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Abstract
Los aldehídos y cetonas son los grupos de moléculas con mayor diversidad sensorial en el vino. La degradación oxidativa asociada a estos compuestos conlleva una rápida pérdida de las cualidades aromáticas del vino y la formación de otros aromas que se asocian al vino deteriorado, por lo que se puede afirmar que la vida útil de un vino termina cuando el aroma de ciertos carbonilos predomina sobre el resto. El análisis de estos compuestos presenta un desafío, ya que son moléculas muy volátiles y reactivas, capaces de formar fuertes interacciones con otras moléculas, entre las que destaca el SO2. Por eso es importante determinar las concentraciones de los compuestos libres y ligados de forma simultánea utilizando surrogados, moléculas cuyo comportamiento es muy similar al de los analitos, mediante un método de HS-SPME-GC-MS. Para que las estimaciones sean correctas, se deben conocer de forma precisa las concentraciones de los surrogados. Por ello se ha llevado a cabo el estudio de la estabilidad de los compuestos carbonílicos (analitos y surrogados) y estándares internos presentes en las disoluciones utilizadas en este método, ya que nos consta que pueden degradarse a pesar de todas las precauciones tomadas en su conservación y manejo. Para ello se preparó una disolución con los compuestos de interés y se siguió su evolución durante 75 días, con un total de 32 mediciones. A partir de los datos obtenidos se representó la concentración de los mismos en relación con la inicial para conocer la tendencia que seguían. Se realizó un estudio estadístico de los compuestos carbonílicos y se consiguió clasificarlos en grupos según su tiempo de estabilidad. Con los datos que se obtuvieron se propone modificar las dos disoluciones de trabajo habituales y dividir cada una de ellas en cuatro grupos atendiendo a los distintos tiempos de estabilidad de los compuestos (1 semana, 2 semanas,1 mes, 2 meses). Herrero Martín, Javier; Ferreira González, Vicente
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TFG2014 PROTOCOLIZACIÓNDELANÁLISISDEALDEHÍDOSDE OXIDACIÓNPRESENTESENVINOSESPAÑOLESYSU RELACIÓNCONDIVERSOSPARÁMETROS COMPOSICIONALESYDEALMACENAMIENTO Director:Dr.VicenteFerreira JavierHerreroMartín
TFG2014 1 Resumen Losaldehídosycetonassonlosgruposdemoléculasconmayordiversidadsensorialen elvino.Ladegradaciónoxidativaasociadaaestoscompuestosconllevaunarápidapérdidade lascualidadesaromáticasdelvinoylaformacióndeotrosaromasqueseasocianalvino deteriorado,porloquesepuedeafirmarquelavidaútildeunvinoterminacuandoelaroma deciertoscarbonilospredominasobreelresto. Elanálisisdeestoscompuestospresentaundesafío,yaquesonmoléculasmuy volátilesyreactivas,capacesdeformarfuertesinteraccionesconotrasmoléculas,entrelas quedestacaelSO2.Poresoesimportantedeterminarlasconcentracionesdeloscompuestos libresyligadosdeformasimultáneautilizandosurrogados,moléculascuyocomportamientoes muysimilaraldelosanalitos,medianteunmétododeHS‐SPME‐GC‐MS.Paraquelas estimacionesseancorrectas,sedebenconocerdeformaprecisalasconcentracionesdelos surrogados. Porellosehallevadoacaboelestudiodelaestabilidaddeloscompuestos carbonílicos(analitosysurrogados)yestándaresinternospresentesenlasdisoluciones utilizadasenestemétodo,yaquenosconstaquepuedendegradarseapesardetodaslas precaucionestomadasensuconservaciónymanejo.Paraellosepreparóunadisolucióncon loscompuestosdeinterésysesiguiósuevolucióndurante75días,conuntotalde32 mediciones.Apartirdelosdatosobtenidosserepresentólaconcentracióndelosmismosen relaciónconlainicialparaconocerlatendenciaqueseguían.Serealizóunestudioestadístico deloscompuestoscarbonílicosyseconsiguióclasificarlosengrupossegúnsutiempode estabilidad. Conlosdatosqueseobtuvieronseproponemodificarlasdosdisolucionesdetrabajo habitualesydividircadaunadeellasencuatrogruposatendiendoalosdistintostiemposde estabilidaddeloscompuestos(1semana,2semanas,1mes,2meses).
TFG2014 2 Abstract Aldehydesandketonesaremoleculargroupswithgreatestsensorydiversityinwine. Oxidativedegradationassociatedwiththesecompoundsleadstoarapidlossofthearomatic qualitiesofthewineandtheformationofotherflavorsthatareassociatedwithspoiledwine. Itcanbestatedthatthelifeofawineendswhenthearomaofcertaincarbonylspredominates overtherest. Theanalysisofthesecompoundspresentsachallenge,astheyareveryvolatileand reactive,capableofformingstronginteractionswithothermolecules,amongwhichstandsout SO2.Becauseofthat,thedeterminationofbothfreeandboundformsofthesecompoundsis crucial.Thisisachievedbyusingsurrogatemolecules,whosebehaviorisverysimilartothe analytes,andbyanalysisusingaHS‐SPME‐GC‐MSmethod.Inordertoensurethatthe estimationsarerighttheconcentrationsofthesurrogatesshouldbeknownaccurately. Asanalytes,internalstandardsandsurrogatescanbedegradeddespiteoftheuseof thoroughpreservationandmanipulationmeasures,theshelf‐lifeofworkingsolutionswith thosefamiliesofcompoundsshouldbeassessed. Consequentlyasolutionwiththecompoundsofinterestwaspreparedandstoredand usedfollowingthoroughstandardproceduresalong75days.Thestabilityofthecompoundsin thesolutionwasassessedbyitsanalyticalcontrol,withatotalof32measurementsevenly distributedalongthe75days.Differentplotsofabsoluteorrelativeareasversustimewere madeanddifferentstatisticaltechniqueswereappliedinordertoassessthedegradationrate ofthedifferentcompounds.Compoundscouldbesatisfactorilyclassifiedintofourdifferent groupsofsimilarstabilities. Thepracticaloutcomeofthisworkistheproposalofsplittingmothersolutionsinto the4differentgroupsofstability(1week,2weeks,1month,2months),minimizing experimentaleffortandpreservingthemethodquality.
TFG2014 3 CONTENIDOPÁGINAS INTRODUCCIÓNYOBJETIVOS…………………………………….. MATERIALESYMÉTODOS………………………………………….. Reactivosyestándares………………………………….. Disoluciones…………………………………………………. Métododeanálisisdelasmuestras‐……………… Calibración…………………………………………………… Estudiodelaestabilidadydeterminacióndel tiempodealmacenaje………………………………….. RESULTADOSYDISCUSIÓN………………………………………… Análisisdemuestrassintéticas………………………. Preparacióndelasdisoluciones……………………… DisolucióndeGrob…………………………………………. Estabilidaddeanalitosysurrogados………………. CONCLUSIONES………………………………………………………….. AGRADECIMIENTOS…………………………………………………… REFERENCIAS……………………………………………………………… ANEXOS……………………………………………………………………… 4 5 5 6 7 10 10 12 12 13 14 15 22 22 23 25
TFG2014 4 1.‐Introducciónyobjetivos Elvinoesunamatrizaromáticaextremadamentecomplejaquecontienegrancantidad demoléculasodorantespertenecientesadistintasfamiliasquímicas,comoalcoholes,ésteres, aldehídos,terpenos,fenolesocetonas.Losaldehídosylascetonasnorepresentanelmayor númerodemoléculas,nisiquieralasdearomamásintenso,perosindudasonelconjuntode moléculasmásdiversodesdeelpuntodevistasensorialenelvino,jugandounpapelrelevante enlacalidaddelmismo.Podemosencontrararomasdescritosmuydiferentes,desdecítricos, chucherías,miel[1],vainillaymantequillaapatatacocida[2],rancio,pepino,manzanapasada [3],cartónyserrín[4,5]. Loscambiosenlaspropiedadesaromáticasligadasalosprocesosdeoxidaciónestán muchasvecesrelacionadosconlaformacióndecompuestoscarbonílicos[6,7].Laformación dealgunosdeestoscompuestossedebealaoxidacióndirectadealcoholes[8‐10],la degradacióndeStreckerapartirdesusrespectivosaminoácidos[11]odecompuestos dicarbonílicos(comoeselcasodeldiacetilo,glioxalyla2,3‐pentanodionapresentesenelvino) oporúltimocomoderivadosdelos‐cetoácidos[12].Deentrelosaldehídosestudiados,hay dosquedestacancomoindicadoresdeoxidaciónenelvino:elmetionalyelfenilacetaldehído [1,8,13‐15].Ladegradaciónoxidativaasociadaaestosaldehídosconllevaunarápidapérdida delascualidadesaromáticas,principalmentelosaromasfrutalesyflorales,ylaformaciónde otrosaromas,comoverduracocidaymielrespectivamente,queseasocianalvinomal envejecidooaldeteriorodelmismo[2].Y,porlotanto,sepuedeafirmarquelavidaútildeun vinoterminacuandoelaromadeciertoscarbonilossepercibedemanerapredominantesobre elresto. Estoscompuestospresentanundesafíoalahoraderealizarsuanálisisporqueson altamentevolátilesyreactivos.Portodoello,parasuanálisisesnecesariaunaetapade derivatizaciónpreviacono‐(2,3,4,5,6‐pentafluorobencil)hidroxilamina(PFBHA)para convertirlosenmoléculasdepesomolecularsuperiorymenospolares,queposteriormentese separanysedetectanporcromatografíadegasesacopladaaespectrometríademasascon fuentedeionizaciónquímicanegativa(GC‐NCI‐MS).Estaetapadederivatizaciónpuede llevarseacaboenuncartuchodeextracciónenfasesólidaSPE[16]odirectamentesobreuna fibrademicroextracciónenfasesólida(SPME)[17]. Lamicroextracciónenfasesólidaesunmétododeextracciónqueconsisteenexponer unasuperficierecubiertaporunapequeñacantidaddematerialsorbenteaunamatrizde interés(yaseadirectamentelafaselíquidaoelespaciodecabeza),dedondeseextraenlos analitos.Loscompuestosextraídosseadsorbenhastaalcanzarelequilibrioentrelamuestray elrecubrimiento,yposteriormentesetransfierenalinstrumentodeanálisis.Eldispositivode extracciónsecomponedeun“holder”oportafibrasyunafibradeSPME.Cuandoloque interesasonlosanalitosvolátilesdelamuestra,elmododeextracciónquesevaautilizaresel deespaciodecabeza.Enestemodo,lafibraseponeencontactoconlafasegaseosaen equilibrioconladisolucióncontenidaenelvial,evitandoasílosposiblesproblemasquepueda causarlapartenovolátilduranteladeterminación.AdemáslaSPMEtieneciertasventajas sobrelaSPE:principalmentelaconcentracióndelosanalitosesmayor,sepuedeautomatizar
TFG2014 5 elprocesoyademáselahorroendisolventes,beneficiotantoanivelecológicocomo económico. Perocomoyasehadichoanteriormente,estoscompuestoscarbonílicossonmoléculas extremadamentereactivasysehademostradoqueformaninteraccionesmuyfuertescon otrasmoléculas[18],especialmenteconelSO2[19],loquepuedeafectarasudistribuciónreal enelespaciodecabeza.Loscompuestoscarbonílicosenelvinopuedenencontrarseenforma libre,responsablesdelaroma,oasociadosformandocomplejosnovolátiles,principalmente conSO2,yportantoinodoros.Estoscomplejosactúancomounareservadecarbonilos, desplazándoseelequilibriohacialaformalibreconformeelSO2desapareceporoxidación[20]. Debidoaestaasociación,sedebediferenciarentreconcentraciónlibreytotaldelosanalitos. Paraladeterminaciónsimultáneadeloscarboniloslibresyacomplejadossehadesarrolladoun método[21]libredeefectosmatriz,basadoenlamicroextracciónenfasesólidadelespaciode cabezaysuanálisisporcromatografíadegasesacopladaaespectrometríademasascon fuentedeimpactoelectrónico(HS‐SPME‐GC‐EI‐MS)queutilizaestándaresinertesalSO2y surrogadosquesecomportandeformasimilaralosanalitos.Lasegundagranventajadeesta metodologíafrentealasanterioresesqueseevitaladerivatizacióndeestoscompuestos, ahorrandotiempoyalargandolavidaútildelasfibras.Además,estossurrogadoscarbonílicos, moléculasmuysimilaresquímicamentealosanalitos,sontambiénextremadamentereactivos. Debidoaquelossurrogadoshandeserañadidosalvino,elestudiodelaestabilidaddeesta disoluciónqueseusaenelmétodoseconsideródesumaimportancia,yaquesonmuchaslas decisionesquesetomanenbasealarespuestadeestoscompuestos.Porotraparte,elpoder proporcionardatossobrelaestabilidaddelosanalitosendisoluciónsintéticaalolargodel tiempoesimprescindibleparaconocercuándoycómocalibraryasípodercuantificardeforma correcta. Elobjetivogeneraldeestetrabajoesdesarrollarlascualidadespropiasdeun investigadormediantelaformaciónenelmétodocientífico,elaprendizajeenlautilizaciónde recursosdebúsquedadeinformacióncientífica,laespecializaciónenelusodeunatécnica cromatográfica,eltratamientodelosdatosobtenidosyelreflejodetodoloaprendido mediantelaescrituradelapresentememoria.Elobjetivoespecíficoesfamiliarizarseconun métododeanálisisdecarbonilos,preparacióndemuestras,integracióndelosresultados,el estudiodelaevolucióndeladisoluciónsintéticadeciertoscarbonilosyladeterminacióndel tiempoquepuedeestaralmacenadadichadisolución.Yasídeestemodosepodrádiseñarun controldecalidaddelmétodoestudiado. 2.‐Materialymétodos 2.1Reactivosyestándares EletanolutilizadosecompróaMerk(Darmstadt,Alemania),elácidotartáricoal99%, glicerol99,5%,1,2‐propanodiol99,5%yelmetabisulfitodesodioal97%aPanreac(Barcelona, España).Scharlau(Barcelona,España)suministróelhidróxidodesodioal99%yAldrich (Madrid,España)elglioxalal40%enagua.ElaguasepurificóenunsistemaMilli‐Qde Millipore(Bedford,Alemania).
TFG2014 6 Losestándaresusadosparalacuantificaciónanalítica,surrogadosypatronesinternos seobtuvierondeAldrich,Fluka(Madrid,España),ChemService(WestChester,PA,USA)y Firmenich(Suiza).Losestándaresquímicosson:2‐metilpropanal(isobutiraldehído)99%,2‐ metilbutanal95%,3‐metilbutanal(isovaleraldehído)97%,fenilacetaldehído>90%,3‐ (metiltio)propanal(metional)≥97%,decanal95%,2,3‐pentanodiona97%,acetovanillona98%, β‐ionona≥97%,2,3‐butanodiona(diacetilo)99%,benzaldehído99%,5‐metilfurfural97%, furfural99%,yβ‐damascenona>93%.Lossurrogadosson:2‐metilpentanal98%, hidrocinamaldehído≥95%,β‐damascona≥90%,3,5,5‐trimetilhexanal≥95%,3‐ (metiltio)butiraldehído≥96%,4,5‐dimetilfurfural97%,3‐octanona≥98%.Lospatronesinternos son:4‐metilpentan‐2‐ol99%,2‐metilbutiratodemetilo≥98%y2,6‐dicloroanisol>97%. 2.2Disoluciones 2.2.1Vinosintético Elvinosintéticosepreparódelasiguienteforma:11%etanol,5g/Ldeácidotartárico, 10g/Ldeglicerina,1,5%propanodiolyelrestoaguadestilada.ElpHdeladisoluciónseajustó a3,5conhidróxidodesodio1M. 2.2.2Disolucióndelospatrones Seprepararondisolucionesindividualesdeentre3a20g/Lenetanoltantodecada unodelosestándaresinternos,comodelossurrogados,comodecadaunodelosanalitos. Algunosdeloscompuestosestabandemasiadoconcentradosparatrabajarconellosdeforma cómoda,porloqueserealizóunaprimeradilucióna100mg/Lenetanolparaeldecanal,2,3‐ pentanodionayβ‐iononayde400mg/Lparalaβ‐damascenonadeformaindividual. 2.2.3Disolucionesparalacalibración Serealizarondilucionesconjuntamentedeciertosanalitosenetanol.Lasdiluciones “A”estabanmásconcentradas(de500µg/La1000mg/L)ylas“B”menosconcentradas(de50 µg/La500mg/L).Losanalitosseagruparondelasiguientemanera: Grupo1:decanal,2,3‐pentanodiona Grupo2:β‐ionona,β‐damascenona,metional,benzaldehído Grupo3:diacetilo Grupo4:fenilacetaldehído,isobutiraldehído,2‐metilbutanal,5‐metilfurfural furfural Grupo5:acetovanillona 2.2.4Disolucionesdetrabajo Ademásfuenecesarialapreparacióndeunadisoluciónenetanoldetodoslosanalitos deformaconjunta,detalmaneraquecadaunodeellospresentaraunaconcentración intermediadelosrangosencontradosnormalmenteenlosvinos[9].Delmismomodose realizóunadisoluciónconjuntaenetanoldetodoslossurrogadosyestándaresinternos,ala
TFG2014 7 quesedenominódisoluciónSIS(SurrogatesandInternalStandards),quecontenía500mg/Lde 4‐metilpentan‐2‐ol,5mg/Ldeβ‐damasconay3,5,5‐trimetilhexanaly50mg/Ldelresto. EnlaFigura1semuestraunesquema‐resumendelasdisolucionespreparadaseneste trabajo. Figura1:Esquemadelasdisolucionespreparadas 2.3Métododeanálisisdelasmuestras 2.3.1Preparacióndelamuestra Elprimerpasoeslaadiciónde100µLdeladisoluciónSISaunmatrazqueseenrasa convinoaunvolumenfinalde25mL.Laaperturadelasbotellasdevinoylaadiciónsellevaa caboenunacámaradeArgóndeJacomex(Dagneux,Francia)connivelesdeoxígenopor debajode0,002%,paraevitarlaoxidacióndelosanalitosydelSO2.Lasmuestrassedejan reposarenlacámaradurante8horas,tiempoquesehacomprobadoessuficienteparaquese establezcanlosequilibriosdelossurrogadosconelSO2.Así,conociendoperfectamentela cantidadañadidadeloséstos,sepuedeestimarelgradodeacomplejamientodecadaunode susanalitosanálogostraselanálisiscromatográficodelossurrogados. 2.3.2HS‐SPME Trasesteperíododeestabilizaciónenlacámarasetrasvasan10mLdemuestraaun vialde20mLdeSPMEysesella.Losvialessesacandelacámara,sellevanalcromatógrafoy sedejanelencarrodemuestras.Seincubana45ºCdurante10minutosantesdeprocedera laextracciónsinagitacióndelespaciodecabezaduranteotros10mina45ºC.Laextracciónse realizaconunafibradeSPMEdepolimetilsiloxano/divinilbenceno(PMDS/DVB)de65mde espesorproporcionadasporSupelco‐Spain(Madrid,España).Laautomatizacióndel
TFG2014 8 procedimientodeextracciónseconsiguióutilizandounautomuestreadorCTCCombiPal (Zwigen,Suiza)queseprogramóconelsoftwaredeedicióndemacrosCycleComposer equipadoconuncarrodemuestrasycarrodeincubacióndetemperaturacontrolada. 2.3.3GC‐EI‐MS ElanálisissellevóacaboenuncromatógrafodegasesShimadzuQP‐2010Plus equipadoconunsistemadedetecciónmedianteespectroscopíademasasconuncuadrupolo. LafibrasedesorbiódirectamenteenelinyectordelGC‐MSenmodosplitlessdurante2,5mina 250ºC.Elgasportadorfuehelioaunavelocidadlinealconstantede40cm/s(1,23mL/min). LaseparaciónserealizóenunacolumnacapilarSPB‐1Sulfur(Supelco)30mx0,32mmd.i., conunespesordefasede4m.Latemperaturainicialdelhornofue40ºCdurante3min, despuésseincrementó10ºC/minhastalos280ºCyfinalmentesemantuvoesatemperatura durante10min.Latemperaturadelafuentedeionesfuede220ºCylainterfasesemantuvoa 280ºC.Setrabajóconlafuentedeimpactoelectrónico(EI)yconelanalizadordemasas operandoenmodoSIM(singleionmonitoring).Losionesseleccionadosparalacaracterización ycuantificacióndecadaanalitosemuestranenlaTabla1.Elsoftwareutilizadoparala integracióndeloscromatogramasfueelLabSolutionsdeGCMSSolutionVersion2.30 (ShimadzuCorporation).Además,enelAnexo1semuestranlasfórmulasylosespectrosde masasdetodosloscompuestos. 2.3.4Preparacióndelinstrumento Antesdecomenzarhuboqueasegurarsedequelaconfiguracióndelequipoerala descritaanteriormente.Paraello,conelequipototalmenteapagado,secambiólafuentede ionizaciónaunadeEI.Posteriormenteseseleccionóelinyectordesplit/splitlessyseinstalóun “liner”deinyecciónlíquida.Seinstalólacolumnaalinyectorparasupurgay acondicionamiento.Unavezhechoesto,seconectólacolumnaalespectrómetrodemasasy secomprobólaexistenciadefugas.Cuandosealcanzóunvacíosuficienteeneldetector,se realizóel“tunning”deéste.EnesemomentosecomprobóelsistemaconeltestdeGroby finalmentesecambióaun“liner”deSPME. 2.3.5Análisisdemuestrassintéticas Comosehacomentadopreviamente,elmétodonopresentaefectomatriz,porloque paraelestudiodelaestabilidaddelasdisolucionessetrabajóconmuestrassintéticas,esdecir, envinosintético.ComoenlasmuestrassintéticasnoseañadeSO2,nofuenecesarioelusode lacámaralibredeO2paralaadicióndeladisolucióndeSIS,niesperarparaquesealcanzarael equilibriodelossurrogadosconelSO2.Porlodemás,elmétododeanálisiseselmismoque paralasmuestrasdevinoreal.
TFG2014 15 3.4Estabilidaddeanalitosysurrogados Primerosellevóacabolaintegracióndetodosloscromatogramasobtenidosdurante unperiodode75días.Lasáreasintegradasdeloscromatogramassenormalizaronutilizando elpatróninterno,2‐metilbutanoatodemetilo,patrónqueseusaparaevitarefectosracha.Las áreasrelativassetransformaronenconcentracióninterpolandoenlasrectasdecalibrado construidasparacadaanalito.Comoparatodoslosanalitossecalibrómásdeunordende magnitud,seutilizaronrectasdecalibraciónponderadas.Estetipodecalibraciónotorgamayor influenciasobrelarectaobtenidaalospuntosdemenorconcentración,yportanto,menor incertidumbre.Porestemotivolasconcentracionesbuscadasenlospuntosdecalibraciónno sonequidistantes(1,60,120,180,240g/L)sinoquesonmúltiplosdedistintosnúmeros segúnelrangoquesequieracubrir(1,4,16,64,256g/L).EnelAnexo2semuestrandos ejemplosdelasrectasdecalibraciónrealizadas(benzaldehídoymetional).Sehantomado comoejemploporqueparaelbenzaldehídonohabríahabidodiferenciasentrehabercalibrado conunarectaestándaroconlaponderada,mientrasqueparaelmetionalsisehubiera calibradonormalmentesehabríacometidounerrorenlainterpolación.Lossurrogadosy estándaresinternosteníansiemprelamismaconcentraciónentodoslospuntosdelasrectas decalibración.Porlotantoparasaberlaconcentracióndeestoscompuestosenlasmuestras conelpasodeltiemposedividióelárearelativaobtenidaentreunfactorderespuesta (Ecuación3)quesecalculóteniendoencuentalasconcentracionesdelaTabla4. Ecuación3: ñ ó Conlasconcentracionesserealizarongráficosparacadacompuestoconelobjetivode poderobservarlatendenciaqueseguíansuscomportamientos.Enelgráficoserepresentóel porcentajedelcompuestodetectadoenelejedeordenadasfrentetiempotranscurrido expresadoendías,desdelapreparacióndelasdisolucionesdetrabajoconjuntasdeanalitosy SIS.Setomócomoreferencialaconcentraciónmedidaelprimerdía,siendoestala consideradael100%. Seobservóqueexistíancompuestoscuyaconcentraciónsemanteníaconstanteteniendoen cuentaladesviaciónpropiadelmétododeSPME.ComosepuedeobservarenlaFigura4,a pesardeladesviaciónexistenteenlosvalores,latendenciaesapermaneceralrededordela concentracióninicial,locualindicaqueestoscompuestosnosevenafectadosporeltiempo quellevapreparadaladisolución.Ademásdelbenzaldehídosiguenelmismocomportamiento el2‐metilbutanal,2‐metilpentanal,furfural,5‐metilfurfural,diacetilo,2,3‐pentanodionay3‐ octanona.
TFG2014 16 Figura4:Gráficadelporcentajedeconcentraciónobtenidorespectoalaconcentracióninicial debenzaldehídofrentealtiempo Porotraparte,bastantescompuestosveíanreducidasuconcentraciónenmayoromenor medidaconelpasodeltiempo,comoseesperaba,teniendoencuentalavolatilidady reactividadquecaracterizaaestoscompuestoscarbonílicos.LaFigura5muestraunodelos ejemplosdeestegrupo,elmetional,elcompuestoquepresentóladisminucióndela concentraciónmásacusada.TambiénenlaFigura6seobservanloscromatogramasobtenidos delmetionaldetresdíasnoconsecutivosyseapreciaclaramenteestadisminuciónenalárea delpicocromatográfico.Otroscompuestosqueevolucionarondeestemodofueronel3‐ (metiltio)butiraldehído,4,5‐dimetilfurfural,fenilacetaldehído,hidrocinamaldehído,decanal,β‐ damascona,β‐damascenonay2,6‐dicloroanisol.Viéndoseclaramentequelaconcentraciónde estegrupodecompuestosdisminuye,lasiguientepreguntaquesetuvoquecontestarfuea partirdecuándoestadisminuciónerasignificativamenterelevante. Figura5:Gráficadelporcentajedeconcentraciónobtenidorespectoalaconcentracióninicial demetionalfrentealtiempo 0 20 40 60 80 100 120 140 0 20406080 % Tiempo(días) benzaldehído 0 20 40 60 80 100 120 140 0 20406080 % Tiempo(días) metional
TFG2014 17 Figura6:Picoscromatográficosdelmetionalconeltranscursodeltiempo Perohubocuatrocompuestos(isobutiraldehído,isovaleraldehído,3,5,5‐ trimetilhexanaly4‐metilpentan‐2‐ol)enlosquelaconcentraciónparecíaaumentarconelpaso deltiempo(Figura7). Figura7:Gráficadelporcentajedeconcentraciónobtenidorespectoalaconcentracióninicial de4‐metilpentan‐2‐olfrentealtiempo Estecomportamientorequiereunaexplicación,yaqueesopuestoalesperado.Unadelas explicacionesposiblespodríadebersealadiferenciadevolatilidad.Silavolatilidaddeestos cuatrocompuestosfuesemenorqueladelosdemásy/oqueladeldisolvente,loscompuestos másvolátilesveríanreducidasuconcentración,mientrasqueestoscuatrocompuestosse 0 20 40 60 80 100 120 140 0 20406080 % Tiempo(días) 4‐metilpentan‐2‐ol
TFG2014 18 concentrarían.Secomprobaronlasvolatilidadestodosloscompuestosynosepudoestablecer ningúntipodecorrelaciónentrelasvolatilidadesylaconcentracióndeestoscuatro compuestos.Otraexplicaciónseríaquedeladescomposicióndealgunodeloscompuestos quesedegradanenladisoluciónseformasenalgunosdeestoscompuestos.Porejemploquea partirdeladegradacióndelisovaleraldehídoseformaraisobutiraldehídoaumentandola concentracióndelúltimoconelpasodeltiempo.Perocomoamboscompuestosven incrementadassusconcentraciones,estaopciónsedescartó. Laacetovanillonaylaβ‐iononanopudieronagruparseenningunodelosgrupos anterioresyaquetuvieronunadispersióndevaloresdemasiadograndecomoparapoder sacaralgunaconclusiónsobresucomportamiento. ElrestodelasgráficasdelosdemáscompuestosseadjuntanenalAnexo3. Dentrodelsegundogrupo,aquellosquedesaparecenconelpasodeltiempo,se observóunatendenciauntantodiferente,puesalgunosdeloscompuestos,comoel4,5‐ dimetilfurfuraldehído,hidrocinamaldehído,fenilacetaldehídooel2,6‐dicloroanisol(Figura8), parecíandegradarsealprincipioyestabilizarsedespués. Figura8:Gráficadelporcentajedeconcentraciónobtenidorespectoalaconcentracióninicial de2,6‐dicloroanisolfrentealtiempo Paracomprobarsisedebíaalpatróninterno,serepresentóenunagráficaelárea brutadel2‐metilbutanoatodemetilo(Figura9).Paraquelosresultadospudiesenser comparables,alestartrabajandoconáreasbrutas,serepresentaronlospuntosenporcentaje respectoalamediadelasáreasfrentealosdíastranscurridos.Enlagráficasepuedeobservar tambiénunagrandispersiónenlosvalores,provocadaporelerroraleatoriodetrabajarcon áreasbrutasenestecaso,yunavariaciónsinusoidal,seguramentedebidaaladerivadel instrumento.Ambossoncorregidostantoenanalitoscomosurrogadosconelusodeáreas relativasalpatróninterno.Peroseobservatambiénqueestepatróninternopresentauna tendenciaaaumentarsuárea.Esteincrementocorrespondealapendiente,esdecir,0,43% ±0,14%pordía.Lahipótesisnulaseríaquelapendientedelpatróninternonoes significativamentediferentede0.Comolapendientenulanoentradentrodelintervalodela pendienteobtenida±sudesviación,sepuedeafirmarquelahipótesisnulanosecumpleyla 0 20 40 60 80 100 120 140 0 20406080 % Tiempo(días) 2,6‐dicloroanisol
TFG2014 19 pendienteessignificativamentediferentede0.Estehechosehaasociadoaquelafibrade adsorciónenelespaciodecabezasetornacadavezmássensibleaciertosanalitos.Porlo tantoloscompuestosquesecomportancomoel4‐metilpentan‐2‐ol,noseestaban concentrandoenladisolución,sinoquelohacenenlafibraenmayormedidaquelohaceel2‐ metilbutanoatodemetilo(hayquerecordarquenosemidieronlasconcentracionesdela disoluciónlíquida,sinosólolaconcentraciónenelespaciodecabeza).Lasoluciónparacorregir estaderivaseríarecalibrarlafibradeformaperiódica.Loscompuestosdelgrupoenelquese observaelaumento,sedebeaquesuconcentraciónenlafibraesmayorqueladelpatrón interno,porloquesusáreasrelativasaumentanconeltiempo.Aunqueesteincrementodel áreadel2‐metilbutanoatodemetiloseproduzcayseaimportanteenelestudiodela estabilidad,noloestantoenelestudiodemuestrasenvinoreal.Enestasmuestrasdevino realqueduranteelalmacenamientoconsumendiversascantidadesdeoxígenolavariaciónen laseñaldebidaaestehechoesmuypequeñaencomparaciónconelaumentodelaseñal producidaporelconsumodeoxígeno. Figura9:Gráficadelporcentajerespectoalamediadelosvaloresdelasáreasdel2‐ metilbutanoatodemetilofrentealtiempo Elcomportamientodel2,6‐dicloroanisolysimilares,puedeserexplicadoporeste hecho,yaqueenáreasbrutassupendientesemantienemuchomáscercanaa0queladel patróninterno(lapendientedel2,6‐dicloroanisolesde0,1%±0,13%,esdecir,no significativamentediferentede0).Suárearelativanodesciendedebidoasudegradación,sino debidoalaumentodeláreadelpatróninterno.Otrosdecrecimientosmásbruscosnopueden serexplicadosporestemotivo.Esoscompuestossedegradantalcomoseesperabayde maneramuyrápida. Conelobjetivodeconocerdurantecuántotiemposonestablesloscompuestos,se realizóunarectarepresentandoenelejeordenadaselárearelativadelcompuestorespectoal 2‐metilbutanoatodemetilo,yeneldeabscisaseltiempotranscurridoendías.Secalculólatexp segúnlasEcuaciones4‐6. 0 20 40 60 80 100 120 140 020406080 % Tiempo(días) ÁreabrutaIS
TFG2014 20 Ecuación4: texp Ecuación5: spendiente ∑ Ecuación6: varianzadelosresiduales ∑est2 =centroidedex yest=layestimadaparaelpuntoutilizandolarecta gradosdelibertad=n‐2 Secalculólatcritparaelmismonúmerodegradosdelibertadal95%.Silatcritera mayorquelatexp,,sepuededecirqueelcompuestoencuestiónesestablesignificativamente duranteelperiododetrabajodelestudio.Sieramenor,elcompuestonoesestable,ysedebe averiguarapartirdequedíasepuedeconsiderarquesehadegradadodeformasignificativa.. Paradeterminareltiempoqueloscompuestospermanecenestables,sebuscóelpuntoenel quelarectadelárearelativasecortaconlaordenadaenelorigen±1,67s.Estevalorviene dadoporZ*s,siendolaZdeunacolaconunasignificatividaddel95%.Lacoordenadaxdeese puntonosdioeltiempoquesebuscaba.EnlasTablas5y6semuestranloscompuestos agrupadossegúnlosresultadosobtenidos. Tabla5:Analitosagrupadossegúnsutiempodeestabilidad GrupoCompuestoTiempo(días) Ana1metional 4 Ana2 β‐damascenona isobutiraldehído decanal isovaleraldehído 11 12 12 16 Ana3fenilacetaldehído 28 Ana4 acetovanillona diacetilo 5‐metilfurfural furfural benzaldehído 2,3‐pentanodiona β‐ionona 2‐metilbutanal 50 61 67 72 +75 +75 +75 +75
TFG2014 21 Tabla6:Surrogadosypatronesinternosagrupadossegúnsutiempodeestabilidad GrupoCompuestoTiempo(días) S14‐metilpentan‐2‐ol 6 S2 2,6‐dicloroanisol ‐damascona 12 14 S3 hidrocinamaldehído22 3,5,5‐trimetilhexanal27 4,5‐dimetilfurfural 27 3‐(metiltio)butiraldehído 33 S4 3‐octanona 52 2‐metilpentanal +75 Comosepuedeobservar,sehanagrupadosegúnsuestabilidad,siendolosgrupos Ana1yS1aquelloscuyasdisolucionesdeberíanrenovarsecadasemana,enlosgruposAna2y S2larenovaciónseríanecesariacadadossemanas,losdelosgruposAna3yS3aguantan alrededordetressemanasylosdelgrupoAna4yS4aguantanmásdedosmeses.Sehahecho distinciónentresurrogadosyanalitosdemaneraquepuedanusarsedeformaindependiente, yaquehayquerecordarqueesteestudioseharealizadoparamejorarlacalidaddelas determinacionesdelasmuestrasrealesdevinosdondesólosedebenañadirladisoluciónde SIS. Conestosdatos,seproponemodificarladisolucióndetrabajodeSISyladisolución conjuntadetodoslosanalitosydividirlassegúnlosgrupospropuestos.Deestaformala disoluciónpreparadadiariamentecontodosloscompuestostendráunacomposiciónestabley seusaráparaelcontroldecalidaddelmétodo.Viendoesteresultadotambiénseplantea comprobarlaestabilidaddelasdisolucionesmadreapartirdelascualessepreparanlasde trabajodeAna1‐Ana4yS1‐S4.Ladegradacióndelasdisolucionesmadrepodríadarlugaraque cuandoserenuevenestosgruposdedisoluciones,loscompuestoscarbonílicosyaestén degradados. Porotraparteseproponeelprepararlasdisolucionesdetrabajodelosanalitosyla disolucióndeSIScomohastaahorayfraccionarlasenvialesdepequeñovolumen(2‐5mL)yasí soloseusaránunavez.Ladegradaciónobservadaenlasdisolucionessintéticassedebe principalmentealcontactodeéstasconeloxígenodelaire.Altenerqueprepararladisolución diariamente,losvialesseabrieron32vecesduranteeltranscursodeesteestudio,permitiendo laentradadeaireyportantoladegradacióndeloscompuestos.
TFG2014 22 4.‐Conclusiones Loscarbonilosconlosquesetrabajaseoxidanydegradanconelpasodeltiempoen lasdisolucionesdetrabajo,talcomoseesperaba.Sehanestudiadoestasdegradacionesde formaquesepuedaconocerladegradaciónqueexperimentanypoderrenovarlascuandosea necesario.Finalmente,sehanpodidoestablecergruposdecompuestosdeformaquese facilitaseeltrabajoconelmétododeanálisis,yaqueahoranosedeberávolverapreparar todaslasdisolucionescadapocotiempo,sinoquesepodráncambiarpequeñosgruposde formasencillayprecisa.Deestaformaseconsigueademásunamejoraenlacalidaddel método,yaquenosetrabajaráconsurrogadosdegradadosquepodríanllevarnosasacar conclusioneserróneastraslosanálisis. Tantoladisolucióndemetionalcomolade4‐metilpentan‐2‐oldebenprepararsepor separadoycadasemana,yaquesonlasquesedegradanmásrápidamente.Losdemás compuestoscarbonílicosseagruparánentresgruposdeanalitosyotrostresdesurrogadosy estándares,detalformaqueserenuevenlasdisolucionescada2semanas,1mesy2meses respectivamentecadagrupo. Deformageneral,losobjetivosdeltrabajodefindegradosehancubierto desarrollándoselascualidadespropiasdeuninvestigadorformadoenelmétodocientíficoy especializadoenelusodetécnicascromatográficasdellaboratorio. Conclusions Thecarbonylcompoundsstudiedhavebeenoxidizedanddegradedovertimeasitwas expected.Thesedegradationshavebeenevaluatedinordertoknowthedegradationpathsso thesolutionscanberenewedwhenareneeded.Finally,compoundshavebeenclassifiedin groups,makingeasiertoworkwiththemethod.Nowjustsomeofthesolutionshavetobe preparedeveryfewdays.Workingwiththenewgroupsofsolutionsproposedavoidswrong inferencesincreasingthequalityofthemethod. Boththemethionalandthe4‐methylpentan‐2‐olsolutionsmustbeprepared separatelyeveryweek,sincetheyaretheonesthatdegradefaster.Theremainingcarbonyl compoundswillbeclassifiedintothreegroupsofanalytesandanotherthreeofsurrogatesand internalstandards,sothesolutionscanberenovatedevery2weeks,1monthand2months respectivelyeachgroup. Theobjectivesofthisworkhavebeenreached,developingthequalitiesthatcanbe expectedfromaresearcherformedinthescientificmethod,andwhohasworkedwith chromatographytechniques. AGRADECIMIENTOS EstetrabajohasidoposiblegraciasalosfondosrecibidosporpartedelMinisterio EspañoldeEconomíayCompetitividad(ProyectoAGL2010230183).AgradeceralLaboratorio deAnálisisdelAromayEnología(LAAE)todalaayudarecibida,asícomoeltratoquemeha sidobrindado.
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