 1 a 3 pases según fueran necesarios para la observación de los resultados. Figura 5.4. Resultados de la formación de homodímeros. Controles (A), FurA (B), FurB (C) y FurC (D). Secciones + : controles positivos, secciones - : controles negativos, secciones 1-4: combinaciones de plásmidos posibles para cada pareja. Figura 5.5. Resultados de la formación de heterodímeros. FurA-FurB (A), FurA-FurC (B), FurB-FurC (C). Secciones + : controles positivos, secciones - : controles negativos, secciones 1-8: combinaciones de plásmidos posibles para cada pareja. Los resultados obtenidos muestran una clara señal en la formación de homodímeros de FurA (figura 5.4, imagen B, sección 2) y de FurB (figura 5.4, imagen D, secciones 1 y 3). Asimismo se aprecia señal más débil y no tan clara para la formación de homodímeros de FurB (figura 5.4, imagen C, secciones 1-4) y heterodímeros de FurA-FurB (figura 5.5, imagen A, secciones 4-8), FurA-FurC (figura 5.5, imagen B, secciones 3 y 5) y FurB-FurC (figura 5.5, imagen C, secciones 3-6). 5.3 Sobreexpresión y purificación de Fur de E. amylovora Para purificar la proteína Fur de E. amylovora se sobreexpresó en E. coli BL21 (DE3) partiendo del plásmido recombinante pET28a con fur. La técnica utilizada para su purificación fue una cromatografía de afinidad a metales (IMAC). A B C D A B C (+) Control positivo. (-) Control negativo. 1pKNT25-FurB + pUT18C-FurC 2pKNT25-FurB + pUT18-FurC 3pKT25-FurB + pUT18C-FurC 4pKT25-FurB + pUT18-FurC 5pKNT25-FurC + pUT18C-FurB 6pKNT25-FurC + pUT18-FurB 7pKT25-FurC + pUT18C-FurB 8pKT25-FurC + pUT18-FurB 15 5.3.1 Sobreexpresión y obtención de biomasa Se transformaron mediante choque térmico células quimiocompetentes de E. coli BL21 (DE3) previamente preparadas con el plásmido recombinante pET28a con fur. Se analizó la sobreexpresión de la proteína en varias colonias de las células transformadas inducidas o no con IPTG 1 mM mediante una electroforesis SDS-PAGE al 15%. Los resultados (figura 5.6) indican que las colonias 2 y 3 muestran un nivel de sobreexpresión de Fur ligeramente mayor. Por tanto, se escogió la colonia 2 para cultivarla a gran escala y purificar la proteína. Figura 5.6. Sobreexpresión de Fur de E. amylovora. El carril M corresponde al marcador de peso molecular. Cada número se refiere una colonia distinta con sus cultivos inducidos o no (-) con IPTG. Una vez escogida la colonia adecuada para realizar la sobreexpresión, se cultivó en 5l de medio, se llevó a fase exponencial y se indujo la sobreexpresión de Fur. El pellet bacteriano se lavó y se conservó congelado a -20ºC. La cantidad de biomasa obtenida fue de 10 g. 5.3.2 Purificación de la proteína El sistema elegido para purificar la proteína fue una cromatografía de afinidad a metales capaz de unir aquellas proteínas con varios residuos de His gracias a su interacción con los iones metálicos inmovilizados en la matriz. La proteína Fur de E. amylovora posee el motivo HHHDH, así que es de esperar que muestre suficiente afinidad por la matriz como para poder realizar su purificación con éxito sin necesidad de añadir una cola de His en su secuencia. El metal a inmovilizar se escogió siguiendo las instrucciones del fabricante. El cobre muestra mayor afinidad por las secuencias de histidina que el cobalto o el níquel, aunque proporciona una menor especificidad de purificación. Se empaquetó la columna de cromatografía con la matriz, se inmovilizó en ella el cobre y se equilibró con el tampón de unión. Una vez preparada la columna, se preparó el extracto crudo partiendo de 5 g de biomasa que se descongelaron en tampón de unión con PMSF para inhibir las proteasas que pudieran degradar la proteína. Las células se rompieron por sonicación y se filtró el extracto crudo antes de cargarlo en la matriz. El extracto crudo preparado se cargó en la columna de purificación dejando una alícuota para analizar posteriormente la purificación de la proteína. Se pasó el tampón de unión con 0,5 M (NH4)2SO4, a continuación se pasó el tampón de unión con glicina para eluir las proteínas unidas con baja afinidad al metal y finalmente se eluyó nuestra proteína con imidazol en tampón de unión. El imidazol, por ser el grupo lateral del residuo His compite fuertemente con los residuos de las proteínas unidas logrando eluirlas. Se recogió el eluido en alícuotas de 1 ml que se guardaron a 4ºC. Además, los lavados Fur 16 realizados durante toda la purificación también se conservaron para poder recuperar la proteína en caso de que se hubiera eluido en alguno de ellos. Finalizada la purificación se hizo un screening de las alícuotas de proteína obtenidas junto con los lavados y la alícuota conservada de extracto crudo, para confirmar que no se había perdido proteína en los lavados y averiguar en qué fracción de alícuotas estaba la más concentrada la proteína (figura 5.7). Figura 5.7. Perfil de purificación de Fur de E. amylovora. Fracciones del lavado de la columna (A): carril 1: marcador de peso molecular, carril 2: extracto crudo y carriles 3-7: lavados consecutivos. Fracciones de laelución (B): carril 1: marcador de peso molecular, carril 2: extracto crudo, carril 3: primer lavado, carril 4: alícuota 5, carril 5: alícuota 10, carril 6: alícuota 15, carril 7: alícuota 20, carril 8: alícuota 25, carril 9: alícuota 30 y carril 10: alícuota 35. Los resultados indican que no se perdió nada de proteína en los lavados y que toda la proteína que se encontraba en el extracto crudo se obtuvo en las alícuotas recogidas. Además se observa que la máxima concentración de proteína se encuentra en torno a las alícuotas 10-15, por lo que se también se analizaron las alícuotas 7-9 y 16-18 (Figura 5.8). Figura 5.8. Perfil de alícuotas de purificación de Fur de E. amylovora. Carril 1: extracto crudo, carril 2: alícuota 7, carril 3: alícuota 8, carril 4: alícuota 9, carril 5: alícuota 16, carril 6: alícuota 17, carril 7: alícuota 18 y carril 8: marcador de peso molecular. En el perfil de la elución (figuras 5.7 y 5.8) se aprecia que la proteína comienza a concentrarse en la alícuota 6 y termina en torno a la 20. Además, se observa que se ha obtenido un alto rendimiento en la purificación y que el grado de pureza, aunque no es muy elevado, es suficiente para realizar los ensayos de caracterización parcial de la proteína que se quieren llevar a cabo. Se dializó la proteína para eliminar del medio el imidazol y las sales que pudieran hacerla precipitar. En función de los resultados anteriores, se agruparon todas las alícuotas en 3 tripas de diálisis según la concentración de Fur y la presencia de impurezas. En la primera tripa se juntaron las alícuotas de la 6 a la 14, que contenían la proteína muy concentrada y con bastantes impurezas, en la segunda las alícuotas de la 15 a la 25 que correspondían a la proteína menos concentrada pero más pura, y en la tercera las alícuotas de la 26 a la 41, que Fur Fur Fur 17 contenían la proteína más diluida y con menos impurezas. El tampón utilizado para la diálisis contenía 50 mM Tris/HCl pH 8, 100 mM de NaCl y 10% de glicerol, y el sistema se mantuvo a 4ºC. La disminución de sales del medio de la proteína durante la diálisis junto a la presencia del glicerol, tenían el fin de estabilizar la proteína en disolución y evitar su agregación. Aun así, cuando la proteína se introdujo en las tripas de diálisis se observaba que estaba comenzando a precipitar en la primera tripa, y finalizada la diálisis había precipitado una gran cantidad de proteína. Se centrifugó para evitar que la proteína sedimentada indujera la precipitación de proteína en el sobrenadante. Posteriormente se resuspendió parte del pellet en H2O y se vio que la proteína podía renaturalizarse por electroforesis SDS-PAGE. 5.3.3 Cuantificación de la proteína Se cuantificó de forma aproximada la proteína en disolución en cada uno de los tres sobrenadantes tomando una alícuota de cada uno, midiendo su absorbancia a 280 nm y calculando su concentración mediante la ley de Beer-Lambert, utilizando como blanco el tampón usado en la última diálisis, y tomando el coeficiente de extinción teórico de ProtParam para la proteína oxidada. La concentración de cada alícuota resultó ser de 391 µM en la fracción más concentrada, 33,2 µM en la fracción de concentración intermedia y 25,2 µM en la fracción con la proteína más diluida. Las tres fracciones se alicuotaron en tubos eppendorf y se conservaron a -20ºC. 5.4 Caracterización parcial de Fur de E. amylovora Se realizó una pequeña caracterización de la proteína con el fin de mostrar por un lado, que la proteína que permanecía en solución conservaba su conformación y actividad, y por otro lado con el objetivo de averiguar más a cerca de su estructura y función. El estudio de la proteína consistió en un análisis de oligomerización y entrecruzamiento, la detección de zinc estructural, y un ensayo de retardo en gel con los promotores de distintos genes que podrían estar regulados por Fur. 5.4.1 Estudio de oligomerización y entrecruzamiento Como se ha visto en otros microorganismos, las proteínas Fur tienden a dimerizar [4]. Por ello se realizó un ensayo de oligomerización incubando diferentes muestras de proteína ya hervidas y desnaturalizadas en presencia o no de DTT 10 mM durante 10 min. El DTT es un agente reductor que actuará sobre las diferentes cisteínas rompiendo los puentes disulfuro y por tanto los posibles oligómeros formados a través de enlaces disulfuro. Los resultados se analizaron por una electroforesis SDS-PAGE al 15% (figura 5.9). El tampón de carga utilizado para todas las muestras no contenía β-mercaptoetanol ya que éste también actúa como agente reductor y nos podría reducir las proteínas del control negativo. También se realizó un ensayo de entrecruzamiento. Esta técnica consiste en la formación de enlaces covalentes entre proteínas que se encuentran cercanas en solución a través de un agente entrecruzante. De esta forma es posible visualizar las interacciones de Fur con otras proteínas o entre monómeros de la misma. Para realizar este ensayo se incubó la proteína en 18 presencia y ausencia de glutaraldehído al 0,5%, como agente entrecruzante, durante 15 min y en oscuridad. El tampón de carga se añadió con β-mercaptoetanol. Los resultados se analizaron mediante una electroforesis SDS-PAGE al 15% (figura 5.9). Figura 5.9. Resultados de los estudios de oligomerización. Efecto de la adición de agente reductor (A): se cargó la proteína a 30 µM en presencia (DTT) o no (-) de DTT 10 mM y con tampón de carga sin βmercaptoetanol. Estudio de entrecruzamiento (B): se cargó la proteína a 30µM en presencia (Glu) o no (-) de glutaraldehído al 0,5% y con tampón de carga con β-mercaptoetanol. Las bandas de Fur muestran un peso menor en la forma oxidada que en la reducida. Como se ha visto en otras ocasiones con proteínas Fur [30], es posible que se deba a que la conformación de la proteína es más compacta en la forma oxidada y esto le permita migrar mejor en el gel. El ensayo de entrecruzamiento muestra una banda de peso mayor que 30 kDa que podría pertenecer a dímeros de Fur y una banda relativamente intensa casi al inicio del pocillo que podría corresponder a hexámeros de Fur. 5.4.2 Detección de zinc estructural Como ya se ha dicho, muchas proteínas Fur contienen metal estructural además de unir el metal correpresor. Mediante el ensayo de detección de zinc estructural se quiso comprobar si Fur de E. amylovora une Zn2+ como se ha visto en otros microorganismos como E. coli [5]. Este ensayo se realizó tiñendo el gel con una solución de PAR capaz de revelar el zinc al reaccionar con H2O2 (figura 5.10). Figura 5.10. Detección de zinc mediante tinción con PAR. Se cargó la proteína a 30 µM en presencia (DTT) o no (-) de DTT 10 mM y con tampón de carga sin β-mercaptoetanol. La intensidad de la banda naranja observada (figura 5.10) indicó que es posible la presencia de zinc en la proteína en condiciones reductoras. Fur (monómero) Fur (monómero) Fur Fur (dímero) 19 5.4.3 Análisis de la interacción con el DNA Por su función reguladora, es de esperar que Fur de E. amylovora se una al promotor de distintos genes relacionados con el metabolismo del hierro. Para detectar la unión de la proteína al DNA se utilizó el ensayo de retardo en gel (EMSA), que consiste en la disminución de la movilidad electroforética del DNA cuando se forma el complejo proteínaDNA. Además, se añadió un DNA competidor al que la proteína no se une, para comprobar que no se producen interacciones inespecíficas entre el DNA y la proteína. Este estudio se realizó con dos objetivos: por un lado, optimizar las condiciones de unión al DNA de Fur de E. amylovora, y por otro lado, averiguar si la proteína interviene en la regulación de distintos genes. Los promotores de los genes seleccionados para realizar el ensayo fueron los siguientes: fur, porque se ha visto que en muchos casos Fur es capaz de autorregularse, hrpL, por regular un cluster de virulencia y hrpS, por actuar como coactivador del factor σ54 implicado en respuestas a estrés [31]. La región promotora (los 400 pbs anteriores al codón ATG de cada gen aproximadamente) se amplificaron por PCR a partir de DNA genómico de E. amylovora CFBP 1430. Los ensayos de unión a DNA se realizaron bajo diferentes condiciones que pudieran afectar a la conformación y actividad de la proteína, se probaron concentraciones de proteína entre 300 y 1000 nM en presencia o ausencia de 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM Mn2+ y 1 mM Zn2+. El Mn2+ actuaría sustituyendo al hierro, que es más inestable. Las mezclas de reacción se incubaron durante unos 15 min a temperatura ambiente para dar lugar a la unión de la proteína al DNA antes de añadirles el tampón de carga y cargarlas en el gel (figura 5.11). Figura 5.11. Ensayos EMSA. En cada carril se cargó distinta concentración de proteína en presencia de 40 ng de DNA específico y 40 ng de DNA competidor, BSA 0,01 µg/ml, y 1 mM de Mn2+, DTT, EDTA y/o Zn2+ según se indica en la muestra. Como se observa en las imágenes de la figura 5.11., no se obtuvo ningún resultado positivo de unión de Fur a los promotores. Seguramente se debe a que no se han logrado las condiciones para que Fur sea activa, ya que era de esperar que al menos se uniese a su propio promotor porque la mayoría de proteínas Fur identificadas son capaces de autorregularse por este mecanismo [24]. 26 9. Anexo I Tabla 9.1 Cepas y plásmidos utilizados Cepas y plásmidos Características y uso Casa comercial Cepas de E. coli XL1-Blue RecA1, EndA1, GyrA96, Thi-1, HsdR17, SupE44, RelA1, Lac [F´ ProAB LacIq Z∆M15 Tn10 (Tetr)], para los clonajes de los plásmidos con furA, furB y furC de Anabaena. Stratagene BTH101 F-, Cya-99, AraD139, GalE15, GalK16, RpsL1 (Strr), HsdR2, McrA1, McrB1, como cepa reportera del experimento doble híbrido. Euromedex, TwoHybrid (BACTH) System Kit BL21(DE3) OmpT HsdSB (rB– mB–) Gal Dcm (DE3), para la sobreexpresión y purificación de Fur de E. amylovora. EMD Biosciences Plásmidos pKT25 Vector con sitio de clonaje múltiple en el extremo 3’ del fragmento T25 de adenilato ciclasa, de bajo número de copias y KmR. Euromedex, TwoHybrid (BACTH) System Kit pKNT25 Vector con sitio de clonaje múltiple en el extremo 5’ del fragmento T25 de adenilato ciclasa, de bajo número de copias y KmR. Euromedex, TwoHybrid (BACTH) System Kit pUT18C Vector con sitio de clonaje múltiple en el extremo 3’ del fragmento T18 de adenilato ciclasa, de alto número de copias y AmpR. Euromedex, TwoHybrid (BACTH) System Kit pUT18 Vector con sitio de clonaje múltiple en el extremo 5’ del fragmento T18 de adenilato ciclasa, de alto número de copias y AmpR. Euromedex, TwoHybrid (BACTH) System Kit pKT25-zip pUT18C-zip Vectores derivados del pKT25 y pUT18C que contienen la cremallera de leucina GCN4 como proteína de fusión a T25 y T18, respectivamente. Sirven como control positivo del experimento doble híbrido ya que al ser cotransformados las cremalleras de leucina dimerizan y se restablece la proteína adenilato ciclasa. Euromedex, TwoHybrid (BACTH) System Kit pET28-a Vector de expresión, KmR. EMD Biosciences 27 Tabla 9.2 Cebadores utilizados para el clonaje de furB y furC Cebador Secuencia Enzima FurC forward 5’-CGCGGATCCCATGCAGCAACAGGCAATATCGAC-3’ BamHI FurC reverse 5’-CGGGGTACCCGCTCTTCATCTTGAGGATGCCG-3’ KpnI FurB forward 5’-CGCGGATCCCATGAGAGCCATACGCACCCGCAG-3’ BamHI FurB reverse 5’-CGGGGTACCCGAATTTCACTCGCGTGATTCATTTGGC-3’ KpnI Tabla 9.3 Cebadores utilizados en secuenciación y detección de inserto Cebador Secuencia Plásmido Batch 1 GTGTGGAATTGTGAGCGGAT pKNT25, pUT18 Batch 2 GCCAGACTCCCGGTCGGCG pKNT25 Batch 3 GTTCGCCATTATGCCGCATC pKT25 Batch 4 GGATGTGCTGCAAGGCGATT pKT25 Batch 5 TTCCACAACAAGTCGATGCG pUT18 Batch 6 CGTCGCTGGGCGCAGTGGAACGCC pUT18C Batch 7 CTTAACTATGCGGCATCAGAGC pUT18C Tabla 9.4 Cebadores utilizados en la amplificación de promotores para EMSA Cebador Secuencia Pfur - Fw GGCCTGAACTGAGCAACCTGGCG Pfur - Rv GCGGATTTTGTCCTGTTACTTTGC PhrpL - Fw GCGCGCCGACGCACTGGCTGCTGC PhrpL - Rv GGCTTGCTCCGTTACTAAATCAGG PhrpS - Fw GCGGACATCGTGAAATACGCCATTAG PhrpS - Rv CATAAAAAATTACCCCTGCCCTATCC 28 Tabla 9.5 Composición para dos geles SDS-PAGE al 15% Reactivo Gel separador 15% Gel concentrador 5% acrilamida : bisacrilamida (30:0,8 p/v) 4,5 ml 0,66 ml Tris/HCl 1,5 M pH 8,8 3,36 ml - Tris/HCl 0,5 M pH 6,8 - 0,5 ml H2O 1,06 ml 2,80 ml SDS al 10% 45 µl 20 µl APS al 10% 30 µl 20 µl TEMED 15 µl 20 µl Tabla 9.6 Composición para dos geles EMSA al 6% Reactivo Volumen añadido acrilamida : bisacrilamida (30:0.8, p/v) 4,12 ml Tampón de electroforesis 5X 3,72 ml Glicerol al 50% 2,80 ml H2O 9,72 ml APS (0.24 g/l) 100 μl TEMED 40 μl