Repositorio Institucional de Documentos

CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DE ARAGON (CIBA) & UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Trabajo Fin de Grado Sensibilidad de células de carcinoma de colon al tratamiento con células NK alogénicas activadas Realizado por: Gustavo Lou Ramírez Director: Dr. Julián Parado Jimeno D. JULIAN PARDO JIMENO, Doctor en Ciencias Químicas e Investigador Aragón I+D en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular y Profesor Asociado del Departamento de Microbiología, Salud Pública y Medicina Preventiva de la Universidad de Zaragoza. CERTIFICAN: Que el Trabajo Fin de Grado “Sensibilidad de células de carcinoma de colon al tratamiento con células NK alogénicas activadas”, ha sido realizado por el Estudiante de Biotecnología GUSTAVO LOU RAMIREZ en el Centro de Investigación Biomédica de Aragón y en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza bajo su dirección y que reúne, a su juicio, las condiciones requeridas para optar al Título de Grado en Biotecnología. Zaragoza, junio 2014 Fdo.: D. Julián Pardo Jimeno ÍNDICE 0.- Resumen/abstract………………..…………………………………………………………………………………1 1.- Introducción……………………………………………………………………………………………………………2 1.1.- Células citotóxicas del sistema inmune…………………………………………………………….2 1.1.1.- Células NK………………………………………………………………………..………………………..2 1.1.2.- Linfocitos T…………………………………………………………………………………….………….4 1.2.- Mecanismos citotóxicos del sistema inmune……………………………………………………4 1.2.1.- Vía de exocitosis granular…………………………………………………………………………..4 1.2.2.- Vía de los receptores mortales…………………………………………………………………..5 1.3.- Apoptosis………………………………………………………………………………............................5 1.4.- Inmunoterapia y cáncer de colon……………………………………………………………………..6 2.- Antecedentes y objetivos………………………………………………………………………………………..7 3.- Materiales y métodos……………………………………………………………………………………………..8 3.1.- Materiales………………………………………………………………………………………………………8 3.1.1.- Productos para cultivos celulares……………………………………………………………….8 3.1.2.- Reactivos empleados en ensayos de citotoxicidad……………………………………..8 3.1.3.- Anticuerpos……………………………………………………………………………………………….8 3.2.- Métodos………………………………………………………………………………………….……...……….9 3.2.1.- Líneas celulares de origen humano…………………………………………….……………..9 3.2.2.- Mantenimiento de los cultivos celulares……………………………………………………9 3.2.3.- Generación de células NK activadas…………………………………………………………10 3.2.4.- Experimentos de citotoxicidad…………………………………………………………………11 3.2.5.- Análisis de proteínas……………………………………………………………………….……….13 4.- Resultados…………………………………………………………………………………………………………….14 4.1.- Expresión de proteínas citotóxicas en células NK activadas con R69 o IL-2………14 4.2.- Expresión de receptores en células NK activadas con R69 o IL-2………………………15 4.3. Experimentos de citotoxicidad………………………………………………………………………….19 4.3.1.- Optimización de las condiciones de los experimentos de citotoxicidad…………………………………………………………………………………………….…………19 4.3.2.- Comparación de la capacidad citotóxica de células NK activadas con R69 ó IL-2……………………………………………………………………………………………………………………..20 4.3.3.- Comparación de la capacidad citotóxica de células NK activadas con R69, IL-2, 721.221, 721.221 + IL-2 ó K562 + IL-2………………………………………………………….22 5.- Discusión y conclusiones/Discussion and conclusions……………………………………………23 6.- Bibliografía………………................................................................................................27 1 0.- RESUMEN El carcinoma de colon es la segunda causa de muerte más común dentro de los diferentes tipos de cáncer. El diagnóstico precoz resulta clave para un tratamiento temprano y efectivo que, en muchos de los casos, requiere cirugía para eliminar las células tumorales. Si el cáncer progresa y se detecta en estadios más avanzados, el tratamiento se basa en quimioterapia combinada con anticuerpos monoclonales como trastuzumab, cetuximab y panitumumab. En ambos casos, en un alto porcentaje de ocasiones, la efectividad es baja y los efectos secundarios abundantes, por lo que el cáncer reaparece. El descubrimiento de que las células NK se activan frente a las células cancerosas en pacientes con cánceres hematológicos trasplantados de médula ósea, ha supuesto una revolución en el tratamiento de leucemias de mal pronóstico. Se ha observado que las células NK alogénicas son capaces de eliminar células de diferentes tipos de leucemia y mielomas resistentes a tratamientos de quimioterapia. Sin embargo, estos resultados no están tan claros en cánceres sólidos. Por este motivo, en este trabajo nos hemos planteado estudiar la sensibilidad de diferentes líneas celulares de cáncer de colon humanas como HT29 y HCT116 frente células NK activadas in vitro mediante diferentes estímulos. Para ello, hemos analizado la muerte celular inducida por células NK y estudiado la expresión de las proteínas citotóxicas y receptores involucrados en tal proceso. 0.-ABSTRACT Colon cancer is the second most common cause of death from cancer. Early diagnosis is essential for an effective and early treatment which, in many cases, requires surgery to eliminate tumor cells. Chemotherapy together with monoclonal antibodies such as trastuzumab, cetuximab and panitumumab is used if cancer spreads and it is detected in advanced stages. In many cases, both treatments exhibit low effectiveness and many side effects, so cancer recurrence is possible. The discovery that NK cells are activated against bone marrow transplanted tumor cells in patients suffering from hematologic cancer represents a revolution in bad prognosis leukemia. Allogeneic NK cells have been shown to be capable of killing cells from different types of chemotherapy-resistant leukemia and myeloma. However, these results aren’t that clear in solid carcinomas. For this reason, the goal of this study is to evaluate the sensitivity of some human colon cancer cell lines such as HT29 and HC116 to in vitro-activated NK cells using different stimulus. Thus, we have analyzed NK cell-induced cell death and also studied cytotoxic proteins and surface receptors involved in such process. 2 1.- INTRODUCCIÓN El sistema inmune es el encargado de defendernos frente a patógenos y células transformadas (tumorales). Las principales células efectoras de estos procesos son los linfocitos T CD8+ y las células NK (“Natural Killer”) [1]. Para ello emplean tres mecanismos diferentes: la vía de exocitosis granular, la vía de los receptores mortales (FasL, TRAIL) y la secreción de factores solubles como interferón-γ [2, 3]. 1.1.- CÉLULAS CITOTÓXICAS DEL SISTEMA INMUNE 1.1.1.- CÉLULAS NK Las células NK humanas comprenden entre un 5% y un 20% de los linfocitos de sangre periférica y proceden de las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ [4]. Son linfocitos granulares ligeramente más grandes que las células B y T. Fenotípicamente están caracterizadas por la expresión de CD56 y la ausencia del complejo TCR/CD3. Se pueden diferenciar dos subpoblaciones de células NK en función del nivel de expresión de CD56: CD56dim y CD56bright [5]. Las CD56dim son más abundantes (90%), más citotóxicas y expresan un nivel mayor de receptores CD16, mientras que la subpoblación CD56bright, a pesar de tener menor capacidad citotóxica, es capaz de producir gran cantidad de citoquinas (IFN-γ, TNF-β, etc) [6]. A diferencia de los linfocitos T CD8+, las células NK “naive” ya expresan moléculas citotóxicas como granzima B (gzmB) y perforina (perf), lo cual facilita una activación de la respuesta inmune innata en cuestión de minutos sin requerir transcripción, traducción o proliferación celular [7, 8]. Tal activación se encuentra estrictamente regulada tanto por el balance de señales estimuladoras e inhibidoras en la célula diana, como por interferones o algunas citoquinas (IL-2, IL-12, IL-15 e IL-18) [9]. En general, los receptores de estimulación reclutan quinasas a través de dominios ITAM (“immunoreceptor tyrosine-based activating motif”) de proteínas adaptadoras, mientras que los de inhibición activan fosfatasas mediante dominios ITIM (“immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif”) localizados en sus colas citoplasmáticas [10]. Los receptores de inhibición reconocen distintos haplotipos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I/HLA-I) de las células “propias” y mantienen a las células NK inactivas. Representan el principal mecanismo de defensa para evitar que ataquen incontroladamente a las células autólogas HLA+ normales. Así, células que evadan el reconocimiento de los linfocitos T CD8+, ya sea por ausencia de MHC-I, evento frecuente en procesos de transformación tumoral o infección por ciertos virus, o porque presenten un MHC-I alogénico, serán potencialmente susceptibles al ataque de las células NK [8-11]. 3 Tabla 1. Receptores de activación y de inhibición de las células NK y sus correspondientes ligandos [12]. Los receptores de inhibición más importantes son los KIR (“Killer Ig-like Receptor”), que reconocen los haplotipos HLA-A, HLA-B y HLA-C. Se designan en función del número de dominios inmunoglobulina que tengan (D0, D1, D2) y en función de la longitud del dominio citoplasmático, pudiendo ser L (“long”), si tienen dominios ITIM, o S (“short”), si carecen de ellos. NKG2A, perteneciente a la familia NKG2, reconoce el haplotipo HLA-E [11] y es presentado en la membrana plasmática en forma de heterodímero junto con CD94 [13]. A diferencia de los KIR, cuya expresión se mantiene constante, los receptores NKG2 son modulados por la acción de IL-2, IL-12 o IL-15 [14, 15].También hay otros receptores de inhibición tipo LILR (“Leukocyte Ig-like Receptor”) como ILT-2 [16]. Los receptores de activación (“Killer Activation Receptor” o KAR), en cambio, reconocen ligandos que expresan las células diana cuando están dañadas o sometidas a estrés. Uno de los receptores de activación más importantes es NKG2D, que reconoce a los ligandos MICA, MICB y ULBPs. NKp46, NKp30 y NKp44 pertenecen al grupo de receptores NCR (“Natural Cytotoxicity Receptors”) y representan los receptores más importantes en la lisis de tumores mediada por células NK [17]. NKp46 4 casi solo se expresa en células NK y es utilizado como marcador. NKp44 únicamente se expresa en células NK activadas y en una minoría de células dendríticas. El nivel de expresión de estas tres proteínas se correlaciona con la capacidad de inducir muerte en células diana [18]. Por otro lado, DNAM-1 es una proteína que actúa como correceptor favoreciendo la adhesión a la célula diana [5, 9]. 1.1.2.- LINFOCITOS T Los linfocitos T tienen la capacidad de reconocer antígenos extraños de manera específica y reaccionar contra ellos. Su activación se lleva a cabo a través de su receptor, el TCR (“T Cell Receptor”), que reconoce el antígeno siempre y cuando éste se encuentre unido a MHC-I, presente en la mayoría de las células, o MHC-II, presente solo en las células presentadoras de antígeno (APC). Para la correcta activación del linfocito T, es necesario que el TCR se encuentre unido al complejo CD3, que es el que traduce las señales exteriores al interior celular [19, 20]. Existen dos tipos fundamentales de linfocitos que expresan TCR: CD8+ y CD4+. Los linfocitos T CD8+, o linfocitos T citotóxicos (CTLs) una vez activados, son capaces de inducir muerte en células diana que reconozcan. Los linfocitos T CD4+ o auxiliares, tienen como función regular la activación de otras células del sistema inmune como los linfocitos CD8+ [21]. Los linfocitos T CD8+ no se encuentran pre-activados como las células NK. Para transformarse en linfocitos T citotóxicos (activos), requieren un encuentro con las células presentadoras de antígeno (APC) y la formación del complejo trimolecular: MHC-I/antígeno/TCR/CD3. Además, necesitan señales de coestimulación que son aportadas por la unión de la molécula de superficie CD28 del linfocito con CD80 y CD86, expresados junto a MHC por las células presentadoras de antígeno [22, 23]. Por último, necesitan una tercera señal, proporcionada por IL-12 o interferón de tipo 1, crucial para que expresen gzmB y perf y puedan eliminar la célula diana [24]. 1.2.- MECANISMOS CITOTÓXICOS DEL SISTEMA INMUNE 1.2.1.- VÍA DE EXOCITOSIS GRANULAR Tanto en células NK como en linfocitos T citotóxicos, las proteínas citotóxicas se localizan en gránulos citoplasmáticos [25]. La perf es la encargada de formar poros en la célula diana para que puedan penetrar otras proteínas de los gránulos como las gzms [26]. La eliminación de la perf en ratones (knock-out) no tiene consecuencias para el desarrollo de linfocitos T [27], pero afecta severamente a la función citolítica y a la respuesta inmune [28]. Las gzms son serin-proteasas asociadas a los gránulos citotóxicos en una forma inactiva gracias a inhibidores como las serpinas o al pH ácido de los gránulos. Cuando 5 se produce el contacto entre la célula efectora y la célula diana, se produce una polarización de los gránulos, que migran hacia la zona de contacto (sinapsis inmunológica) a través de los microtúbulos y son exocitados. Al liberarse su contenido, las gzms se activan a pH neutro y penetran en la célula diana a través de la perf, que oligomeriza en la membrana de la célula diana en presencia de calcio extracelular [1]. Las gzms más importantes son la gzmA y la gzmB. La gzmB es principal inductora de apoptosis. Produce una activación directa de las caspasas, especialmente la caspasa ejecutora, la caspasa-3, aunque también es capaz de activar la muerte celular por procesamiento directo de Bid para activar la vía intrínseca de apoptosis (mitocondrial) [29]. Por otro lado, la gzmA no tiene un papel relevante en citotoxicidad, pero se ha visto que es capaz de estimular la producción de citoquinas proinflamatorias en macrófagos [30-32]. 1.2.2.- VÍA DE LOS RECEPTORES MORTALES Los receptores mortales están localizados en la membrana celular. Pertenecen a la superfamilia del receptor de necrosis tumoral. Estos incluyen Fas (CD95/APO-1), receptor TNF tipo I y los receptores DR4 y DR5 cuyo ligando es TRAIL (“tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand”) [33]. Cada uno presenta un dominio citosólico mortal (DD), el cual interacciona con el dominio mortal complementario expresado por la proteína FADD, la cual activa la cascada intracelular de la vía extrínseca apoptótica [34]. 1.3.- APOPTOSIS El término apoptosis fue utilizado por primera vez en 1972 por Kerr, Wyllie y Currie para describir una nueva morfología cuando las células morían [35]. Se trata de un proceso ubicuo y estrictamente regulado en el que las células sufren una muerte celular programada [36]. La resistencia a la apoptosis, por ganancia de señales antiapoptóticas y pérdida de señales proapotóticas, es la característica fundamental que define al cáncer [37]. Las dos vías principales de apoptosis son la vía extrínseca y la vía intrínseca. La vía extrínseca comienza con la interacción entre ligandos y sus receptores específicos, como Fas, receptor TNF tipo I y los receptores mortales (DR4, DR5) y termina con el reclutamiento de las caspasas iniciadoras 8 y 10 y la activación de las caspasas 3 y 7 ejecutoras de la apoptosis. La vía intrínseca (o mitocondrial) es activada por diversos estímulos intracelulares como el daño del DNA, hipoxia, separación celular, estrés celular, y moléculas citotóxicas que convergen en la mitocondrial, donde las señales proapoptóticas (Bid, Bad, Bim) dejan de ser inhibidas por miembros de la familia Bcl-2 (Bcl-2 y Bcl-xL). Este exceso de las señales proapoptóticas sobre las antiapoptóticas produce una 6 permeabilización de la membrana externa mitocondrial, que conduce a la liberación de proteínas como citocromo c y Smac/Diablo desde el espacio intermembrana al citosol a través de poros formados por las proteínas proapoptóticas Bak y Bax. Una vez liberado el citocromo c, se une a Apaf-1 y a la pro-caspasa-9 para formar el apoptosoma, el cual activará a la caspasa-3 ejecutora [38, 39]. 1.4.- INMUNOTERAPIA Y CÁNCER COLORECTAL El cáncer de colon es una causa mayor de mortalidad en todo el mundo y representa uno de los tipos de cáncer más común [40]. Cirugía, quimio y radioterapia han sido las principales estrategias para eliminar tumores en pacientes, pero el desarrollo de resistencias a fármacos o a la radiación conduce a una reaparición muy significativa del cáncer. Las células del sistema inmune innato y adaptativo evitan la formación de neoplasias. Sin embargo, las células malignas pueden desarrollar mecanismos para evitar la “inmunovigilancia”, por ejemplo, produciendo citoquinas inmunosupresoras, como IL-10 y TFG-β, y alterando la expresión de proteínas de superficie como MHC-I [41]. Durante los últimos años se han investigado nuevos tratamientos, como el uso de anticuerpos monoclonales (mAbs) que permiten atacar de modo más específico a las células tumorales. Tienen como función favorecer la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (“Antibody-dependent celular cytotoxicity” o ADCC) a través de CD16, activar el Complemento o inactivar las señales de proliferación. Algunos mAbs utilizados en cáncer colorrectal son cetuximab y panitumumab, usados en casos de metástasis y cuya diana es el receptor del factor de crecimiento epidérmico [42], trastuzumab, que reconoce y bloquea el receptor HER-2, o bevacizumab, que inactiva el VEGF [43]. Otra línea de estudio es la inmunoterapia centrada en la capacidad de las células NK para eliminar diferentes tipos de tumores, pues una baja capacidad citotóxica de éstas se ha asociado a un mayor riesgo de padecer cáncer [44]. Las células NK alogénicas activadas son capaces de eliminar células de cánceres hematológicos independientemente de su expresión de MHC-I [45, 46], así como células de glioblastoma con propiedades de células madre (“Cancer-Stem Cells” o CSC) [47, 48]. En lo que atañe a tumores sólidos, son capaces de eliminar CSC sin haber sido activadas previamente, pero son ineficaces contra células tumorales diferenciadas [49]. Sin embargo, datos muy recientes sugieren que diferentes líneas celulares de cáncer de colon son sensibles a las células NK activadas in vitro [50]. 13 luz y se procedió al análisis de los marcadores apoptóticos de cada muestra mediante un citómetro de flujo FACScan (BD Biosciences). Además, se utilizaron pocillos de cada línea celular diana, sin células efectoras, como control. 3.2.5.- ANALISIS DE PROTEÍNAS 3.2.5.1.- Análisis de la expresión de proteínas de membrana mediante citometría de flujo Se realizó el marcaje de KAR y KIR mediante anticuerpos para comparar la expresión de estos antes y después de la activación. Para ello, se centrifugaron las células y se resuspendieron en el volumen necesario de FACS buffer (PBS al 5% de SFB y 0,1% de NaN3). Se dispusieron 105 células en 100 μl por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo cónico. A continuación se centrifugó a 3500 rpm durante 2 minutos y se incubó con el anticuerpo durante 20 minutos a 4 °C. Tras esto, se realizaron dos lavados con FACS buffer y se fijaron las células con PFA 1% para analizar cada muestra mediante citometría de flujo. Debemos puntualizar que, para poder separar nuestra población de interés con el citómetro (CD56+, CD3-), a cada uno de los pocillos se le añadió, además del anticuerpo frente al receptor correspondiente, un anticuerpo CD3-FITC y otro CD56-APC. Además, se hizo uso de los isotipos IgG1 e IgG2b como control. 3.2.5.2.- Análisis de la expresión de proteínas intracelulares mediante citometría de flujo En primer lugar se realizó el marcaje extracelular. Se centrifugó el número necesario de células y se resuspendió en FACS buffer (PBS al 5% de SFB y 0,1% NaN3). Se dispusieron 2x105 células en 100 μl por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo cónico. Posteriormente se centrifugó a 3500 rpm durante 2 minutos y se incubó con los anticuerpos CD3-FITC y CD56-APC durante 20 minutos a una temperatura de 4°C. En segundo lugar, se procedió al marcaje con los anticuerpos frente a gzmB y perf. Para ello se hizo uso de una solución de permeabilización (PBS al 5% de SFB y 0,1% de saponina) durante 40 minutos a temperatura ambiente y en ausencia de luz. A continuación, se realizaron dos lavados y se fijaron las células con PFA 1%. Al igual que en el marcaje de proteínas de membrana, se usaron los isotipos IgG1 e IgG2b como control. 14 4.- RESULTADOS 4.1.- EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS CITOTÓXICAS EN CÉLULAS NK ACTIVADAS CON R69 Ó IL-2 Las proteínas citotóxicas de los gránulos citoplasmáticos son una de las vías a través de las cuales las células NK y los linfocitos T CD8+ inducen muerte en las células diana. Para conocer y cuantificar la expresión de estas proteínas en células NK en respuesta a diferentes estímulos, se realizó un marcaje intracelular, marcando previamente las subpoblaciones linfocitarias con CD3 y CD56, a los 5 días, para cada una de las dos activaciones (IL-2 y R69). Como control, se realizó un marcaje de las células NK naive sin activar a día 0. El nivel de expresión se observó mediante citometría de flujo de fluorescencia. Figura 1. Porcentaje de células NK CD56+/CD3naive (azul) y activadas, con células R69 (rojo) o IL-2, (verde) que expresan gzmB y perf (A) y nivel de expresión de las mismas (B). Los resultados se representan como “media ± sd” de 4 experimentos independientes analizados mediante el test de t-student comparando cada activación con el control: p<0,05 (*); p<0,01 (**); p<0,001 (***). Prácticamente el 100% de las células NK sin activar (naive) expresan perf y gzmB, sin observarse cambios significativos con ningún tipo de activación (Fig. 1A). Midiendo la intensidad de fluorescencia media (MFI) con el citómetro de flujo podemos saber cuánta perf y gzmB expresan las células (Fig. 1B). En este caso, los niveles de perf han aumentado ligeramente tras la activación, pero no significativamente. Sin embargo, la MFI de gzmB ha aumentado exponencialmente, pues de un valor de 370 pasamos a unos valores de 2.884 y de 3.055 para las activaciones con R69 e IL-2 respectivamente. Teniendo en cuenta los resultados, podemos decir que ambos modelos son buenos a priori para llevar a cabo la activación in vitro de células NK. Además, es de suponer que las células que expresen un mayor nivel de perf y gzmB (IL-2) sean más citotóxicos que aquellos que expresen un menor nivel (R69), pese a que las diferencias no sean significativas. A B 15 4.2.- EXPRESIÓN DE RECEPTORES EN CÉLULAS NK ACTIVADAS CON R69 Ó CON IL-2 A diferencia de los linfocitos T CD8+, las células NK se activan gracias a un balance entre estímulos positivos y negativos, de tal forma que las que resultan más intensas son las que acaban imponiéndose. Figura 2. Porcentaje de células NK CD56+/CD3naive (azul) y activadas,con R69 (rojo) o IL-2 (verde), que expresan diferentes receptores de activación (A) y nivel de expresión de los mismos (B). Los resultados se representan como “media ± sd” de 4 experimentos independientes analizados mediante el test de t-student comparando cada activación con el control (naive): p<0,05 (*); p<0,01 (**); p<0,001 (***). En C) se muestran ejemplos representativos del análisis de la expresión de diferentes receptores de activación en células NK naive y estimuladas, usando el anticuerpo frente a IgG1 como control. A B C 16 Para estudiar como varía la expresión de algunos de estos receptores de activación e inhibición, se realizó el marcaje de las subpoblaciones linfocitarias CD3 y CD56 y se procedió con el marcaje extracelular de los receptores tras 5 días de activación. Como control, se realizó el mismo estudio con linfocitos recién aislados de sangre de los mismos pacientes. El nivel de expresión se observó mediante citometría de flujo de fluorescencia. Las células NK naive no expresan NKp44. Sin embargo, tras activarse, no solo aumenta el porcentaje de células que lo expresan, sino que además lo hacen fuertemente. Como podemos ver en la figura 2, NKp44 pasa de no ser expresado, a estar presente en un 27,5% de las células NK activadas con R69 con una MFI de 144. Del mismo modo, el 50% de las células NK activadas con IL-2 expresan NKp44 en su superficie con una MFI de 212. A diferencia de NKp44, alrededor del 50% de las células NK sin activar expresan NKp46. Este valor se incrementa al 70% después de ambos tipos de estimulación. Aunque no es un cambio muy pronunciado, la MFI se duplica en los linfocitos activados con R69 y se triplica en los estimulados con IL-2. El receptor NKp46 presenta una dinámica opuesta. Un 80% de las células NK naive expresan el receptor, y este valor se mantiene más o menos constante tras la activación con R69 e incluso desciende levemente tras la activación con IL-2. En cuanto a la MFI, no aumenta en las células tratados con IL-2, pero se duplica en las células estimuladas con la línea celular linfoblastoide. DNAM-1 no es un receptor de activación como tal, sino que es una proteína que interviene en la adhesión celular de la célula efectora con la célula diana, pero dada su función se engloba en dicho grupo. Prácticamente el 100% de las células NK naive lo expresan. En la figura 2A se puede ver como el porcentaje de células NK activadas con IL-2 que expresan DNAM-1 desciende ligeramente aunque no significativamente, sin embargo esto puede deberse a que el marcaje con el anticuerpo frente a DNAM-1 se realizó dos veces, en lugar de cuatro como el resto. En cuanto al nivel de expresión, aumenta en el mismo grado en ambos tipos de activación. Por último, los receptores NKG2D y NKG2C, pertenecientes a la familia de receptores NKG2, muestran un comportamiento diferente. Por un lado, casi todas las células NK expresan NKG2D, llegando a aumentar casi al 100% tras la estimulación con R69 o IL-2. A pesar de que en este aspecto no haya un cambio considerable, el nivel de expresión aumenta enormemente tras la estimulación, pasando de una MFI de 68 en células sin activar a 175 y 275 en las activadas con R69 e IL-2 respectivamente. Por otro lado, sólo el 30% de la población linfocitaria CD56+/CD3muestra NKG2C en su superficie. Aunque este valor disminuye al 10% tras la activación, el nivel de expresión aumenta. 17 Figura 3. Porcentaje de células NK CD56+/CD3naive (azul) y activadas, con R69 (rojo) o IL-2, (verde) que expresan diferentes receptores de inhibición (A) y nivel de expresión de los mismos (B). Los resultados se representan como “media ± sd” de 4 experimentos independientes analizados mediante el test de t-student comparando cada activación con el control: p<0,05 (*); p<0,01 (**); p<0,001 (***). En C) se muestran ejemplos representativos del análisis de la expresión de diferentes rceptores de inhibición en células NK naive y estimuladas, utilizando el anticuerpo frente a IgG2b como control. Como se observa en la figura 3, la expresión de los receptores de inhibición de las células NK es muy variable. Aproximadamente, un 40% de las células CD56+/CD3naive B A C 18 expresa NKG2A, aumentando a un 70% tras la activación con R69 y a un 60% con IL-2. A pesar de que el número de células que presentan la proteína en su superficie es mayor tras activarse con R69 que con IL-2, la MFI es ligeramente superior en las células estimuladas con IL-2. En ambos casos, la MFI se duplica con respecto a las células sin activar. El receptor de inhibición ILT-2 es expresado por más de la mitad las células NK sin activar. Al activarse con R69, muestran una disminución del porcentaje y del nivel de expresión de la proteína, con respecto al control, mayor que las células NK activadas con IL-2. Las células NK sin activar no expresan KIR2DL5. Tras la estimulación con R69, no varió ni el porcentaje ni el nivel de expresión de la proteína en las células NK de ningún paciente. Sin embargo, en uno de los pacientes, tras la estimulación con IL-2, se observó una expresión del 11,3% y una MFI de 172. En el caso de KIR2DL1/DS1, el porcentaje de expresión en las células NK es el mismo en las tres situaciones estudiadas: células NK naive, activadas con R69 o con IL-2. A pesar de esto, como se puede ver en la figura 3B, el nivel de expresión (MFI), se incrementa con respecto al control, siendo este incremento mayor en las células NK activadas con IL-2 que en las activadas con R69. KIR2DL2/DL3 muestra un comportamiento similar. Alrededor del 25% de las células NK naive expresan la proteína y este porcentaje se mantiene constante tras ambos tipos de estimulación. Al igual que en el caso anterior, la MFI también aumenta exponencialmente, pasando de un valor de 136 en los cultivos sin activar, a 574 en los activados con R69, y a 740 en los activados con IL-2. Por último, KIR3DL1 prácticamente no es expresado células NK sin activar. Tanto el porcentaje de células NK que lo expresan como su nivel de expresión aumentan muy ligeramente tras la estimulación, en mayor medida en los cultivos activados con IL-2 que en aquellos activados con R69. En conjunto se observa que, tanto en los receptores de activación como en los de inhibición, la expresión es mayor en las células NK estimuladas con IL-2 que en las estimuladas con R69. De las doce proteínas estudiadas, solamente NKp46 y NKG2A muestran una dinámica diferente. Teniendo en cuenta que la activación de las células NK está regulada por el balance de señales estimuladoras e inhibidoras, el método que las active más eficazmente será aquel que proporcione un mayor número de señales positivas en detrimento de las negativas. 19 4.3.- EXPERIMENTOS DE CITOTOXICIDAD 4.3.1.- OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE LOS EXPERIMENTOS DE CITOTOXICIDAD Los protocolos utilizados para realizar los experimentos de citotoxicidad se basaron en otros desarrollados por el personal del laboratorio [45]. Sin embargo, tales protocolos estaban descritos para estudiar la muerte en líneas celulares en suspensión (cánceres hematológicos) en lugar de células adherentes (tumores sólidos). Así, nos planteamos cambiar algunas de las condiciones en los ensayos. En primer lugar y más importante, decidimos aumentar la cantidad de anexina V Dy634 usada como marcador apoptótico de las dianas HCT116 y HT29 ya que tienen un tamaño superior al de otras utilizadas anteriormente como K562, Jurkat o H929. Por ello, pasamos de utilizar 1 µL por pocillo (punto de experimento) a 2 μL. Figura 4. Comparativa de la expresión de marcadores apoptóticos con 7-AAD y con 1 μL de anexina V (izquierda) o con 2 μL de anexina V (derecha). Los números representan el porcentaje de células en cada cuadrante. En este ejemplo se ilustran los marcadores apoptóticos de dos puntos de experimento idénticos, pertenecientes células NK activadas con IL-2 frente a células HCT116 con un ratio E:T de 9:1. A pesar de que la muerte de las células diana es prácticamente similar, el marcaje es mucho más limpio cuando se utilizan 2 µL de anexina V en lugar de 1 µL. Las poblaciones se separan mucho mejor, facilitando la selección de los “gates” a la hora de analizar los resultados. Las células adherentes necesitan tiempo para pegarse a la placa donde se cultivan. Por ello, nos preguntamos cuánto tiempo sería necesario para que las células de adhirieran a la placa antes de añadir las células NK. Para ello, observamos en el microscopio invertido como evolucionaba el “pegado” de las líneas celulares HT29 y HCT116. Al cabo de 7 u 8 horas, todavía permanecían sin adherirse completamente. Por lo tanto, decidimos cultivar las células 24 horas antes de añadir las células NK. Otro aspecto que se estudió fue el número de células diana que se disponían por pocillo: 10.000, 15.000 ó 20.000. Debido a que las 10.000 células apenas llenaban el 20 pocillo y que las 20.000 prácticamente alcanzaban la confluencia, acentuada todavía más por el crecimiento durante la incubación overnight, nos decantamos por disponer 15.000 células por pocillo. Por último, comparamos la influencia de la adhesión celular sobre la capacidad citotóxica de las células NK activadas con R69 frente a las líneas celulares diana. Figura 5. Comparativa de la sensibilidad de las líneas celulares HT29 (A) y HCT116 (B) , incubadas tres horas antes del ensayo (rojo) y overnight (azul), frente a células NK activadas con R69. En C) se muestran ejemplos representativos del análisis de la citotoxicidad de las células NK estimuladas con R69 sobre las células HT29 incubadas overnight. Los números representan el porcentaje de células en cada cuadrante. Como se puede ver en la figura 5, la sensibilidad de las líneas celulares diana (HT29 y HCT116) frente células NK activadas con R69 fue la misma independientemente de si las células dianas se habían cultivado 3 horas antes o 24 horas antes de añadir las células NK. Nos decantamos por la incubación overnight teniendo en cuenta que, no sólo es logísticamente más práctica sino que además es más fisiológica. 4.3.2.- COMPARACIÓN DE LA CAPACIDAD CITOTÓXICA DE LAS CÉLULAS NK ACTIVADAS CON R69 Ó IL-2 Una vez optimizados los protocolos para los experimentos de citotoxicidad, se analizó la capacidad citotóxica de células NK activadas con R69 o IL-2 frente a diferentes líneas celulares de cáncer de colon (HT29 y HCT116). Para ello, se incubaron células NK purificadas con las células diana a diferentes ratios E:T como se describe en A B C 21 la sección de metodología. Como control, se utilizó la línea celular K562, que no expresa HLA-I y es por tanto muy sensible a las células NK. Se analizó la citotoxicidad analizando la translocación de fosfatidilserina (anexina V) y la permeabilidad de la membrana plasmática (7-AAD). Figura 6. Comparativa del efecto citotóxico de las células CD56+ activadas con R69 (rojo) o IL-2 (azul) frente a las células diana K562. Como ya sabíamos de antemano por resultados obtenidos por investigadores de nuestro laboratorio, las células NK activadas estimuladas con R69 son capaces de inducir muerte en las células K562. Sin embargo, en este experimento se muestra como las células NK son capaces de infligir más muerte en la línea celular K562 cuando son estimuladas con IL-2 durante el mismo periodo de tiempo, sin observarse cambios significativos. Figura 7. Comparativa del efecto citotóxico de las células NK CD56+ activadas con R69 (rojo) e IL-2 (azul) frente a las células diana HT29 (A) y HCT116 (B). Los resultados se representan como “media ± sd” de 4 experimentos independientes analizados mediante el test de t-student comparando ambos tipos de activación entre sí: p<0,05 (*); p<0, 01 (**). En la figura 7 podemos ver a simple vista como las células NK activadas con IL-2 son más citotóxicas que las activadas con R69. Por ejemplo, las células activadas IL-2 inducen una muerte del 75% en las células HT29 al ratio E:T de 9:1, mientras que las activadas con R69 tan solo matan al 43%. B A 22 La sensibilidad de las células HT29 y HCT116 es prácticamente la misma frente a las células NK activadas con R69. Del mismo modo ocurre con las activadas con IL-2. Cabe destacar que los puntos del experimento de las figuras 7A y 7B correspondientes al ratio 6:1 muestran un valor igual o superior a sus correspondientes ratios 9:1. Este hecho no lógico, se debe a que este ratio sólo se ensayó una vez debido a la falta de linfocitos obtenidos en la purificación con el MACS. Por lo tanto, los resultados seguramente sean superiores a la media, menos exactos y menos representativos. 4.3.3.- COMPARACIÓN DE LA CAPACIDAD CITOTÓXICA DE LAS CÉLULAS NK ACTIVADAS CON R69, IL-2, 721.221, 721.221 + IL-2 Ó K562 + IL-2 Por último, decidimos añadir a nuestro estudio tres tipos de activación de células NK adicionales, dos de ellas haciendo uso de la línea celular linfoblastoide EBV+ 721.221, con y sin IL-2. El tercer tipo de activación incorporada fue la de las células K562, que no expresan HLA-I, con IL-2. En este caso, el protocolo fue el mismo que en ensayos previos [45]. La línea 721.221 tiene un origen similar a la R69 (células B transformadas con EBV), pero al contrario que R69, no expresa HLA-I. Figura 8. Comparativa del efecto citotóxico de las células CD56+ activadas con R69 (rojo), IL-2 (azul), 721.221 (verde), 721.221 + IL-2 (rosa) y K562 + IL-2 (caqui) frente a las células diana K562 (A) y HT29 (B). Como se puede ver en la figura 8A, las células NK activadas con 721.221, 721.221 + IL-2, IL-2 y R69 son muy citotóxicas frente a la línea celular control K562, confirmándose que la activación ha sido satisfactoria. Sin embargo, las células NK activadas con K562 + IL-2 prácticamente no han inducido muerte. Este hecho es extraño dado que la línea K562 no expresa MHC-I en su superficie, además de que son las células frente a las que se han activado las células NK. En la figura 8B se observa una dinámica similar. Las células NK activadas con K562 + IL-2 inducen prácticamente el mismo nivel de muerte en las células control que en la línea HT29. Se puede ver a simple vista que las células NK estimuladas con R69 son A B 29 45. Sanchez-Martinez et al., Human NK cells activated by EBV+ lymphoblastoid cells overcome anti-apoptotic mechanisms of drug resistance in haematological cancer cells. 2014 (sent, not published yet). 46. Ruggeri, L., et al., Natural killer cell recognition of missing self and haploidentical hematopoietic transplantation. Semin Cancer Biol, 2006. 16(5): p. 404-11. 47. Castriconi, R., et al., NK cells recognize and kill human glioblastoma cells with stem celllike properties. J Immunol, 2009. 182(6): p. 3530-9. 48. Avril, T., et al., Human glioblastoma stem-like cells are more sensitive to allogeneic NK and T cell-mediated killing compared with serum-cultured glioblastoma cells. Brain Pathol, 2012. 22(2): p. 159-74. 49. Tallerico, R., et al., Human NK cells selective targeting of colon cancer-initiating cells: a role for natural cytotoxicity receptors and MHC class I molecules. J Immunol, 2013. 190(5): p. 2381-90. 50. Bhat, R. and J. Rommelaere, NK-cell-dependent killing of colon carcinoma cells is mediated by natural cytotoxicity receptors (NCRs) and stimulated by parvovirus infection of target cells. BMC Cancer, 2013. 13: p. 367. 51. Sanchez-Martinez, D., et al., All-trans retinoic acid (ATRA) induces miR-23a expression, decreases CTSC expression and granzyme B activity leading to impaired NK cell cytotoxicity. Int J Biochem Cell Biol, 2014. 49: p. 42-52. 52. Klein, E., et al., Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer, 1976. 18(4): p. 421-31. 53. Saez-Borderias, A., et al., IL-12-dependent inducible expression of the CD94/NKG2A inhibitory receptor regulates CD94/NKG2C+ NK cell function. J Immunol, 2009. 182(2): p. 829-36. 54. Kaiserman, D., et al., The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol, 2006. 175(4): p. 619-30. 55. Harari, A., et al., Distinct profiles of cytotoxic granules in memory CD8 T cells correlate with function, differentiation stage, and antigen exposure. J Virol, 2009. 83(7): p. 286271. 56. Vitale, M., et al., NKp44, a novel triggering surface molecule specifically expressed by activated natural killer cells, is involved in non-major histocompatibility complexrestricted tumor cell lysis. J Exp Med, 1998. 187(12): p. 2065-72. 57. Lopez-Botet, M., et al., Structure and function of the CD94 C-type lectin receptor complex involved in recognition of HLA class I molecules. Immunol Rev, 1997. 155: p. 165-74.