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Trabajo Fin de Grado IDENTIFICACIÓN DEL SEGMENTO GENÓMICO RESPONSABLE DE LA MODULACIÓN DE SÍNTOMAS DEL VIRUS DEL MOSAICO DE LA ALFALFA (AMV) EN ALGUNAS LEGUMINOSAS (VIGA UGUICULATA) Autor LUIS MANUEL VILLAR MARTÍN Director Ponente Dr. Fernando Escriu Paradell Dra. Maria Luisa Peleato Sánchez Grado en Biotecnología Universidad de Zaragoza Septiembre 2014 2 Departamento de Sanidad Vegetal. Laboratorio de Virología vegetal. Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA) 3 1. ÍNDICE 2. Resumen/Abstract…………………………………………………..……… 5 3. Abreviaturas…………………………………………………………..……... 6 4. Introducción………………………..…………………………..………….7-10 4.1 Estructura del genoma y expresión viral……………….…………….7-8 4.2 Enfermedades en cultivos hortícolas y sintomatología……....……….8 4.3 Caracterización de cepas del virus y huéspedes de diagnóstico...9-10 4.4 Mantenimiento y multiplicación del virus…………..….........…………10 5. Objetivos y planteamiento del trabajo...........................……..……….11 6. Materiales y métodos……………..……..………………………….….12-20 6.1Material vegetal y aislados virales…..………………………………….12 6.1.1 Inoculación..……………………………………………………….12 6.2 Extracción de RNA de doble cadena y RNA total………………..12-13 6.2.1 RNA de doble cadena…………..……………..……………..12-13 6.2.2 RNA total………..…………………………………………...…….13 6.3 Amplificación de un fragmento de 2115 nt coterminal con el extremo 3’ del RNA 3 genómico de AMV………………………………………..13-15 6.3.1 Retrotranscripción…………………..…………………….….13-14 6.3.2 PCR…………………………………………………………....14-15 6.4 Amplificación y secuenciación de los extremos 3’ y 5’ del RNA 3 mediante la técnica RACE……………………………………………....15-17 6.4.1 RACE 3’………………………………………………………..….15 6.4.2 RACE 5’………………………..………………………………….16 6.4.3 Secuenciación……………………………..……………………..17 6.5 Diseño y formación de un adaptador en 5’……………………..…17-18 6.6 Obtención del fragmento viral completo e inserción en el vector pUC19……………………………………………………………………..…..19 6.7 Clonaje del fragmento viral completo en bacterias……..……………20 4 7. Resultados…………..………………………………………………………..21-25 7.1 Caracterización biológica de aislados de AMV………….……...…21-22 7.2 Construcción de un clon de cDNA de longitud total del RNA 3 de AMV………………………………………………..………………………..23-24 7.3 Transformación bacteriana………………………………….………...…25 8. Discusión……………………………………………………………..……….26-27 9. Conclusiones/Conclusions……………..…………………………...….……..28 10. Bibliografía.……………………………………..………………………...…29-30 ANEXO I…………………………………………………………...……………...31-33 5 2. RESUMEN El virus del mosaico de la alfalfa (AMV), de amplia distribución mundial, afecta a un gran número de huéspedes vegetales como la alfalfa, su principal huésped natural, y a otras especies hortícolas, entre ellas varias leguminosas como Vigna unguiculata, judía y haba. El genoma de AMV está constituído por tres segmentos de RNA monohebra y sentido mensajero que se encapsidan de forma independiente. En trabajos previos se han observado aislados virales con distinto comportamiento en cuanto a la inducción de mosaico en Vigna unguiculata. En este trabajo se ha iniciado un método para identificar el segmento genómico responsable de este comportamiento diferencial, mediante la generación de pseudorrecombinantes artificiales que intercambian segmentos genómicos procedentes de aislados con comportamiento distinto. Se ha generado un fragmento de cDNA del RNA3, que una vez clonado, permitiría la obtención in vitro de un RNA transcrito infectivo. El empleo de un método análogo para los RNAs 1 y 2 posibilitaría la obtención de dichos pseudorrecombinantes artificiales. 2. ABSTRACT Alfalfa mosaic virus (AMV) is distributed worldwide and infects a wide host range of plants, including alfalfa, it’s main natural host, and other vegetable species, such as the legumes, Vigna unguiculata, bean and faba bean. AMV genome is composed of three single-stranded messenger-sense RNA segments, which are independently encapsidated in different particles. In previous works, AMV isolates have been found inducing different syntoms (i.e. presence or abcense of systemic mosaic) in Vigna unguiculata. In this work, we have started the optimization of a method to identify the genomic segment that causes this differential behaviour, through the generation of experimental pseudorrecombinants that exchange the three genomic segments from different types of isolates. A cDNA fragment of AMV-RNA3 has been generated, which after cloning, could serve as a template for the synthesis of an infective transcribed RNA. The same method could be used for the synthesis of RNAs 1 and 2, and the final generation of experimental RNAs 1, 2 and 3 pseudorrecombinants. 6 3. ABREVIATURAS AMV: Alfalfa mosaic virus cDNA: ácido desoxirribonucleico complementario CP: proteína de la cápsida dNTPs: trifosfato de N (N= A adenosina, T timina, C citosina, G guanina) DEPC: Dietilpirocarbonato DIECA: Dietilditiocarbamato de sodio EDTA: ácido etilendiaminotetraacético IPTG: isopropilo-D-1thiogalactopiranosido MMLV-RT: Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase MP: proteína de movimiento PCR: reacción en cadena de la polimerasa RACE: rapid amplification of cDNA ends RNA: ácido ribonucleico Rpm: revoluciones por minuto RT: retrotranscripción SDS: dodecil sulfato sódico SSC: citrato sodio-salino STE: sodio cloro tris EDTA TAQ: Termophilus aquaticus TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase TRIS: tris(hidroximetil)aminometano U: unidades v/v: volumen/volumen X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido 7 4. INTRODUCCIÓN El virus del mosaico de la alfalfa (Alfalfa mosaic virus, AMV) es un virus de vegetales perteneciente al género Alfamovirus de la familia Bromoviridae con una distribución mundial. 4.1 ESTRUCTURA DEL GENOMA Y EXPRESIÓN VIRAL Tiene el genoma dividido en tres moléculas de ácido ribonucleico (RNA 1, RNA 2 y RNA 3) (Fig. 1) de sentido mensajero, en orden según masa molecular, las cuales se empaquetan por separado en partículas con forma de bacilo (Bancroft & Kaesberg (1958,1960). También tiene un mensajero subgenómico (RNA 4), empaquetado en una partícula de forma esférica (Gibbs et al. 1963). El RNA 1, de 3644 nt, codifica la proteína P1 (replicasa) de 126kDa que contiene dominios N-terminal y C-terminal similares a metiltransferasas y helicasas. El RNA 2, de 2593 nt codifica la proteína P2 (replicasa) de 90 KDa con el dominio polimerasa. El RNA 3, de 2142nt, es dicistrónico y codifica la proteína de movimiento (MP) de 32 KDa, esencial para el movimiento de célula a célula durante la infección de la planta, y la proteína de la cápsida (CP) de 24 KDa, proteína estructural que conforma la cubierta proteica, implicada en el movimiento célula a célula (Sánchez-Navarro y Bol. 2001). Además, esta última contiene también un dominio de unión al RNA en el extremo N-terminal necesario para diferentes procesos como la activación genómica, replicación y traducción (Bol, 2005). Las proteínas P1, P2 y MP se expresan directamente del RNA genómico, mientras que la proteína CP se expresa a partir del mensajero subgenómico RNA 4, análogo a los 881 nucleótidos del extremo 3’ del RNA 3. (Gould y Symons, 1978). Las tres moléculas de RNA genómicas poseen en el extremo 5’ la estructura CAP (7MGppp) pero no tienen secuencia poly A (Pinck, 1975), y los 112 nucleótidos del extremo 3’ presentan >80% de similitud de secuencia y pueden adoptar estructuras similares (Olsthooorn et al, (1999): una estructura secundaria de unión a la CP (CPB) y otra estructura similar al de un ARN de transferencia (TLS) (Fig. 1). Ambas se requieren en la traducción y replicación del virus (Bol, 2003). Figura 1. Estructura genómica de AMV. Se representan los dominios de unión metiltransferasa y helicasa (RNA1), polimerasa (RNA2) y MP (RNA3) y CP (RNA 3 y RNA4). 3’ puede adoptar diferente estructura secundaria. Tomado de Vlot C. et al, 2001. Role of the 3’-untranslated regions of Alfalfa Mosaic Virus RNAs in the formation of a transiently expressed replicase in plants and in the assembly of virions. Journal of virology. 8 Para iniciar el proceso de infección son necesarios los RNA 1, 2 y 3 y además el ARN4 o la CP, ya que cualquiera de los dos últimos puede servir para iniciar el proceso de la activación genómica (Bol, 2008). 4.2 ENFERMEDADES EN CULTIVOS HORTÍCOLAS Y SINTOMATOLOGÍA La infección se produce de forma natural y a menudo sin síntomas en muchas plantas herbáceas y leñosas (150 especies en 22 familias, Schmelzer, Schmidt y Beczner, 1973) y se transmite experimentalmente a más de 430 especies de 51 familias de dicotiledóneas (Hull, 1969; Crill, Hagedorn y Hanson, 1970; Schmelzer, Schmidt y Beczner, 1973). Entre estas especies destaca la alfalfa (alfalfa; Medicago sativa), su huésped principal, dónde AMV provoca diversos mosaicos, moteados y malformaciones (Fig. 2), pero a menudo es asintomática, especialmente en épocas calurosas y es más frecuente en cultivos de varios años. Afecta a otros huéspedes como la patata (Solanum tuberosum) en la cual causa necrosis, causa mosaico en el trébol rojo y blanco, mosaico amarillo en judia (Phaseolus vulgaris), carilla (Vigna unguiculata), judia mungo (V. radiata) y el pimiento (Capsicum annuum), causa necrosis y retraso del crecimiento en guisante (Pisum sativum), necrosis severa en tomate (Solanum lycopersicum ) y marchitamiento en garbanzo (Cicer arietinum). Tiene una trasmisión entre huéspedes muy eficaz pues en condiciones naturales se realiza mediante algunas especies de pulgones (más de 25 especies de forma no persistente (Edwardson y Christie, 1991) y a través de la semilla de plantas infectadas individualmente. En condiciones experimentales también se transmite de forma eficiente de forma mecánica (Jaspar y bos, 1980). Los síntomas dependen en gran medida de la cepa del virus, de la etapa de crecimiento del huésped y de las condiciones ambientales. La recuperación se produce de forma eficaz muy a menudo. Figura 2. Síntomas de AMV en alfalfa Photo courtesy of G.C. Bergstrom, Dept. of Plant Pathology, Cornell University, Ithaca, NY 9 4.3 CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DEL VIRUS Y HUÉSPEDES DE DIAGNÓSTICO Se han descrito numerosas cepas o variantes de AMV de plantas según diferencias en propiedades tales como las formas de agregación de partículas en el citoplasma del tabaco, transmisión por polen y semillas, propiedades físico-químicas, secuencia de nucleótidos y propiedades biológicas como la reacción diferencial en huéspedes indicadores. La mayor parte de la biología molecular se ha llevado a cabo con la cepa AMV 425 procedente de aislados de trébol (Hagedorn y Hanson, 1963). Las especies de leguminosas Phaseolus vulgaris (judía) y Vigna unguiculata (carilla) son buenos huéspedes de ensayo para la caracterización de AMV ya que su reacción diferencial a la infección por distintas cepas permite la distinción de las mismas (Hagimorad & Francki, 1988). En judía, algunas cepas dan lesiones necróticas de coalescencia y otras lesiones locales cloróticas o ningún síntoma local, pero en este último caso aparece moteado leve sistémico, necrosis de los vasos y distorsión de la hoja. En vigna unguiculata (carilla) las cepas más comunes producen lesiones locales necróticas sin aparición de síntomas sistémicos (Fig. 3) y otras provocan lesiones locales cloróticas, poco definidas, o no provocan lesiones pero producen diversos síntomas sistémicos (Fig.4). Otras especies de diagnóstico menos utilizadas son Vicia faba (haba) donde la mayoría de las cepas dan lesiones locales necróticas, a veces seguido por un moteado leve, necrosis y muerte de la planta, Pisum sativum (guisante), en el que se producen lesiones y/o marchitamiento de las hojas inoculadas con necrosis del tallo y muerte de las plantas, Chenopodium amanticolor y chenopodium chinoa en las cuales se producen lesiones locales cloróticas o necróticas y en las cuales el moteado clorótico y necrótico sistémico distingue Fig. 3 Lesiones necróticas locales en V. unguiculata. Foto tomada en el CITA, febrero 2014 Fig. 4 Mosaico sistémico en V. unguiculata. Foto tomada en el CITA, febrero 2014 16 6.4.2. RACE 5’ Esta técnica se llevó a cabo mediante el kit 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0 (Invitrogen). En primer lugar, se retrotranscribieron 900 bases complementarias al inicio del RNA 3, usando el cebador MP (R) (Tabla1), a una concentración final de 100 nM. 1 µl del primer fue puesto en contacto con 10 µl de RNA total extraído y con agua DEPC durante 10’ a 70 ºC en el termobloque y posteriormente los tubos fueron introducidos en hielo 5’. Tras ello, se añadieron a cada tubo 8,5 µl de la siguiente mezcla de reacción: 1X tampón PCR (200mM Tris-HCl, pH 8’4, 500 mM KCl), 2,5mM MgCl 2 , 10mM DTT y 0,4mM de cada dNTP. Los 24 µl resultantes se tuvieron 1’ a 42ºC en el termobloque y posteriormente se añadió 200U de la enzima SuperScript TM II RT. La mezcla se incubó 50’ a 42 ºC, 15’ a 70ºC para acabar la reacción, se centrifugó 10-20 segundos y se incubó a 37ºC. Por último, se añadió 1 µl de RNase mix para deshacerse de las cadenas de RNA y se incubó durante 30’ a 37ºC. El cDNA resultante fue purificado mediante la columna de purificación del kit S.N.A.P. basada en la unión del cDNA a una matriz, fue lavado con diferentes tampones y con etanol, y resuspendido en 10 µl. Una vez obtenido el cDNA purificado, se llevó a cabo una adición de citosinas en el extremo 3’ del cDNA mediante la acción del enzima TdT. Los 10 µl de cDNA fueron puestos en contacto con 6,5 µl de agua DEPC, 5 µl de 5X tampón tailing (50mM Tris-HCl pH 8,4, 125mM KCl, 7,5mM MgCl 2 ) y 10 µl de dCTP 2mM durante 2-3’ a 94ºC en el termobloque y posteriormente 1’ en hielo. Seguidamente, se añadió 1 µl de TdT y se incubó durante 10’ a 37ºC. Finalmente, se inactivó el enzima por choque térmico: 10’ a 65ºC. El polyC-cDNA resultante se amplificó por PCR. El volumen final fue de 49,5 µl con los siguientes componentes: 1X tampón de PCR (200 mM Tris-HCl, pH 8’4, 500mM KCl), 0,2mM de cada dNTP, 1,5mM MgCl 2 , 0,4 µM del cebador MP2(R) (Tabla1), 0,4 µM del cebador 5’ RACE Abridged Anchor Primer (Tabla1), 2,5U TAQ DNA polimerasa, 5 µl de poly-cDNA y se completó el volumen con agua miliQ. La mezcla de reacción se sometió a los siguientes ciclos: desnaturalización a 94ºC durante 2’, 35 ciclos consistentes en desnaturalización a 94ºC durante 30’’, anillamiento a 45ºC durante 30’’ y elongación a 72ºC durante 1’, y por último elongación final a 72ºC durante 7’ y conservación a 4ºC. Tras la PCR, se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa 1% de 5 µl del producto de PCR resultante para visualizar el producto obtenido. 17 6.4.3 SECUENCIACIÓN Las muestras positivas del RACE 3’ y del 5’ se mandaron a secuenciar por duplicado. En el caso del producto del extremo 3’, se envió la muestra a una concentración de 20ng/µl junto con dos cebadores directos CP1(F) (Tabla1) y otro todavía más cerca del extremo, CP3(F) (Tabla1) a una concentración de 5 µM, mientras que en el caso del producto del RACE 5’, se envió la muestra a una concentración de 20ng/µl junto con dos cebadores AMV MP2 (R) y AMV MP1 (R). La secuenciación con dos cebadores diferentes se hace con el objetivo de obtener una lectura doble de la secuencia. Una vez se recibieron las secuencias de las muestras, se visualizaron y unificaron con el programa informático ChromasLite201 y se alinearon entre ellas y entre las secuencias del GenBank escogidas (AnexoI), usando el programa ClustalX, implementado en el paquete informático MEGA4. 6.5 DISEÑO Y FORMACIÓN DE UN ADAPTADOR EN 5’ Para completar los 27nt faltantes correspondientes al extremo 5’ del RNA3 de AMV, se sintetizó un adaptador de DNA de doble cadena (dsDNA), AMVlnk (Fig 6), que incluía estos 27 nt e inmediatamente aguas arriba el promotor T7 de transcripción. Además contenía también una diana del enzima de restricción XbaI para un ligamiento posterior. El adaptador fue ensamblado a partir de dos oligonucleótidos de cadena sencilla: AMVlnk5p, junto con su complementario AMVlnk5n (Fig.6), los cuales fueron fosforilados en el extremo 5’. Para ello se utilizó la enzima T4 polinucleótido kinasa (T4PNK) (New England Biolabs) usando las siguientes condiciones recomendadas por la casa comercial: 1,7 µg de oligonucleótido (AMVlnk5n o AMVlnk5p), 1X tampón de fosforilación (New England Biolabs, 70mM Tris-HCl, 10mM MgCl 2 , 5mM DTT, pH 7,6), 10U de T4PNK (New England Biolabs) y agua miliQ hasta un volumen de 10 µl. La mezcla de reacción se incubó a 37ºC 30’ en el termobloque. Una vez fosforilados los extremos 5’, se llevó a cabo una rampa de temperatura para que los oligonucleótidos solapasen y se formase el adaptador AMVlnk5 por complementariedad de bases. Los 10 µl de cada oligonucleótido fosforilado se juntaron en un tubo eppendorf y se incubaron durante 2’ a 100ºC en el termobloque, dejándolos enfriar a temperatura ambiente posteriormente. El adaptador en forma de dsDNA deja en su extremo 3’ una secuencia preparada para ligar con la secuencia de corte que deja el enzima EcoRI (Fig 6) EXTREMO 5’ ALF 121 GTTTTAATACCATTTTCAAAATATTCCAATTCAACTCAATTAACGCTTTTACA... ALF123 GTTTTAATACCATTTTCAAAATATTCCAATTCAACTCAATTAACGCTTTTACA... ALF129 GTTTTAATACCATTTTCAAAATATTCCAATTCAACTCAATTAACGCTTTTACA... AMV-me5f2-EcoRI (F) CGGAATTCAACTCAATTAACGCTT Secuencia de corte de EcoRI AMVlnk5p CCTCTAGATAATACGACTCACTATAGGTTTTAATACCATTTTCAAAATATTCC Corte XbaI Promotor T7 Polimerasa AMVLNK5 AMVlnk5n GGAGATCTATTATGCTGAGTGATATCCAAAATTATGGTAAAAGTTTTATAAGGTTAA Complementario a secuencia corte con EcoRI EXTREMO 3’ ALF 121 TGTGCTAACGCACATATATAAATGCTCATGCAAAACTGCATGAATGCCCCTAAGGGATGCAAAAAAAAAAAAAAAAA ALF123 TGTGCTGATGCACATATATAAATGCTCATGCAAAACTGCATGAATGCCCCTAAGGGATGCAAAAAAAAAAAAAAAAA ALF129 TGTGCTCGCGCACATATATAAATGCTCATGCAAAACTGCATGAATGCCCCTAAGGGATGCAAAAAAAAAAAAAAAAA Cola polyA AMV-R3e3.PstI (R) CGGGGATTCCCTACGACGTCCTG Secuencia corte PstI Fig. 6 Secuencias de los extremos de las muestras, junto con primers y el adaptador utilizado 19 6.6 OBTENCIÓN DEL FRAGMENTO VIRAL COMPLETO E INSERCIÓN EN EL VECTOR PUC19 El producto de PCR de 2115nt coterminal con el extremo 3’ del RNA viral, obtenido en 6.3, contiene una diana EcoRI en su extremo 5’ incluída en el cebador en la reacción de RT-PCR (ver apdo. 6.3). El fragmento fue cortado con la enzima EcoRI-HF (New England Biolabs) en una reacción de digestión con los siguientes componentes: 250ng del producto de purificación de DNA del mencionado fragmento, 1X del tampón CutSmart (Acetato potásico 50mM, 20mM Tris-acetato, 10mM magnesio acetato, 1mM DTT pH 7,9), 20 U de EcoRI-HF y agua miliQ hasta un volumen final de 50 µl. La mezcla se tuvo a 25ºC durante 1h en el termobloque. A continuación, el producto de digestión fue sometido a electroforesis en gel de agarosa al 1% y recuperado de gel con el kit ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit. Posteriormente fue ligado al adaptador AMVlnk5 obtenido en 6.5 en una reacción de ligación con los siguientes componentes: 1X de tampón de ligación (New England Biolabs, 50mM TRIS-HCl, 10mM MgCl 2 , 1mM ATP, 10mM DTT pH 7,5), 170ng del adaptador AMVlnk5, 250ng de cDNA del fragmento de 2115nt, 0,25U T4 DNA ligasa (New England Biolabs) y agua miliQ hasta un volumen de 20 µl. La mezcla se tuvo a 25ºC durante 1 hora en el termobloque. El producto de ligación y el plásmido utilizado, pUC 19 fueron digeridos por separado con las enzimas XbaI (New England Biolabs) y PstI-HF (New England Biolabs) en una reacción de digestión similar a la anterior (excepto las enzimas). El producto de la ligación anterior se purificó mediante el kit DNA clean & concentratorTM-kit de Zymo Research y el vector pUC19 se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y recuperó de la correspondiente banda del gel. Ambos fueron ligados entre sí en una reacción similar a la anteriormente realizada (ver Fig 7). Figura 7. Vector pUC 19 con la contrucción introducida . 20 6.7 CLONAJE DEL FRAGMENTO VIRAL COMPLETO EN BACTERIAS La construcción obtenida en 6.6, que incluye el fragmento viral completo del RNA3 de AMV aguas abajo del promotor de transcripción T7, se clonó en bacterias competentes de la cepa JM109 de Escherichia coli de la empresa Promega. Para ello 2 µl de la construcción fueron añadidos a 50 µl de bacterias y 1 µl de vector pUC19 sin inserto fue añadido a 100 µl de las mismas bacterias como control. Las mezclas se incubaron en hielo 20’ y fueron sometidas a choque térmico en un baño termostatizado a 42ºC durante 45-50’’ sin agitación. Tras esto, fueron introducidas nuevamente en hielo 2’ y se añadió medio SOC (20 g/l triptona, 5 g/l extracto de levadura, 0,01M NaCl, 1M KCl, 2M MgCl 2 , 1M glucosa) hasta 1ml. Se dejó en incubación 1h y 30’ a 37ºC en un agitador horizontal a 150 rpm. La siembra se llevó a cabo en dos placas Petri con el medio de cultivo LB sólido (10 g/l triptona, 5g/l extracto de levadura, 0,008M NaCl, agar, 100mg/ml de ampicilina (Sigma), 0,8M IPTG (Promega) y 50mg/ml XGal (Promega)). En una de ellas se añadió 200 µl de bacterias y en la segunda, tras centrifugar y eliminar 600 µl, se sembraron los 200 µl de células restantes. Las placas fueron depositadas en una estufa y dejadas a 37ºC toda la noche. 21 7. RESULTADOS: 7.1 CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE AISLADOS DE AMV Los 10 aislados recolectados en campo a partir de plantas sintomáticas y asintomáticas de alfalfa, se caracterizaron por su reacción en V. unguiculata. La observación de síntomas permitió distinguir entre aislados que inducen mosaico sistémico y aislados que inducen lesiones locales necróticas sin aparición de síntomas sistémicos (Tabla 2 y Fig.8). Aquellos aislados que no indujeron lesiones en V. unguiculata se inocularon en haba para su clonaje biológico. Unas cinco lesiones por aislado, tanto necróticas (Fig.8) como cloroticas (Fig.9), cada una provocada por una colonia de una variante viral, fueron cortadas e inoculadas en cinco plantas de N. clevelandii (Fig.10), planta multiplicadora para propagar los clones obtenidos. Tabla 2. Material vegetal utilizado y síntomas observados. ALFALFA Lesiones locales necróticas en Vigna unguiculata Aparición de mosaico sitémico en Vigna unguiculata Alfalfa con síntomas 111 No Si Multiplicadas en cinco plantas por cada aislado de Nicotiana clevelandii 113 No Si 121 Si No 124 No Si 125 Si No Alfalfa sin síntomas 116 No Si 118 No Si 123 Si No 128 No Si 129 No Si Figura 9. Lesiones cloróticas locales en Vigna unguiculata. CITA, febrero 2014 Figura 8. Lesiones necróticas locales que presentó una de las plantas al ser inoculada pasada una semana CITA, febrero 2014. 22 Se analizó si existe asociación entre la aparición de síntomas de mosaico en las plantas de alfalfa de procedencia de cada aislado con la inducción de síntomas de mosaico en V. unguiculata, para lo cual los resultados de la Tabla 2 se agruparon como se indica en la Tabla 3 (tabla de contingencia). El análisis de la tabla de contingencia mediante un test chi-cuadrado de comparación entre frecuencias observadas y esperadas (Tabla 3) indicó que la aparición de síntomas de mosaico en alfalfa de procedencia del aislado es independiente de que dicho aislado induzca mosaico en V. Unguiculata, sin existir relación estadística alguna (X 2 =0,476; P=0,4902, test exacto de Fisher G=0,483; P=0,487. Tabla 3. Frecuencia de aparición de mosaico en alfalfa y V. unguiculata (las frecuencias entre paréntesis son las esperadas bajo la hipótesis de que no existe asociación de síntomas en ambos huéspedes) Nº de carillas con síntoma Nº de carillas sin síntomas Total de plantas Mosaico en alfalfa 2 (1,5) 3 (3,5) 5 Sin mosaico en alfalfa 1 (1,5) 4 (3,5) 5 Total 3 7 10 Figura 11. Nicotiana clevelandii, planta multiplicadora. CITA, febrero 2014 Figura 10. Mosaico sistémico a partir de plantas sin síntoma necrótico local. CITA, julio 2013. 23 7.2 CONSTRUCCIÓN DE UN CLON DE cDNA DE LONGITUD TOTAL DEL RNA3 DE AMV Se hizo en primer lugar un alineamiento de secuencias de aislados de AMV disponibles en GenBank (AnexoI), con el objetivo de diseñar los cebadores necesarios para amplificar y clonar fragmentos de cDNA de longitud total del RNA3 de los aislados recolectados en campo, mediante la identificación de zonas conservadas en dicho RNA entre distintas secuencias. El alineamiento de estas secuencias mostraba una alta similitud en las últimas bases del extremo 3’, lo que permitía diseñar un cebador. Sin embargo, en el extremo 5’, la diferencia entre las secuencias era más notable. Por ello se decidió amplificar a partir del RNA total un fragmento de 2115 nt con los cebadores AMV-R3e3.PstI (R), cuyas bases correspondían al extremo 3’, y AMV me5F” EcoRI (F), cuyas bases eran complementarias a las bases posteriores a la región variable del extremo 5’, que sí estaban conservadas (Tabla 1 y Fig.6). Se amplificó dicho fragmento de dos aislados, (121 y 123) que inducían lesión necrótica en V. Unguiculata (sin síntomas de mosaico) y otros dos (124 y 129) que inducían mosaico sistémico en dicho huésped. El resultado de la amplificación se muestra en la figura 12. Para comprobar que la secuencia del extremo 3’ del alineamiento coincidía con la secuencia real del genoma de nuestros aislados, se amplificó y secuenció el extremo 3’ de las muestras positivas mediante RACE 3’ (Fig. 6 y 13). Por otro lado, para poder diseñar un adaptador que complementara los 27nt no amplificados correspondientes a la región variable del extremo 5’, se amplificó y secuenció el extremo 5’ de las muestras positivas mediante RACE 5’ (Fig. 6 y 14). Ambas amplificaciones de los extremos se hicieron partiendo de RNA total, ya que vimos que el dsRNA, extraído en concreto para esta técnica, no se había extraído correctamente. El alineamiento de las secuencias obtenidas, mostró identidad de secuencia en los 3 aislados amplificados, 121, 124 y 129 de manera que se procedió a diseñar un adaptador común para los tres aislados, AMVlnk5 (Fig 6), el cual fue ligado al fragmento de 2115 nt amplificado anteriormente, de forma que se obtuvo un fragmento de longitud completa del RNA3 de nuestros aislados. El adaptador AMVlnk5 diseñado incluía además la secuencia del promotor T7 inmediatamente aguas arriba de la secuencia viral correspondiente al extremo 5’ del RNA 3(Fig. 6). De este modo se podría sintetizar mediante transcripción in vitro en presencia de CAP (7MGppp) un RNA que resultada infectivo. Los fragmentos de longitud completa obtenidos para cada aislado se insertaron en el vector pUC19 (dianas XbaI y PstI, Fig.7) y se clonaron en bacterias. 24 25 7.3 TRANSFORMACIÓN BACTERIANA En las figuras 15 a 17 se muestran los resultados observados tras la transformación en bacterias de las construcciones obtenidas y su posterior siembra en placas: Como puede observarse, las bacterias no fueron transformadas con el vector supuestamente introducido. La transformación si funcionó de forma correcta puesto que en los controles positivos aparecieron colonias de bacterias transformadas. 32 Aislado País de origen Huésped RNA3 a 195-AN Italy Solanum lycopersicum AJ130705 CP Da Italy Solanum lycopersicum Y09110 CP Lst Italy Lavandula stoechas FN667967 c Tef-1 Italy Teucrium fruticans FR854391 CP 95-08 Serbia Medicago sativa FJ527748 CP 196-08 Serbia Nicotiana tabacum FJ527749 CP 100-08 Serbia Syringa vulgaris EU925642 CP Ca375 Canada Solanum tuberosum DQ314749 CP Ca175 Canada Solanum tuberosum DQ314750 CP Ca399 Canada Solanum tuberosum DQ314751 CP Ca400 Canada Solanum tuberosum DQ314752 CP Ca401 Canada Solanum tuberosum DQ314753 CP Ca508 Canada Solanum tuberosum DQ314754 CP Ca518 Canada Solanum tuberosum DQ314755 CP Ca616 Canada Solanum tuberosum DQ314756 CP AMV-P Brazil Carica papaya FJ858264 CP AMV-A Brazil Medicago sativa FJ858265 CP V.tinus Chile Viburnum tinus JN040542 CP HQ288892.1 Egypt Solanum tuberosum HQ288892 CP N20 Australia Medicago sativa HM807304 CP 33 Aislado País de origen Huésped RNA3 a S30 Australia Medicago sativa HM807305 CP S40 Australia Medicago sativa HM807306 CP W1 Australia Medicago sativa HM807307 CP WC3 Australia Trifolium repens JN209847 CP TN Australia Medicago sativa HQ185568 CP NZ1 Lincoln New Zealand Medicago sativa AF215663 CP NZ34 New Zealand Medicago sativa AF215664 CP NZ1 New Zealand Medicago sativa U12509 CP NZ2 New Zealand Medicago sativa U12510 CP 175 New Zealand Actinidia guilinensis KC767660 c 176 New Zealand Actinidia glaucophylla KC767661 c 178 New Zealand Actinidia fortunatii KC767662 c HZ China -- HQ316637 c AZ Korea -- AB126031 c Kr Korea -- AB126032 c KR1 Korea Solanum tuberosum AF294432 CP KR2 Korea Solanum tuberosum AF294433 CP Secuencia RNA3 completo (c) o parcial (CP) sequence